CZ285867B6 - Exprese heterologních proteinů v oslabených bakteriích využívající htrA promotorů - Google Patents
Exprese heterologních proteinů v oslabených bakteriích využívající htrA promotorů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285867B6 CZ285867B6 CZ962182A CZ218296A CZ285867B6 CZ 285867 B6 CZ285867 B6 CZ 285867B6 CZ 962182 A CZ962182 A CZ 962182A CZ 218296 A CZ218296 A CZ 218296A CZ 285867 B6 CZ285867 B6 CZ 285867B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- htra
- promoter
- vaccine composition
- sequence
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 53
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 12
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 12
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical group OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 6
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 5
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 4
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 3
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 3
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 101150006844 groES gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 229920003134 Eudragit® polymer Polymers 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 229940124842 Salmonella vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- 101150110188 30 gene Proteins 0.000 description 1
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010069747 Burkholderia mallei infection Diseases 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000228957 Ferula foetida Species 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 201000003641 Glanders Diseases 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101001041393 Homo sapiens Serine protease HTRA1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N N-acetyl-s-geranylgeranyl-l-cysteine Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241000935974 Paralichthys dentatus Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101001009851 Rattus norvegicus Guanylate cyclase 2G Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021119 Serine protease HTRA1 Human genes 0.000 description 1
- 108050008280 Shikimate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 102100027224 Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050003317 Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 101150075115 hrtA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940076155 protein modulator Drugs 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Konstrukt DNA zahrnující sekvenci promotoru htrA operativně navázanou na sekvenci DNA, kodující jeden nebo více heterologních proteinů, replikovatelné expresní vektory obsahující takovéto konstrukty a oslabené bakterie obsahující konstrukty nebo vektory, dále vakcinový přípravek, zahrnující výše uvedenou oslabenou bakterii nebo fúzní protein exprimovaný z výše uvedeného konstruktu a farmaceuticky přijatelný nosič.ŕ
Description
(57) Anotace:
Vakcinový přípravek, zahrnující oslabenou bakterii, obsahující konstrukt DNA, zahrnující sekvenci promotoru htrA operativně navázanou na sekvenci DNA, kódující jeden nebo více heterologních proteinů, a farmaceuticky přijatelný nosič.
CZ 285 867 B6
Vakcínový přípravek
Oblast techniky
Vynález se týká konstruktů DNA, replikovatelných expresních vektorů obsahujících tyto konstrukty, oslabených bakterií obsahujících tyto konstrukty a vakcin obsahujících tyto bakterie.
Dosavadní stav techniky
V posledních letech se objevila nová generace živých orálních salmonelových vakcin, založených na kmenech Salmonella, které byly oslabeny zavedením nevratné mutace do genu v biosyntéze aromatických složek bakterie. Takovéto kmeny jsou popsány například v EP-A15 0322237. Výše uvedené živé orální salmonelové vakciny se ukazují jako slibné při salmonelózách u člověka a zvířat a mohou být rovněž účinně používány jako nosiče pro dodávání heterologních antigenů do imunitního systému. Kombinované salmonelové vakciny se používají k dodávání antigenů z virů, bakterií a parazitů, vyvolávajících sekreční, humorální a buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď na rekombinantní antigeny. Kombinované 20 salmonelové vakciny vykazují velký potenciál jako jednorázové orální multivakcinové systémy [C. Hormaeche a d., FEMS Symposium č. 63, Plenům, New York, str. 71-83, 1992].
Při vývoji kombinovaných salmonelových vakcin je nutno překonávat určité problémy. Hlavním cílem je dosažení vysoké hladiny exprese rekombinantního antigenů v salmonelové vakcině, 25 která by dostačovala k vyvolání imunitní odpovědi. Neregulovaná vysoká hladina exprese cizích antigenů však může být toxická a ovlivnit životnost buněk [I. Charles a G. Dougan, TIBTECH 8, str. 117-21, 1990], což vede k neúčinnosti vakciny nebo ke ztrátě rekombinantní DNA. Bylo popsáno několik řešení tohoto problému, například exprese z plasmidů nesoucích nezbytné geny, „on-off ‘ promotory nebo zabudování cizích genů do chromosomu salmonely.
Alternativní přístup k překonání uvedeného problému by spočíval v použití promotoru, který je možno zavést in vivo, a jedním z takových promotorů je nitrit reduktosový promotor E. coli nirB, který je indukován při anaerobióze. Vakcinové přípravky obsahují bakterie transformované konstrukty zahrnujícími promotor nirB jsou popsány v naší dřívější mezinárodní přihlášce 35 č. PCT/GB93P/1617.
Podstata vynálezu
Vynález se týká vakcinových přípravků na bází oslabených bakterií s obsahem konstruktů DNA obsahujících jiný indukovatelný promotor, totiž promotor pro gen htrA, který kóduje stresem indukovaný protein.
Gen htrA je popsán v K. Johnson a d., Mol. Microbiol. 1991, 5:401-7 a v uvedených odkazech 45 a je příkladem genu, kódujícího protein teplotního šoku, který je produkován jako odpověď na vzrůst teploty nad 42 °C.
Předmětem vynálezu je tedy vakcínový přípravek, zahrnující oslabenou bakterii, obsahující konstrukt DNA, zahrnující sekvenci promotoru htrA operativně navázanou na sekvenci DNA, 50 kódující jeden nebo více heterologních proteinů, a farmaceuticky přijatelný nosič.
V jednom provedení je předmětem vynálezu výše uvedený vakcinový přípravek, kde je sekvence promotoru htrA operativně navázána na sekvenci DNA, kódující jeden nebo více heterologních protein.
Proteiny tvořící fúzi mohou být spojeny pomocí flexibilní pantové oblasti.
V dalším aspektu je předmětem vynálezu vakcinový přípravek, zahrnující oslabenou bakterii, obsahující konstrukt DNA, zahrnující sekvenci promotoru hrtA operativně navázanou na sekvenci DNA, kódující první a druhý heterologní protein, kde první heterologní protein je antigenní sekvence, zahrnující fragment C tetanového toxinu nebo jeden nebo více jeho epitopů.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy oslabené bakterie, spočívajícího v tom, že se oslabená bakterie transformuje výše definovaným konstruktem DNA.
V dalším aspektu se vynález týká hostitelské buňky, například bakteriální buňky, obsahující výše definovaný konstrukt DNA. Konstrukt DNA může být přítomen v extrachromosomální formě, například v plasmidu, nebo může být o sobě známými metodami integrován do hostitelského (například bakteriálního) chromosomu.
První a druhý protein jsou přednostně heterologní proteiny a zejména může jít o polypeptidické imunogeny; může se jednat například o antigenní sekvence odvozené od viru, bakterie, plísně, kvasinky nebo parazita. Je zvláště výhodné, jestliže první protein představuje antigenní sekvence zahrnující fragment C tetanového toxinu nebo jeho epitopy.
Druhým proteinem je přednostně antigenní determinanta patogenního organismu. Antigenní determinantou může být například antigenní sekvence odvozená od viru, bakterie, plísně, kvasinky nebo parazita.
Příklady virálních antigenních sekvencí pro první a/nebo druhý heterologní protein představují sekvence odvozené od některého typu viru lidské imunodeficience (HIV), jako je HTV-1 nebo HTV-2, receptorového vazebného místa CD4 z HTV, například z HTV-1 nebo HTV-2, viru hepatitidy A, B nebo C, lidského rhinoviru, například typu 2 nebo typu 14, viru Herpes simplex, polioviru typu 2 nebo 3, viru slintavky a kulhavky (FMDV), viru vztekliny, rotaviru, chřipkového viru, viru coxsackie, lidského papillomaviru (HPV), například papillomaviru typu 16, jeho proteinu E7 a fragmentů obsahujících protein E7 nebo jeho epitopy, a viru opičí imunodeficience (STV).
Jako příklady antigenů odvozených od bakterií je možno uvést antigeny odvozené do Bordetella pertussis (například protein P69 a antigeny filamentózního hemaglutininu (FHA), Vibrio cholerea, Bacillus anthracis, a antigeny E. coli, jako je podjednotka B tepelně labilního toxinu E. coli (LT-B), antigeny K88 E. coli a enterotoxigenní antigeny E. coli. Další příklady antigenů zahrnují buněčný povrchový antigen CD4, antigeny glutathion S-transferasy P28 Schistosoma mansoni (antigeny P28) a antigeny motolice, mykoplasmy, hlístic, tasemnic, Chlamydia trachomatis a parazitů malárie, například parazitů rodu Plasmodium nebo Babesia, například Plasmodium falciparum, a peptidu kódující imunogenní epitopy z výše uvedených antigenů.
Konkrétní antigeny zahrnují plnou délku P28 Schistosoma mansoni a oligomery (například 2-, 4— a 8mer) imunogenního peptidu P28 aa 115-131 (který obsahuje epitop buněk B i T) a proteinu E7 lidského papillomaviru, antigenů Herpes simplex, antigeny viru slintavky a kulhavky, antigeny viru opičí imunodeficience a antigeny záškrtového toxinu, například vazebnou oblast gangliosidu záškrtového toxinu.
-2CZ 285867 B6
Zde používané odkazy na promotor htrA se vztahují na promotor jako takový nebo na jeho část nebo derivát, který je schopný podporovat expresi kódující sekvence. Výhodná sekvence, obsahující promotor htrA, je:
AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTA (SEQ ID NO 1)
V konstruktech podle vynálezu může sekvence DNA kódovat fuzní protein ze dvou nebo více proteinů, v němž jsou sousední proteiny odděleny pantovou oblastí. Patentová oblast je oblast, ío konstruovaná tak, že poskytuje dostatečný prostorový i časový odstup, umožňující nezávislé skládání prvního a druhého proteinu.
Patentovou oblast typicky tvoří sekvence, kódující vysoký podíl aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Může být složena celá z aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Pantová oblast může 15 obsahovat jeden nebo více dipeptidů glycin-prolin.
Pantová oblast může například obsahovat až asi 15 aminokyselin, například alespoň 4 a přednostně 6 až 14 aminokyselin, přičemž počet aminokyselin je takový, aby umožňoval flexibilitu mezi prvním a druhým proteinem.
V jednom provedení může pantová oblast v podstatě odpovídat pantové oblasti imunoglobulinu. Pantové oblasti zejména protilátek IgG jsou bohaté na proliny [T. E. Michaelson a d., J. Biol. Chem. 252, 883-9, 1977], o nichž se má za to, že poskytují flexibilní spoj mezi vazebnou a koncovou doménou antigenu.
Bez omezování se na určitou teorii je možno uvést, že proliny patrně tvoří tuhou část pantu, poněvadž kruhová struktura, charakteristická pro tuto aminokyselinu, brání rotaci kolem peptidické vazby, která spojuje prolinový zbytek se sousední aminokyselinou. Má se za to, že tato vlastnost brání prolinu a sousedním zbytkům v zaujmutí uspořádané struktury šroubovice a 30 nebo řetězce β. Flexibilitu patrně poskytuje glycin, nejjednodušší aminokyselina s velmi omezenými sterickými požadavky. Má se za to, že glycin funguje v pantu jako ohebná kloubová součást. Glycin může být nahrazen jinými aminokyselinami, zejména bez objemných postranních řetězců, jako je aianin, serin, asparagin a threonin.
V jednom výhodném provedení tvoří pantovou oblast řetězec čtyř nebo více aminokyselin, definujících sekvenci
-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]rkde Pro je prolin, každý ze symbolů X a Y představuje glycin nebo aminokyselinu 40 s neobjemným postranním řetězcem, Z je jakákoliv aminokyselina, p je celé kladné číslo, q je celé kladné číslo od 1 do 10 a r je 0 nebo celé kladné číslo větší než 0.
Pantovou oblast může tvořit oddělená oblast, heterologní jak k prvnímu, tak ke druhému proteinu, nebo může být pantová oblast definována C-koncovou částí prvního proteinu nebo N45 koncovou částí druhého proteinu.
V nejvýhodnějším aspektu je předmětem vynálezu molekula DNA, zahrnující promotor htrA, operativně navázaný na sekvenci DNA, kódující první a druhý polypeptidický imunogen, které jsou spojeny pantovou oblastí, přičemž první polypeptidický imunogen zahrnuje fragment C tetanového toxinu nebo jeho epitopy.
V jiném výhodném aspektu je předmětem vynálezu replikovatelný expresní vektor, vhodný pro použití v bakteriích, obsahující sekvenci promotoru htrA, operativně navázanou na sekvenci
-3CZ 285867 B6
DNA, kódující první a druhý polypeptidický imunogen, které jsou spojeny pantovou oblastí, přičemž první polypeptidický imunogen zahrnuje fragment C tetanového toxinu nebo jeho epitopy.
V dalším aspektu je předmětem vynálezu konstrukt DNA, zahrnující promotor htrA, operativně navázaný na DNA, kódující první protein, a počínaje jeho 3-koncem sekvenci DNA, kódující pantovou oblast, a za ní jedno nebo více endonukleosových restrikčních míst.
Uvedeným proteinem je přednostně výše definovaný antigenní protein, zejména fragment TetC 10 nebo jeho epitopy.
Stabilní exprese prvního a druhého heterologního proteinu, spojených pantovou oblastí, je možno dosáhnout in vivo. Heterologní proteiny mohou být exprimovány v oslabené bakterii, která tak může být použita jako vakcina.
Oslabená bakterie může být vybrána zrodu Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria a Yersinia. Alternativně může být jako oslabená bakterie použit oslabený kmen enterotoxigenní Escherichia coli. Je možno uvést zejména tyto druhy: S. typhi - původce lidského tyfu, S. typhimurium - původce salmonelózy u několika druhů živočichů, S. enteritidis 20 - původce otravy jídlem u lidí, S. choleraesuis - původce salmonelózy u prasat, Bordetella pertussis - původce černého kašle, Haemophilus influenzae - původce meningitidy, Neisseria gonorrhoeae - původce kapavky, a Yersinia -původce otravy jídlem.
Oslabení bakterie může být přisouzeno nerevertující mutaci genu v biosyntetické dráze 25 aromatických aminokyselin u bakterie. Syntézy chorismátu, sloučeniny z bodu větvení biosyntetické dráhy aromatických aminokyselin, se účastní alespoň deset genů. Některé z nich jsou v bakteriálním genomu umístěny v diametrálně odlišných polohách, například aroA (5enolpyruvylšikimát-3-fosfát synthesa), aroC (chorismát synthesa), aroD (3-dihydrochinát dehydratasa) a aroE (šikimát dehydrogenasa). Mutace tedy může nastat v genu aroA, aroC, aroD 30 nebo aroE.
Přednostně však oslabená bakterie obsahuje nerevertující mutaci v každém ze dvou jednotlivých genů v biosyntetické dráze aromatických aminokyselin nebo obsahuje nerevertující mutaci v aromatické biosyntetické dráze a nerevertující mutaci v regulačním genu, jako je htrA, OmpR 35 nebo OsmC. Příklady vhodných oslabených bakterií jsou uvedeny například v EP-A-0322237 a EP-A-0400958.
Oslabená bakterie, obsahující konstrukt DNA podle vynálezu, může být použita jako vakcina. Při přípravě vakcin mohou být rovněž použity fuzní proteiny (přednostně v podstatě v čisté 40 formě), exprimované bakterií. Například bylo zjištěno, že čištěný fuzní protein TetC-P28 je sám o sobě imunogenní. V dalším aspektu je tedy předmětem vynálezu vakcinovy přípravek, zahrnující farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo a jako účinnou složku výše definovanou oslabenou bakterii a fuzní protein.
Vakcina může obsahovat jednu nebo více vhodných pomocných látek.
Vakcina se výhodně nachází v lyofilizované formě, například ve formě tobolek, pro orální podávání pacientovi. Tyto tobolky mohou být opatřeny enterosolventním povlakem, zahrnujícím například Eudragit „S“, Eudragit „L“, acetát celulózy, acetátftalát celulózy nebo hydroxy50 propylcelulózu. Tobolky mohou být používány jako takové nebo může být lyofilizovaný materiál před podáváním rekonstituován, například ve formě suspenze. Rekonstituce se výhodně provádí v pufru při vhodném pH, aby byla zajištěna životaschopnost organismů. K ochraně oslabených bakterií a vakciny před žaludeční kyselostí se před každým podáním vakciny výhodně podává
-4CZ 285867 B6 preparát na bázi bikarbonátu sodného. Alternativně může být vakcina připravována pro parenterální, intranasální nebo intramamální aplikaci.
Přednostně je vakcina upravena pro podávání mukózní cestou, například orální, intranasální nebo intrabronchiální aplikací.
Oslabená bakterie obsahující konstrukt DNA podle vynálezu může být použita k profylaxi nebo ošetření hostitele, zejména člověka, ale popřípadě rovněž zvířete. Je tedy možno zabránit infekci vyvolané mikroorganismem, zejména patogenem, podáváním účinné dávky oslabené bakterie podle vynálezu. Bakterie pak exprimuje heterologní protein nebo proteiny schopné vyvolávat tvorbu protilátek proti mikroorganismu. Použité dávkování závisí na různých faktorech zahrnujících velikost a hmotnost hostitele, typ forulované vakciny a charakter heterologního proteinu.
Oslabená bakterie podle vynálezu může být připravena transformací oslabené bakterie výše definovaným konstruktem DNA. Je možno použít jakékoliv vhodné techniky transformace, například elektroporace. Tímto způsobem je možno získat oslabenou bakterii schopnou exprimovat protein nebo proteiny, heterologní k bakterii. Kultura oslabené bakterie je možno pěstovat za aerobních podmínek. Připraví se tak dostatečné množství bakterie pro formulaci vakciny s minimálním výskytem exprese heterologního proteinu.
Expresní vektor je opatřen vhodnými prvky kontroly transkripce a translace, zahrnujícími kromě promotoru htrA terminační místo transkripce a startovací a terminační kodon translace a příslušné místo vazby ribosomů. Typicky vektor zahrnuje počátek replikace, a je-li to žádoucí, selektovatelný markerový gen, jako je gen resistence k antibiotikům. Vektorem může být například plasmid.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je podrobněji osvětlen v souvislosti s dále uvedenými příklady a připojenými výkresy, které představují:
Obr. 1 je schematické znázornění konstrukce plasmidu pHTRAl, obsahujícího promotor htrA podle vynálezu.
Obr. 2 je schematické znázornění konstrukce plasmidu pHTRA2, obsahujícího promotor htrA a DNA kódující fragment C tetanového toxinu, navázanou na pantovou oblast.
Obr. 3 znázorňuje strukturu plasmidu pTECH2. ί
Obr. 4 znázorňuje strukturu intermediámího plasmidu pBD907.
Obr. 5 ukazuje strukturu plasmidu pHTRAl, připraveného podle schématu na obr. 1.
Obr. 6 ukazuje strukturu získaného plasmidu pHTRA2, připraveného podle schématu na obr. 2.
Obr. 7A až 7B znázorňují vliv posunů teploty na promotory nirB, groE a htrA.
Obr. 8 znázorňuje expresi lacZ a htrA, nirB a groE v makrofágách.
-5CZ 285867 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konstruktu htrA-TetC-pant
Jak je patrné z obr. 1, byl výchozím materiálem pro přípravu vektoru, obsahujícího promotor htrA a geny kódující fragment C tetanového toxinu, plasmid pTETnirló, jehož struktura a příprava je popsána vnáší dřívější mezinárodní přihlášce PCT/GB93/01617 (č. zveřejnění WO 94/03615) a tam citovaných odkazech, například WO-A-92159689.
Plasmid pTETnirló obsahuje promotor nirB, navázaný na gen kódující fragment C tetovaného toxinu (TetC). Jak je znázorněno na obr. 1, byl pTETnirl5 digerován se SacII a BamHI a vzniklé fragmenty 2,9 kb a 813 bp byly gelově čištěny. Fragment 2,9 kb byl ligován s fragmentem 1,74 kb, odvozeným od genu filamentózního hemaglutininu (FHA) B. pertussis, který má sekvenci znázorněnou jako SEQ ID NO 7. Výsledný plasmid byl označen pBD907 a jeho restrikční mapa je znázorněna na obr. 5. Účelem přípravy intermediámího plasmidu pBD907 bylo odstranit místo EcoRl, přítomné ve fragmentu TetC, aby bylo možno nahradit sekvenci promotoru nirB sekvencí promotoru htrA. Toho bylo dosaženo digescí plasmidu pBD907 s EcoRl a BglII. Vzniklý fragment 4535 bp byl gelově čištěn a ligován s těmito oligonukleotidy 55 bp, obsahujícími promotor htrA:
Oligo-1 5’AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATGTGACGTACACAGCAATTTA (SEQ ID NO 2)
Oligo-2
3'gataaggccttgaagcgcaatattttácttacactgcatgtgtcgttaaatctag (SEQ ID NO 3)
Přítomnost promotoru ve vzniklém intermediámím plasmidu pINT byla potvrzena sekvenováním DNA. Plasmid pINT pak byl digerován se SacII a BamHII a ligován s fragmentem 813 bp z pTETnirl5 za vzniku plasmidu pHTRAl. Sekvence DNA pHTRAl je znázorněna jako SEQ ID NO 4; oblast htrA, která je definována prvními 55 páry bází, má sekvenci
AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTA (SEQ ID NO 1).
Vzhledem k sekvenci SEQ ID NO 4 je GAACTT box -35 a TCTGA je box -10. Na 513, resp. 2235 párech bází je restrikční místo SacII, resp. AlwN 1.
Plasmid pHTRA byl použit k transformaci kmene BRD509 Salmonella typhimurium (uložen 12. 10. 1992 pod přírůstkovým číslem NCTC 12716) a vzniklý kmen, označený BRD935, byl standardními metodami testován na expresi fragmentu TetC. Kmen BRD935 byl uložen 27. 1. 1995 vNational Collection of Type Cultures, Colindale, Spojené království, pod přírůstkovým číslem 12883).
Plasmid pHTRAl, znázorněný na obr. 2, byl použit k přípravě modifikovaného konstruktu, v němž je na C-konci fragmentu TetC přítomna „pantová“ oblast. Nukleotidová sekvence, reprezentující „pantovou“ oblast, byla získána z plasmidu pTECH2, který má sekvenci DNA, znázorněnou jako SEQ ID NO 5 a v poloze 533, resp. 2304 má restrikční místo SacII, res. AlwNI. Příprava tohoto plasmidu je popsána vnáší dřívější přihlášce PCT/GB93/01617 (č. zveřejnění WO 94/03615).
-6CZ 285867 B6
Plasmid pTECH2 zahrnuje oblast promotoru nirB, napojenou na fragment C tetanového toxinu, který je přes svůj 3'-konec napojen skrze restrikční místo BamHI na pantovou oblast, kódující opakující se jednotku Gly-Pro-Gly-Pro spolu s četnými restrikčními místy, umožňujícími insekci genů, kódujících další polypeptidy. Fragment 1,7 kb, kódující pantovou oblast a část oblasti fragmentu C tetanového toxinu, byl zpTECH2 odstraněn digescí se SacII a AlwNI a přečištěn. Sekvence DNA vzniklého fragmentu je znázorněna jako SEQ ID NO 6.
Plasmid pHTRAl, který kóduje promotor htrA a fragment C tetanového toxinu, ale neobsahuje žádný pant, byl digerován se SacII a AlwNI a vzniklý fragment 2 kb byl gelově přečištěn.
Fragment 1,7 kb (SEQ ID NO 6) z pTECH2 a fragment 2 kb z pHTRAl byly ligovány za vzniku plasmidu pHTRA2, který zahrnuje promotor htrA, operativně navázaný na gen pro fragment C tetanového toxinu, mající na svém 3'-konci pantovou oblast.
Oslabený kmen Salmonella Typhimurium byl transformován vektorem pHTRA2 a po selekci standardními technikami byl izolován salmonelový kmen BRD 1062, obsahující plasmid pHTRA2.
Plasmid pHTRA2 slouží jako meziprodukt pro přípravu konstruktů, kódujících fuzní protein, spojený pantovou oblastí. Metodami, popsanými v naší dřívější přihlášce PCT/GB93/01617, tak mohou být klonovány další proteiny do míst restrikční endonukleasy v pantové oblasti.
MATERIÁLY A METODY
Bakteriální kmeny
Během experimentů byly používány kmeny E. coli HB101 a BRD509 (oslabený kmen S. typhimurium aroA aroD) (uloženo pod přírůstkovým číslem NCTC ....). Bakterie byly kultivovány v médiu Luria broth (LB) nebo v LB ztuženém 1,6 % w/v agaru, doplněném příslušnými antibiotiky.
Manipulace s DNA
Plasmidová DNA byla čištěna metodou alkalické lýze (R. Maniatis a d., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Restrikční fragmenty DNA byly čištěny zagarových gelů metodou podle Tautze a Rentze (1983, ,Λη optimised freeze-squeeze method for the recovery of DNA Fragments from agarose gels“, Analytical Biochem. 132, 14-19). Restrikční enzymy byly dodány od Boehringe Mannheim, Německo, a New England Biolabs, USA, a byly používány podle národu výrobce. ;
Sekvenování DNA
DNA pro dvouvláknové sekvenování byla izolována metodou Stephena a d. (1990, A Rapid Method for Isolating Hing Quality Plasmid DNA Suitable for DNA Sequencing, Nucleic Acid Research, 18. č. 24, str. 7463). Sekvenování bylo prováděno s použitím verze 2 kitu Sequenase (USB) podle návodu výrobce.
Oligonukleotidy
Oligonukleotidy byly syntetizovány na syntetizátoru oligonukleotidů SAMI (Biolabs, GB).
-7CZ 285867 B6
Příklad 2
Příprava konstruktu htrA-lacZ
Vlastnosti promotoru htrA byly složeny s pomocí dvou dalších indukovatelných promotorů, totiž nirB a groE.
Subklonování lacZ po směru exprese za promotoři nirB, htrA a groE
Fragment DNA, kódující gen lacZ bez promotorů, byl čištěn z plasmidu pMAC1871 (Pharmacia) technikou nízkotající agorózy s následujícím štěpením plasmidu restrikčními enzymy Sáli a BamHI [14], Plasmidy pTETnir-15 [S.N. Chatfíeld a d., Bio/Technology 10, 888-892], resp. pTEThtrA-1, obsahující promotory nirB, resp. htrA, byly digerovány s endonuklesami Sáli a BamHI a čištěný fragment kódující lacZ byl klonován do rámce ve směru exprese za promotory. K měření exprese β-galaktosidasy (β-gal) z promotoru groE byl použit plasmid pRZ-PES. pRS-PES obsahuje před geny groES a lacZ promotor groE-operonu E. coli. Byl konstruován subklonováním fragmentu EcoRI-HindlII 2,1 kg, nesoucího operon z plasmidu pOF39 [O. Fayet a d., J. Bacteriol. 171, 1379-1385 (1989)], do pUC19. Fayet a d., J. Bacteriol. 171, 1379-1385 (1989)], do pUC19. Pak bylo mezi geny groES a groEL pomocí místně řízené mutagenese zavedeno nové místo BglII. Fragment EcoRI-BglII, nesoucí promotor groE a gen groES, byl klonován do plasmidu promotoru-sondy pRF5255, vyříznutého pomocí EcoRIBamHI [P.F. Lambert a d., J. Bacteriol. 162, 441-444 (1985)], za vzniku plasmidu pRZ-PES. Plasmidy, připravené v S. typhimurium LB5010 (r'm+) [L.R. Bulles a d., J. Bacteriol. 256, 471474 (1983)], byly s použitím elektroporace zavedeny do kmene S. typhimurium BRD915 (S. typhimurium LS1344 htrA) [S.N. Chatfíeld a d., Microbial Pathog. 12, 145-151 (1992)]. Lac pozitivní rekombinanty byly podrobeny screeningu na agarových plotnách L, obsahujících ampicilin a X-gal.
Vliv změn podmínek životního prostředí na expresi lacZ
Bakteriální kmeny, obsahující rekombinační plasmidy, byly kultivovány za třepání při 30 °C přes noc v médiu L-broth. Kultury byly zředěny 1:50 a ponechány růst další 3h při 30 °C do dosažení hodnoty OD60o 2,8 až 3,4. 0,2 ml každé kultury bylo uchováváno při 4 °C a použito k určení základní hodnoty aktivity β-gal. Zbylé části kultur byly přesunuty do dále popsaných odlišných kultivačních podmínek a po 0, 2, 4, 6 a 24 h, není-li uvedeno jinak, byly odebírány vzorky. V každém časovém bodě bylo stanoveno OD6oo a před prováděním testu na β-gal byly bakterie uchovávány při 4 °C.
Měření exprese v infikovaných buněčných liniích HEp-2, Caco-2 a THP 1-makrofága i
Buňky byly naočkovány v množství přibližně 108 buněk na jamku na 24jamkové plotny a kultivovány přes noc při 37 °C v atmosféře 5 % CO2 v Dolbeccově modifikovaném Eaglesově médiu bez fenolové červeně (ICN Flow), doplněném 10% (obj./obj.) fetálního telecího séra a 2 mM glutaminu. Ke tkáňovým kulturám byla přidána zředěná kultura bakterií, získaná přes noc, v množství 108 CFU. V různých časových bodech byly odebírány vzorky média tkáňové kultury pro měření aktivity β-gal v extracelulámích bakteriách. Počet bakterií v každém vzorku byl stanoven vizuálně a odpovídající hodnota OD6oo byla stanovena ze standardní křivky. Infikované buňky byly promyty fosfátovým solným pufrem (PBS) a inkubovány ještě 1 h v přítomnosti 200 mg/ml gentamicinu za účelem usmrcení extracelulámích bakterií. Pak byly buňky lyžovány intenzivním pipetováním s použitím sterilní destilované vody. Pro každý lyzát byla stanovena aktivita β-gal. Počet bakterií v každém lyzátu byl stanoven vizuálně a odpovídající hodnota OD60o byla stanovena ze standardní křivky.
-8CZ 285867 B6
VÝSLEDKY
Exprese z každého z promotorů, zvolených pro tuto studii, je citlivá na změny v podmínkách okolního prostředí. Již dříve se prokázalo, že nirB reaguje na změny anaerobicity. Počáteční experimenty měly za úkol stanovit úroveň exprese lacZ z každého z promotorů, umístěných na podobných multikopiových plasmidech, obsažených ve kmeni salmonelové vakciny BRD915. Vliv posunů teploty na různé promotory je znázorněn na obr. 7. Posun teploty z 30 na 37 °C (obr. 7A) při expresi lacZ z promotorů nirB a htrA vedly ke zvýšení počtu jednotek enzymu βgal. U promotoru groE nebylo detekováno významné zvýšení počtu jednotek β-gal. Posun teploty z 30 na 42 °C vedl ke zvýšení počtu jednotek β-gal ze všech tří promotorů. Rychlost zvýšení počtu β-gal z htrA a nirB byla ve srovnání s groE vyšší (obr. 7B). Posuv teploty z 37 na 42 °C vedl kindukci promotorů nirB a htrA smírnějším růstem počtu jednotek β-gal z promotoru groE (obr. 7C).
Exprese β-gal z různých promotorů byla testována rovněž selekcí bakterií, které vstoupily do eukaryotických buněk. Buněčné linie HEp-2, Caco-2 a THP-1 makrofága byly infikovány 108 bakterií a inkudovány při 30 °C. Počet jednotek β-gal, stanovený 3 h po infekci HEp-2, ukazuje zvýšenou expresi lacZ z promotorů htrA a nirB (obr. 2). Nedošlo však k detekovatelné expresi lacZ z promotoru groE. Podobné výsledky byly získány s infikovanými buňkami Caco-2 (neznázoměno). Naopak v extracelulámím prostředí makrofága byly všechny tři promotory indukovány (obr. 8). Nejvíce byl ovlivněn promotor nirB a nejméně promotor groE (obr. 8). Když byl stanoven počet jednotek β-gal v extracelulámím prostředí každé buněčné linie, nebylo patrné žádné zvýšení aktivity enzymu (neznázoměno).
Vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že růst v makrofágovi ovlivňuje expresi ze všech tří promotorů, byla monitorována jejich citlivost na peroxid vodíku, který se obvykle nachází ve fagosomu makrofágů. Inkubace bakterií při 30 °C ve 100 μΜ peroxidu vodíku neměla žádný významný vliv na promotory groE a nirB. Naopak hladina β-gal z promotoru htrA se zvýšila a do 4 h dosáhla 10 jednotek nad základní hodnotu. Pak následoval rychlý pokles během 6 h na základní hodnotu (neznázoměno). Konstitutivní exprese lacZ z plasmidu pLK [M. Szabo a d.,
J. Bacteriol.. 174, 7245-7252] nebyla významně ovlivněna žádnou z podmínek prostředí (neznázoměno).
V této studii byly k expresi genu lacZ za různých růstových podmínek použity tři promotoiy, regulované okolními podmínkami. Tyto promotory jsou zástupci tří skupin indukovatelných bakteriálních promotorů: anaerobicky indukovatelný nirB E.coli, htrA závislý na σΕ a groE závislý na σ32. Exprese z promotoru nirB je závislá na transkripčním faktoru FNR, který se váže mezi polohy -52 a -30 proti směru exprese od startu transkripce. V některých případech je transkripce závislá na FNR modulována společně s drahým transktripčním faktorem NarL. Zde použitý plasmid pTETnir-15 však obsahuje pouze vazebné místo závislé na FNR.
Bakterie odpovídají na stresové okolní podmínky rychlou změnou rychlostí syntézy mnoha proteinů. V mnoha případech se přechodnou indukcí nastaví hladina proteinu do nového ustáleného stavu. V této studii jsme testovali vliv okolních podmínek na hladinu β-gal. Zjistili jsme, že posun teploty má větší účinek na promotory htrA v porovnání s groE. Tento výsledek souhlasí se skutečností, že in vivo je promotor htrA indukován RNA polymerasou, obsahující σΕ, před groE (který je závislý na σ32) a společně se σ32 [11, 12]. Je překvapivé, že promotor nirB je také podporován zvýšenou teplotou. I když je možné, že při vysoké teplotě je snížena koncentrace kyslíku v růstovém médiu, může ze skutečnosti, že posun teploty z 30 0 na 37 °C vyvolává rychlé zvýšení počtu jednotek β-gal exprimovaných z promotora nirB, vyplývat, že FNR podobně jako jiné stresové modulátory proteinů odpovídá na různé okolní stimuly. Podobně
-9CZ 285867 B6 byl htrA indukován také za anaerobních růstových podmínek, a tudíž se zdá, že tento promotor je buď regulován jinými faktory než σΕ nebo že σΕ je aktivován také za nízké tense kyslíku.
Aby se bakterie S. typhimurium uchovala virulence, musí být schopna přežít v makrofágách. Toto přežití je závislé na schopnosti bakterie tolerovat velký rozsah toxických smrtících mechanismů včetně produktu peroxidu vodíku. Již dříve bylo zjištěno, že na rozdíl od mutantů htrA E. coli nejsou mutanti htrA S. typhimurium usmrcování zvýšenou teplotou, ale místo toho mají zhoršenou schopnost přežít významné hladiny peroxidu vodíku. Je zajímavé, že promotor htrA je jediný z testovaných promotorů, jehož exprese se v přítomnosti peroxidu vodíku zvýšila.
Za účelem stanovení vlivu intracelulámího prostředí byla monitorována hladina exprese ze tří různých promotorů poté, co Salmonella, obsahující testované plasmidy, vstoupila do různých kultivovaných eukaiyotických buněčných linií. Bakterie byly pěstovány in vitro a byly použity k infekci eukaryotických buněk při 30 °C, poněvadž posud teploty ze 30 na 37 °C dramaticky indukoval promotor htrA i nirB. Zjistili jsme, že zatímco se hladina exprese β-gal z promotoru nirB a htrA zvýšila ve všech testovaných buněčných liniích, byl promotor groE indukován pouze v infikovaných makrofágách.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: MEDEVA HOLDINGS BV (B) ULICE: CHURCHILL-LAAN 223 (C) MĚSTO: AMSTERDAM (E) ZEMĚ: NIZOZEMSKO.
(F) POŠT. KÓD: 1078 ED (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: VAKCINY (iii) POČET SEKVENCÍ: 7 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, verze #1.25 (EPO) (ví) ÚDAJE O PRIORITNÍ PŘIHLÁŠCE: i (A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: GB 9401795.1 (B) DATUM PODÁNÍ: 31. LEDEN 1994 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
-10CZ 285867 B6 (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Salmonella typhimurium (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: 1..5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:
AATTCTATTC CGGAACTTCG CGTTATAAAA TGAATCTGAC GTACACAGCA ATTTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární , (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2:
AATTCTATTC CGGAACTTCG CGTTATAAAA TGAATGTGAC GTACACAGCA ATTTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina ;
(C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:
GATAAGGCCTT TGAAGCGCAA TATTTTACTT ACACTGCATG TGTCGTTAAA TCTAG
-11CZ 285867 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3712 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: dvojité (D) TOPOLOGIE: kruhová (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: promotor htrA (B) POLOHA: 1..55 (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: restrikční místo SacII (B) POLOHA: 513 (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: restrikční místo AlwN 1 (B) POLOHA: 2235 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:
-12CZ 285867 B6 όθ
AATTCTATTC CGGAAC7TCG CGTTATAAAA TGAATCTGAC GTACACAGCA ATTTAG.ATCT
| TAATCATCCA | CAC-G.-.C-ACTT | TCTGATC-AAA | AACCTTGATT | C-TTGGGTCGA | CAACGAAGA.A | 120 |
| GACATCGATG | TTATCCTGAA | AAAGTCTACC | AT7CTGAACT | TGGACATCAA | CAACGATATT | 180 |
| ATCTCCGACA | TCTCTGGTTT | CAACTCCTCT | GTTATCACAT | ATCCAC-ATGC | TCAATTGGTG | 240 |
| CCGGGCATCA | ACGGCAAAGC | TATCCACCTG | GTTAACAACG | AATCTTCTGA | AGTTATCGTG | 300 |
| CACAAGGCCA | TGGACATCGA | ATACAACGAC | ATGTTCAACA | ACTTCACCGT | TAGCTTCTGC- | 360 |
| CTGCGCGTTC | CGAAAC-TTTC | TGCTTCCCAC | CTGGAACAGT | ACGGCACTAA | CGAGTACTCC | 420 |
| ATCATCAGCT | CTATGAAGAA | ACACTCCCTG | TCCATCGGCT | CTGGTTGGTC | TGTTTCCCTG | 480 |
| AAGGGTAACA | ACCTG.A7CTG | GACTCTGAAA | GACTCCGCGG | C-CGAAGTTCG | TCAGATCACT | 540 |
| TTCCGCGACC | TGCCGGACAA | GTTCAACGCG | TACCTGGCTA | ACAAATGGGT | TTTCATCACT | 600 |
| ATCACTAACG | ATCGTCTGTC | TTCTGCTAAC | CTGTACATCA | acggcgttct | GATGGGCTCC | 660 |
| GCTGAAATCA | CTGGTCTGGG | CC-CTATCCC-T | C-AGGACAACA | ACATCACTCT | TAAGCTC-GAC | 720 |
| CGTTGCAACA | ACAACAACCA | GTACGTATCC | ATCGACAAC-T | TCCGT^CTT | CTC-C.V-AGC.A | 780 |
| CTG.A.ACCCGA | ·Γ' » 1 Vkjr·. | ’ /•’η > *p tóftAv i i Γ. 1 | ACCAGCTACC | TGTCTATCAC | CTTCCTGCGT | 840 |
| C-ACTTCTGGG | '’Τΐ' rr.'r*r’” | ACCGAATATT | ACCTGATCCC | GGTAGCTTCT | 900 | |
| AC-CTCT.AAAG | ..Lj; tLr/jk.; | G.AA--AAC.ATC | ACTC-ACTACA | TGTACCTGAC | C.--ACGCGCCG | 960 |
| TCCTACACTA | rX - .w.L i | G.AACATCT.AC | TACCC-ACGTC | TGTACAACGG | CCTGAAATTC | 1020 |
| atcatcaaac | GCTACACTCC | GAACAACGAA ATCGATTCTT | TCGTTAAATC | TGGTGACTTC | 1060 | |
| ATCAAACTGT | ACGTTTCTT.A | CAACAACAAC GAACACATCG | TTGGTTACCC | GAAAGACGGT | 1140 | |
| AACGCTTTCA | ACAACCTGGA | CAGAATTCTG CGTGTTGGTT | ACAACGCTCC | GGGTATCCCG | 1200 | |
| CTGTACAAAA AAATGGAAGC TGTTAAACTG CGTGACCTGA AAACCTACTC | TGTTCAGCTG | 1260 | ||||
| AAACTGTACG ACGACAAAAA | CGCTTCTCTG | GGTCTGGTTG | GTACCCACAA | CGGTCAGATC | 1320 | |
| GGTAACGACC | CGAACCGTGA | CATCCTC-ATC | GCTTCTAACT | GGTACTTCAA | CCACCTGAAA, | 1380 |
| GACAAAATCC | TGGGTTGCGA | CTGGT.ACTTC | GTTCCG.ACCG | ATGAAGGTTG | GACCAACGAC | 1440 |
| T.AAGG.ATCCG | CTAGCCCGCC | TAATC-AC-CGG | Η · Τ' ·! ’ z Π111 ζτ* T* *1* VLilÍLilll | CTCGGGCAGC | GTTGGGTCCT | 1500 |
| P· Ρ·Ρ* « <· r- P | V— wi ς-.~. 1 v. | GTC-CTCCTG7 | CGTTC-AGGAC | CCGGCT.AGGC | TGGCGGGGTT | 1560 |
| GCGTTACTGG | T7AGC-G··--” | C-.-ATCACCGA | *r · /- r- f' r *. >~ρ | ř_AC G“ G A.AC-C | G.ACTC-CTGCT | L. 0 «í 0 |
| GCAAAACGTC | . UvbAW UA | iíwviUv.L·. i | GAATC-GTCTT | CGGTTTCCG” | GTTTCGTAAA | 1580 |
| GTCTGGAAAC | GCGG.-_-.GTCA | ρρρ· rvrvm/-'' | GC77CC7CGC | TC.ACTGACTC | C-C7GCGC7CC- | 1740 |
| GTCGTTCC-GC | T G·— G GC G AG C | Γ· r-fr· ».·*»<· * z* z—n uV ir.l i. | CAC7CAAAGG | CGGTAATACG | v. ;λ1\··μ.*χλ | 1800 |
| GAATCAGGGG | j rr · * /-»<· z* * r· r* Λα .---.Lu w.-.uu | » « > r* * » r τ zp | 7 G .AGC.AAAAG | GCCAGCAAAA | ’Γ-~' > | 1660 |
-13CZ 285867 B6
| CGTAAAAAGG | CCGCGTTGCT | GGCGTTTTTC | CATAGGCTCC | GCCCCCCTGA | CGAGCATCAC | 1920 |
| AAAAATCGAC | GCTCAAGTCA | GAGGTGGCGA | AACCCGACAG | GACTATAAAG | ATACCAGGCG | 1980 |
| TTTCCCCCTG | GAAGCTCCCT | CGTGCGCTCT | CCTGTTCCGA | CCCTGCCGCT | TACCGGATAC | 2040 |
| CTGTCCGCCT | TTCTCCCTTC | GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC | AATGCTCACG | CTGTAGGTAT | 2100 | |
| CTCAGTTCGG | TGTAGGTCGT | TCGCTCCAAG | CTGGGCTGTG | TGCACGAACC | CCCCGTTCAG | 2160 |
| CCCGACCGCT | GCGCCTTATC | CGGTAACTAT | CGTCTTGAGT | CCAACCCGGT | AAGACACGAC | 2220 |
| TTATCGCCAC | TGGCAGCAGC | CACTGGTAAC | AGGATTAGCA | GAGCGAGGTA | TGTAGGCGGT | 2280 |
| GCTACAGAGT | TC7TGAAGTG | C-TGGCCTAAC | TACC-GCTACA | CTAGAAGGAC | AGTATTTGGT | 2340 |
| ATCTGCC-CTC | GGAAAAAGAG | 1 χ\.χ·;λι·\.Λ | TTGATCCGGC | 2400 | ||
| AAACAAACCA | CCGCTC-GTAG | CGGTGGTTTT | m ή ρ· 'Τ’ *p (3(^ | AC-CAGCAGAT | TACGCGCAC-A | 2460 |
| AAAAAAGGAT | CTCAAGAAGA | TCCTTTGATC | GGTCTGACGC | 1 x kTv/v.L. | 2520 | |
| GAAAACTCAC | GTTAAGGGAT | TTTGGTCATG | x f* * 8 1 i Λ. Ι»ΛΛ | AAAGGATCTT | GACCTAGATC | 2580 |
| CTTTTAAATT | AAAAATGAAG | TTTTAAATCA | ATCTAAAGTA | TATATGAGTA | AACTTGGTCT | 2640 |
| GACAGTTACC | AATC-CTTAAT | CAGTGAGGCA | CCTATCTCAG | CGATCTGTCT | ATTTCGTTCA | 2700 |
| TCCATAC-TTG | CCTGACTCCC | CGTCGTGTAG | ATAACTACGA | TACGGGAGGG | CTTACCATCT | 2760 |
| GGCCCCAGTG | CTGCAATGAT | ACCGCGAGAC | CCACGCTCAC | CGGCTCCAGA | TTTATCAGCA | 2820 |
| ATAAACCAGC | CAGCCGGAAG | f*r*r*n | AGAAGTGGTC | CTGCAACTTT | ATCCGCCTCC | 2880 |
| ATCCAC-TCTA | TTAATTGTTG | CCGGGAAGCT | AGAGTAAGTA | GTTCGCCAGT | TAATAGTTTG | 2940 |
| CGCAACGTTG | TGCCATTGC | TGCAGGCATC | GTGGTGTCAC | GCTCGTCGTT | ikítflAl UVJ'-! | 3000 |
| TCATTCAGCT | CCGGTTCCCA | ACGATCAAGG | CGAC-TTACAT | GATCCCCCAT | GTTGTGCAAA | 3060 |
| AAAGCGGTTA | GCTCCTTCGG | TCCTCCGATC | GTTGTCAGAA | GTAAGTTGGC | CGCAC-TGTTA | 3120 |
| TCACTCATGG | TTATGGCAGC | ACTGCATAAT | TCTCTTACTG | TCATGCCATC | CGTAAGATGC | 3180 |
| TTTTCTGTGA | ρ*ρρτρ r,m 8 1;υυΛ*.-Λ'ΐΑ | CTCAACCAAG | TCATTCTGAG | AATAGTGTAT | GCGGCGACCG, | 3240 |
| AGTTGCTCTT | 1 u | AACACGGGAT | AATACCGCGC | CACATAGCAG | aactttaaaa' | 3300 |
| GTGCTCATCA | 3 3 M * 1 | TTCTTCGGGG | CGAAAACTCT | CAAGGATCTT | ACCGCTGTTG | 3360 |
| AGATCCAGTT | CGATC-TAACC | CACTCGTGCA | CCCAACTGAT | CTTCAGCATC | Φ T* Τ’ £ | 3420 |
| ACCAGCGTTT | CTGGGTGAGC | AAAAACAGGA | AGGCAAAATG | CCGCAAAAAA | C-GGAATAAGG | 3480 |
| GCGACACGGA | AATGTTGAAT | ACTCATACTC | TTCCTTTTTC | AATATTATTG | AAGCATTTAT | 3540 |
| CAGGGTTATT | k;; - 1 ku-.x (ww | CGGATACATA | TTTGAATGTA | TTTAGAAAAA | TAAACAAATA | 3600 |
| GGGGTTCCGC | 3 p· > | CCGAAAAGTG | CCACCTGACG | TCTAAGAAAC | CATTATTATC | 3660 |
| ATGACATTAA | CCTATAAAAA | TAGGCGTATC | ACGAGGCCCT | TTCGTCTTCA | AG | 3712 |
-14CZ 285867 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3769 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: dvojité (D) TOPOLOGIE: kruhová (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:
-15CZ 285867 B6
| TTCAGG7AAA | 7TTGATGTAC | ATCAAATGGT | ACCCCTTGCT | GAATCG77AA GG7AGGCGG7 | 60 |
| agggcccaga | TCTTAATCAT | CCACAGGAGA | CTTTC7GATG | AAAAACCTTG ATTGTTGGGT | 120 |
| CGACAACGAA | GAAGACATCG | ATGTTATCCT | GAAAAAGTCT | ACCATTCTGA ACTTGGACAT | 180 |
| CAACAACGAT | ATTATCTCCG | acatctctgg | TTTCAACTCC | TCTGTTATCA CATATCCAGA | 240 |
| 7GC7CAATTG | G7GCCGGGCA | TCAACGGCAA | AGCTATCCAC | CTGGTTAACA ACGAATCTTC | 300 |
| TGAAG7TATC | GTGCACAAGG | CCATGGACAT | CGAATACAAC | GACATGTTCA ACAACTTCAC | 360 |
| CGTTAGCTTC | TGGCTGCGCG | TTCCGAAAGT | TTCTGCTTCC | CACCTGGAAC AGTACGGCAC | 420 |
| TAACGAGTAC | 1 vvA;Lrti vr*. | \jv x v ;λ1 | GAAACACTCC | CTC-7CCATCG GCTCTGGTTG | 48'0 |
| GTCTGTT7CC | C7GAAGGGTA | ACAACC7GAT | CTGGACTCTG | AAAGAC7CCG CGGGCGAAGT | 540 |
| x\.v;L.-.'c.-.TC | ACTTTCCGCG | ACCTGCCGGA | CAAGTTCAAC | GCGTACCTGG CTAACAAA7G | 600 |
| GGTTTTCATC | ACTATCACTA | ACGATCGTCT | GTCTTCTGCT | AACC7G7ACA TCAACGGCG7 | 66Q |
| TCTC-ATGGGC | TCCGCTGAAA | 7CAC7GGTCT | GGGCGC7A7C | CGTGAGGACA ACAACATCAC | 720 |
| TCT7AAGCTG | r· κ kxr.v-v^vj X x | ACAACAACAA | CCAGTACG7A | TCCATCGACA AGT7CCG7AT | 780 |
| CTTC7GCAAA | GCACTGAACC | CGAAAGAGAT | CGAAAAACTG | 7ATACCAGC7 ACCTG7C7AT | 840 |
| CACCTTCCTG | CC-TGACTTCT | GGGGTAACCC | GCTGCGTTAC | GACACCGAAT A7TACC7GAT | 900 |
| CCCGG7AGCT | 7CTAGC7CTA | AAGACGTTCA | GCTGAAAAAC | ATCAC7GACT ACA7GTACC7 | 960 |
| GACCAACGCG | CCGTCCTACA | CTAACGGTAA | ACTGAACATC | TACTACCGAC GTCTG7ACAA | 1020 |
| CGGCC7GAAA | TTCATCATCA | AACGCTACAC | TCCGAACAAC | GAAATCGATT CTTTCG77AA | 1080 |
| v. a z. cr.L· | TTC-TC.-’J-C | TGTACG7TTC | TTACAACAAC | AACGAACACA TCGTTGGTTA | 1140 |
| CCCGAAAGAC | z” <*··η > k | TCAACAACCT | GGACAGAATT | CTGCGTGTTG GT7ACAACGC | 1200 |
| TCCGGGTATC | CCGCTGTACA | AAAAAATGGA | AGCTGTTAAA | CTGCG7GACC TGAAAACCTA | 1260 |
| CTCTGTTCAG | CTGAAACTGT | ACGACGACAA AAACGCTTCT | CTGGG7CTGG T7GGTACCCA | 1320 | |
| CAACGGTCAG | ATCGGTAACG | ACCCGAACCG TGACATCCTG | ATCGCTTCTA ACTGG7ACTT | 1380 | |
| CAACCACCTG | AAAGACAAAA | TCCTGGGTTG CGACTGGTAC | TTCGTTCCGA CCGATGAAGG | 1440 | |
| TTGGACCAAC | GACGGGCCGG | GGCCCTCTAG | AGGATCCGA7 | A7CAAGCTTA CTAGTTAATG | <1500 |
| ATCCGCTAGC | CCGCCTAA7G | AGCGGGC77T | TTTT7C7CGG | GCAGCG7TGG GTCCTGGCCA | 1560 |
| CGGGTGCGCA | TGATCGTGCT | CCTG7CGTTG | AGGACCCGGC | TAGGC7GGCG GGGTTGCCTT | 1620 |
| ACTGGTTAGC | AGAATGAATC | ACCGATACGC | GAGCGAACGT | GAAGCGACTG CTGCTGCAAA | 1680 |
| ACGTCTGCGA | CCTGAGCAAC | AACA7GAA7G | GTCTTCGGTT | TCCGTG7T7C GTAAAG7C7G | 1740 |
| GAAACGCGGA | AGTCAGCGC7 | CTTCCGCTTC | CTCGCTCACT | GACTCGCTGC GCTCGGTCG7 | 1800 |
| 7CGGCTGCGG | Lví.“.uvk?ví t λ i | CAGCTCACTC | AAAGGCGGTA | ATACGG7TAT CCACAGAATC | 1860 |
| AGGGGATAAC | GCAGGAAAGA | ACATGTGAGC | AAAAGGCCAG | CAAAAGGCCA GGAACCGTAA | 1920 |
| ί n 4--Γ.Λ Ws. v. Ví v. V | CCTGACGAGC ATCACAAAAA | •SBO |
-16CZ 285867 B6
| TCGACGCTCA | AGTCAGAGGT | GGCGAAACCC | GACAGGACTA | TAAAGATACC AGGCGTTTCC | 2040 |
| vLu i vwaAuu | TCCCTCGTGC | GCTCTCCTGT | TCCGACCCTG | CCGCTTACCG GATACCTGTC | 2100 |
| CGCCTTTCTC | CCTTCGGGAA | TCTCAATGC | TCACGCTGTA GGTATCTCAG | 2160 | |
| TTCGGTGTAG | GTCGTTCGCT | CCAAGCTGGG | CTGTGTGCAC | GAACCCCCCG TTCAGCCCGA | 2220 |
| CCGCTGCGCC | TTATCCGGTA | ACTATCGTCT | TGAGTCCAAC | CCGGTAAGAC ACGACTTATC | 2280 |
| GCCACTGGCA | GCAGCCACTG | GTAACAGGAT | TAGCAGAGCG | AGGTATGTAG GCGGTGCTAC | 2340 |
| AGAGTTCTTG | AAGTGGTGGC | CTAACTACGG | CTACACTAGA | AGGACAGTAT TTGGTATCTG | 2400 |
| CGCTCTGCTC- | AAKCAGTTA | CCTTCGGAAA | AAGAGTTGGT | AGCTCTTGAT CCGGCAAACA | 2460 |
| AACCACCGCT | rm « ς\ίΐ.-,ς\, x v | gtttttttgt | TTGCAAGCAG | CAGATTACGC GCAGAAAAAA | 2520 |
| AGGATCTCAA | GAAGATCCTT | TGATCTíTTC | TACGGGGTCT | GACGCTCAGT GGAACGAAAA | 2580 |
| CTCACGTTAA | GGGATTTTGG TCATGAGATT | ATCAAAAAGG | ATCTTCACCT AGATCCTTTT | 2640 | |
| AAATTAAAAA | AATCAATCTA | AAGTATATAT | GAGTAAACTT GGTCTGACAC- | 2700 | |
| TTACCAATGC | TTAATCAGTG | AGGCACCTAT | CTCAGCGATC | TGTCTrTTTC C-T^^CC^ | 2760 |
| AGTTGCCTGA | CTCCCCGTCG | TGTAGATAAC | TACGATACGG | GAGGGCTTAC CATCTGGCCC | 2820 |
| CAC-TGCTGCA | ATGATACCGC | C-A.GACCCACG | CCAGATT7AT CAGCAATAAA | 2880 | |
| CCAGCCAGCC | GGAAGGGCCG | AGCGCAGAAG | TGGTCCTGCA | ACTTTATCCG CCTCCATCCA | 2940 |
| GTCTATTAAT | TGTTGCCGGG | AAGCTAGAGT | AAGTAGTTCG | CCAGTTAATA GTTTGCGCAA | 3000 |
| CGTTGTTGCC | ATTGCTGCAG | GCATCGTGGT | GTCACGCTCG | TCGTTTGGTA TGGCTTCATT | 3060 |
| CAGCTCCGGT TCCCAACGAT | CAAGGCGAGT | TACATGATCC CCCXTGTTGT GCAAAAAAGC | 3120 | ||
| GGTTAGCTCC | TTCGGTCCTC | CGATCGTTGT | CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT | 3180 | |
| CATGGTTATG GCAGCACTGC | ATAATTCTCT | TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC | 3240 | ||
| TGTGACTGGT GAGTACTCAA | CCAAGTCATT | CTGAGAATAG | TGTATGCGGC GACCGAGTTG | 3300 | |
| CTCTTGCCCG | GCGTCAACAC | GGGATAATAC | CGCC-CCACAT | AGCAGAACTT TAAAAGTGCT | 3360 |
| CATCATTGGA | AAACGTTCTT | CGGC-GCC-AAA | ACTCTCAAGG | ATCTTACCGC TGTTGAGATC | ' 3420 |
| CAGTTCGATG | TAACCCACTC | GTGCACCCAA | CTGATCTTCA | GCATCTTTTA CTTTCACCAG | 3480 |
| I*· 'T'*7’ r- /· i 1 i < i | *n<- i i | L.-.CC.-VÍSJJV.“ | AA.--TGCCC-CA | AAAAAGGGA?. TAAGGGCGAC | 3540 |
TCCGCGCACA :gaa aagtgccacc
ATTAACCTAT
AAAAATAGGC GTATCACGAG
ATGAGCGGAT ACATATTTGA
TGAATACTCA TACTCTTCCT
| TTTTCAATAT | TATTGAAGCA TTTATCAGGG | 3600 |
| ATGTATTTAG | AAAAATAAAC AAAIAGGGGT | 3660 |
| TGACGTCTAA | GAAACCATTA TTATCATGAC | 3720 |
| GCCCTTTCGT | CTTGA-GAA | 3769 |
-17CZ 285867 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1766 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) POZITIVNÍ: NE (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: pantová oblast (B) poloha: 923..934 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 6:
-18CZ 285867 B6
GGGCGAAGTT
CGTCAGATCA
CTTTCCGCGA CCTGCCGGAC
AAGTTCAACG CGTACCTGGC
TAACAAATGG
GTTTTCATCA
CTATCACTAA CGATCGTCTG
TCTTCTGCTA ACCTGTACAT
120
CAACGGCGTT
CTGATGGGCT
CCGCTGAAAT
CACTGGTCTG
GGCGCTATCC
GTGAGGACAA
180
CAACATCACT
CTTAAGCTGG
ACCGTTGCAA
CAACAACAAC
CAGTACGTAT
CCATCGACAA
240
| GTTCCGTATC | TTCTGCAAAG | CACTGAACCC | GAAAGAGATC | GAAAAACTGT | ATACCAGCTA | 300 |
| CCTGTCTATC | ACCTTCCTGC | C-TGACTTCTG | GGGTAACCCG | CTGCGTTACG | ACACCGAATA | 360 |
| TTACCTGATC | x Λ\»ς i i | CTAC-CTCTAA | AGACGTTCAG | CTGAAAAACA | TCACTGACTA | 420 |
| v.-.i sř i AL'» x v | * Z“' X X r.u w.--“ck»LL | CGTCGTACAC | 1 r-nLcc . λΛλ | CTGAACATCT | ACTACCGACC- | 480 |
| TCTGTACAAC | GGCCTGAAAT | TCATCATCAA | ACGCTACACT | CCGAACAACG | * — ΛΛΛ - VUftí . - | 540 |
| * 1» * | TCTGGTC-ACT | TCATCAAACT | GTACGTTTCT | TACAACAACA | ACGAACACAT | 600 |
| CGTTGC-TTAC | L V kí ΛΛΛ\3 AL O | GTAACGCTTT | CAACAACCTG | GACAGAATTC | TGCGTGTTGG | ÓÓO |
| TTACAACGCT | CCGGGTATCC | CGCTGTACAA | AAAAATGGAA | GCTGTTAAAC | TGCGTGACCT | 720 |
| GAAAACCTAC | TCTGTTCAGC | TGAAACTGTA | CGACGACAAA | AACGCTTCTC | TGGGTCTGG7 | 780 |
| TGGTACCCAC | AACGC-TCAGA | TCGGTAACGA | CCCGAACCGT | GACATCCTGA | TCGCTTCTAA | 840 |
| CTGGTACTTC | AACCACCTGA | AAC-ACAAAAT | CCTGGGTTGC | GACTGGTACT | r* rw m Q q c£ r· | 900 |
| CGATGAAGGT | TGGACCAACC- | r-LuLvrx- L íjvv | GCCCTCTAGA | GGATCCGATA | TCAAGCTTAC | 960 |
| TAGTTAATGA | TCCGOTAGCC | CGCCTAATGA | GCGGGCTTTT | TTTTCTCGGG | L-r.LL\j x 1 wc | 1020 |
| TCCTGGCCAC | f*r*r*mr*r*r*r*9m X7VX71 uvuLr.l | GATCGTGCTC | CTGTCGTTGA | GGACCCGGCT | AGGCTGGCGG | 1080 |
| GGTTGCCTTA | CTGGTTAGCA | GAATGAATCA | CCGATACGCG | AGCGAACGTG | AAGCGACTGC | 1140 |
| TGCTGCAAAA | CGTCTGCGAC | CTGAGCAACA | ACATGAATGG | TCTTCGGTTT | CCGTGTTTCG | 1200 |
| TAAAGTCTGG | AAACGCGGAA | GTCAGCGCTC | TTCCGCTTCC | TCGCTCACTG | ACTCGCTGCG | 1260 |
| LlCWlWlí. | p r· f> r* *n r* P f f* LL-vc x xj<-LLL | GAGCGGTATC | AGCTCACTCA | AAGGCGGTAA | l.’XWA Xr.iu | 1320 |
| CACAGAATCA | GGGGATAACG | CAGGAAAGAA | CATGTGAGCA | AAAGGCCAGC | AAAAGGCCAG; | 1380 |
| GAACCGTAAA | AAGGCCGCGT | TGCTGGCGT? | TTTCCATAGG | CTCCGCCCCC | CTGACGAGCA | 1440 |
| TCACAAAAAT | CGACGCTCAA | GTCAGAGGTG | GCGAAACCCG | ACAGGACTAT | AAAGATACCA | 1500 |
| GGCGTTTCCC | CCTGGAAGCT | CCCTCGTGCG | CTCTCCTGTT | CCGACCCTGC | CGCTTACCGG | 1560 |
| ATACCTGTCC | GCCTTTCTCC | CTTCGGGAAG | CGTGGCGCTT | TCTCAATGCT | CACGCTGTAG | 1620 |
| GTATCTCAGT | TCGGTGTAGG | TCGTTCGCTC | CAAGCTGGGC | lui civcALu | AACCCCCCGT | 1680 |
| TCAGCCCGAC | TATCCGGTAA | CTATCGTCTT | C-AGTCCAACC | CGGTAAGACA | 1740 | |
| CGACTTATCG | CCACTGGCAG | CAGCCA | 1766 |
-19CZ 285867 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1736 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 7:
-20CZ 285867 B6
| GGCC-GCCTAC | GCC-ATTGACG | GCACGGCGGC | Ζ·/*/-Ζ-ζ·<-ζ··χ rpz* | TACGGCAAGC | ACATCACGCT | 60 |
| GGTGTCCAGC | GATTCAGGCC | TGGGCGTGCG | CCAGCTCGGC | AGCCTGTCC7 | CGCCATCGGC | 120 |
| CATCACCGTG | TCGTCGCAGG | GCGAAATCGC | GCTGGGCGAC | GCCACGGTCC | 180 | |
| GCTCAGCCTC | GGGTCGTGTC | GGCCGGCAAA | CTGGCCTCCG | z« z»z· c-/-<·/-/*<*/- | 240 | |
| GGTGAACGTC | /· ** ř* f· í- /- n *· /· uvwwuvvu | GGGCGGTGAA | GATCGCGTCG | GCCAGCAGCG | TTGGAAACCT | 300 |
| CGCGGTGCAA | C-GCGGCGGCA | AGGTACAGGC | CACGCTGTTG | ÁÁiuvLljvvv | GGACGTTGCT | 360 |
| GGTGTCGGGC | CGCCAGGCCG | TCCAGCTTGG | CC-CGGCGAGC | AGCCGTCAGG | Ζ-ΖζΖ-zhQ-pQ/^Q-n | 420 |
| GAACGCGGGC | z·*· *· <·z*z*z*mz· * VtfVtfvlU 1 \-A | AGGCGGACAA | z* m z* r* r· f* cx. i X5 i LCUUŮ | ACGCGACGGG | i v c.-ζΧ. b; wr. | 480 |
| TGGCAAGCAG | ρΛι.ΛφΓ·Λΐΐ·* | TGGGGTCGGC | CAGCAGCAAT | bx-tsx-A xH Uwx? | m /· z»r> πη>· r z* r* r* ;vUHbxwiw | 540 |
| CGGCGCCCTC | ΛΛ'ςννυνυνΛ | AGCTGTCGGC | GACGGGGCGA | CTGGACGTGG | ACGGCAAGCA | 600 |
| GGCCGTCACG | f»—1 r- ~ z-»m mr·** x. i cvc 1 | TTGCGAGCGA | Lev X uvbL A b | TCGGTAAGCG | ^ι^Λ**<*^*** * > V X WíWk | 660 |
| CCTGCGGGCG | X · z»/- « * mm/»#* ΓΛνςΛΛί a σν | TCTCCAC-TGC | CCAACTTGTG | GT GCGTGGGC | AGCC-GGAGGT | 720 |
| CGCGCTGGAT | f** Z»mZrtz»<* x lcur. | GCGCACGCGG | CATGACCGTG | GTTGCCGCAG | GAGCGCTGGC | 780 |
| GGCCCGCAAC | CTGCAGTCCA | AGGGCGCCAT | CGGCGTACAG | GGTGGAGAGG | CGGTCAGCGT | 840 |
| GGCCAACGCG | ΛΛ “.XJX-ΧϊΛ^, | CGGAATTGCG | CGTGCGCGGG | CGCGGCCAGG | mr*#* * τζψζζ* x vxsr. 1 v i Vx— | 900 |
| CGACCTGAGC | z* r·* z* z* z* <»/“/*«·· cvAjcbcu^u | GCGCGGATAT | CTCCGGCGAG | GGGCGCGTCA | ATATCGGCCG | 960 |
| TGCGCGCAGC | GATAGCGATG | TGAAGGTCTC | Ζ-ι*ζ·Ζ-/*·»Ζ·Ζ·Ζ·Ζ» CxřUxjrvACUxžC | GCCTTGTCC-A | TCC-ATAGCAT | 1020 |
| GACGGCCCTC | GGTGCGATCG | GCGTCCAGGC | AGGCGGCAGC | GTGTCGGCCA | AGGATATGCG | 1080 |
| CAGCCGTGGC | GCCGTCACCG | TCAGCGGCGG | CGGCGCCGTC | AACCTGGGCG | ATGTCCAGTC | 1140 |
| GGATGGGCAG | GTCCGCGCCA | CCAGCGCGGG | GTGCGAGACG | ζηζ·ζ·/·ζ»»·*·*πζ-ζ- X ~VX-VCX,AXSX, | 1200 | |
| CGCCGACCTT | GCGCTGCAGG | /-<~'-ζ·Ζ'ζ* x/-/-zLuuvLurx | GTTGCAGGCC | GGGTTCCTGA | X X Λ» Z-/*/·*-/-Z- * ftj-.ς vxyv^bvx: | 1260 |
| TGCCATGACC | GTGAACGGCC | bx-v5í-.A\JUUvř t | /-—/· ·ζ-ζζ κ ei C'. j.-tk. i MVíri X | GGCC-CGCACG | CGvGCGGGCA | 1320 |
| ATTGCGGGTT | TCCAGCGACG | GGCAGGCTGC | gttgggcagt | CTCGCGGCCA | AGGGCGAGCT | 1380 |
| GACGGTATCG | C-CCGCGCGCG | CGGCGACCGT | GGCCGAGTTG | AAGTCGCTGG | ACAACATCTC' | 1440 |
| CGTGACGGGC | GGCGAACGCG | TGTCGGTTCA | gagcgtcaac | AGCGCGTCCA | GGGTCC-CCAT | 1500 |
| TTCGGCGCAC | GGCGCGCTGG | ATGTAGGCAA | GGTTTCCGCC | AAGAGCGGTA | TCGGGCTCGA | 1550 |
| x z· r* z*friz· z» ftUUXz X v\5 W<- | GCGGTCGGAG | CGGACTCCCT | CGGTTCCGAC | GGCGCGATCA | GCGTGTCCGG | 1620 |
| GCGCGATGCG | GTCAGGGTCG | ATCAAGCCCG | CAGTCTTGCC | GACATTTCGC | i vjxawxyjx-xřxíA | 1580 |
| AGGCk^CGCC | ACGCTGGGCG | CGGTGGAGGC | lu^Luui Iw | ATCGACGTGC | z* r* z· z-ζ-ζ» VX-AJXJVX3 | 1736 |
-21CZ 285867 B6
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vakcinový přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje oslabenou bakterii, obsahující konstrukt DNA, zahrnující sekvenci promotoru htrA operativně navázanou na sekvenci DNA, kódující jeden nebo více heterologních proteinů, a farmaceuticky přijatelný nosič.
- 2. Vakcinový přípravek podle nároku 1,vyznačující se tím, že sekvence promotoru htrA je operativně navázána na sekvenci DNA, kódující fuzní protein dvou nebo více proteinů.
- 3. Vakcinový přípravek podle nároku 2, vy z n a č uj í c í se t í m , že proteiny tvořící fůzi jsou spojeny pomocí flexibilní pantové oblasti.
- 4. Vakcinový přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že pantová oblast je řetězec čtyř nebo více aminokyselin, definujících sekvenci-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]rkde Pro je prolin, každý ze symbolů X a Y představuje glycin nebo aminokyselinu sneobjemným postranním řetězcem, Z je jakákoliv aminokyselina, p je celé kladné číslo, q je celé kladné číslo od 1 do 10 a r je 0 nebo celé kladné číslo větší než 0.
- 5. Vakcinový přípravek podle kteréhokoli z nároků 2, 3 a 4, vyzn ač uj íc í se tím, že promotor htrA je operativně navázán na sekvenci DNA, kódující první a druhý heterologní protein, kde prvním heterologním proteinem Je antigenní sekvence, zahrnující fragment C tetanového toxinu nebo jeden nebo více jeho epitopů.
- 6. Vakcinový přípravek podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je ve formě pro orální, intranasální nebo intrabronchiální aplikaci.
- 7. Vakcinový přípravek podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že oslabená bakterie je oslabena v důsledku nevratné mutace genu v biosyntéze aromatických aminokyselin bakterie.
- 8. Vakcinový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že oslabená bakterie obsahuje nevratnou mutaci v každém ze dvou jednotlivých genů v biosyntéze aromatických aminokyselin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9401795A GB9401795D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ218296A3 CZ218296A3 (en) | 1996-10-16 |
| CZ285867B6 true CZ285867B6 (cs) | 1999-11-17 |
Family
ID=10749598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ962182A CZ285867B6 (cs) | 1994-01-31 | 1995-01-31 | Exprese heterologních proteinů v oslabených bakteriích využívající htrA promotorů |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0742829B1 (cs) |
| JP (1) | JP3731004B2 (cs) |
| KR (1) | KR100392916B1 (cs) |
| AT (1) | ATE254178T1 (cs) |
| AU (1) | AU701384B2 (cs) |
| BR (1) | BR9506666A (cs) |
| CA (1) | CA2182315C (cs) |
| CZ (1) | CZ285867B6 (cs) |
| DE (1) | DE69532109T2 (cs) |
| DK (1) | DK0742829T3 (cs) |
| ES (1) | ES2210283T3 (cs) |
| FI (1) | FI119476B (cs) |
| GB (1) | GB9401795D0 (cs) |
| HU (1) | HU222982B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ278930A (cs) |
| PL (1) | PL180091B1 (cs) |
| PT (1) | PT742829E (cs) |
| SK (1) | SK99696A3 (cs) |
| WO (1) | WO1995020665A1 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9720033D0 (en) * | 1997-09-19 | 1997-11-19 | Medeva Plc | Hepatitis B virus polypeptides |
| US20020168771A1 (en) * | 2001-05-08 | 2002-11-14 | Gamerman Gary Eric | Vectors having replication, immunogenicity and/or pathogenicity under stress promoter regulation and use thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68917126T2 (de) * | 1988-02-01 | 1995-02-02 | Praxis Biolog Inc | T-zellen-epitope als träger für einen konjugierten impfstoff. |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| GB9007194D0 (en) * | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
| CZ285118B6 (cs) * | 1991-03-05 | 1999-05-12 | The Wellcome Foundation Limited | Exprese rekombinačních proteinů v oslabených bakteriích |
| AU4719393A (en) * | 1992-07-31 | 1994-03-03 | Medeva Holdings B.V. | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
-
1994
- 1994-01-31 GB GB9401795A patent/GB9401795D0/en active Pending
-
1995
- 1995-01-31 EP EP95907080A patent/EP0742829B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 AU AU15415/95A patent/AU701384B2/en not_active Ceased
- 1995-01-31 DE DE69532109T patent/DE69532109T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 WO PCT/GB1995/000196 patent/WO1995020665A1/en active IP Right Grant
- 1995-01-31 BR BR9506666A patent/BR9506666A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-01-31 AT AT95907080T patent/ATE254178T1/de active
- 1995-01-31 PT PT95907080T patent/PT742829E/pt unknown
- 1995-01-31 CA CA002182315A patent/CA2182315C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 SK SK996-96A patent/SK99696A3/sk unknown
- 1995-01-31 HU HU9602084A patent/HU222982B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 KR KR1019960704245A patent/KR100392916B1/ko active IP Right Grant
- 1995-01-31 DK DK95907080T patent/DK0742829T3/da active
- 1995-01-31 ES ES95907080T patent/ES2210283T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 JP JP51995795A patent/JP3731004B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 CZ CZ962182A patent/CZ285867B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 NZ NZ278930A patent/NZ278930A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 PL PL95315670A patent/PL180091B1/pl unknown
-
1996
- 1996-07-30 FI FI963016A patent/FI119476B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100392916B1 (ko) | 2003-10-22 |
| PT742829E (pt) | 2004-04-30 |
| JPH09508276A (ja) | 1997-08-26 |
| BR9506666A (pt) | 1997-09-09 |
| CZ218296A3 (en) | 1996-10-16 |
| AU701384B2 (en) | 1999-01-28 |
| EP0742829B1 (en) | 2003-11-12 |
| GB9401795D0 (en) | 1994-03-23 |
| FI963016A0 (fi) | 1996-07-30 |
| JP3731004B2 (ja) | 2006-01-05 |
| FI119476B (fi) | 2008-11-28 |
| HU222982B1 (hu) | 2004-01-28 |
| AU1541595A (en) | 1995-08-15 |
| KR970700770A (ko) | 1997-02-12 |
| CA2182315A1 (en) | 1995-08-03 |
| FI963016A (fi) | 1996-09-25 |
| HUT75734A (en) | 1997-05-28 |
| DE69532109D1 (de) | 2003-12-18 |
| WO1995020665A1 (en) | 1995-08-03 |
| PL180091B1 (pl) | 2000-12-29 |
| ATE254178T1 (de) | 2003-11-15 |
| ES2210283T3 (es) | 2004-07-01 |
| SK99696A3 (en) | 1997-01-08 |
| DK0742829T3 (da) | 2004-03-22 |
| CA2182315C (en) | 2005-11-15 |
| PL315670A1 (en) | 1996-11-25 |
| DE69532109T2 (de) | 2004-08-26 |
| EP0742829A1 (en) | 1996-11-20 |
| NZ278930A (en) | 1998-07-28 |
| HU9602084D0 (en) | 1996-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6680182B1 (en) | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria | |
| KR101911114B1 (ko) | 폴리펩티드 | |
| US11649561B2 (en) | Molecular display system | |
| CN100475964C (zh) | Hcv复制子穿梭载体 | |
| DK2385119T3 (en) | Analysis for the detection of the viral load of respiratory syncytial virus (RSV) | |
| KR102055215B1 (ko) | 돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법 | |
| CN1989242A (zh) | P19表达单元 | |
| CN1989243A (zh) | P180表达单元 | |
| CN110734480B (zh) | 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用 | |
| AU701384B2 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htrA-promoters | |
| CN1989257A (zh) | 谷氨酸棒杆菌的p1－34表达单元 | |
| AU609183B2 (en) | Antimalaria vaccines | |
| WO1995020665A9 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
| KR20070034634A (ko) | Ｐ２-１０ 발현 유닛 | |
| CN113355288B (zh) | 一种治疗covid-19的通用型嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用 | |
| CN1984991A (zh) | P1－35表达单元 | |
| MXPA96003097A (es) | Vacunas | |
| CN1153531A (zh) | 用htra启动子在减毒细菌中表达异源蛋白 | |
| KR20230138781A (ko) | 암괴사인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬 바이러스 벡터 기반의 대장암 치료용 암용해성 바이러스 및 이를 이용한 대장암 치료 조성물 | |
| CN111518833B (zh) | 一种携带aim2基因的溶瘤腺病毒的构建方法及应用 | |
| CN114901812A (zh) | 使用环状dna将抗原特异性受体基因导入至t细胞基因组的方法 | |
| KR20070032077A (ko) | 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함하는 ｐ１－３４ 발현유닛 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140131 |