KR20230138781A - 암괴사인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬 바이러스 벡터 기반의 대장암 치료용 암용해성 바이러스 및 이를 이용한 대장암 치료 조성물 - Google Patents

암괴사인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬 바이러스 벡터 기반의 대장암 치료용 암용해성 바이러스 및 이를 이용한 대장암 치료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암 치료용 재조합 NDV 바이러스와 LVP-K1-TRAIL 바이러스 및 이를 포함한 대장암 치료용 조성물에 관한 것으로 본 발명의 인간 TRAIL 단백질 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스로서 대장암 세포에 감염되어 정상적인 TRAIL 단백질을 발현하여 대장암 세포사멸 또는 대장암 조직 축소를 통해 임상 증상 감소 도는 부분 관해 도는 완전 관해를 유도할 수 있는 치료용 바이러스 제제이다.

Description

암괴사인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬 바이러스 벡터 기반의 대장암 치료용 암용해성 바이러스 및 이를 이용한 대장암 치료 조성물{Oncolytic virus for colorectal cancer treatment based on a recombinant newcastle virus vector containing a TRAIL gene and colorectal cancer treatment composition using the same}
본 발명은 암괴사인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 벡터 기반의 대장암 치료용 암용해성 바이러스(oncolytic virus) 및 이를 이용한 대장암 치료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 대장암 세포 감염성을 갖는 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 기반으로 하여 대장암 조직의 증식 억제 및 암세포 사멸 효과를 가지는 암조직괴사 인자 관련 세포자살 유도 리간드 유전자를 함유한 재조합 뉴캐슬바이러스를 제작하고 이를 통한 암치료 및 암 진행 억제를 위한 바이러스 치료제이다.
직장암이란 직장에 생긴 암세포로 이루어진 악성종양을 말한다. 직장은 대장의 마지막 부분으로 길이는 약 12~15 cm이고 항문으로 이어진다. 대장은 점막층, 점막하층, 근육층, 그리고 장막층으로 나뉘어져 있다. 보통 직장암은 장의 점막에서 선암으로 시작되는 경우가 많다.
직장암의 원인은 여러 가지 복합적으로 발생한다. 유전적인 취약성, 정상 대장 점막의 세포에서 변성이 일어나 대장에 용종이 발생하고 이것이 점차 악성화하여 그 일부에 암세포가 발생하게 된다. 더 진행되면 침윤성 암이 되고, 점차 대장 이외의 다른 장기로 암이 퍼지게 되는 전이성 암으로 발달하게 된다.
위험인자는 가족력, 과거력, 염증성 장 질환 환자 특히 궤양성 대장염 및 크론병 환자에게서 높으며, 육류 섭취가 많고 섬유질 섭취가 적은 사람이 취약하다. 그리고 대부분의 암은 2-30대보다 중년 이후에 50세 이상부터 발생률이 크게 증가한다. 또한, 한번 발생한 사람이라면 대장 점막에 암 발생의 소지가 정상인보다 높을 가능성이 있으므로 재발의 가능성이 높다. 증상으로는 대표적으로 배변의 변화가 크다. 변비나 설사, 변실금 등으로 나타나며 직장에 출혈이 있는 경우는 혈변을 보기도 하고 통증으로 인해 복부의 불편감을 느끼기도 한다. 이유 없이 체중이 감소하기도 한다. 보통 대부분의 사람들이 초기에는 증상을 잘 느끼지 못한다. 초기의 대장암은 형태에 따라 65~92%로 5년 생존율이 높은 편이지만, 암이 전이된 이후에는 13%로 떨어진다.
직장암은 발생률 측면에서 네 번째로 흔한 암 유형이며 세계에서 암 관련 사망의 세 번째 원인이다. 다른 종양과 마찬가지로 특정 돌연변이 TP53, KRAS, APC 및 CDKN2A 와 같은 여러 종양 유전자 및 종양 억제 유전자가 연관이 있다. 유전자 돌연변이는 다양한 유형의 악성종양 치료법을 선택에 중요한 사항이다. 유전자 돌연변이 비율은 KRAS, KIT, PIK3CA, MET 및 EGFR의 조직 돌연변이 비율은 각각 52.1, 19.7, 29.9, 15.4 및 14.5%이며, TP53, APC, CDKN2A, STK11 및 FBXW7의 돌연변이 비율은 각각 65.8, 39.3, 32.5, 19.7 및 19.7%이다.
암의 진행 정도에 따라 치료법이 다르지만 크게 수술, 항암 화학요법과 방사선 치료로 나뉜다. 종양의 크기가 작은 경우에는 간단하게 대장내시경을 하는 도중에 절제가 가능하다. 외과적 수술로는 종양으로부터 충분한 거기를 둔 다음에 절제하며 림프 경로도 함께 포함하게 광범위하게 절제한다. 화학요법은 5-플루오로우라실(5-FU)을 사용하거나 옥살리플라틴, 이리노테칸을 사용한다. 방사선 치료는 대개 항암 화학요법과 함께 시행되며 수술 후의 재발 위험성을 줄이고 수술 전 종양 크기를 줄이기 위해 비교적 많은 양의 방사선을 암세포에 조사하게 된다. 조기에 사용하는 경우는 드물지만 림프절에 전이된 경우라면 대부분 시행하게 된다. 재발 가능성이 높은 2기 및 3기의 대장암의 방사선 치료는 진행성 직장암에서 2 기암 및 3 기암의 수술 전후 보조적 치료 요법으로 이용되며 국소 재발률을 감소시키는 효과를 가져온다. 또한, 직장암의 위치에 따라 항문을 보존하기 힘든 경우에 수술전 방사선 치료로 종양의 크기를 줄이기 위해 이용되기도 한다. 방사선 치료는 방사선을 주사한 곳에 한하여 효과를 볼 수 있으며 중요한 점은 암이 전이되는 것을 막을 수 없다는 점이다.
한편, 암세포사멸을 유도하는 유전자를 탑재한 바이러스를 이용하여 암치료용 바이러스의 개발이 활발히 진행되고 있다. 암 발생에 관련된 다양한 유전자 이상이 확인되고 또 암세포사멸에 관련된 유전자가 밝혀지면서 이러한 유전자를 이용한 암용해성 바이러스(Oncolytic virus)가 지속적으로 개발되고 있다. Oncolytic virus는 암억제 유전자, 세포자살 유도 유전자 그리고 암세포에 대한 면역반응을 촉진하는 유전자 등을 함유하고 있다. 이러한 유전자 외에도 바이러스 자체가 암용해성을 갖는 경우도 있다. 대표적인 내재적 암용해성 바이러스가 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease Virus, NDV)이다.
NDV는 Paramyxoviridae 과에 속하는 전염성이 높은 조류 병원체이다. 다른 paramyxovirus 와 유사하게 15,186개의 nucleotide를 가진 (-)sense single strand RNA이다. 약 100~300 nm의 지질 이중층을 코팅하는 RNA 바이러스로 대부분 구형의 형태를 갖추고 있다. NDV 유전자는 nucleoprotein(NP), phosphoprotein(P), matrix protein(M), fusion protein(F), hemagglutinin-neuraminidase protein(HN) 그리고 large protein(L) 6개의 구조 유전자(structural gene)를 가지고 있다. HN과 F는 바이러스 외막에 있으며 수용체 결합과 막 융합을 매개하여 세포로 진입하는데 중요한 역할을 한다. M 단백질은 바이러스 막의 내부 소엽 아래에서 내부 단백질 층을 형성하고 바이러스 조립 및 발아에 필수적인 역할을 한다. NP, P, 및 L 단백질은 바이러스 RNA와 결합하고 리보핵 단백질 복합체(RNP)를 형성하고 바이러스의 genome 복제에 관여한다. P 유전자가 전사되는 동안 2개의 비구조 단백질인 V 및 W가 전사된다. V 단백질은 STAT 신호전달을 방해하고 인터페론 자극 유전자 발현을 방지하여 NDV의 인터페론 반응을 회피할 수 있는 능력을 부여한다.
바이러스에 감염된 세포를 제거하기 위해 숙주 세포에서는 방어 메커니즘으로 세포사멸(apoptosis)을 일으킨다. Apoptosis는 막 수포, 염색질 응축, genome DNA 절편 분해 및 apoptotic body 형성 등의 형태학적 특징을 가지는 세포사멸 프로그램을 말한다. 외인성 apoptosis 및 내인성 apoptosis의 두가지 경로를 활성화하여 유발된다. 외인성 apoptosis는 세포 표면 수용체(FAS, TNFR, Death receptor 4 또는 5)에 사멸을 일으키는 리간드인 FAS 리간드, TNF-α 또는 TRAIL의 결합에 의해 유발된다. TNF-α가 TNFR1에 결합하여 TNFR1의 삼량체화 및 TRADD의 동원을 유도한 이후 FASS, TRAF2 및 RIP1을 포함하는 신호전달 복합체를 조립하는 것이다. 이 신호전달 복합체는 신호를 다운스트림으로 전달하며 전사인자인 NF-κB를 활성화하게 된다.
한편, TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)는 I형 및 II형 인터페론에 의해 활성화하게 되며 T 세포, 호중구, 수지상 세포, 형질 세포양 수지상 세포, 선천 림프구, NK 및 NK T 세포를 비롯한 다양한 면역세포에 의해 일반적으로 발현된다. TRAIL은 C-말단 TNF 상동성 도메인(THD)이 막횡단 도메인 및 세포내 도메인의 stalk 영역에 의해 연결된 281개 아미노산의 타입 II transmembrane 단백질로서 유전자 서열 확인을 통해 CD95L extracellular domain과 28% 상동성을 가지며 TNF와 23% 유전적 상동성을 가진다. TNF 상동성 도메인(THD)은 리간드 삼량체화 및 수용체 결합을 담당한다. Stalk 영역은 단량체 TRAIL(monomer TRAIL)의 단백질 분해 방출을 위한 cleavage site를 포함한다. 즉, extracellular carboxy-terminal 부분이 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 세포 표면의 수용체(receptor)와 vesicle의 형태로 결합 또는 용해성 형태로 작용한다. 다른 대부분의 TNF family members와 같이 TRAIL 단백질의 monomer 세 개가 모여 C-terminal 부분이 homotrimer(trimeric TRAIL)로 결합한다. 아연(Zn) 원자가 각각의 monomer의 cysteine과 결합하여 trimer 형성과 안정성에 매우 중요한 역할을 하며 최적의 생물학적 역할에도 중요한 역할을 한다. 생물학적 기능 연구에 의해 정상 세포에서는 작용하지 않으나 TRAIL은 다양한 암세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 암세포사멸 기전을 이용한 암 치료용 의약품 응용연구가 활발히 이루어지게 된다. 다른 TNF family member와는 다르게 TRAIL의 발현은 매우 정교하게 이루어지며 간혹 활성화된 세포에서 일시적으로 발현되기도 한다. TRAIL mRNA는 대부분 조직에서 일정하게 발현되는 것으로 알려져 있으며 가장 주요한 생물학적 기능은 세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있으나 아직 완벽한 생리학적 역할에 대해서는 완벽하게 이해되지는 않았다. 간의 NK 세포에서 TRAIL 발현은 NK 세포에서 생성되는 IFN-γ에 의해 유도되는 것으로 마치 autocrine 방식과 같다. TRAIL 유전자 knock out 마우스 실험 결과를 통해 TRAIL 단백질은 면역세포 감식에 의한 항암 효과에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
TRAIL에 의해 유도되는 apoptosis는 이에 상응하는 TNF 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) receptors와의 상호작용에 의해 유도된다. 최근까지 TRAIL에 대한 네 개의 homologous human receptors가 확인되었다. 지금까지 밝혀진 receptor는 DR4, KILLER/DR5, TRID/DcR1/TRAIL-R3 그리고 TRAIL-R4/DcR2 이다. 이외에도 다섯 번째 receptor로 불리는 osteoprotegerin(OPG)가 있다. 사멸수용체(Death Receptor)로 알려진 DR4 및 DR5는 공통의 보존된 death domain(DD) motif를 가지고 있으며 이 receptor를 매개로하여 apoptosis 신호를 전달한다. 나머지 3종류의 receptor는 TRAIL에 유도된 apoptosis가 과도하게 유도되는 경우 TRAIL의 작용을 방해하는 미끼같은 역할을 한다. 미끼 receptor(Decoy receptor) 1(DcR1)과 DcR2 는 DR4 및 DR5와 유사한 extracellular domain을 가지고 있다.
포유류 세포에서 apoptosis 자살이 시작되는 내재적 경로와 외재적 경로, 두 개의 신호전달 경로가 알려져 있다. 외재적 경로는 TRAIL 단백질이 DR4, DR5와 결합하면서 apoptosis를 유발시킨다. 결합을 통해 삼중체 DD는 death-inducing signaling complex(DISC)를 형성하며 adaptor molecule인 FADD, 그리고 순차적으로 caspase-8과-10을 활성화시킨다. 활성화된 caspase-8과-10 그리고 절단된 caspase-3가 세포사멸을 최종 유도한다. 내재적 경로에 의한 apoptosis의 작용은 DNA 손상, 세포주기 점검에 의한 결함, 유사분열 저산소증(mitotic catastroph hypoxia) 그리고 세포 생존에 필요한 factor 손실과 다양한 형태의 세포 스트레스에 대한 반응으로 시작된다. 내재적 경로에 Bcl2 유전자 superfamily의 proapoptotic arm의 활성화가 관련되어 있다. Bcl2의 활성화는 미토콘드리아에서 apoptogenic factors(cytochrome c, SMAC/DIABLO)의 방출을 일으키고 방출된 cytochrome c는 adaptor APAF-1과 결합하여 ‘apoptosome’을 형성한다. 이후 apoptosis-initiating protease caspase-9 활성화되어 caspase-3, -6, and -7을 순차적으로 활성화하며 SMAC/DIABLO는 apoptosis 저해물질과 결합하여 apoptosis 저해를 방지한다. TRAIL 단백질에 의한 외재적 경로에 의한 세포자살 유도 기능은 재조합 TRAIL 단백질을 이용한 암세포 투여 또는 암조직 모델 동물 투여를 통해 암세포사멸을 유도하는 것이 여러 연구를 통해 밝혀져 있다. 그러나 단백질을 이용한 치료 방법은 용량과 안정성 그리고 일부 외래 유래 TRAIL 단백질에 저항성(또는 비반응성)을 보이는 경우도 있어 최근 TRAIL 유전자를 직접 도입하여 암세포사멸에 이용하는 연구가 진행되고 있다.
NDV는 포유동물 세포의 종양세포에 특이적으로 감염되어 apoptosis를 유도하여 종양세포 사멸을 유도한다. 이때 외인성 및 내인성 apoptosis를 모두 유도하여 미토콘드리아 막 전위의 손실, cytochome c 방출, 및 caspase 9의 활성화를 유발하는 것으로 알려져있다. 또한, NDV 균주에 감염된 세포에 의해 TNF-α도 분비되며 세포의 표면에 TRAIL 단백질도 발현된다. NF-κB 경로의 활성화와 TNF-α 및 TRAIL의 상향 조절을 통해 외인성 세포사멸 경로를 유도한다. Caspase-8이 활성화되어 D324에서 전장 RIP1을 RIP1-N 및 RIP1-C로 절단하여 apoptosis를 촉진한다. Bid와 RIP1을 절단하여 apoptosis를 유도한다. 최적의 apoptosis를 유도하기 위해서는 바이러스 진입, 복제, 및 바이러스 단백질 합성이 필요하다.
또한, NDV는 포유동물의 체액성 면역(humoral immune response)을 유발하지 않는다. NDV가 포유류에 감염되었을 때 포유류 세포는 즉각적으로 세포 내 IFN-α를 합성하여 감염된 NDV의 게놈 RNA를 파괴한다. 따라서 정상적인 포유류 세포에서 NDV는 증식할 수 없고 체액성 면역을 유발하지도 않는다. 이러한 NDV의 특징은 포유류에 유전자 전달체나 암용해 바이러스로 이용되었을 경우 면역반응에 의한 효능 감소나 부작용이 없는 장점이 있다. 또 다른 NDV의 장점은 NDV 바이러스 감염에 암세포 내에서의 복제나 전달된 유전자의 발현이 모두 감염된 숙주세포의 세포질에서 일어나기 때문에 유전적으로 DNA 바이러스에 비해 안전하다.
1950년대 강독성(velogenic) NDV 바이러스 주를 이용한 암세포 사멸 효과를 시험하였으며 특정 경우에는 암환자를 대상으로 한 임상시험도 진행되었다. 여러 연구와 임상시험을 통해 NDV를 이용한 암 치료가 전망이 좋을 것이라는 여러 증거가 확보되었으며 NDV는 정상적인 포유류 세포에는 감염되지 않을 뿐만 아니라 반복되는 NDV 접종에 의한 부작용 없이 암세포사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과가 유지되며, 임상시험에서도 5년간 NDV 바이러스 접종으로 암환자가 5년 이상 생존한 경우도 있었다. 그러나 강독성 NDV는 닭에 감염되는 치명적인 바이러스로서 양계 산업에 매우 위험한 바이러스로 강독성 바이러스로 암 치료제 개발에 한계가 발생하였다.
2000년대 과학자들은 중간독(mesogenic) NDV 바이러스를 이용한 oncolytic virus 개발을 시작하였다. 그러나 중간독 NDV 바이러스는 병원성이 줄어든 만큼 암세포사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과 등에서 강독주 NDV에 비해 효능이 떨어지는 것으로 확인되었다. 낮은 효능을 보이는 가장 큰 이유는 중간독 NDV 바이러스가 용원성(lysogenic) 바이러스와 같은 성격을 가지며 감염된 암세포에서 다른 암세포로 다시 재감염이 쉽게 일어나지 못하는 단점이 있기 때문이다.
2000년대 이르러 중병원성(mesogenic) 또는 비병원성(lentogenic) NDV 주의 cDNA clone을 이용한 재조합 NDV를 제작하여 암용해성 바이러스나 암백신 개발에 이용하고자 하는 노력이 시작되었다. 효능을 높이기 위한 방법으로 싸이토카인 유전자(cytokine gene), 암억제 유전자(cancer suppressor gene) 그리고 세포자살 유전자(apoptosis gene)을 cDNA에 삽입하여 암세포 내에서 단백질 발현을 유도암세포 치료 효과가 향상된 재조합 NDV를 제작하는 것이다.
따라서 본 발명에서는 암세포 apoptosis를 유도하는 TRAIL 유전자를 도입하여 대장암 치료에 사용할 수 있는 NDV 기반 ocolytic 바이러스를 제조 및 이를 이용한 암 치료 효능 평가를 통해 대장암 치료용 바이러스 제제를 개발하는 것이다.
10-2016-0179997
본 발명의 목적은 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터에 세포 사멸(apoptosis) 관련 TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) 유전자가 도입된 LVP-K1-TRAIL 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 LVP-K1-TRAIL 벡터를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 포함하는 대장암 치료용 약품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장암 치료 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 개체에 투여하는 단계; 및 개체의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 TRAIL 유전자를 포함하며 이를 암세포 내에서 단백질로 발현 할 수 있는 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 LVP-K1-TRAIL 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LVP-K1-TRAIL 벡터는 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 포함하고, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(Gene end(GE), Intergenic sequence(IG), Gene start(GS), Kozak 서열 및 MCS(multicloning site)로 이루어진 것인, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 외래유전자 삽입용 벡터로 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LVP-K1-TRAIL 벡터는 TRAIL 유전자가 서열번호 2로 표시되는 LVP-K1 벡터의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 도입된 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이어서, 본 발명은 상기 LVP-K1-TRAIL 벡터를 도입한 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
더불어, 본 발명은 상기 치료용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계; 및 개체의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법을 제공한다.
암세포 자살을 유도하는 TRAIL 유전자를 도입한 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)를 이용하여 대장암 치료를 위한 LVP-K1-TRAIL oncolytic virus를 개발하여 안전하고 효능이 뛰어난 대장암 치료제 개발에 기여하고 대장암으로 인한 환자의 치료와 대장암 악화를 막아 대장암 치료에 기여하는 효과를 가져올 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, NDV VG/GA 게놈 내로 transgene cassette를 삽입한 유전자 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, LVP-K1-TRAIL 벡터의 유전자 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 재조합 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 회수를 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, LVP-K1-TRAIL 바이러스 작출 후 바이러스의 확인, TRAIL 유전자 확인 및 벡시니아 바이러스의 제거 확인을 위한 RT-PCR 산물을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, Vero 세포에서의 바이러스의 성장동역학(kinetics)를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, LVP-K1-TRAIL 바이러스가 감염된 대장암세포(HCT116)의 사멸도를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, LVP-K1-TRAIL 바이러스가 감염된 대장암세포(HCT116)의 세포 병변 효과(cytopathic effect, CPE)를 현미경을 통해 관찰한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 대장암세포(HCT116)에 바이러스를 감염 후 생성된 TRAIL 단백질의 발현 수준 비교를 보여주는 Western Blotting을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 대장암 이종이식 마우스 모델에서의 종양 성장 억제를 나타낸 도이다(LVP-K1-TRAIL 바이러스를 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 나타낸 종양 성장곡선(9a), 마우스 사진(9b), 마우스 종양 사진(9c), 및 조직병리학적 분석을 위한 H&E 염색 사진(9d)).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 이로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여보다 상세하게 설명하도록 한다.
외래유전자 발현을 통한 재조합 oncolytic virus로서 사용될 수 있는 바이러스로서는 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 벡시니아 바이러스(Vaccinia virus), 아데노노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno associated virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 폭스바이러스(Poxvirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 알파바이러스(Alphavirus) 등이 있을 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다. 외래유전자 도입을 통해 단백질을 발현할 수 있고, 높은 안정성, 높은 발현 능력 및 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 바이러스이면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 바람직하게는 피막 바이러스(enveloped virus)로서 유전자 전달뿐만 아니라 바이러스 표면에 단백질 발현이 용이한 벡시니아 바이러스, 폭스바이러스(Poxvirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 알파바이러스(alphavirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)가 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 인체 감염성이 없는 안전한 바이러스이며 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)일 수 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 닭에게 감염되어 신경 증상 및 호흡기 증상 등을 일으키는 법정 전염병으로 닭에게는 매우 치명적인 바이러스로 이러한 병원성에 따라 강병원성(velogenic), 약병원성(mesogenic), 비병원성(lentogenic)으로 나뉘며, 모두 외래 유전자 전달 바이러스 벡터 제조에 모두 사용이 가능하나 바람직하게는 약병원성, 비병원성 바이러스가 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 비병원성 바이러스 주를 이용한 재조합 바이러스가 될 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
또한, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(Gene end(GE), Intergenic sequence(IG), Gene start(GS)) 및 MCS(multicloning site)로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)"는 약 15kb 정도 (-)sense RNA 게놈을 가지고 있는 paramyxovirus에 속하며 인체감염성 없는 포유류에 안전한 바이러스로 알려져 있다. NDV 게놈 RNA는 30 base 정도의 extragenic leader 서열을 가지고 있으며 50 base 정도의 tail 서열을 가지고 있다. 양쪽 말단의 두 서열은 바이러스 유전자의 전사(transcription)와 복제 replication) 그리고 새롭게 합성된 RNA 게놈을 바이러스 파티클 안에 봉입(encapsidation) 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. NDV 유전자 구성은 양쪽 말단 리더와 꼬리 유전자 사이에 NP, P, M, F, HN 및 L을 포함하는 6개의 유전자로 구성되어 있으며 각각의 유전자는 nucleoprotein(NP), phosphoprotein(P), matrix protein(M), fusion protein(F), hemagglutinin-neuraminidase protein(HN), large protein(L)을 암호화하고 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 각각의 유전자 사이에 IGS(GE-IG-GS) 서열이 존재하고 있으며 숙주세포 감염 초기 각각의 유전자는 전사과정을 거쳐 숙주세포의 소포체(endoplasmic reticulum, ER)으로 이동 단백질을 합성하게 된다. 이후 M protein 합성량이 일정 수준 이상으로 올라가게 되면 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 하여 (-)sense RNA 게놈을 합성하게 된다. 완성된 바이러스 파티클은 세포 밖으로 배출되게 된다.
상기 뉴캐슬병 바이러스의 외부 유전자 도입 능력은 최대 6 kb 정도인 것으로 알려져 있으며 외래유전자 도입은 주로 P과 M 유전자 사이 그리고 HN과 L 유전자 사이에 이루어져 왔다. 다만 6개의 유전자 사이에 외래유전자 도입이 모두 가능한 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 mRNA 발현, 단백질 발현 그리고 심한 경우 바이러스 증식에도 영향이 있는 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 정량적인 비교 시험은 이루어지지 않은 상태이다. 각각의 유전자 사이에는 GE-IG-GS 유전자가 있으며 특히 IG 유전자의 경우 NP-P, P-M, M-F 사이에는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 가지고 있으며 F-HN 사이는 35개, HN-L 사이는 47개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 바이러스 감염 후 (-)sense RNA 게놈은 NDV가 보유하고 있는 NP, P, 및 L 단백질에 의해 감염 초기 각 단백질의 mRNA를 합성하여 합성된 mRNA가 숙주 세포의 소포체로 이동하여 각 유전자의 단백질을 합성하게 된다. 이후 NP, P, L 단백과 M 단백의 상호작용에 의해 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 많은 copy의 (-)sense RNA 게놈을 합성하고 숙주세포 밖으로 방출되게 된다. 최초 감염시 자가 단백질 생산을 위한 mRNA의 합성량은 N 말단, 즉 NP mRNA가 가장 많이 합성되고 이후 N 말단으로부터 멀어질수록 mRNA 합성은 줄어드는 것으로 알려져 있다.
뉴캐슬병 바이러스의 cDNA 구축에는 NDV (-)sense RNA 게놈을 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)법을 통해 여러 조각의 double strand DNA로 만든 이후 각각의 조각을 다시 ligation 하여 전체 NDV의 cDNA clone을 만드는 방법이 사용되고 있다. 이 방법을 이용한 cDNA 작성은 reverse transcriptase의 특성상 point mutation이 일어날 가능성이 높아 cDNA를 다 작성한 이후에 sequencing을 통해 15 kb에 달하는 유전자 서열을 확인하고 하나 이상의 point mutation 이 발생하면 다시 NDV 게놈으로부터 cDNA를 만드는 과정을 반복해야 한다. cDNA 조각을 pBR322 벡터에 삽입하여 recombinant NDV를 구축한다.
또한, 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 통해 항원 단백질이 발현 또는 작동할 수 있도록 외래 유전자 삽입 가능한 위치에 쉽게 외래유전자를 도입할 수 있도록 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 만들어 삽입하였다. 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 외래 유전자 삽입위치 N말단 앞쪽에 GE-IG-GS sequence 및 multi cloning site(MCS)로 구성되어 있으며, 다양한 제한효소(restriction enzyme) 서열과 함께 rule of six에 맞춰 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이, HN 및 L 유전자 사이에 삽입하여 제작할 수 있다. 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이에 삽입하는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 완벽하게 만들어진 recombinant NDV에 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 각 유전자 사이에 넣고 4조각의 DNA로 나누어 각각의 NDV 조각 유전자를 pBR322 plasmid DNA에 라이게이션(ligation) 후 TOP10 E.coli 에 형질전환(transformation)하여 4종의 재조합 균주로 제작 보관한 후 새로운 유전자 도입 시 각 재조합 E. coli 균주로부터 유전자를 분리하고 본 유전자를 PCR을 이용하여 fragment를 획득한 후 overlap cloning 방법을 통해 재조합 NDV 바이러스를 제작하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기와 같은 방법으로 제작된 벡터는 매번 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 만드는 과정 중에 발생하는 point mutation을 막아주며 multiple cloning site(MCS)를 통해 쉽게 외래유전자를 NDV cDNA에 삽입할 수 있다는 특징이 있다.
암세포 사멸 유도 도는 면역반응 유도 그리고 증식 억제에 관련된 유전자를 이용한 Oncolytic virus가 개발되고 있다. 암세포의 유전적 이상에 대한 연구 자료를 바탕으로 하여 mutation이 일어난 유전자의 기능을 회복시키기도 하며 또는 암세포 자살을 유도하는 유전자를 삽입하여 암세포 사멸을 유도하기도 한다. 또한, 암세포 특이적 면역 반응을 촉진하기 위하여 면역 관련 싸이토카인 유전자를 도입하기도 한다. 또한, 위에 언급한 방법의 특정 조합을 통해서도 보다 나은 치료 효과를 기대할 수 있는 oncolytic virus 개발이 이루어질 수 있다. 본 발명에서 LVP-K1 바이러스 벡터에 삽입 될 수 있는 다양한 암치료용 유전자는 GM-CSF, IL2, IL6, IL12, TNF-α, TNF-β, Interferon-γ 등 다양한 면역반응 관련 유전자일 수 있고 또한 면역 반응을 이용한 항암 효과를 보여 줄 수 있는 다양한 면역세포들 Th1 cell, cytotoxic T lymphocytes, NK Cell, MART 1, Th2 effector 기능을 촉진 시키는 면역 호르몬, fas ligand, Natural killer, 면역반응 촉진을 위한 MHC(Major histocompatibility complex), Antigen presenting cell과 Dendritic 세포 활성화 관련 호르몬, CD40 ligand, Type 1 helper T Lymphokine 활성화 또는 유도 단백질 등 다양한 유전자 또는 유전자로 유도되는 단백질 유전자 일 수 있다. 또한, 위에 서술된 유전자 외에도 추가적으로 밝혀지는 항암효과 면역 관련 유전자도 삽입 가능한 유전자 일 수 있다. 대표적인 암세포 자살 유도 유전자로는 p53, PTEN, TRAIL, TNF-α, Caspase 등이 LVP-K1 벡터에 삽입 가능한 유전자이다. 또한, 세포 자살을 유도하는 다양한 세포 내 signal transduction에 관련된 유전자 또는 단백질 등의 유전자도 삽입 가능한 유전자 일 수 있으며 추가적으로 밝혀질 세포 자살 유도에 관련된 단백질 유전자 또는 유전자가 삽입 가능한 유전자 일 수 있다. 세번째로 발암성 유전자의 발현 저해 또는 발암성 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 삽입할 수 있다. 대표적인 암 유발 유전자로는 epidermal growth factor receptor(EGFR), platelet-derived growth factor receptor(PDGFR), vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR), HER2, Src-family, Syk-ZAP-70 family, BTK family of tyrosine kinases, Abl gene in CML, Raf kinase, cyclin-dependent kinases, Ras protein, myc gene 등이 알려져 있으며 이에 대한 상보적인 RNA나 각 단백질 특이적 결합 단백질의 유전자를 도입할 수 있다.
위에 언급된 항암 효과에 관련된 유전자 또는 단백질은 유전자 형태 또는 단백질 형태로 LVP-K1에 함유될 수 있으며 또는 바이러스 표면에 anchoring 된 형태 또는 세포질 외부로 방출되는 형태를 취할 수 있다.
본 연구에서 사용 가능한 대장암 치료용 oncolytic virus인 LVP-K1에 삽입할 수 있는 유전자는 TRAIL, p53, PTEN, GM-CSF, IL6 등 다양한 유전자를 사용할 수 있다. 바람직하게는 TRAIL과 p53 유전자 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TRAIL 유전자 일 수 있을 것이다. TRAIL 재조합 단백질을 이용한 다양한 암세포에 대한 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 암세포 사멸 및 암조직 성장 저해 및 암조직 파괴 효과가 있으며 동물 인체에도 부작용이 없는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 human TRAIL 유전자의 아미노산 서열 340에서 846까지의 유전자를 도입하여 LVP-K1-TRAIL 벡터를 제작하였다. TRAIL 유전자 삽입 위치는 NP와 P유전자 사이, P와 M 유전자 사이, M과 F 유전자 사이, F와 HN 유전자 사이 그리고 HN과 L 유전자 사이가 될 수 있다. 바람직하게는 NP와 P 유전자 사이 그리고 P와 M 유전자 사이가 될 것이다. 가장 바람직하게는 NP와 P 유전자 사이가 유전자 삽입 위치가 될 것이다.
상기 TRAIL 유전자를 발현하는 트랜스진 카세트(transgene cassette)와 MCS 그리고 NDV 바이러스주의 NP, P 유전자는 TRAIL 단백질 유전자가 대장암 세포에 재조합 NDV를 통해 전달되어 정상적인 단백질로 발현 암세포 증식 억제, 사멸 효과 등을 발휘하는데 고안된 유전자 또는 유전자 조합이다. 따라서 NP 단백질로부터 트랜스진 카세트(transgene cassette), TRAIL 유전자 그리고 P 유전자까지의 전체적인 조합은 기능적으로 TRAIL 단백질 유전자의 전달 발현 기능적 활성에 최적의 염기서열을 제공한다. 이와 동일한 기능적 활성을 가지고 있는 다양한 염기서열이 가능할 것이며 바람직하게는 70% 이상의 동일한 염기서열일 것이다. 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일한 염기서열일 것이며 가장 바람직하게는 90% 이상의 기능적 활성을 가지는 염기서열일 것이다. 또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 LVP-K1-TRAIL 벡터가 도입된 바이러스(수탁번호 KCTC14543BP)일 수 있으며, 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 "기능적 동등한 물질"이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 정제된 항원을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 치료제 조성물은 상술한 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 치료용 조성물은 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)는 암세포 면역 면역반응의 유도에 의한 치료 효과에 도움을 줄 수 있는 물질이 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 NDV 바이러스 LVP-K1-TRAIL 대장암 치료용 바이러스는 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액체 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 체내 흡수가 용이한 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액체 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료용 바이러스에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
바이러스 안정성 및 치료제로서의 안전성을 필요한 기술 분야는 당업자에게 공지되어 있으며 단백질, 당 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자 등이 사용될 수 있다. 추가될 수 있는 조성물로는 안정제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 투여경로에 따라 바이러스는 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 치료용 바이러스는 암조직에 직접 주사하거나 경구, 근육, 피하, 정맥 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 정맥 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 "개체"는 질병의 치료 및 증상의 완화에 대한 조절 또는 치료 방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 대장암 세포의 증식 억제 또는 사멸 그리고 대장암 조직의 감소 증가 지연 등의 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 대장암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
나아가, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 LVP-K1-TRAIL 바이러스는 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. TRAIL 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열번호 1(LVP-K1-TRAIL)를 제작 완료한 후 3종의 helper plasmid(NP, P, L), modified vaccina virus(MVA/T7)를 HEp-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipofectamine 3,000을 이용한 transfection을 실시하였으며 세포주는 HEp-2 세포을 이용하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제한 후 적절한 세포주로 선정된 vero 세포에서 배양하여 실험에 사용하였다. 상기 재조합 바이러스주 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 TRAIL 단백질 발현 확인을 위한 방법은 Reverse transcription polymerase chain reaction 법을 이용하여 TRAIL 단백질의 유전자 안정성과 mRNA 발현 및 Western blotting을 이용하여 TRAIL 단백 발현을 확인하였으며 Western blot을 수행하기 이전에 바이러스 정제를 수행하였다.
재조합 바이러스 배양액을 harvest 후 원심분리하여 clarification을 진행한다. Clarification은 원심분리나 micro filtration 방법을 사용할 수 있다. 원심분리 조건은 10,000 g, 4 ℃ 조건에서 10분 동안 실행하여 supernatant를 다음 정제과정에 사용할 수 있다. Micro filtration의 경우 filter의 pore size는 1.0 ㎛ 에서 0.2 ㎛ 사이의 filter를 사용할 수 있으며 바람직하게는 0.45 ㎛ pore size filter를 사용할 수 있다. Filtration 방법은 dead end filtration이나 cross flow filtration 방법을 사용할 수 있으며 두 방법 모두 적용이 가능하다. 재조합 바이러스 정제는 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다. 통상적으로 바이러스 정제는 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 TNE buffer에 재부유하여 다음 공정에 사용한다. 재조합 바이러스는 양이온 교환수지 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였으며 샘플 loading 후 sodium chloride 농도 구배를 통해 특정 농도에서 추출되는 fraction을 회수하였다. 회수된 fraction은 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 주사용 생리식염수에 재부유하여 다음 공정에 사용한다.
또한, 본 발명은 사람의 대장암에 대한 치료 효과를 유도하기 위해 상기 바이러스 조성물의 치료 유효량을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 대장암 치료 유도법을 제공한다.
또한, 상기 치료 효과는 대장암으로 인한 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 대장암 세포의 혈액 또는 체액 또는 기관의 샘플에서 낮은 대장암 세포수의 차이나 대장암 조직의 감소, 대장암 세포의 사멸에 의해 입증된다.
또한, 치료제의 유효량은 치료 효과를 유도하여 사람에서 대장암에 의한 임상적 증상 감소 암세포의 감소 암조직의 감소 등의 효과를 유도할 수 있는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 재조합 바이러스 조성물을 포함하는 치료제의 경우 정제된 바이러스의 양은 105.0 TCID50/ml에서 1011.0 TCID50/ml 일수 있다. 더 바람직하게는 108.0 TCID50/ml에서 109.0 TCID50/ml 이상일 수 있다.
상기 치료 효과 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내 경로로 상기 조성물을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 이상의 조성물을 정맥 또는 암조직에 직접 주사하는 것일 수 있다. 더 바람직하게는 정맥주사일 수 있다. 치료 효과에 따라 접종 횟수를 제한하는 것은 아니다.
마지막으로, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 치료 효과 평가방법을 제공한다.
또한, 상기 방법은 인간의 암세포주를 이용한 암세포 사멸 효과를 측정하는 것일 수 있다.
상기 암세포주는 대장암 유래 세포주일 수 있으며 바람직하게는 HCT116 세포주일 수 있다. 이 외에도 환자 유래 암 세포주를 이용할 수 있으며 본 발명에서는 대장암 유래 세포주에만 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 LVP-K1-TRAIL 바이러스를 대장암 세포를 이식한 마우스 즉 Xenograft 모델의 암조직에 주사하여는 방법을 제공하는 것이다. 암조직 생성 후 정맥주사 또는 암조직에 직접 주사하는 방법을 이용할 수 있으며 바이러스 주사로 인해 암조직 완전관해, 부분 관해 또는 축소 등의 효과를 측정할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> NDV VG/GA 주를 기본 backbone으로 한 재조합 NDV 바이러스 게놈 전사 벡터 제조
뉴캐슬 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) VG/GA는 약 15 kb 정도의 negative-sense 단일 가닥 RNA를 유전정보로 가지고, 6개의 ORFs로 구성되어 있으며 바이러스의 구조를 이루는 단백질은 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자를 코딩한다. viral RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리(isolation) 후, 유전자에 특이적인 4쌍의 프라이머를 제작하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하였다. 상기 유전자에 특이적인 5쌍의 프라이머는 하기표 1(본 발명의 NP와 P사이의 MCS 삽입 벡터 제작을 위해 이용한 프라이머를 나타낸다)에 나타내었다.
RT-PCR은 42 ℃ 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 1분의 반응을 총 30 사이클을 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 반응하였으며, 네 조각의 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략은 도 1에 나타내었다.
벡터의 재구성 효율을 높이기 위해 바람직하게는 low-copy-number plasmid인 modified pBR322 벡터로 인식부위와 절단부위가 상이한 PacⅠ과 PmeⅠ제한효소를 위치시켜 클로닝을 수행하였다. Modified pBR322 벡터는 바람직하게는 T7 RNA polymerase promoter의 통제 하에 있으며, NDV 게놈 말단에서 RNA를 분할하는데 사용되는 D형 간염 바이러스(hepatitis delta virus; HDV) 항게놈 리보자임(antigenome ribozyme)과 T7 terminator 유전자에 의해 종결되도록 위치시켜 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 가능하게 하였다. 또한, NDV VG/GA strain의 완전한 게놈 서열을 포함시켜 정확하게 전사되도록 하였다.
이후, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 네 조각으로 나뉘어 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략을 이용하여 NP 유전자와 P 유전자 사이에 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 도입하였다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
Fragment 1 Forward TTCTCGCTTCCGGCGGCATC 5,036
Reverse CCGCTTCTACCCGTATTTTTTCTAAGCAGAGGAATTGGGATGACCTC
Fragment 2 Forward TACGGGTAGAAGCGGCCGCGGCCGGCCCCACACCCCACCCCTCAATCC 2,938
Reverse CCGGGATCCAGAATCTTCTACCC
Fragment 3 Forward GATTCTGGATCCCGGTTGGCG 5,578
Reverse CCGCCATCACTTGACAGTTCC
Fragment 4 Forward GTCAAGTGATGGCGGAAGGG 5,256
Reverse CGCCGGAAGCGAGAAGAATC
RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)는 유전자 사이의 stop-start 메커니즘 IGS(GE-IG-GS)에 의해 순차적인 방식으로 전사를 시작한다. GS에서 전사의 재개시가 완전하지 않으므로 3' 말단에 위치한 mRNA의 전사 수준이 높다. 따라서 3' 말단 일수록 높은 mRNA 전사 수준을 보이며 5' 말단으로 갈수록 그 수준이 낮아진다. 그러므로 NP 유전자와 P 유전자 사이의 새로운 외부 유전자 삽입은 P 유전자와 M 유전자 사이 및 HN 유전자와 L 유전자 사이에 비해 더 높은 수준의 mRNA 전사와 외부 단백 번역이 일어나므로 NP-P 사이의 유전자 삽입이 더 바람직하다고 할 수 있다.
상기 네 조각의 cDNA 절편은 말단 15 bp의 염기서열이 동일하며, 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS(GE-IG-GS) 서열 및 다중클로닝 부위(Multiple cloning site; MCS)로 이루어졌다. overlap cloning 법을 이용해 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입하여 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 구축하였다(도 1 참조).
<실시예 2> TRAIL 유전자를 함유하는 재조합 NDV 바이러스 cDNA 제작
뉴캐슬병 바이러스(NDV) 바이러스 cDNA에 TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) 단백질 유전자를 함유하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다. 제작법은 다음과 같다. 상기 실시예 1에서 제작된 LVP-K1 벡터를 NP와 P 유전자 사이에 NotI 및 FseI 제한효소가 포함된 MCS가 삽입된 벡터를 NotI 및 FseI 제한효소로 처리하였다. 서열번호 4번의 아미노산 서열 340에서 846까지의 TRAIL 유전자가 포함된 DNA 절편을 표2의 프라이머 LVP-K1-TRAIL(1st PCR)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이후 얻어진 DNA 절편은 gel 정제를 진행 후 NotI 및 FseI 제한효소 인식 부위의 삽입을 위해 표 2의 프라이머 LVP-K1-TRAIL(2nd PCR)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이후 gel 정제를 진행한 뒤 NotI 및 FseI 제한효소로 처리하였다. 이후 준비된 동일한 제한효소로 처리된 LVP-K1의 NP와 P 유전자 사이에 TRAIL 유전자를 T4 ligase를 이용하여 16 ℃에 overnight 으로 반응시켜 ligation 하였다. 이후 E. coli DH5α competent cell 로 42 ℃에 90초 동안 반응시키는 heat shock 법을 이용하여 transformation을 진행하였다. Ampicillin이 포함된 LB agar plate에 도포하였다. 다음날 확인된 colony를 각각 Ampicillin이 포함된 LB broth에 배양하였다. 각 콜로니 별로 PCR 법을 이용하여 확인 후 해당되는 콜로니를 plasmid midi preparation을 통하여 plasmid DNA를 확보하여 염기서열이 100% 일치되는 여부를 염기서열분석을 통해 확인하였다. 상기 방법에 의해 TRAIL 유전자가 삽입된 벡터를 "LVP-K1-TRAIL"로 명명(서열번호 1)하였다. 이에 대한 모식도는 도 2에 도시하였다. 하기 표 2는 TRAIL 유전자를 LVP-K1 벡터에 삽입하기 위한 프라이머를 도시한다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
LVP-K1-TRAIL
(1st PCR)		 Forward ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG 846
Reverse TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG
LVP-K1-TRAIL
(2nd PCR)		 Forward ATACCATCATTAACATAGGCCGGCCACCATGGCTATGATGGAGGTCCAGG 899
Reverse ATACCATCATTAACATAGGCCGGCCTTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG
<실시예 3> 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 작출
NDV 전사효소 복합체의 개별적인 클론(NP, P, 및 L)을 pBR322 벡터로 클로닝 하여 helper plasmid로 이용하였다(pBR322-NP, pBR322-P, 및 pBR322-L). 전날 6-well 플레이트에 5×105 cells/well로 HEp-2 세포를 준비 후 변형된 벡시니아 바이러스(MVA-T7)를 1 MOI로 감염시켰다. 상기 세포주에 T7 promoter에 의해 단백질이 발현되는 pBR322-NP, pBR322-P, 및 pBR322-L Helper plasmid와 TRAIL 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드인 LVP-K1-TRAIL 벡터(서열번호 1)을 각각 2.5 μg, 1.5 μg, 0.5 μg, 및 5 μg을 lipofectamine 3000(Invitrogen)과 적정비율로 혼합하여 형질전환 하였다. 이후 3일에서 4일간 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양 후 HEp-2 세포 상층액을 수확하였다. 이후 9~11일령의 SPF 발육란의 요막공간(allantoic cavity)로 접종하였으며, 접종 4일 후 요막강액을 채취하였다. 이후, 백시니아 바이러스 제거를 위해 PBS를 이용하여 10-3으로 희석된 요막강액을 각각 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종 뒤 4일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인 실험을 실시하였다. 도 3은 전체 과정의 모식도이다.
바이러스 확인 실험은 요막강액을 Viral RNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리(isolation) 후, 추출한 RNA 5 ul, 하기 표 3의 프라이머를 Forward 및 Reverse 각각 1 μl를 이용하여 ONE-STEP RT-PCR로 42 ℃에서 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃에서 1분, 60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 반응을 총 35 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 수행하여 확인하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 백시니아 바이러스가 제거되었음을 확인하였으며, 뉴캐슬병 바이러스 및 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-TRAIL 바이러스를 확인하였다. 하기 표 3은 본 발명의 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 구축 확인에 필요한 프라이머를 도시한다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
NDV
check		 Forward CCACAATTCCAAGATAACCGGAG 327
Reverse GCTGCCACAATCAGATGCCTTTG
TRAIL
check		 Forward CCCAATTCCTCTGCTTAGAAAAA 564
Reverse TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG
Vaccinia virus
check		 Forward ATGACGATGAAAATGATGGTACATA 1,059
Reverse CTCCAATACTACTGTAGTTGTAAGG
<실시예 4> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-TRAIL 바이러스 배양 및 정제
전날 Vero 세포를 3×105 cells/mL로 배양 후 다음날 재조합 바이러스 0.05 MOI로 접종하여 2일 후에 가장 높은 역가의 바이러스 상층액을 얻었다. 이후, 바이러스 상층액은 부유물을 제거하기 위해 5,000 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액은 재조합 바이러스 농축을 위해 32,000 rpm 4 ℃에서 3시간 동안 초원심분리를 진행하였으며, 상층액을 제거 후 TNE buffer(10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA)로 재부유하였다. 농축된 바이러스는 30~60% sucrose gradient 법을 이용해 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 동안 초원심분리를 진행하였다. 40~50%에서 재조합 바이러스를 수득하였다. 마지막으로 수득한 재조합 바이러스를 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 초원심분리를 한번 더 진행하여 수크로스(sucrose)를 제거하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-TRAIL 바이러스를 정제하였다.
<실시예 5> HCT116 세포 및 Vero 세포 배양
암세포사멸 효과를 확인하기 위해 HCT116(CRL-1690™, ATCC) 대장암 세포를 이용하였다. HCT116 세포의 배양은 다음과 같다. HCT116 세포는 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium(RPMI1640, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37 °C 배양기(5%, CO2)에서 175T flask를 이용하여 배양하였다. 세포가 플라스크에 70~80% monolayer를 형성하여 자라게 되면 1:4에서 1:6으로 subculture를 통해 세포를 유지한다. Seeding density는 2~4×104 cells/ml 정도로 한다. Vero 세포(vero KCLB No. 21587)는 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여 배양하였으며 175T Flask 플라스크를 이용하여 배양하였다. 세포가 70~80% 이상 monolayer를 형성하여 자라게 되면 subculture를 진행하여 유지한다. Vero 세포의 split ratio는 1:8까지 가능하며 seeding density는 1×104 cells/ml이다.
<실시예 6> Vero 세포를 이용한 재조합 바이러스의 성장동역학(kinetics) 확인
Vero 세포를 이용하여 LVP-K1-TRAIL 바이러스와 양성대조군으로 LVP-K1 바이러스의 증식에 대한 비교 실험을 실시하였다. 일반적으로 외래유전자를 삽입한 바이러스의 경우 증식이 잘 되지 않는 현상이 자주 발생하여 TRAIL 유전자를 삽입한 바이러스의 증식을 비교 확인하였다. 70~80% 이상 monolayer를 형성한 vero 세포(175T flask) 배양액을 제거한 후 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 10 ml을 플라스크에 넣고 조심해서 흔들어 세포를 세척 한다. 이런 과정을 2~3회 반복하고 난 후 양성대조군으로 LVP-K1 바이러스를 실험군으로 LVP-K1-TRAIL 바이러스를 5 ml(0.1 MOI)을 플라스크에 넣고 37 ℃ incubator에서 10분 간격으로 흔들어 주며 1시간 동안 바이러스를 감작 시킨다. 이후 바이러스액을 제거하고 혈청이 없는 DMEM 배지 10 ml을 플라스크에 넣어 남아 있는 바이러스액을 제거한 후 다시 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 50 ml 씩 넣어주고 12시간 간격으로 96시간이 될 때까지 각각의 플라스크에서 1 ml의 배양액을 채취하여 바이러스 역가를 Tissue Culture Infective Dose 50%(TCID50) 측정 방법으로 측정하였다. 그 결과 도 5에서와 같이 LVP-K1 바이러스와 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 성장동역학은 큰 차이가 없었다. 이것은 외래유전자를 삽입한 바이러스가 아무런 문제 없이 증식한다는 것을 의미한다.
<실시예 7> TRAIL 유전자가 도입된 바이러스 감염으로 인한 대장암 세포사멸 효과 확인
LVP-K1-TRAIL 바이러스 감염으로 인한 대장암 세포 HCT116 세포의 사멸 효과를 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 통상적인 MTT assay 방법에 따라 실시하였으며 자세한 실험과정을 기술한다. 96-well plate에 1개의 well에 1×104개의 HCT116 세포를 24시간 동안 세포배양용 penicillin, streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium(RPMI1640, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37°C 배양기(5% CO2)에서 배양하고 LVP-K1-TRAIL 바이러스 및 양성대조군으로 LVP-K1 바이러스를 MOI가 0.001, 0.01, 0.1, 1, 및 10이 되도록 감염시킨다. 결과의 신뢰성을 위해서, 같은 조건의 well을 4개씩 준비하여 진행하였다. 감염 후, 37°C 배양기(5% CO2)에서 배양하고 감염 후 96시간 이후에 각각의 well에 20μl의 MTT 용액(CellTiter 96® AQueous One solution Cell Proliferation Assay, Bio-Rad, USA)를 첨가하고 1시간 동안)에서 배양기(5% CO2)에서 1시간 배양한다. iMark Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 450nm의 파장을 가지는 빛의 흡광도를 측정하여 세포 사멸도를 측정한다. 이후 음성대조군에 대한 상대적인 사멸률(%)을 확인한다.
그 결과 도 6에서 보는 것과 같이 MTT assay 결과 TRAIL 유전자를 삽입한 바이러스가 TRAIL 바이러스를 삽입하지 않은 바이러스보다 암세포 사멸 효과가 더 높게 나타났다. 특히 이러한 암세포 사멸 효과의 차이는 세포에 접종된 바이러스 농도가 낮을수록 차이를 보이는데 이는 재조합 NDV 바이러스인 LVP-K1 바이러스 역시 본래 oncolytic effect를 가지고 있어 높은 농도에서는 차이를 보이지 않으나 0.1 및 1 MOI 에서 TRAIL 유전자를 삽입한 바이러스의 사멸 효과가 높은 것은 바이러스로 전달된 TRAIL 유전자에 의해 암세포 내에서 정상적인 TRAIL 단백질이 발현되고 이러한 TRAIL 단백질이 암세포의 자살(apoptosis) 효과를 높여 세포사멸에 영향을 준 것으로 판단된다.
이후 HCT116 세포 배양액에 바이러스를 접종 후 현미경 관찰을 실험을 실시하여 세포병변효과(CPE)를 관찰하였다. HCT116 세포를 6 well plate에서 배양하여 90% 이상 monolayer가 형성된 후 각각의 바이러스를 0.1 및 1 MOI로 접종 후 6, 12, 24 및 48 시간마다 HCT116 세포의 CPE를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 도 7에서와 같이 0.1 MOI 및 1 MOI 접종 두 경우 모두 TRAIL 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-TRAIL 바이러스 접종 세포에서 TRAIL 유전자가 없는 LVP-K1 바이러스 접종 세포보다 먼저 세포병변효과(CPE)가 관찰됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 8> 대장암세포에서 바이러스를 감염 후 TRAIL 단백질의 발현량 비교
미리 준비된 HCT116 세포에 LVP-K1-TRAIL 바이러스 및 양성대조군으로 LVP-K1 바이러스를 접종하고 음성대조군으로 접종하지 않은 HCT116 세포에서의 TRAIL 단백질 발현을 비교하였다. Western blotting이 정량적인 단백질량을 정확히 평가할 수 없는 실험이나 상대적인 평가를 통해 단백질 발현량을 비교할 수 있다고 판단하여 실험을 실시하였다. 80% 이상 monolayer를 형성한 HCT116 세포주에 역가가 확인된 바이러스를 준비하여 MOI 1이 되도록 접종한 후 9시간이 될 때까지 3시간 간격으로 CPE를 현미경을 통해 관찰 후, 배양액 전체를 동결 해동을 3회 이상 반복하여 샘플을 채취하였다. 통상적인 SDS-PAGE(Gel 농도 12%) 방법을 통해 단백질을 분리하고 단백질은 transblottor(Thermo fisher)를 이용하여 PVDF membrane(25A, 15분)에 이송하였다. PVDF memebrane은 1% BSA 용액으로 blocking을 한 후 통상적인 western blotting 방법에 따라 실시하였다. TRAIL에 특이적으로 결합하는 1차 항체는 TRAIL 단클론 항체(Cat No. 170533, invitrogen)를 사용하였다. 단백질 특이적인 발생 반응을 확인하기 위한 2차 항체는 Anti-mouse Anti-IgG Horseradish Peroxidase Conjugated Antibody (Invitrogen)를 사용하였으며 항체 농도는 제조사의 권장량을 사용하였다. 2차 항체 반응 후 발색제로 ECL(Enhanced chemiluminescence, Bio-Rad) 용액을 적당량 넣고 발색이 되면 ChemiDoc™ MP Imaging System(Bio-Rad) 이용하여 단백을 확인하였다.
TRAIL은 유형Ⅱ 막횡단 단백질(membrane TRAIL)로 발현이 되며 monomer 단백질 분해 방출을 위한 cleavage site를 포함한다. 막결합 TRAIL은 총 846개의 아미노산으로 32.5 kDa이다. Extracellular carboxy-terminal 부분이 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 방출된 monomer TRAIL은 아미노산 서열 340에서 846까지 18.7 kDa의 size이다. Monomer 단백질 세 개가 결합하여 trimeric TRAIL을 형성한다. Trimeric TRAIL은 functional 단백질로 알려져 있다.
도 8의 결과는 바이러스 감염 후 TRAIL 단백질 발현량을 측정한 western blotting 결과이다. LVP-K1-TRAIL 바이러스의 NP와 P 유전자 사이에 삽입된 18.7 kDa size의 TRAIL 단백질이 LVP-K1-TRAIL 바이러스 처리 9시간 후에 가장 높은 것을 확인하였다. 이것은 바이러스 감염 시간이 경과하면서 trimeric TRAIL 단백질의 발현량이 상승한 것을 의미한다.
또한, NDV 바이러스에 의해 감염된 세포는 세포의 표면에 membrane TRAIL 단백질의 발현을 자극하는 것으로 알려져 있고, 이는 LVP-K1 바이러스 접종 그룹에서 membrane TRAIL(32.5 kDa)의 발현됨을 통해 확인되었다. 종합하여 보면 LVP-K1-TRAIL 접종 그룹이 LVP-K1 접종 그룹에 비해 더 높은 TRAIL 단백질 발현이 확인이 됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 1 MOI로 바이러스를 처리하였을 시 LVP-K1 바이러스 접종그룹에 비해 LVP-K1-TRAIL 바이러스 접종 그룹이 6시간째 더 빠른 세포병변효과(CPE)를 나타낸 것으로 보아 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 TRAIL 단백질에 의해 apoptosis를 더욱 촉진하는 것을 의미한다.
<실시예 9> 대장암 이종이식 누드 마우스를 이용한 바이러스의 종양 내 접종 시 암세포 증식 억제 효과 확인
Xenograft model을 이용하여 LVP-K1-TRAIL 바이러스의 암조직 성장 억제 효과를 측정하였다. 배양된 HCT116 세포 1×107 cells/mL을 RPMI 배지에 풀어 100 ul를 동량의 matrigel(Corning)과 혼합하여 마우스 좌측 둔부에 접종하여 HCT116 이종이식 모델을 확립하였다. 사용된 마우스는 SPF female BALB/c 누드 마우스 14~19g 정도의 12마리를 SLC(Japan)로부터 구입하여 무작위로 그룹당 4마리씩 구분하여 실험하였다. 각 실험 그룹은 LVP-K1-TRAIL 바이러스 및 양성대조군으로 LVP-K1 바이러스를 정맥 주사한 그룹, 그리고 PBS 접종 그룹으로 나뉘었다. 접종한 바이러스의 농도는 107.0 TCID50/ml 이며 100 ul 씩 접종하여 처리군 및 대조군 사이의 종양 성장률을 비교하였다. HCT116 세포 접종 후 6일째 종양 부피가 100-300 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 임의로 그룹을 나뉘었다. 바이러스 접종은 3일 간격으로 3회 접종하였다. 종양 접종 후 21일까지 암조직의 변화를 관찰하였다. 암조직의 크기는 1/2 (가장 작은 직경)2 × (가장 큰 직경) 공식을 통해 계산하였다.
그 결과 도 9a 및 도 9b를 통해 LVP-K1-TRAIL 바이러스 처리군은 400 mm3 이하로 대조군(PBS) 약 1,200 mm3 와 약 3배의 차이가 확인되어 종양이 관해되었음을 확인하였다. 또한, TRAIL 유전자가 삽입되지 않은 바이러스(LVP-K1)는 TRAIL 유전자가 삽입된 바이러스(LVP-K1-TRAIL)보다 종양 용해 효과가 낮음을 확인하였다. 이러한 결과는 TRAIL 단백질이 암세포의 자살(apoptosis) 효과를 높여 세포사멸에 영향을 준 것으로 판단되며 MTT assay 결과와 상동성을 확인하였다. TRAIL 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-TRAIL 바이러스 접종군에서 가장 빠르고 효과적으로 암조직이 축소되는 것을 관찰할 수 있었다. 종양 조직을 적출하여 비교하였을 시 PBS 종양조직의 크기에 비해 LVP-K1-TRAIL 접종군의 종양 조직이 현저하게 축소한 것을 확인하였다(도 9c). 또한, 도 9d와 같이 병리학적 조직 양상은 LVP-K1-TRAIL 군에서는 높은 수준의 lymphocyte infiltration이 관찰되었고, 종양세포는 적은 수준으로 관찰되었다. LVP-K1 접종군의 경우에는 중등도 수준의 lymphocyte infiltration이 관찰되었다. 하지만 cell density는 높은 편으로 TRAIL 유전자가 삽입된 바이러스와의 차이를 보였다. 이와 같은 소견으로 보아 LVP-K1-TRAIL군의 암세포사멸 효과가 LVP-K1 접종군에 비해 높은 것을 의미한다.
포유류에서 면역반응을 일으키지 않고 항체도 생성되지 않는 NDV 바이러스를 이용한 새로운 암치료용 바이러스를 제작하여 대장암에 대한 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다. NDV 바이러스는 정상 세포에서 감염 즉시 innate immunity에 의해 암세포에 도달하지 못하고 사라지는 NDV 바이러스가 많고 또 정맥주사로 인한 희석 효과로 인해 기존에 사용해 오던 단순 재조합 바이러스가 아닌 암세포 증식 억제 효과, 세포자살 유도, 면역반응 유도등 다양한 유전자를 삽입하여 암세포에서 단백질로 발현되어 효능을 증가시키는 재조합 NDV 바이러스의 개발은 매우 중요한 과제이며 앞으로 추가적인 연구를 통해 더 많은 발전이 있어야 할 것이다. 본 발명은 대장암의 TRAIL 유전자 돌연변이에 의한 정상적인 TRAIL 단백질의 기능이 상실된 암세포에 oncolytic 기능을 어느 정도 가지고 있으며 이에 TRAIL 유전자를 도입하여 NDV 재조합 바이러스를 제작하고 이에 대한 효과가 개선되었음을 증명한 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC) KCTC14543BP 20210421
<110> LIBENTECH Co.,LTD. <120> Oncolytic virus for colorectal cancer treatment based on a recombinant newcastle virus vector containing a TRAIL gene and colorectal cancer treatment composition using the same <130> PN2203-161 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LVP-K1-TRAIL <400> 1 accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60 tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120 aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180 agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240 caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300 tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360 ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420 tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480 gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540 caacggtacc ccgttcgtca 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ggacatctca 7680 tttcctttat cagcgagggt catcatactt ctcccctgcc ctactatatc ctatgatagt 7740 cagcaacaaa acagccactc ttcatagtcc ttatacattc aatgccttca ctcgaccagg 7800 tagtgtccct tgccaggctt cagcaagatg ccctaactca tgtgttaccg gagtctatac 7860 tgatccatat cccttggtct tctataggaa ccacaccttg cgaggggtat tcgggacgat 7920 gcttgatgat aaacaagcaa gactcaaccc tgtatctgca gtatttgaca gcatatcccg 7980 cagtcgcata acccgggtga gttcaagcag caccaaggca gcatacacaa catcaacatg 8040 ttttaaagtt gtaaagacca ataaaaccta ttgtctcagc attgccgaaa tatccaatac 8100 cctcttcggg gaattcagaa tcgtcccttt actagttgag attctcaagg atgatggggt 8160 tagagaagcc aggtctagcc ggttgagtca actgcgagag ggttggaaag atgacattgt 8220 atcacctatc ttttgcgacg ccaagaatca aactgaatac cggcgcgagc tcgagtccta 8280 cgctgccagt tggccataat cagctagtgc taatgtgatt agattaagtc ttgtcggtag 8340 tcacttgatt aagaaaaaat gtgggtggta gcgggatata aggcaaaaca actcaaggag 8400 gatagcacgg gtaggacatg gcgagctccg gtcccgagag ggcggagcat cagattatcc 8460 taccagagtc acacctgtct tcaccattag tcaagcacaa actactctat tactggaaat 8520 taactgggct accactccct gacgagtgtg acttcgacca cctcattctc agccgacaat 8580 ggaagaaaat acttgaatcg gcctcccctg acactgagag aatgataaaa cttggaaggg 8640 cagtgcacca gactctcaac cacaattcca agataaccgg agtactccat cccaggtgtt 8700 tagaagaatt ggctagtatt gaggttcctg actcaaccaa caagtttcgg aagatcgaga 8760 agaaaatcca aattcacaac acaaggtatg gagaactgtt cacaagactg tgcacgcatg 8820 tagagaagaa attgttggga tcatcttggt ctaataatgt cccccggtca gaagagttca 8880 acagcatccg tacagatccg gcattctggt ttcactcaaa atggtccaca actaagtttg 8940 catggctcca tataaaacag attcaaaggc atctgattgt ggcagcaaga acaaggtccg 9000 cagccaacaa attggtgacg ctgacccata aggtaggcca agtctttgtt actcctgagc 9060 ttgtcattgt gacacataca gatgagaaca agttcacgtg tcttacccag gaacttgtgt 9120 tgatgtatgc agatatgatg gagggcagag atatggtcaa cataatatca tccacggcgg 9180 cacatctcag gagcctatca gagaaaattg atgacattct gcggttagta gatgccctgg 9240 caaaagatct gggtaatcaa gtctacgatg ttgtagcact catggaggga tttgcatacg 9300 gcgccgtcca gctgcttgag ccgtcaggta cattcgcagg ggatttcttc gcattcaacc 9360 tgcaggagct caaagacact ttgatcggcc tccttcctaa ggatatagca gaatctgtga 9420 ctcacgcaat agccactgta ttctctggct tagaacaaaa tcaagcggct gagatgctgt 9480 gcctgttgcg tctatggggc cacccattac ttgagtcccg tattgcggca aaagcagtaa 9540 ggagccaaat gtgcgcacca aaaatggtag actttgatat gatcctccag gtattgtctt 9600 tctttaaagg aacaatcatc aacggataca gaaagaagaa tgcaggtgtt tggccacgtg 9660 tcaaagtaga tacgatatac gggaaggtca ttgggcagct acacgctgat tcagcggaga 9720 tttcacacga tatcatgttg agagagtaca agagtttatc tgcgcttgaa ttcgagccat 9780 gtatagaata cgaccctatc accaatctga gcatgtttct aaaagacaag gcgatcgcac 9840 acccgaaaga caactggctc gccgcgttta ggcgaaacct tctctctgag gaccagaaga 9900 aacatgtaaa ggaggcaacc tctactaacc gtctcttgat agagttctta gagtcaaatg 9960 attttgatcc atataaggag atggaatatc tgacgaccct tgagtaccta agagatgaca 10020 atgtggcagt atcatactcg ctcaaggaga aggaagtgaa ggttaatggg cggatttttg 10080 ctaagctaac aaagaaatta aggaactgtc aagtgatggc ggaagggatc ttagctgacc 10140 agattgcacc tttctttcaa gggaatgggg tcattcagga tagcatatct ttaaccaaga 10200 gtatgctagc gatgagtcaa ttgtctttca acagcaataa gaaacgtatc actgactgca 10260 aagaaagagt agcctcaaac cgcaatcacg atcaaaagag caagaatcgt cggagagttg 10320 ccacttttat aacgactgac ctgcaaaagt actgtcttaa ttggagatat cagacaatca 10380 aactgttcgc tcatgccatc aatcagctga tgggcttacc tcacttcttc gaatggattc 10440 atctaagact aatggatact acgatgtttg taggagaccc tttcaatccc ccaagtgacc 10500 caactgactg tgatctctca agagtcccaa atgatgacat atatattgtc agtgctagag 10560 ggggtattga gggattatgt cagaagctat ggacaatgat ctcaattgct gcaatccaac 10620 ttgctgcagc aagatcacat tgtcgcgtcg cctgtatggt acagggtgac aatcaagtaa 10680 tagctgtaac gagagaggta aggtcagatg actccccgga aatggtgtta acacaattgc 10740 atcaagccag tgataatttc ttcaaggaat tgattcatgt taatcatttg attggccata 10800 atttgaagga tcgtgaaaca atcagatcag acacattctt catatacagc aaacgaatat 10860 tcaaagatgg agcaatactc agtcaagtcc tcaaaaattc atctaaatta gtgctaatat 10920 caggcgacct tagtgaaaac accgtaatgt cctgtgccaa cattgcatct actatagcac 10980 ggctgtgcga gaacgggctt ccaaaggatt tctgttatta cttaaactac ctgatgagtt 11040 gcgtgcagac atactttgat tctgagtttt ccatcactaa cagctcgcac cccgattcta 11100 accagtcgtg gattgaagac atctcttttg tgcactcata tgtcctgacc cctgcccagc 11160 tagggggact gagcaacctc caatactcaa ggctctacac gaggaacatc ggtgacccgg 11220 gaactactgc ttttgcagag atcaagcgat tagaagcagt ggggttacta agtcctagta 11280 ttatgactaa catcttaact aggccgcctg gaaatggaga ttgggccagt ctgtgtaacg 11340 acccttactc tttcaatttt gagactgtcg cgagtccaaa tattgtcctt aagaaacata 11400 cacaaagagt cctatttgaa acttgttcaa atcccttatt atctggcgtg catacagagg 11460 ataatgaggc agaagagaag gcgttggctg aatttttact caatcaagaa gtaattcatc 11520 cacgtgtcgc acatgctatc atggaagcaa gctctatagg taggaggaag cagattcaag 11580 ggcttgttga cacaacaaac accgtaatca agattgcatt gactaggagg ccacttggca 11640 tcaagaggct gatgcggata gttaactact cgagcatgca tgcaatgctg tttagagacg 11700 atgttttctc atctaacagg tctaaccacc ccttagtttc ctctaatatg tgttctctga 11760 cgctagcaga ctatgcacgg aatagaagct ggtcaccatt gacggggggt agaaagatac 11820 tgggtgtatc taatcctgat actatagaac ttgtagaggg tgagatcctt agcgtcagcg 11880 gaggatgcac aagatgtgac agcggagatg aacaattcac ttggttccat cttccgagca 11940 atatagaact gaccgatgac accagcaaga atcctccgat gagagtgccg tacctcgggt 12000 caaagactca agagaggagg gccgcctcgc ttgcgaaaat agctcatatg tcaccacatg 12060 tgaaagctgc tctaagggca tcatccgtgt tgatctgggc ttatggagac aacgaagtaa 12120 attggactgc tgctcttaaa attgcaagat ctcggtgcaa tataaactca gagtatcttc 12180 gactattgtc ccccttaccc acagctggga atctccaaca tagactggat gacggcataa 12240 ctcagatgac attcacccct gcatctctct acagggtgtc accttatatt cacatatcca 12300 atgattctca aaggttattc acggaagaag gagtcaaaga gggaaatgta gtttatcagc 12360 aaatcatgct cttgggttta tctctaatcg aatcactctt cccgatgacg acaaccagga 12420 catacgatga gatcacattg cacctccaca gtaaatttag ctgctgtatc agggaagcac 12480 cggttgcagt tcctttcgag ttactcggga tggcaccaga actaaggaca gtgacctcaa 12540 ataagtttat gtatgatcct agtcctgtat cggagggtga ctttgcgaga cttgacttag 12600 ctatctttaa gagttatgag cttaatctag aatcatatcc cacaatagag ctaatgaaca 12660 ttctttcaat atccagcggg aagttaatcg gccagtctgt ggtttcttat gatgaagata 12720 cctccataaa gaatgacgcc ataatagtgt atgacaacac ccggaattgg atcagcgaag 12780 ctcagaattc agatgtggtc cgcctattcg agtatgcagc acttgaagtg cttctcgact 12840 gttcttatca gctctactat ctgagagtaa gaggcctaga caatatcgtg ttgtatatga 12900 gtgacttata taagaatatg ccaggaattc tactttccaa cattgcagct acaatatctc 12960 atcccatcat tcattcaaga ttgcatgcag taggcctggt caatcacgac gggtcacacc 13020 aacttgcaga cacagatttc atcgaaatgt ctgcaaaact attagtctct tgcactcgac 13080 gcgtggtctc aggtttatat gcagggaata agtatgatct gctgttcccg tctgtcttag 13140 atgataacct gagtgagaag atgcttcagc tgatatctcg gttatgctgc ctgtatacgg 13200 tgctctttgc tacaacaaga gagatcccga aaataagagg cttatctgca gaagagaagt 13260 gttcagtact tactgagtac ctactgtcag atgctgtgaa accattactt agttctgagc 13320 aagtgagctc tatcatgtct cctaacatag ttacgttccc agctaatcta tattacatgt 13380 ctcggaagag ccttaatttg attagggaaa gagaggacag ggacactatc ttggcattgt 13440 tgttccccca agagccacta cttgagttcc ccttagtaca agatattggc gctcgagtga 13500 aagatccatt cacccgacaa cctgcggcgt ttttacaaga attagatttg agcgctccag 13560 caaggtatga cgcatttaca cttagtcagg ttcattctga acacacatca ccaaatccgg 13620 aggacgacta cttagtacga tacctgttca gaggaatagg gaccgcgtcc tcctcttggt 13680 ataaggcatc tcaccttctt tctgtacctg aggtcagatg tgcaaggcac gggaattcct 13740 tatacttggc agaaggaagc ggagccatta tgagtcttct cgaactgcat gtgccgcatg 13800 agactatcta ttacaatacg ctcttctcaa acgagatgaa ccccccacag cggcatttcg 13860 gaccgacccc aacacagttt ctgaattcag ttgtttatag gaatctacag gcggaggtac 13920 catgtaagga tggatttgtc caggagttcc gtccattatg gagagagaat acagaagaaa 13980 gcgatctgac ctcagataaa gcagtgggtt acatcacatc tgcagtgccc taccggtctg 14040 tatcattgct gcactgtgac attgagattc ctccaggatc caatcaaagc ttactggatc 14100 aactggctac caatctgtct ctgattgcca tgcattctgt aagggagggc ggggtcgtga 14160 tcatcaaagt gttgtatgca atgggatatt acttccatct actcatgaac ttgttcactc 14220 cgtgttctac gaaaggatat attctctcta atggctatgc atgtagaggg gatatggagt 14280 gttacctggt atttgtcatg ggctatcgag gtgggcctac atttgtacat gaggtagtga 14340 ggatggcaaa aactctagtg cagcggcacg gtacactttt gtccaaatca gatgagatca 14400 cactgactag gttatttacc tcacagcggc agcgtgtaac agacatccta tccagtcctt 14460 taccgagact aataaagttc ttgagaaaga atatcgatac tgcgctaatt gaagccgggg 14520 gacaacccgt ccgtccattc tgtgcagaga gcttggtgag gacactagcg gacacaactc 14580 agatgaccca gatcatcgct agtcacattg acacagtcat tcgatctgtg atctacatgg 14640 aggctgaggg tgatctcgcc gacacagtgt tcttatttac cccctacaat ctctctacag 14700 acggtaaaaa gagaacatca cttaaacagt gcacaaggca gatcttagag gtcacaatat 14760 tgggtcttag agttgaaaat ctcaataaag taggtgatgt agtcagtcta gtacttaaag 14820 gtatgatttc tctggaggac ctgatccctc taagaacata cttgaagcgt agtacctgcc 14880 ctaagtattt gaagtctgtt ctaggtatta ctaaactcaa agaaatgttt acagacacct 14940 ctttattata cttgactcgt gctcaacaaa aattctacat gaaaactata ggcaacgcag 15000 tcaagggata ctacagtaac tgtgactctt aaagataatc acatattaat aggctccttt 15060 tctagttaac tgagcccttg ttgatttaat gatactatat tagaaaaaag ttgcactccg 15120 atcctttagg actcgtgttc gaattcaaat aattgtctta gaaaaaagtt gcgcgtaatt 15180 gttcttgaat gtagtcctgt cattcaccaa atctttgttt ggtcggcatg gcatctccac 15240 ctcctcgcgg tccgacctgg gcatccgaag gaggacgcac gtccactcgg atggctaagg 15300 gagtagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ggcgcgccgt 15360 cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg 15420 actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg 15480 gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc 15540 ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc 15600 gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cgacgcgctg 15660 ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg ccttccccat tatgattctt 15720 ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag gcaggtagat 15780 gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc ttaccagcct aacttcgatc 15840 actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg cgagcacatg gaacgggttg 15900 gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca 15960 tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca 16020 ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt 16080 ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca 16140 gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag 16200 gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa 16260 gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc 16320 gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct 16380 gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta acgaagcgct 16440 ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac 16500 cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc 16560 tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa tcccccttac acggaggcat 16620 cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg ctttatcaga agccagacat 16680 taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga acaggcagac atctgtgaat 16740 cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg 16800 gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 16860 ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag 16920 ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga 16980 gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 17040 aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 17100 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 17160 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 17220 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 17280 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 17340 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 17400 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 17460 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 17520 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 17580 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 17640 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 17700 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 17760 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 17820 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 17880 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 17940 aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 18000 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 18060 agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 18120 cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 18180 ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 18240 gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 18300 cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 18360 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 18420 ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 18480 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 18540 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 18600 ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 18660 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 18720 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 18780 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 18840 acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 18900 ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 18960 tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac 19020 attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat tctaatacga 19080 ctcactatag g 19091 <210> 3 <211> 846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAIL <400> 3 atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120 gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180 gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc 240 aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300 tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 360 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac 420 tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 480 cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540 ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca 600 aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 660 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat 720 tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta 780 acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt 840 ggctaa 846 <210> 4 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trimeric TRAIL <400> 4 atggtgagag aaagaggtcc tcagagagta gcagctcaca taactgggac cagaggaaga 60 agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac 120 tcctgggaat catcaaggag tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt 180 gaactggtca tccatgaaaa agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt 240 caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa 300 tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct 360 aaagatgcag aatatggact ctattccatc tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa 420 aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc 480 agttttttcg gggccttttt agttggctaa 510

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 LVP-K1-TRAIL 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 TRAIL 유전자가 서열번호 2로 표시되는 LVP-K1 벡터의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 도입된 것을 특징으로 하는, LVP-K1-TRAIL 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항의 LVP-K1-TRAIL 벡터를 도입한 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC 14543BP).
  4. 제3항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 항원을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제4항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제4항의 조성물을 개체에 투여하는 단계; 및 개체의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제3항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계;
    상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 제조 방법.
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