KR20190122647A - 식물 병원체의 생물방제를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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KR20190122647A
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카렌 인
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페블 랩스 유에스에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명 기술은 식물 병원체 및 초식동물의 방제를 위한 신규한 시스템, 방법 및 전략에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명 기술은 병원체-감염된 식물에게 억제 RNA 분자를 전달하도록 구성된 신규한 조성물, 시스템 및 방법을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 억제 RNA 분자를 병원체-감염된 식물에게 전달하도록 구성된 유전자 조작된 내생 박테리아를 포함한다. 바람직한 일 구체예는 바이러스 단백질 축적 수준의 감소를 초래하는, 바이러스 인코딩된 단백질을 표적으로 하는 헤어핀 RNA의 신규한 트랜스-킹덤 전달을 포함할 수 있다.

Description

식물 병원체의 생물방제를 위한 시스템 및 방법
이 출원은 2016년 12월 6일자 미국 가특허출원 번호 62/430,671에 기초한 우선권 주장 출원이다. 전술한 출원의 명세서 및 도면 전체는 본원에 그 내용 전체가 참조 병합된다
서열목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열목록을 포함하며 그 전체가 본원에 참조 병합되었다.
기술 분야
본 발명의 분야는 일반적으로 식물 분자 생물학 및 식물 바이오테크놀로지에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본원은 표적화된 유전자의 발현을 억제하거나 표적화된 유전자를 하향-조절하기 위한 구조물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기술은 식물 병원체, 애완동물 및/또는 초식동물의 생물방제에 관한 것이기도 하다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 변형 박테리아를 통한 억제 RNA 분자를 통한 질병-전달 식물 병원체의 생물방제를 위한 신규한 기술, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 2,500 종 이상의 것으로 추산되는 농작물의 재배화는 수확된 작물의 수확량과 품질을 향상시키는 바람직한 특성을 인공적으로 선택하는 것과 관련이 있다. 고투입 환경에서 농작 대상을 재배하는 것은 전세계 작물 생산성을 성공적으로 증대시킨 한편으로, 상대적으로 다양성 수준이 낮은 현대 작물 품종을 생산케 한 경향이 있다. 이러한 감소된 유전적 다양성은 비-최적 조건 하에서 작물 생산에 적합한 품종의 이용 가능성을 제한할 수 있다. 식물 방어 형질은 다른 바람직한 형질에 대한 선택의 결과로 재배 식물에서는 부족하거나 약하게 표현될 수 있다. 현대의 품종들이 농약 사용이 제한된 저투입 시스템에서 잘 기능하지 못하는 것으로 나타났기 때문에 이것은, 작물 생산의 지속 가능성을 향상시키는데 있어 특별한 과제를 부과한다. 지난 세기 동안 작물 생산성은 증가하였지만, 잡초, 해충 및 질병으로 인해 세계적인 작물 손실량은 최대 40%에 달할 수 있다 (Oerke and Dehne, 2004). 모든 식생(vegetation) 시스템에서 수목, 수액 및 뿌리를 먹는 초식 동물은 순수 식물 생산성의 20% 이상을 제거한다. 이러한 손실은 최근 수십년에 걸친 농약의 사용 증가에도 불구하고 발생한 것으로, 이는 화학물질의 투입에 덜 의존하면서도 병원체와 해충 구제를 위한 지속적인 접근법을 개발할 필요가 있음을 강조하는 것이다.
질병 구제는 종종 많은 질병에 대해 우수한 내성을 갖게끔 육종된 식물의 사용, 및 윤작, 무병원균 종자의 사용, 적절한 식재일 및 식물 밀도 등의 식물 재배 접근법, 재배지 습기 제어 및 농약 사용에 의해 종종 달성 및/또는 향상되었다. 넓은 면적과 많은 작물 종에 걸쳐, 여러 질병이 일반적으로 발전된 환경에서는 식물의 수확량을 매년 10%씩 감소시키지만 덜 발달된 환경에서는 종종 20% 넘게 수확량을 감소시키는 것으로 추산된다. 전통적인 재배 기술이 농업 생산성에서 상당한 이익을 가져왔지만, 그러한 기술이 식물 집단군에 대한 모든 위협을 해소할 수는 없다. 이러한 위협은 현금 및 식용 작물과 관련하여 특히 심각하다.
이러한 경향을 염두에 둘 때, 식물 병원체가 전세계 재배자들이 생산하는 식품, 사료 및 섬유의 품질과 양에 직접적인 위협이 된다는 우려가 점점 커지고 있다. 식물 질병을 예방, 완화 또는 통제하기 위해 다양한 접근법을 사용할 수 있다. 재배자들은 전통적인 농경 및 원예 관행 이외에도 종종 화학 비료 및 농약에 의존해야 한다. 이러한 농업 투입은 지난 100 년 동안 농작물 생산성과 품질면에서 획기적인 향상에 크게 기여하였다. 그러나 농업 화학 물질의 과도한 사용과 오용으로 인한 환경 오염뿐만 아니라 일부 농약에 대한 두려움-혼란은 농업 분야에서 농약 사용에 대한 사람들의 태도에 상당한 변화를 가져왔다. 오늘날 화학 농약 사용에 대한 엄격한 규제가 있으며 신뢰할 수 있고 효과적인 화학 물질을 시장으로부터 제거하려는 정치적 압력도 있다. 또한, 자연 생태계에서의 식물 질병의 확산은 적용해야 마땅할 그 규모로 인해 화학 물질의 성공적인 적용을 배제할 수 있다.
살충제와 제초제의 사용 및/또는 과용을 다루는 한 가지 방법은 형질전환 식물의 개발이다. 형질전환 식물 DNA는 유전 공학 기술을 사용하여 변형된다. 목표는 종에서 자연적으로 발생하지 않는 새로운 형질을 그 식물에 도입하는 것이다. 형질전환 식물은 인위적으로 삽입된 유전자를 포함할 수 있다. 삽입된 유전자 서열은 도입유전자(transgene)로 알려져 있으며, 관련이 없는 식물 또는 전혀 다른 종에서 유래한 것일 수 있다. 그러한 형질전환 식물의 예로는 베타 카로틴과 같은 전구체를 비타민 A로 전환시킬 수 있는 항바이러스 단백질 복합체, 농약 또는 대사 경로 효소와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 삽입을 포함할 수 있다. 식물에 유전자 조합을 삽입하는 목적은 식물을 가능한 한 유용하고 생산적으로 만드는 것이다. 그러나, 이러한 형질전환 식물 시스템은 또한 몇 가지 과학적이고 실용적인 단점을 갖는다.
일례로, 형질전환 식물은 Bt-기반 독소의 발현을 통해 특정 곤충/해충을 방제하기 위해 개발되었다. 감수성 곤충에서 장(gut) 상피 세포 막의 투과성을 돕는 Bt 살충 단백질의 발현이 처음에는 효과적이라는 것이 입증되었다. 그러나 이 접근법은 일부 특정 작물의 특정 해충을 관리하는 것으로 한정적일 뿐 아니라 일부 곤충이 Bt에 내성을 가질 수 있다는 위협도 있다. 형질전환 식물 시스템에 대한 추가 제한 사항으로 선별 및 생성하는 것이 어렵고 시간이 많이 소요된다는 사실을 들 수 있다. 예를 들어, 형질전환 균주의 개발은 종자를 성공적으로 번식하거나 특정 환경에서 형질전환 식물 종의 자연적인 번식과 번식을 허용하는 능력에 의해 제한될 수 있다. 또한 형질전환 식물의 사용에 반대하는 중요한 사회적 압력이 발생했다. 서구 및 유럽 국가에서의 운동은 식품에 형질전환 식물을 사용하지 못하도록 노력해왔다. 또한 유기 및 비 형질전환 제품에 대한 새로운 시장이 지난 10년 동안 동시 발생함에 따라 비-형질전환 식물이 시장에서 프리미엄을 누리며 판매되게 되었다. 마지막으로, 한 가지 사례로, 형질전환 식물의 종자 공급을 제한하는 대형 농업 재벌에 의해 많은 형질전환 식물이 통제되어, 많은 제3 세계 국가에서의 광범위한 사용이 억제되고 있다
이러한 일부 제약사항을 해결하기 위한 노력의 일환으로, 내생미생물 (endophytes)와 같은 식물계 미생물을, 유익한 유전자의 전달 벡터뿐만 아니라 식물 질병을 유발하는 것과 같은 바람직하지 않은 유전자의 유전적 억제를 위해 활용할 수 있다. 식물은 뿌리, 잎 및 줄기 조직을 포함한 그 표면에서 뿐 아니라 세포 내에서도 많은 유익균들을 보유할 수 있다. 식물과 연계하여 살아가는 내생 및 이소성(ectopic) 박테리아에는 특히 다음의 하위 개념의 것들이 포함된다: 아시도박테리아, 악티노박테리아, 알파프로테오박테리아, 아르마티모나데테스, 박테리오데스, 베타프로테오박테리아, 델타프로테오박테리아, 퍼미큐테스, 그라마프로테오박테리아, TM7, 바실러스, 에스케리치아.
이들 박테리아 중 많은 것들이 생체외(in vitro)에서 신속하게 배양될 수 있으며 현재 그 유전학적 특징화가 불충분한 트랜스-킹덤(trans-kingdom) 전달 시스템에 의해 식물이 이용할 수 있는 외래 RNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다 (Baulcombe, 2015; Kim 등, 2014; Arguel 등, 2012). 예를 들어, 토마토 병원성 진균이 식물에 sRNA를 전달할 수 있고 진균 sRNA가 혈관 조직을 통해 식물 전체에 동원될 수 있다는 것이 입증되었다 (Baulcombe, 2015; Weiberg and Jin, 2015). 형질전환 식물체로부터의 siRNA의 트랜스-킹덤 전달이 성공적으로 증명되어 siRNA를 섭취하는 선충류를 방제하는데도 사용되었다 (Bakheti 등, 2005; Knip 등, 2014).
또한, 모기의 트립토판 신진 대사에 관여하는 필수 유전자인 HKT를 불활성화시키기 위해 표적화된 미세조류의 엽록체와 세포질에서 각각 생성 된 dsRNA및 siRNA 의 트랜스-킹덤 전달은, 3-히드록시키누레닌 트랜스아미나제($HKT$) 발현을 억압하여 모기의 치사율을 상승시키는 것으로 나타났다 (Kumar 등, 2015). 그러나 진핵생물과 달리 박테리아에는 dsRNA 전구체로부터 siRNA를 생성할 수 있는 다이서(Dicer)/RISC 복합체가 없다. 그러나, 전술한 바와 같이, 그러한 시스템은 여전히 응용 및 상업적 생존 능력 모두에서 잘 이해되지 않고 비효율적이다. 따라서 식물을 먹이로 하는 병원균, 해충 및 초식 동물을 통제하기 위해 식물에 억제 RNA 분자를 박테리아로 전달하는 것이 효과적으로 입증되지 않았다는 것은 놀라운 일도 아니다. 예를 들어, 일부는 dsRNA 또는 sRNA를 식물체에 직접 적용하여 유전자 발현을 제어하려고 시도하였으나, RNA를 생산하는데 엄청난 비용이 들었고 분해로 인해 RNA의 수명이 제한적이었다. (예컨대 Nature Plants 3, Article number: 16207 (2017) doi: 10.1038/nplants.2016.207 참조) 반대로, 본원에 기술된 새로운 시스템은 억제 RNA가 유전자 변형 박테리아에 의해 만들어지므로 이렇다할 비용 없이dsRNA 또는 sRNA를 연속적으로 생산할 수 있다.
억제 RNA 분자의 효과적인 박테리아 전달을 통한 식물 및/또는 초식 동물 집단에 특유한 질병의 생물학적 방제에 관한 전술한 문제점은 그에 대한 효과적이면서도 -그리고 경제적인- 해결책에 대한 오랜 필요성을 대변하는 것일 수 있다. 구현 요소가 이용가능 하였을 수 있지만, 이러한 요구를 충족시키기 위한 실제 시도는 어느 정도 부족했을 수 있습니다. 이는 당업자가 관련된 문제점 및 도전의 본질을 충분히 인식하거나 이해하지 못하였기 때문일 수 있다.
이러한 이해 부족으로 인해, 이러한 오래된 요구 사항을 충족시키기 위한 시도는 본원에서 확인된 문제점이나 과제들 중 하나 이상을 효과적으로 해결하지 못하였을 수 있다. 이러한 시도는 심지어 본 발명 기술에 의해 취해진 기술적인 방향에서 벗어났을 수도 있고, 심지어 이 분야의 일부에 의해 취해진 접근법의, 어느 정도 예상치 못한 결과로서 여겨지는 본원 기술의 달성을 야기할 수도 있다. 이하에서 보다 자세히 설명되는 바와 같이, 본원의 기술은 실로 효과적인 벡터 생물방제 전략 목적을 만족하면서도, 전통적인 식물 병원체 방제 시스템의 한계를 극복한다.
발명의 간단한 개요
일반적으로, 본원의 기술은 식물 병원체, 식물 바이러스, 진균 병원체, 해충 등을 포함하는 식물 병원체 및 해충의 방제를 위한 새로운 전략에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 선택된 식물 병원체 및 초식 동물의 생물학적 방제를 위한 신규한 기술, 시스템 및 방법을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 바이러스 게놈에 상동인 억제 RNA의 신규한 트랜스-킹덤 전달에 관한 본 발명은 바이러스 단백질의 바이러스 복제 및 번역을 효율적으로 하향 조절하거나 제거한다.
바람직한 일 구체예는 인코딩된 단백질 축적 수준의 감소를 초래하는 분해를 위해, 병원체를 코딩하는 RNA를 표적으로 하는 헤어핀 RNA/dsRNA 분자의 신규한 트랜스-킹덤 전달을 포함할 수 있다. 이 새로운 트랜스-킹덤 전달은 병원체 코딩 또는 조절 RNA 서열과 상동성인 조절 dsRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 구조물을 지닌 유전자 변형된 내생 박테리아로 식물을 감염시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예는 바이러스성 병원체가 인코딩된 단백질을 표적으로 하는 헤어핀 RNA의 신규한 트랜스-킹덤 전달을 포함할 수 있는데 이에 의해 바이러스 단백질 축적 수준이 감소된다. 이 새로운 트랜스-킹덤 전달은 표적 병원체 단백질에 상동성인 헤어핀 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 구조물을 지닌 유전자 변형된 내생 박테리아로 식물을 감염시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예는 진균성 병원체가 인코딩된 단백질을 표적으로 하는 헤어핀 RNA의 신규한 트랜스-킹덤 전달을 포함할 수 있는데 이에 의해 진균 단백질 축적 수준이 감소된다. 이 새로운 트랜스-킹덤 전달은 표적 병원체 단백질에 상동성인 헤어핀 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 구조물을 지닌 유전자 변형된 내생 박테리아로 식물을 감염시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 일 구체예는 바이러스 단백질 축적 수준의 감소를 초래하는, 해충 인코딩 단백질을 표적으로 하는 헤어핀 RNA의 신규한 트랜스-킹덤 전달을 포함할 수 있다. 이 새로운 트랜스-킹덤 전달은 표적 병원체 단백질에 상동성이거나, 또는 이에 지향된 헤어핀 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 구조물을 지닌 유전자 변형된 내생 박테리아로 식물을 감염시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 그의 발현이 관심 대상 유전자의 표적화된 mRNA의 턴오버를 유도할 수 있는 hpRNA, dsRNA, shRNA, siRNA 또는 마이크로RNA와 같은 억제 RNA 분자를 이용하여, 번식, 병원성 및/또는 일반적인 대사에 관여하는 병원체에 특유한 표적화 유전자의 불활성화를 표적으로 할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 도입함으로써 식물 병원체를 무력화, 잠재적으로 사멸 및/또는 그 복제를 방지하기 위한, 신규한 크로스-킹덤 메커니즘을 이용하여, 식물 매개 질병 제제를 방제하는 혁신적인 시스템 및 전략을 포함할 수 있다. 특유의 관심 대상 표적 유전자의 예로는 진균 및 곤충의 대사 유전자에 대한 바이러스 코트 단백질, 곰팡이 세포 벽 유전자, 곤충 외골격 구성 요소 유전자 및 종 특이적인 고유 mRNA 표적을 들 수 있다.
추가의 구체예는 식물 뿌리, 줄기, 잎 및 생식 기관에서 발견될 수 있는 조작된 내생 박테리아에서의 hpRNA, dsRNA, shRNA, siRNA 및 마이크로RNA와 같은 억제 RNA 분자의 발현을 포함한다. 이 구체예에서, 본 발명의 기술은 필수 또는 다른 표적 식물 병원체 및/또는 초식 동물 유전자의 녹다운을 위한 다양한 크로스-킹덤 메카니즘을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이것은 병원성 또는 번식 등에 필요하거나 필수적인 표적 식물, 병원체 및/또는 초식 동물을 하향 조절할 수 있는 특이적인 억제 RNA 분자를 발현하는 조작된 미생물을 식물 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 본 발명 기술의 추가 구체예들은 내생 박테리아, 식물 및/또는 초식 동물 계에서 특이적인 억제 RNA 분자 및 다른 단백질의 발현을 표적 수준으로 허용하는 다양한 프로모터 및 다른 유전 요소를 갖는, 플라스미드 등과 같은 유전자 구조물도 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 식물 세포에서 서열 상동성 표적화에 의해 병원체 유전자(들)을 하향-조절하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 핵산 구조물, 그리고 이 핵산 구조물에서 사용하기 위한, hpRNA 또는 어닐링된 dsRNA와 같은 억제 RNA 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이 방법은 억제RNA를 생성할 수 있는 핵산 구조물을 세포에 도입하고, 표적 병원체 유전자 또는 서열의 발현을 억제하는 siRNA (작은 간섭 RNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA) 를 생성하는데 충분한 시간 동안 핵산 구조물을 발현시키는 것을 포함한다. miRNA 구조물은 이중 가닥 RNA (dsRNA) 또는 헤어핀 (hpRNA)을 형성할 수 있는 변형된 RNA 전구체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 상기 변형된 RNA 전구체는 변형된 miRNA 및 변형된 miRNA에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 변형된 miRNA는 (i) 표적 서열에 전적으로 또는 부분적으로 상보적이 되도록 변형된 miRNA이다. 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, pre-miRNA는 일부 경우에 이중 가닥 영역이 매우 짧을 수 있는, 예를 들어 길이가 21-25 bp를 초과하지 않는 헤어핀을 형성한다. 핵산 구조물은 폴리 뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 이하에 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 상기 세포는 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 옥수수, 밀, 쌀, 보리, 귀리, 사탕수수, 수수, 해바라기, 홍화, 목화, 콩, 카놀라, 알팔파, 아라비돕시스(애기장대)를 들 수 있다. 일부 실시 예는 사과, 포도, 감귤류, 배, 복숭아, 자두, 오렌지, 레몬, 라임, 자몽, 석류, 올리브, 땅콩, 담배 등과 같은 특정 쌍떡잎 작물일 수 있다. 또한, 식물은 장미, 금잔화, 달맞이꽃, 층층나무, 팬지, 제라늄 등과 같은 화훼 식물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 식물은 담배, 예컨대 엔. 벤타미아나(N. benthamiana), 엔. 타바쿰(N. tabacum)이다. 또 다른 예를 이하에 제시하였다. 프로모터는 병원체-유도성 프로모터이거나 또는 다른 유도가능한 프로모터일 수 있다. 변형된 miRNA의 표적 RNA에 대한 결합은 표적 RNA의 절단을 유도한다. 표적 RNA의 표적 서열은 유전자의 비-코딩 비-번역 영역, 코딩 서열, 인트론 또는 스플라이스 부위일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 변형된 식물 miRNA 또는 siRNA 전구체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 변형된 전구체는 dsRNA 또는 헤어핀을 형성할 수 있고 변형된 miRNA 및 변형된 miRNA에 상보적인 서열을 포함하며, 여기서 상기 변형된 miRNA는 (i) 표적 서열에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 miRNA이다. 폴리 뉴누클레오타이드의 발현은 표적 서열의 발현을 억제하는 성숙한 miRNA를 제공하기 위해 숙주 세포에서 가공되는 miRNA 전구체를 생산한다. 억제 RNA 폴리뉴클레오타이드(들)은 내생 박테리아 또는 중화된 병원성 박테리아와 같이, 유전자 변형된 미생물을 통해 식물에 전달될 수 있는 플라스미드와 같은 핵산 구조물로부터 형성될 수 있다. 핵산 구조물은 또한 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 병원체-유도성 프로모터이거나 또는 다른 유도가능한 프로모터일 수 있다. 변형 된 miRNA와 표적 RNA의 결합은 표적 RNA의 절단을 유도한다. 표적 RNA의 표적 서열은 유전자의 비-코딩 비-번역 영역, 코딩 서열, 비-코딩 서열 또는 스플라이스 부위일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 다수의 표적 서열을 억제하기 위한 억제 RNA 핵산 구조물을 제공한다. 핵산 구조물은 적어도 2 개 내지 45 개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 각각은 dsRNA 또는 헤어핀을 형성할 수 있는 miRNA 전구체를 인코딩한다. 각각의 miRNA는 실질적으로 표적에 상보적이거나 본원에 설명된 바와 같이 표적에 상보적으로 변형된다. 일부 구체예에서, 구조물 내의 전구체 miRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 각각은 단일 프로모터의 제어하에 개별적으로 위치한다; 일부 구체예에서, 전구체 miRNA를 인코딩하는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 단일 프로모터의 제어하에 놓일 수 있도록 함께 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 다수의 miRNA의 구조물에 작동가능하게 연결될 수 있거나 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 병원체-유도성 프로모터 또는 다른 유가능한 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, 다수의 폴리뉴클레오타이드들이 서로 연결되어 발현시 단일 전사체를 형성한다. 핵산 구조물에서 폴리뉴클레오타이드의 발현은 다수의 miRNA 전구체를 생성하며, 이들은 숙주 세포에서 가공되어 각각이 표적 서열의 발현을 억제하는 다수의 성숙한 miRNA를 제공한다. 일 구체예에서, 각각의 표적 RNA에 대한 성숙한 miRNA 각각의 결합은 각각의 표적 RNA의 절단을 초래한다. 표적 RNA의 표적 서열은 유전자의 비-코딩 비-번역 영역, 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 비-번역 영역, 비-코딩 서열 또는 스플라이스 부위일 수 있다. 억제 RNA 폴리뉴클레오타이드(들)은 내생 박테리아 또는 중화된 병원성 박테리아와 같은 유전자 변형된 미생물을 통해 식물에 전달될 수 있는 플라스미드와 같은 핵산 구조물로부터 형성될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 유전자 변형된 박테리아를 통해 억제 RNA 분자를 식물 세포에 전달하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 유전자 변형된 박테리아는 dsRNA 및 hpRNA와 같은 억제 RNA 분자를 효율적이고도 안정적으로 생산하기 위한 유전적 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 유전자 변형된 박테리아는 박테리아에 존재하는 dsRNA를 분해할 수 있는 RNAaseⅢ 활성이 감소되거나 그러한 활성을 갖지 않도록 변형되었을 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 유전자 변형 박테리아는 RNAase Ⅲ의 녹-아웃 (knock-out)을 포함하거나, 또는 효소 활성이 감소되거나 없는 돌연변이형 RNAase Ⅲ를 발현하도록 변형된 것일 수 있다.
특정 구체예에서, 조성물은 표적 서열의 영역에 실질적인 상보성을 갖는 억제 RNA를 인코딩함으로써 표적 유전자 발현을 선택적으로 억제한다. miRNA/siRNA가 핵산 구조물에 제공되는데 이것은 RNA로 전사될 경우 세포에 의해 성숙한 siRNA/miRNA를 생성하도록 가공된 다음, 표적 유전자 또는 일반적으로 후술되는 서열의 발현을 억제하는 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예상된다.
추가의 구체예에서, 임의의 특정 표적 병원체 유전자에 대한 억제 RNA를 코딩하기 위해 핵산 구조물이 제공된다. 이것은 예를 들어, 식물 세포 내 또는 주위에 콜로니화하여, miRNA 프로세싱을 위해 억제 RNA를 발현 및 식물 세포에 전달하여 본원에서 일반적으로 설명된 바와 같이 표적 병원체 유전자의 억제를 야기할 수 있는 유전자 변형된 박테리아에 의해 발현될 수 있는 플라스미드 상에 코딩될 수 있다. 어떠한 억제 RNA든 구조물 내로 삽입될 수 있다. 인코딩된 억제 RNA가 표적 병원체 유전자를 선택적으로 표적화여 억제하도록 임의의 RNA를 구조물에 삽입할 수 있다.
추가의 구체예에서, 표적 서열을 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 억제 RNA 분자가 표적 서열의 영역에 디자인되고 박테리아 플라스미드와 같은 구조물에 삽입되는 상기 구조물을 사용한다. 예를 들어, 내생 박테리아 (endophytic bacteria)를 통한 세포 내로의 도입시, 박테리아 내에서 생성된 miRNA는 생성되어 식물 세포로 전달되어 본원에서 일반적으로 기술 된 바와 같이 표적화된 서열의 발현을 억제한다. 일부 구체예에서, 유전자 변형된 박테리아는 선택 또는 유전자 조작 소포과형성(hypervesiculation)을 통해 출현할 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 소포과형성은 박테리아 플라스미드에 의해 생성된 억제 RNA 분자를 주변 세포, 세포 표면 또는 다른 세포 식물 구조로 효율적으로 수송하는 것을 도울 수 있다.
특정한 일 구체예에서, 표적 유전자 또는 서열은 내인성 식물 유전자 또는 이종 유전자일 수 있다. 표적 유전자는 또한 식물 병원체, 예컨대 병원성 박테리아 또는 바이러스, 선충류, 초식 동물, 곤충 또는 곰팡이 또는 진균으로부터의 유전자일 수 있다. 구조물 및/또는 miRNA를 포함하는 식물, 세포 및 종자가 제공된다. 전형적으로, 세포는 식물의 세포일 것이지만, 비제한적인 예로서 효모, 곤충, 선충 또는 동물 세포를 비롯한 다른 진핵 세포도 고려된다. 식물 세포에는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물의 세포가 포함된다. 본 발명은 또한 상기 구조물 및/또는 miRNA를 포함하는 식물 및 종자도 제공한다. 상기 구조물을 포함하는 바이러스 및 원핵 세포도 제공된다.
일부 구체예에서, 표적 유전자 또는 서열 (이들 용어는 일반적으로 호환가능함)은 식물 병원체로부터 선택된다. 표적 유전자 또는 병원체에 대한 억제 RNA 분자를 포함하는 식물 또는 세포는 그 병원체에 대해 감소된 감수성 및/또는 증가된 내성을 가질 것으로 예상된다. 일부 구체예에 있어서, 억제 RNA 분자는 내생 박테리아에서 발현되고 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 박테리아 플라스미드와 같은 핵산 구조물에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 병원체-유도성 프로모터이다.
본 발명의 한 가지 목적은 식물에서 표적 유전자 발현 및 바이러스 복제를 차단하기 위한 박테리아 dsRNA 안정화 및 전달 시스템의 개발을 포함한다. 도시된 바와 같이, dsRNA 생산 및 식물체로의 전달은 dsRNA 생합성, 배출, 안정화, 숙주로의 도입 및 병원균 복제의 불 활성화의 조절을 아우르는 다성분 공정이다.
본 발명의 한 가지 목적은 박테리아로부터 식물 숙주 세포로의 dsRNA 전달을 향상시키기 위한 시스템 및 방법을 포함한다. 특정 구현 예에서, 이는 dsRNA 생산, 안정화, 배출 및/또는 전달을 향상시키는 박테리아 균주 및 헬퍼 유전자의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 종류의 박테리아는 독소와 단백질을 비롯한 다양한 분자가 숙주 생물에 접근할 수 있도록 하는 다양한 분자 분비 시스템을 발달시켰다. 이하에 6 가지 박테리아 분비 시스템에 대해 설명한다. 이들 6 가지 분비 시스템은 공통적이고도 고유한 작용 양식을 갖는다. II형 및 V형 분비 시스템은 단백질이 처음에는 박테리아의 내막(IM)을 통과한 다음 외막(OM)을 통해 수송되는 2 단계 과정이다. I형, Ⅲ형 및 IV형 분비 시스템을 통한 분비의 경우, 물질은 세포외 환경 또는 숙주 세포로 직접 전달된다. Ⅲ형 시스템은 병원성 박테리아에 의한 인자들의 수송에 특이적이고 숙주 세포로의 직접 주입을 포함한다. 독특한 VI형 분비 시스템은 박테리아가 박테리아 외막으로부터 형성된 세포외 소포의 세포외 환경으로 단백질 및 지질의 대규모 복합체 그룹을 분비하도록 한다. 이어서 이들 소포들은 숙주 세포와 융합하여 그들의 화물을 전달한다.
본 발명의 목적, 장점 및 신규한 특징, 및 추가의 적용 범위는 첨부된 도면과 관련하여 취해진 상세한 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 이하의 검토 또는 본원발명의 실시에 따라 부분적으로 당업자에게 명백히 이해될 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 특히 첨부된 청구 범위에서 지적된 수단 및 조합에 의해 실현되고 달성될 수 있다.
도 1: hpRNA 벡터 pAD-WRKY-GHYl의 지도.
도 2: hpRNA 벡터 pAD-ADH-GHY2의 지도.
도 3: hpRNA 벡터 pOXB-WRKY-GHY3의 지도.
도 4: hpRNA pOXB-ADH-GHY4의 지도.
도 5: hpRNA pAD-WRKY-GHY5의 지도.
도 6: hpRNA p AD-ADH-GHY6의 지도.
도 7: hpRNA p AD- WRK Y-GHY7의 지도.
도 8: RNaselll 돌연변이주의 성공적인 구축을 입증하기 위한 PCR 분석
도 9: 비. 세레우스(B. cereus) 53522 균주의 동정. 레인 M: lkb DNA 래더. 레인 1: PminiT-16s rRNA를 Xhol로 절단하였다. 레인 2: PminiT-23s rRNA를 Xhol로 절단하였다. 레인 3: PminiT-motB를 Xhol로 절단하였다. 레인 4: PminiT-엔도-글루카나제를 Xhol로 절단하였다. 레인 5: PminiT-rncA를 Xhol로 절단하였다.
도 10: 7 dpi 후 엔. 타바쿰(N. tabacum)에서의 침윤 증상. (At: 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)); TMV: pJL-TRBOG; MJM109: M-JM109-GHY2 (RNaselll 돌연변이주, 무항생제); GHY5: pAD-WRKY-GHY5; GHY6: pAD-ADH-GHY6; GHY3: pOXB-WRKY-GHY3; GHY4: pOXB-ADH-GHY4)
도 11a: 엔. 타바쿰(N. tabacum)의 건강한 잎과 침윤된 잎의 UV 조사 하에서 검출된 증상 및 GFP 시그널
도 11b: 7 dpi에서 UV 조사 하에서의 엔. 타바쿰(N. tabacum)의 TMV-GFP 시그널.
도 11c: 7 dpi에서 UV 조사 하에 M-JM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY1로 처리된 엔. 타바쿰(N. tabacum)의 TMV-GFP 시그널.
도 12: 담배 식물에서 TMV-인코딩된 GFP 시그널의 확산을 억제하는 hpRNA의 효능을 입증하는 시간-경과 이미지
도 13: 엔. 타바쿰(N. tabacum)에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CCB422/pAD-WRKY-GHY5에 의한 담배 침윤.
도 14: 엔. 벤타미아나(N. benthamiana)에서 잎 전체 침윤에서 At/TMV 시그널의 확산을 억제하는데 있어 hpRNA에 의한 대장균 균주 HT27의 소포과형성.
도 15: 모델 식물 생물체에서 hpRNA 매개된 GFP 시그널 억제 효율의 시간-경과 입증.
도 16: 7 dpi에서 잎 구조를 통한 TMV-GFP의 확산은 siRNA 이동 증상을 제한한다.
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도 17: MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5 유래된 siRNA는 담배 식물 모델에서 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한시켰다.
도 18a-b: siRNA는 담배 식물 모델에서 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한시켰다.
도 19a-c: 자연광 및 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC)에 노출 하에 4X 배율로 관찰된 Bc53522/pAD43-25 및 Bc53522/pAD-WRKY-GFfY5의 콜로니. A)는 자연광 하에서 4X 배율로 관찰된 Bx53522/pAD43-25의 콜로니를 나타낸다. B)는 4X 배율로 관찰된FITC에 노출된 Bc53522/pAD43-25 콜로니로서 녹색 시그널을 나타낸다. C)는 4X 배 배율로 자연광 하에서 관찰된 Bc53522/pAD-WRKY-GHY5의 콜로니를 나타낸다; D)는 4X 배로 관찰된 FITC에 노출된 Bc53522/pAD-WRKY-GETY5의 콜로니로서 아무런 시그널도 나타내지 않는다.
도 20a-c: 예시적인 담배 식물에서 비.세레우스(B. cereus)의 콜로니화. A) 담배에 접종된 B. cereus는 식물에게 유해한 증상을 나타내지 않았다. B) 자외선 하에서의 GFP 시그널. C) 형광 스테레오 현미경 하에서의 식물의 다른 영역의 GFP 시그널.
도 21: 바이러스 인코딩된 GFP를 표적으로 하는 헤어핀 RNA의 트랜스-킹덤 전달은 바이러스 단백질 축적 수준을 감소시킨다. A) hpRNA의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) CCB422 매개된 트랜스-킹덤 전달은 숙주의 RNAi 반응을 성공적으로 촉발시켜 N.tabacum 식물에서 바이러스 GFP 축적을 현저하게 감소시킨다. B) TMV-GFP 감염 샘플 및 TMV-GFP + pAD-WRKY-GHY5 (CCB422) 침윤 샘플에서 GFP 단백질 수준의 정량화. GFP 시그널을 RBCL에 대해 정규화시켰다. 참고로 사용된 TMV-GFP 복제 # 1. C) 바이러스 GFP 단백질은 HT27을 인코딩하는 hpRNA 트리거가 공침윤된 TMV 샘플에서 검출 불가능함. 면역-검출로부터의 GFP3c 시그널. 로딩 컨트롤로서의 RBCL (Ponceau 염색).
도 22: HT27/pAD-WRKY-GHY5에 의한 TMV-GFP mRNA 억제를 모니터하기 위한 qPCR. hpRNA를 발현하는 박테리아 대 대조군에 감염된 식물에서의 GFP mRNA 억제에 대한 qPCR 데이터 (TMV-GFP 단독, TMV-GFP 플러스 hpRNA가 없는 박테리아).
각종 표와 서열목록도 본원에 제공되며 이들도 명세서의 일부이다.
발명을 수행하기 위한 형태
본 발명은 다양한 양태를 포함하며, 이들은 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 구성 요소들을 열거하고 본 발명의 일부 실시예를 설명하기 위해 제공된다. 이들 요소는 처음 구체예와 함께 열거되지만, 부가적인 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식으로 및 임의의 수로 얼마든지 조합가능함을 이해하여야 한다. 다양하게 기술된 예시들 및 바람직한 실시예들은 본 발명을 명시적으로 기술된 시스템들, 기술들, 및 애플리케이션들 만으로 국한시키는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 명세서의 설명은 다양한 구체예, 시스템, 기술, 방법, 장치 및 적용예 모두의 설명 및 청구범위를, 임의의 수의 개시된 구성 요소, 각각의 구성 요소 단독 및 본원 또는 임의의 후속 출원에서의 모든 구성요소들의 임의의 그리고 모든 다양한 순열 및 조합으로 뒷받침 및 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
식물 병원체, 병충해 및 초식 동물의 유전적 조절을 위한 방법 및 조성물은 모두 일반적으로 집합적으로 식물 병원체(들)로 기술된다.
강화된 siRNA 매개 간섭을 위한 표적 유전자로 사용하기 위해 식물 병원체, 해충 및/또는 초식 동물의 생명주기에 필수적인 하나 이상의 유전자(들)을 확인하는 방법 역시도 제공된다. 억제 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 식물 병원체의 성장, 생존, 발달 및/또는 번식에 필수적인 하나 이상의 표적 유전자를 억제하도록 고안될 수 있다. 이러한 억제 RNA 분자를 효율적으로 감염, 생산, 및 전달하도록 조작될 수 있는 유전자 변형된 내생 박테리아 또는 다른 미생물도 본 발명에서 설명된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 식물 병원체에서 표적 유전자의 코딩 서열 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 표적 유전자의 발현 또는 억제를 전사후 억제시키는 방법을 제공한다. 이들 및 추가의 구체예에서, 해충 또는 초식 동물은 표적 유전자의 코딩 서열 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 전부 또는 일부로부터 전사된 하나 이상의 dsRNA, siRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있음으로 해서, 식물-보호 효과를 제공한다.
본 발명 기술의 일 구체예는 유전자 조작된 미생물에 의한 감염을 통해 표적 식물 세포 내로 억제 RNA 분자를 도입하는 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포 내에서 하나 이상의 억제 RNA 분자를 발현할 수 있는 박테리아, 진균 또는 심지어 바이러스와 같은 유전자 조작된 미생물을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 억제 RNA 분자는 억제 RNA 분자가 전형적으로 세포 내 특정 표적 mRNA 분자의 파괴를 일으킴으로써 유전자 발현을 억제 또는 녹-다운시키는 생물학적 과정을 개시할 수 있다. 추가적인 구체예는 식물 병원 발생에 필요한 유전자를 억제하는 억제 RNA 분자를 식물 시스템에 도입할 수 있다. 이러한 구체예는 바이러스 코트 단백질, 진균 세포벽 유전자, DNA 및 RNA의 복제 및 생산에 관여하는 유전자의 억제를 표적으로 하는 독특한 종-특이적 유전자 서열, 곤충 엑소 골격 성분 유전자, 종-특이적 대사 유전자 및 초식 동물을 표적으로 할 수 있는 억제 RNA 분자를 식물 시스템 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 바람직한 구체예는 예를 들어 안정화 단백질 등의 안정화 인자의 사용을 통한 억제 RNA 분자에 대한 개선된 전달 시스템을 포함할 수 있다. 본 발명의 기술의 또 다른 바람직한 구체예는 smRNA 또는 dsRNA 전구체 안정화 단백질 또는 hpRNA/dsRNA 세포 내 전달 단백질의 동시 전달에 의해 식물 세포 내에서 억제 RNA 분자의 전달을 촉진시키는 개선된 시스템을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 특정 이펙터 복합체에 대한 직접적인 smRNA 로딩 또는 예컨대 식물 체관부(plant phloem)를 통해 그의 전달을 용이하게 할 수 있는 dsRNA로 특정 RNA 모티프를 통합시킬 수 있다. 또 다른 구체예는 가공 효소 활성을 갖는 특정 단백질을 추가로 공동-발현시킬 수 있는 유전자 구조물을 포함할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 포함할 수 있다.
다른 유사한 구체예는 병원체 경로를 표적화할 수 있는 2차 하류 숙주 유전자를 활성화할 수 있는 억제 RNA 분자 및/또는 유전자의 동원을 향상시킬 수 있는 다양한 유전자를 발현하거나 심지어 과발현할 수 있는 식물 시스템에 미생물을 도입하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예는 dsRNA, shRNA, hpRNA (일부 구체예에서, dsRNA의 헤어핀 루프에 위치한 표적화 생물로부터의 인트론을 함유함), siRNA, 및 마이크로RNA와 같이, 병원체 게놈에 상동성이면서 성장, 증식, 대사 또는 병원성에 책임이 있는 중요하거나 필수적인 유전자들을 표적으로 하는 억제 RNA 분자를 발현하도록 추가로 유전자 조작될 수 있는 잎 및 뿌리의 내생 및 외생 박테리아를 제공하는 것일 수 있다. 이들 억제 RNA 분자는 숙주 다이서/RISC 복합체에 의해 매개되는 ~ 21-22 뉴클레오타이드 siRNA의 생성을 통해 식물 바이러스, 진균 및 곤충 병원체 및 해충에서 이들 필수 표적 유전자의 발현을 불활성화 및/또는 녹-다운시킬 수 있다. 이 과정은 일반적으로 RNA 간섭 또는 RNAi라고 칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)은 특정 유전자의 발현을 방지하기 위해, 예를 들어 hpRNA에 의해 제공되는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 촉발된 전사후 유전자 사일런싱 (PTGS: post transcriptional gene silencing)을 유도하는 생물학적 메카니즘이다. 예를 들어, 바람직한 일 구체예에서, RNA 간섭은 짧은 hpRNA 분자가 세포질에 직접 도입되고 한데 어닐링되어 dsRNA를 형성한 다음 다이서 효소에 의해 짧은 단편으로 절단될 수 있음으로 해서 달성가능하다. 이 다이서 효소는 dsRNA를, 3 '말단에 2-뉴클레오타이드 돌출부(overhang)가 있는 ~ 21-22- 뉴클레오타이드인, 작은 간섭 RNA (siRNAs)로 가공할 수 있다. siRNA의 안티센스 가닥은 엔도뉴클리아제-단백질 복합체, RISC (RNA-induced silencing complex: RNA-유도된 사일런싱 복합체)에 특화되며, 이어서 이것은 상동성 RNA를 표적화하여 이를 특정 부위에서 분해시킴으로 해서, 단백질 발현을 녹-다운시킨다.
hpRNA, dsRNA, shRNA, siRNA 및 마이크로RNA 종을 식물에 전달할 수 있는 내생 박테리아에는 다음 아문(subphyla)에 속하는 것들을 들 수 있다: 아시도박테리아 (Acidobacteria), 악티노박테리아 (Actinobacteria), 알파프로테오박테리아 (Alphaproteobacteria), 아르마티모나데테스 (Armatimonadetes), 박테리오데스 (Bacteriodes), 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria), 델타프로테오박테리아 (Deltaproteobacteria), 퍼미큐테스 (Firmicutes), 그라마프로테오박테리아 (Grammaproteobacteria), TM7, 바실러스 (Bacillus), 에스케리치아(Escherichia).
바람직한 일 구체예에서, 식물을 감염시키거나 또는 달리 콜로니화사커나 또는 그의 표면 잎, 줄기 또는 뿌리에서 살 수 있는 내생, 외생 또는 임의의 박테리아를, 억제 RNA 분자를 생성할 수 있는 플라스미드와 같은 인공적으로 만들어진 유전자 구조물을 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 이러한 플라스미드는 식물의 자손들과 식물 물질을 섭취하는 어떤 해충이나 초식 동물 사이의 수직적 전달뿐만 아니라 환경적 접종을 광범위하게 허용할 수 있는 접합을 통해 다른 박테리아로 옮길 수 있도록 구성될 수 있다.
이 구체에에서, 이러한 구조물은 프로모터, 터미네이터, 공동-활성화제 및 공동-리프레서 그리고 원핵생물뿐만 아니라 진핵생물 시스템에서 조절될 수 있는 유사한 제어 요소들과 같은 전사 조절 부분을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 시스템 내에서 발현되는 억제 RNA 분자의 유형, 시기 및 양을 제어할 수 있다. 추가의 구체예는 식물 병원체에 반응하여 생성된 스트레스-관련 단백질 또는 심지어 식물 병원체 등에 의해 생성된 단백질 및 기타 전구체 화합물 등, 식물 세포 내의 특정 단백질 또는 화합물의 존재 여부 등과 같은, 외부 인자를 통해 유도될 수 있는 유전자 구조물을 포함할 수도 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 기술은 하나 이상의 억제 RNA 분자를 생성하는 유전자 변형된 잎 및 뿌리의 내생 및 외생 박테리아를, 억제 RNA 분자가 표적 바이러스, 진균 및 곤충 병원체와 초식동물의 발현을 불활성화 및/또는 녹-다운시킬 수 있는 표적 식물 아문 및/또는 종으로 전달시킬 수 있는 시스템 및 방법을 포함할 수도 있다. 특정 구체예에서, 하나의 문 또는 심지어 특정 종에 특이적인 것으로 알려진 박테리아와 같은 미생물을 선택할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 억제 RNA 분자의 전사 활성화 및 촉진은 하나의 문 또는 심지어 특정 식물 또는 초식 동물 종에 특이적인 특정 인자의 존재에 의존할 수 있다. 추가의 구체예는 표면 단백질의 발현 또는 억제, 및 특정 식물 계통 또는 심지어 특정 식물 종에 대한 수입 인자 등 독성 인자의 증가 및 표면 단백질 또는 다른 부산물 단백질 등 예를 들어, 숙주 식물 세포가 면역형 방어를 일으킬 수 있는 세포 내 숙주 수용체에 의해 인식될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명 기술은 하나 이상의 단백질 또는 단백질 복합체에 의해 추가로 안정화될 수 있는 종-특이적 억제 RNA 분자뿐만 아니라 병원체의 트랜스-킹덤 전달을 위한 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 안정화 단백질은 식물의 RNA 사일런싱 반응의 억제에 기여할 수 있는 톰부바이러스인 식물 RNA 바이러스로부터 선택된 P19 단백질을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어 P19 단백질은 전형적으로 이량체로서 siRNA를 인식하고 이에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로 PI9 단백질은 외인성 또는 내인성 여부에 관계없이 siRNA를 격리할 수 있으며 결과적으로 Agronaute 단백질에의 그의 로딩 및 RISC(RNA-유도 사일런싱 복합체)의 형성을 방지한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명 기술은 식물 체관부를 통한 박테리아 합성 RNA의 전달을 용이하게 하기 위해 dsRNA와 같은 억제 RNA 분자 내로의 RNA 동원 모티프의 통합을 포함할 수 있고 박테리아에서 병원체 및 초식동물 필수 유전자의 불활성화를 표적으로 하는 RNA 종과 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 원형질연락사(plasmodesmata) 와 체관부는 직접적인 세포 간의 커뮤니케이션 및 식물 전체에 수송을 매개하는 단순화 된 네트워크를 형성한다. 선택된 내인성 RNA, 바이러스 RNA는 이 네트워크를 통해 특정 세포 또는 기관 간의 트래픽을 회피한다. 전술한 바와 같이, 바람직한 일 구체예에서, 세포 경계를 뛰어넘어 수송을 촉진하는 세포 인자와 상호 작용하는 서열/구조 모티브를 포함하도록 억제 RNA 분자를 생성할 수 있다.
특정 구체예에서, 상이한 서열/구조 모티프를 발현하는 다수의 억제 RNA 분자가 동시에 발현될 수 있다. 이 구체예에서, 상이한 서열/구조 모티프는 다중 특이적 세포 경계 및/또는 세포 유형에 걸친 억제 RNA 분자의 다중 방향 수송을 허용하는 특정 모티프의 인식을 허용할 수 있다. 이러한 모티프는 특정 문 (phyla) 및/또는 종 (species) 내에서 특이적인 활성 또는 불활성을 나타내도록 추가로 설정될 수도 있다.
본 발명 기술의 또 다른 구체예는 일반적으로 억제 활성이라 칭해지는, 감소된 RNase Ⅲ 발현, 또는 불활성화된 RNase Ⅲ 기능 또는 활성을 갖는 신규한 박테리아 균주의 개발을 포함할 수 있다. 이러한 RNase Ⅲ 발현 및/또는 활성의 감소 또는 불활성화는 dsRNA 종의 보다 작은 RNA 종으로의 RNase Ⅲ-매개 프로세싱을 억제 또는 감소시킬 수 있다.
부가적인 구체예는 dsRNA 종의 보다 작은 RNA 종으로의 프로세싱이 향상되도록 RNase Ⅲ을 과발현하는 신규 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 본 발명 기술은 또한 바이러스 및 진균 불활성화를 표적으로하는 2 차 siRNA의 2 차 숙주 (식물) RNA-의존성 RNA 폴리머라제-의존성 발현을 촉발하기 위해 바이러스 siRNA를 인코딩하는 dsRNA를 세균적으로 발현시키는 시스템 및 방법의 개발을 포함할 수 있다. 전술한 시스템 각각은 프로모터, 터미네이터, 보조-활성화제 및 보조-억제제와 같은 전사-조절 요소 및 원핵 및 진핵 시스템에서 조절가능한 다른 조절 요소들을 포함할 수 있는 유전 구조물을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 시스템 내에서 발현되는 RNAase Ⅲ 또는 다른 단백질의 유형, 타이밍 및 양을 제어할 수 있다. 추가의 구체예는 식물 병원체에 반응하여 생성된 스트레스-관련 단백질 또는 심지어 식물 병원체 등에 의해 생성된 단백질 및 기타 전구체 화합물 등, 식물 세포 내의 특정 단백질 또는 화합물의 존재 여부 등과 같은, 외부 인자를 통해 유도될 수 있는 유전자 구조물을 포함할 수도 있다.
본 발명의 기술의 또 다른 구체예는 siRNA 동원을 향상시키는 것으로 알려진 유전자를 갖는 식물 숙주, 외인성 또는 유전자-변형된 박테리아 균주의 과발현을 촉진시키는 시스템 및 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 표 5 내지 표 8에 나타낸 바와 같이, 하기 칼럼 1에서 확인된 특정 단백질의 과발현은 대상 식물 또는 다른 시스템 전반에 걸쳐 siRNA 동원을 향상시킬 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 기술의 추가적인 구체예는 병원체의 게놈/유전자에 상동성인 hpRNA의 트랜스-킹덤 전달 및 발현의 신규 시스템을 포함할 수 있으며, 병원체 성장, 대사 또는 병원성 등에 필요한 필수 단백질의 바이러스 복제 및 번역을 효과적으로 하향-조절하거나 제거한다.
본 발명 기술의 추가적인 구체예는 식물 뿌리, 줄기, 잎 및 생식기관에서 발견가능한 조작된 내생 박테리아에서, dsRNA, shRNA, siRNA 및 마이크로 RNA와 같은 억제 RNA 분자를 트랜스-킹덤 전달 및 발현하기 위한 신규한 시스템을 포함할 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명 기술은 몇 가지 예를 들자면, 향상된 추위, 더위, 소금기, 가뭄 및 비생물적(abiotic) 스트레스 내성을 허용할 수 있을 뿐 아니라 다양한 식물 종에서 곤충/해충/병원체 내성 및 향상된 영양 결과 등 새로운 속성을 통합시킬 수 있는, 표적 유전자를 녹-다운시키기 위한 다양한 크로스-킹덤 메커니즘을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 병원체 단백질의 억제를 목표로 하는 헤어핀 dsRNA를 인코딩하는 플라스미드를 보유하는 내생 박테리아의 RNase Ⅲ 돌연변이체는 병원체 게놈 코딩 병원체 유전자를 발현하는 병원체에 감염된 식물에서 상기 단백질을 억제할 것이다.
바람직한 일 구체예는 dsRNA의 내생 박테리아 전달, 식물에서 siRNA 로의 가공 및 하나 이상의 병원체를 인코딩하는 유전자의 억제를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, dsRNA의 내생 박테리아 전달은 상기 병원체에 감염된 식물에서 상기 단백질을 억제할 수 있는 병원체 단백질의 억제를 목표로 하는, 헤어핀 dsRNA를 인코딩하는 플라스미드를 보유하고, RNase Ⅲ를 포함하지 않거나 RNase Ⅲ가 억제된 박테리아의 RNase Ⅲ 돌연변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 본원에 설명된 간섭 RNA 분자를 인코딩하는, 표적 식물에 자연적으로 콜로니화할 수 있는 하나 이상의 유전자 변형된 박테리아를 도입함으로써, 이종 DNA를 함유하는 상기 식물이 hpRNA와 같은 간섭 RNA 분자를 생성하고, 상기 간섭 RNA 분자가 표적 식물 병원체를 사멸시키거나 또는 표적 식물의 병원성 또는 중요(critical) 유전자 중 하나 이상의 발현을 억제하도록 함으로써, 바이러스 및 진균 질병과 같은 식물 병원체에 대한 상기 식물의 내성을 강화시키는 방법을 제공한다.
또 다른 구현 예는 식물의 표적 바이러스 질병에 대한 내성이 표적 바이러스 질환에 대한 상기 야생형 식물의 내성보다 크도록, 바이러스 질병에 대한 식물의 내성을 증강시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예는 표적 해충에 대한 식물의 내성이 표적 해충에 대한 상기 야생형 식물의 내성보다 크도록, 표적 해충에 대한 식물의 내성을 증강시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예는 식물의 표적 초식동물에 대한 내성이 표적 초식동물에 대한 상기 야생형 식물의 내성보다 크도록, 표적 초식 동물에 대한 식물의 내성을 증강시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들에 의해 입증된 또 다른 구체예로서, 병원체 내성 식물의 생성을 들 수 있다. 이 바람직한 구체예에서, 숙주의 RNAi 머시너리에 의해 병원체의 필수 RNA 전사체를 표적화함으로써 필수 병원체 RNA 분해를 초래할 수 있으며, 따라서 병원체의 필수 mRNA를 단백질로 번역하지 못하게 할 수 있다. 이 구체예에서, 병원체 인코딩 단백질과 상동성인 헤어핀 RNA와 같은 억제 RNA 분자의 신규한 트랜스-킹덤 전달에 의한 식물 숙주의 RNAi 방어 증강은, 식물 숙주에서 smRNA 생합성을 유발하여 궁극적으로 병원체 감염에 대한 내성을 부여함으로써, 병원체 인코딩 단백질 축적의 손실 또는 감소를 초래할 수 있다.
본 발명자들에 의해 입증된 또 다른 구체예로서, 바이러스성 병원체 내성 식물의 생성을 들 수 있다. 이 바람직한 구체예에서, 식물은 필수적인 바이러스 인코딩 단백질과 상동성인 hpRNA를 생산하는 내생 박테리아에 의해 감염될 수 있다. 이들 hpRNA 전사체는 숙주의 RNAi 머시너리에 의해 가공되어 필수적인 바이러스 RNA 분해가 초래될 수 있으며 이에 따라 해당 바이러스 병원체의 필수 mRNA를 단백질로 번역하지 못하게 할 수 있다. 이 구체예에서, 바이러스 인코딩 단백질과 상동성인 헤어핀 RNA와 같은 억제 RNA 분자의 신규한 트랜스킹덤 전달에 의한 식물 숙주의 RNAi 방어 증강은, 식물 숙주에서 smRNA 생합성을 유발하여 궁극적으로 병원체 감염에 대한 내성을 부여함으로써, 바이러스 인코딩 단백질 축적의 손실 또는 감소를 초래할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포에서 발현된 병원체 단백질의 억제를 표적으로 하는 hpRNA를 인코딩하는 플라스미드를 발현하는 내생 박테리아로서의 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 용도를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 이 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 균주는 RNase Ⅲ가 결핍되도록 유전자 변형될 수 있으며, 여기서 이러한 결핍은 감소된 RNase Ⅲ 발현 또는 불활성화된 RNase Ⅲ 기능을 의미할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 균주는 본원에 기술된 균주 53522를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포에서 발현된 병원체 단백질의 억제를 표적으로 하는 hpRNA를 인코딩하는 플라스미드를 발현하는 내생 박테리아로서의 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 용도를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 이 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 균주는 RNase Ⅲ가 결핍되도록 유전자 변형될 수 있으며, 여기서 이러한 결핍은 감소된 RNase Ⅲ 발현 또는 불활성화된 RNase Ⅲ 기능을 의미할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 균주는 본원에 기술된 균주 CCB422를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포에서 발현된 병원체 단백질의 억제를 표적으로 하는 hpRNA를 인코딩하는 플라스미드를 발현하는 내생 박테리아로서의 대장균 (E. coli)의 용도를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 이 균주는 RNase Ⅲ가 결핍되도록 유전자 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 이 균주는 소포과형성 유전형/표현형을 발현하도록 자연적으로, 또는 유전자 변형될 수 있다. 바람직한 일 구체에에서, 이 균주는 본원에 기술된 균주 HT27을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포에서 발현된 병원체 단백질의 억제를 표적으로 하는 hpRNA를 인코딩하는 플라스미드를 발현하는 내생 박테리아로서의 바실리스(Bascillis) 의 용도를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 이 균주는 RNase Ⅲ가 결핍되도록 유전자 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 이 균주는 소포과형성 유전형/표현형을 발현하도록 자연적으로, 또는 유전자 변형될 수 있다. 바람직한 일 구체에에서, 이 균주는 본원에 기술된 균주 HT27을 포함할 수 있다.
특정한 다른 구체예에서, 이들 내생 박테리아 균주 중 하나 이상에 의해 생성된 hpRNA는 원래의 감염 또는 도입 부위로부터 식물, 잎, 뿌리 또는 줄기를 통해 이동할 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 이들 내인성 세균 균주 중 하나 이상에 의해 생성 된 hpRNA는 식물 병원균 이동/신호의 이동을 방지 할뿐만 아니라 감염 또는 도입의 원래 위치로부터 식물, 잎, 뿌리 또는 줄기를 통해 이동할 수 있다. 이들 내인성 세균 균주 중 하나 이상에 의해 생성 된 hpRNA는 식물 병원균 이동/신호의 이동을 방지 할뿐만 아니라 감염 또는 도입의 원래 위치로부터 식물, 잎, 뿌리 또는 줄기를 통해 이동할 수 있으며, 식물 병원체의 이동/시그널을 방지할 수 있다.
또 다른 구체예는 표적 식물을 콜로니화하고 억제 RNA 분자를 전달하여 하나 이상의 필수 식물 병원체 유전자를 억제하여 증가된 병원체 내성을 제공하도록 구성된 유전자 변형 박테리아를 포함하는 조성물을 제공하며 본원에 개시된 이러한 방법은 표적 병원체로 이미 감염되었거나 감염 위험이 있는 식물을 국소적으로 치료하는데 사용된다.
특정 구체예에서, 이는 식물 병원체가 위치하는 식물 세포 또는 위치로 dsRNA 생산, 안정화, 배출 및/또는 전달을 향상시키는 헬퍼 유전자 및 박테리아 균주의 용도를 포함할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 박테리아는 다음을 포함하는 다수의 분비 시스템을 발달시켰다:
대장균(Escherichia coli)의 헤모리신 분비 시스템으로 예시되는 I형 분비 시스템 (TISS: Type I secretion system)은, 그램 음성 박테리아의 세포 외피를 가로 질러 다양한 크기의 단백질들의 통과를 용이하게 하는 단순한 삼자 시스템(tripartitie system)이다. 이들은 ATP-결합 카세트 (ABC: ATP-binding cassette) 트랜스포터 또는 프로톤-안티포터, 내막 (IM)과 외막 (OM)을 연결하는 어댑터 단백질 및 외막 공극로 구성된다. 이들은 안정적인 페리플라즈마 중간체가 없는 단일 단계로 기질을 분비한다. TISS는 RTX (repeat-in-toxin) 단백질 패밀리, 세포 표면층 단백질, 프로테아제, 리파아제, 박테리오신 및 헴(haem)-획득 단백질에 속하는 세포 독소의 분비에 관여한다.
II형 분비 시스템 (T2SS)은 전좌를 위한 2 단계 메커니즘을 사용하는 다성분 장치다. 첫 번째 단계 동안, 전구체 이펙터 단백질은 Sec 트랜스로콘 또는 Tat 경로에 의해 내막을 통해 전좌된다. 일단 페리플라 즘에 들어가면, 이펙터 단백질은 외막을 통해 T2SS에 의해 전좌된다. T2SS 트랜스로콘은 박테리아 세포막, 세포질 및 페리플라즘 양자 모두에서 발견되는 12-16 개의 단백질 구성 요소로 이루어져 있다. T2SS는 IV 형 선모(pilus) 어셈블리 장치와의 진화 관계를 보여준다.
인젝티오좀(injectisomes)이라고도 불리는 Ⅲ형 분비 시스템 (T3SS)은 단일-단계 분비 메커니즘을 매개하며 살모넬라종(Salmonella spp.), 시겔라종(Shigella spp.), 예르시니아종(Yersinia spp.), 장관병원성 및 장관출혈성 대장균(Escherichia coli) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 비롯한 많은 식물 및 동물 병원체에서 사용된다. T3SS는 침입형(Inv) 및 Prg 단백질을 이용하는 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 시스템에 의해 예시된다 (아래 그림 참조). T3SS는 Sec-독립적인 방식으로 진핵생물 숙주 세포의 세포질에 이펙터 단백질을 전달한다. T3SS는 유전적으로, 구조적으로 및 기능적으로 박테리아 편모와 관련이 있다. 이들은 박테리아 세포 외피를 가로지르는 커다란 초분자 구조를 형성하는 20 종 이상의 서로 다른 단백질로 구성된다.
IV형 분비 시스템은 그램-음성 박테리아 및 그램-양성 박테리아에서 발견되며 단일 단백질에서 단백질-단백질 및 단백질-DNA 복합체에 이르기까지 다양한 기질을 분비하는 다재다능한 시스템이다. 이들 시스템은 Agrobacterium tumefaciens VirB/D 시스템에 의해 예시된다.
V형 분비 시스템 (T5SS)에는 오토트랜스포터 및 2-파트너 분비 시스템이 포함된다. T5SS는 2 단계로 기질을 전좌시킨다. Neisseria meningitidis의 NalP와 같은 오토트랜스퍼 단백질은 Sec-의존적 과정에서 내막을 통해 전구체 단백질로서 분비되는 다중 도메인 단백질이다. 그 후, 단백질의 트랜스로케이터 도메인은 외막으로 삽입되어 패신저 도메인의 표면 국소화를 용이하게 한다. 2-파트너 분비 시스템에서, 별도의 트랜스로케이터 단백질(TpsB)은 외막을 통해 이펙터 단백질(TpsA)의 분비를 매개한다. 자동-응집, 부착, 침입, 세포독성, 혈청 내성, 세포간 확산 및 단백질 분해를 비롯한 기능을 갖는 700 종 이상의 단백질이 이들 두 가지 분비 시스템을 사용하여 간단한 2-단계 과정에서 내막과 외막을 가교시킨다.
VI 형 분비 시스템 (T6SS)은 최근 P. aeruginosa, enteroaggregative E. coli, S. Typhimurium, Vibrio cholera 및 Yersinia pestis와 같은 여러 병원체에서 발견되는 분비 시스템이다. T6SS는 12-25 개의 서브 유닛으로 구성될 수 있는 다성분 시스템이다.
본 발명의 일 구체예는 박테리아 분비 시스템을 이용하여 식물 숙주에 대한 dsRNA의 전달을 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 식물 세포에 dsRNA를 전달하기 위해 IV형 박테리아 분비 시스템을 강화시키는 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물 병원체 Agrobacterium tumefaciens는 VirD2-단일 가닥 DNA 복합체뿐만 아니라 독성 단백질들인 VirD5, VirE2, VirE3 및 VirF를 숙주 세포로 전달하는데 IV 형 분비 시스템을 사용한다. 일 구체예는 곤충 세포에 dsRNA 전달을 촉진시킬 수 있는 Vir 단백질에 대한 dsRNA 결합 단백질의 융합을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 세포에 dsRNA를 전달하기 위한 Ⅵ형 박테리아 분비 시스템을 강화시키기 위한 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 구체예에서, 박테리아 유전자 yfgL의 과발현은 포스파티딜 글리세롤 (막 지질) 합성 및 소포 생성과 출아를 향상시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 많은 독성 인자를 조절하는 글로벌 조절 인자 인자인 hns 유전자의 돌연변이는 대장균 소포 생산의 증가를 야기할 수 있다. 또 다른 구체예에서, LPS O-항원 측쇄가 결핍된 Salmonella 및 P. aeruginosa 돌연변이체 역시도 소포 형성 증가를 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명은 dsRNA 안정화 및 식물 세포 내로의 동원을 향상시키는 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구체예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:
- 뉴클레오티딜트랜스퍼라제(MUT2)의 공동 발현, 또는 과다 발현은 세포 간 RNA 동원에 필수적임
- smoyl화(smoylated) hnRNPA2B I에 결합된 모티프를 갖는 dsRNA로부터 유래된 마이크로 RNA는 T 세포로부터 분비된 소포에 풍부한 것으로 밝혀짐
- miR-1289 결합 부위 및 서열 모티프 (스템-루프 구조로 제시된 CUGCC)를 갖는 RNA
- 비-템플릿화된 3' 유리딜화된 마이크로RNA
- 세포 내 내인성 RNA는 miRNA의 세포외 소포로의 분류를 조절할 수 있음.
- Ago2 단백질의 동시 발현 또는 과다 발현
- RNA를 세포로 도입할 때 비교적 잘 특성화된 역할을 하는 C. elegans 단백질 4 개가 동정됨 (Winston 등, 2002). 동일한 유전자의 추가 대립 유전자들이 다른 2 스크린-섭식(fed) (섭식RNAi 결손) 스크린 (Timmons 등, 2003) 및 rsd (RNAi 확산 결손) 스크린에서 동정됨
- 세포에 shRNA의 안정화 및 전달을 촉진하는 브로모바이러스 P19 단백질의 공동 발현
- 분비 이펙터 단백질과 dsRNA 결합 단백질 사이의 융합 단백질의 발현. 예컨대 shRNA의 숙주 세포 내로의 안정화 및 전달을 용이하게 하기 위한 dsRNA 가공과 관련된 Argonaut (Ago) 단백질.
- 아래 표 5-8에서 확인된 임의의 유전자를 공동 발현하거나 과발현.
- 본원에 기술된 발명의 일부로서, 하기 표 7에 확인된 균주를 사용함.
또 다른 구체예는 표적 식물을 콜로니화하고 하나 이상의 억제 RNA 분자를 전달하여 하나 이상의 필수 식물 병원체 유전자를 억제하여 증가된 병원체 내성을 제공하도록 구성된 유전자 변형 박테리아를 포함하는 조성물을 제공하며 본원에 개시된 이러한 방법은 표적 병원체로 이미 감염되었거나 감염 위험이 있는 식물을 공중(areal) 치료하는데 사용된다. 바람직한 일 구체예에서, 이러한 공중 치료는 에어로졸, 액상 또는 건조 박테리아 또는 포자 적용을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 식물은 외떡잎 또는 외떡잎 식물의 세포이다. 예를 들어, 외떡잎 식물은 벼과 및 곡물 그룹에 속한다. 외떡잎 종의 비제한적인 예로서, 곡물, 열대 과일 및 꽃, 바나나, 옥수수, 벼, 보리, 우엉, 글라디올러스, 사탕 수수, 파인애플, 대추야자, 양파, 벼, 수수, 잔디 및 밀을 들 수 있다.
또 다른 일 구체예에서, 식물은 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물의 세포이다. 예를 들어, 쌍떡잎 식물은 Anacardiaceae (예를 들어, 캐슈넛, 피스타치오) 국화과 (Asteraceae: 예를 들어, 과꽃(asters) 및 집단화(composite flowers)), 십자화과 (Brassicaceae: 예를 들어, 양배추, 순무, 기타 겨자), 선인장과 (Cactaceae: 예를 들어, 선인장), 박과 (Cucurbitaceae: 예를 들이면, 수박, 호박), 대극과 (Euphorbiaceae: 예를 들어, 캬사야 (manioc)), 콩과 (Fabaceae: 예를 들어, 콩 및 다른 모든 콩과 식물), 참나무과(Fagaceae: 예를 들면 참나무), 제라늄(Geraniales: 예컨대 제라늄)), 유란시아과(Juglandaceae: 예컨대 피칸), 벼과(linaceae: 예를 드어 아마), 아욱과(Malvaceae: 옐르 들어 목화), 물푸레나무과(Oleaceae: 예를 들어 올리브, 애쉬, 라일락), 장미과(Rosaceae: 예를 들어 장미, 사과, 복숭아, 딸기, 아몬드), 꼭두서니과(Rubiaceae: 예를 들어 커피), 운향과(Rutaceae: 예를 들어 오렌지 및 기타 감귤류 과일), 가지과(예를 들어 감자, 토마토, 담배), 차나무과 (Theaceae: 예를 들어 차) 및 포도과 (예를 들어, 포도)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"식물" 또는 "표적 식물"이라는 용어는 병원체에 대해 지속 가능한 임의의 식물을 포함한다. 이 용어는 또한 식물 전체, 식물 기관, 식물 전체 또는 식물 기관의 자손, 배아, 체세포 배아, 배아 유사 구조체, 원형 세포, 프로토콤(protocorms), 프로토콤-유사체(PLB) 및 식물 세포 현탁액도 포함한다. 식물의 장기는 예를 들어 발아 영양기관(shoot vegetative organs)/구조물 (예컨대 잎, 줄기 및 과경), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관 /구조물 (예를 들면, 포엽, 꽃잎, 꽃잎, 수술, 암술, 꽃밥 및 배주), 종자(배아, 배유 및 종피를 포함) 및 열매 (성숙 난소), 식물 조직 (예를 들어, 유관 조직, 기본 조직 등) 및 세포 (예를 들어 가드 세포, 난 세포, 모상체 등)를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물 종류는 일반적으로 본 명세서에 기재된 분자생물학과 식물 육종 기술에 적합한 고등 식물 및 하등 식물, 특히 속씨 식물 (외떡잎 식물 (외떡잎 식물)과 쌍떡잎 식물 (쌍떡잎 식물)) 클래스만큼 넓다. 여기에는 배수체, 배수체, 배수체, 반수체 및 반 형질을 포함하여 다양한 배수성 수준의 식물이 포함된다. 본원에 기재된 유전자 변형 식물은 수수, 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 기장, 및 삼백초 등의 외떡잎 작물일 수 있다. 본 발명은 또한 칸나바과 및 다른 대마초 주, 예를 들면 C. sativa를 포함할 수 있다.
추가적인 관심 대상 식물 종의 예로는 옥수수 (Zea mays), Brassica sp. (예를 들면, B, napus, B. rapa, B.juncea), 특히 종자유의 공급원으로 유용한 Brassica종, 알팔파 (Medicago sativa), 벼 (Oryza sativa), 호밀 (Secale cereale), 당밀 (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 기장 (예, 진주 기장 (Pennisetum glaucum) 프로소 기장(Panicum miliaceum) 여우 기장 (Setaria italica), 손가락 기장 (Eleusine coracana), 해바라기 (Helianthus annuus), 홍화 (Carthamus tinctorius), 밀(Triticum aestivum), 콩 (Glycine max), 담배 (Nicotiana tabacum), 감자 (Solarium tuberosum), 땅콩(Arachis hypogaea), 목화 (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), 고구마 (Ipomoea batatus), 카사바 (Manihot esculenta), 커피 (Coffea spp.), 코코넛 (Cocos nucifera), 파인애플 (Ananas comosus), 감귤나무 (Citrus spp.), 코코아 (Theobroma cacao), 차 (Camellia sinensis), 바나나 (Musa spp.), 아보카도 (Persea americana), 무화과 (Ficus casica), 구아바 (Psidium guajava), 망고 (Mangifera indica), 올리브 (Olea Europaea), 파파야 (Carica papaya), 캐슈 (Anacardium occidentale), 마카다미아 (Macadamia integrifolid), 아몬드 (Prunus amygdalus), 사탕무 (Beta vulgaris), 사탕수수 (Saccharum spp.), 귀리, 보리; 채소, 관상용 식물 및 침엽수를 들 수 있다. 채소에는 토마토 (Lycopersicon esculentum), 양상추 (예컨대 Lactuca sativa), 녹색 콩 (Phaseolus vulgaris), 리마 콩 (Phaseolus limensis), 완두콩 (Lathyrus spp.) 및 오이속, 예컨대 오이 (C. sativus), 멜론 (C. cantalupensis), 머스크 멜론 (C. melo)가 포함된다. 관상용 식물에는 진달래(Rhododendron spp.), 수국(Macrophylla hydrangea), 히비스커스(Hibiscus rosasanensis) 장미(Rosa spp.)라, 튤립(Tulipa spp.), 수선화(Narcissus spp.), 페츄니아(Petunia hybrida), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 및 국화가 포함된다. 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 침엽수로는 소나무, 예를 들어, 로블리 소나무 (Pinus taeda), 슬래쉬 소나무 (Pinus elliotii), 폰데로사 소나무 (Pinus ponderosa), 랏지폴 소나무 (Pinus contorta) 및 몬테레이 소나무 (Pinus radiata), 더글러스 전나무 (Pseudotsuga menziesii), 서양 헴록 (Tsuga canadensis), 싯카 스프루스 (Picea glauca), 레드우드 (Sequoia sempervirens), 전나무 예컨대 은 전나무 (Abies amabilis) 및 발삼 전나무 (Abies balsamea) 및 삼나무 예컨대 웨스턴 적색 삼나무(Thuja plicata)와 알래스카 황색 삼나무 (Chamaecyparis nootkatensis)와 같은 삼나무를 들 수 있다. 특정 구체에에서, 본 발명의 식물은 작물 식물 (예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 옥수수, 알팔파, 해바라기, Brassica, 대두, 목화, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 기장, 담배 등) 이다.
"식물 병원체" 또는 "병원체"는 식물이나 식물 성분을 감염시키는 생물체 (박테리아, 바이러스, 원생 동물, 조류 또는 진균)를 의미한다. 예를 들면 전형적으로 포자를 사용하여 식물이나 식물 성분 (예를 들어 과일, 채소, 곡물, 줄기, 뿌리)을 감염시키는 곰팡이, 진균 및 랏(rot)을 들 수 있다. "식물 병원체"는 또한 식물의 병원성 또는 병원성 영향에 필요한 모든 유전자를 포함하거나 그의 억제 또는 제거에 의해 그러한 효과가 감소되거나 제거되는 것을 가리킨다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 과도한 실험 없이 통상의 기술자에게 인식되고 입수가능한, 일반적으로 유전자 표적 또는 필수 유전자로 지칭되는 병원체 유전자 표적을 비롯한 식물 바이러스의 다음과 같은 비제한적인 1종 이상의 그룹에 적용가능하다:
Figure pct00001
Figure pct00002
추가적인 식물 병원체로는 다음을 들 수 있다: 감귤류 트리스테자 바이러스, 보리 황색 난쟁이 바이러스, 감자 잎말림 바이러스 및 토마토 및 덤불 스턴트 바이러스.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 과도한 실험 없이 통상의 기술자에게 인식되고 입수가능한, 일반적으로 유전자 표적 또는 필수 유전자로 칭해지는 식물 진균 병원체를 비롯한 식물 진균 병원체의 다음과 같은 비제한적인 1종 이상의 그룹에 적용가능하다:
Figure pct00003
Figure pct00004
세포 (바람직하게는 식물 세포)에서 발현되는 모든 유전자가 표적화될 수 있다. 세포에서 발현되는 유전자는 RNA (예컨대 miRNA) 및 선택적으로 단백질을 생성하도록 전사되는 유전자이다. 표적 유전자는 내인성 유전자 또는 외인성 또는 외래 유전자 (즉, 도입 유전자(transgene) 또는 병원체 유전자)일 수 있다. 예를 들어, 바이러스 구조물의 게놈 통합의 결과로서 세포의 게놈에 존재하는 형질도입 유전자는 본 발명에 따른 억제 RNA를 사용하여 조절될 수 있다. 외래 유전자는 숙주 게놈(좋기로는 염색체 DNA) 내로 통합될 수 있거나 또는 플라스미드 또는 코스미드와 같은 여분의 염색체 유전자 구조물 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 본원에 기술 된 신규한 트랜스-킹덤 방법을 통해 간섭 RNA가 도입되는 세포의 게놈, 또는 유사하게 그러한 생물 또는 세포를 감염시킬 수 있는, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물과 같은 병원체의 게놈 내에 존재할 수 있다.
좋기로는 표적 유전자는 병원체 유전자와 같은 세포 게놈에 대해 이종인 유전자 또는 세포의 내인성 유전자이다. 바람직하게는, 병원체의 유전자는 진핵생물을 감염시킬 수 있는 병원체로부터 유래한다. 가장 바람직하게는, 상기 병원체는 상기 언급된 바와 같이 바이러스, 박테리아, 진균 및 선충류 군으로부터 선택된다. 식물에서 본 발명의 억제 RNA를 발현시킴으로써, 식물 유전자 뿐만 아니라 식물을 감염시키거나 식물을 먹는 (식품 또는 사료로서) 생물의 유전자 역시도 유전자 침묵의 표적 유전자로서 작용할 수 있다. 따라서, 표적 유전자는 동물 또는 식물 병원체의 유전자일 수도 있다. 표적 유전자는 바람직하게는 식물 유전자 또는 식물 감염 병원체의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 표적 유전자의 발현 (발현된 RNA 또는 단백질에 의해 측정됨)은 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50% 또는 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 또는 95% 또는 100% 감소, 저해 또는 약화된다.
전사체 또는 단백질과 같은 표적 생성물의 수준은 식물, 해충 또는 초식동물과 같은 생물체 전체에 걸쳐 감소될 수 있으며, 또는 표적 생성물의 그러한 감소는 생물체의 하나 이상의 특정 장기 또는 조직에 국한될 수도 있다. 예를 들어, 비제한적인 예로서 뿌리, 괴경, 줄기, 잎, 줄기, 과일, 열매, 베리, 견과류, 나무 껍질, 포드, 종자 및 꽃을 비롯한 식물의 하나 이상의 조직 및 장기에서 제품의 수준이 감소될 수 있다. 바람직한 기관은 식물의 씨앗이다. 식물의 유전자뿐만 아니라 병원체, 동물 또는 인간을 감염 시키거나 먹는 유전자 또는 식물을 비롯한 광범위한 표적 유전자를 본 발명의 방법을 사용하여 조절할 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자는 식물 내인성, 도입유전자 또는 식물 감염 병원체의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 식물 감염 병원체는 바이러스, 진균, 박테리아, 곤충 및 선충으로 구성된 군에서 선택되는 것이 좋다.
병원체의 경우, 표적 또는 필수 유전자는 하우스 키핑 (housekeeping) 유전자 또는 병원체의 생존력 또는 증식에 필수적인 다른 유전자일 수 있다. 표적 유전자의 약화 또는 사일런싱은 (또한 천연 또는 표적 유전자의 성질에 따라) 다양한 효과를 가질 수 있다. 좋기로는, 상기 표적 유전자의 사일런싱 또는 약화는 손실 또는 감소 또는 병원체의 유해한 영향, 즉 병원성 또는 농경적 형질의 손실, 감소를 일으킨다. 상기 농경 적 형질은 바람직하게는 질병 내성, 제초제 내성, 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 내성 및 개선된 영양가로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서, 표적 유전자는 예를 들어 단백질, 펩타이드, 지방산, 지질, 밀랍, 오일, 전분, 당류, 탄수화물, 향료, 냄새, 독소, 카로티노이드, 호르몬, 폴리머, 플라비노이드, 저장 단백질, 페놀산, 알칼로이드, 리그닌, 탄닌, 셀룰로오스, 당단백질 및 당지질의 합성 및/또는 분해에 관여하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이들 모든 서열은 당업자에게 공지되어 있고 당업자의 DNA 데이터 베이스(예를 들어, GenBank)로부터 용이하게 입수가능하다.
특정 구체예에서, 억제 RNA 분자의 신규한 트랜스-킹덤 전달, 즉 본 발명의 방법 및 수단은 진핵 세포 또는 생물체, 특히 식물 세포에서 및 식물에서, 병원체 (예컨대, 바이러스 또는 선충)에 대한 내성을 얻는데 특히 적합할 수 있다. 숙주 생물 (예컨대 식물)에서 전사에 의해 생성된 억제 RNA 분자 (또는 이로부터 유래된 dsRNA 분자)는, 그 생물 전체에 전신적으로 퍼질 수 있다고 예상된다. 따라서, 원예학, 포도 재배 또는 과실 생산에 있어 중요할 수 있는 본 발명의 방법의 유전자를 포함하는 형질전환 스톡에 접목된 식물의 비-형질전환 부위의 세포에서 핵산의 표현형 발현을 감소시킬 수 있다 (또는 그 반대도 가능). 거미, 곰팡이, 곤충, 선충류, 원생동물, 바이러스, 박테리아 및 질병과 같은 식물 병원체에 대한 내성은 특정 병원체의 성장, 생존, 특정 발달 단계 (예컨대 번식) 또는 증식에 필수적인 유전자의 유전자 발현을 감소시킴으로써 성취될 수 있다. 적절한 감소는 상기 단계들의 완전한 억제를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 하나 이상의 단계의 지연을 유발할 수도 있다. 이것은 예를 들어, 병원체 도입을 허용하는 식물 유전자를 포함할 수 있지만, 병원체-상동성 유전자일 수도 있다. 좋기로는 억제 RNA (예컨대hpRNA 또는 그로부터 유도된 dsRNA)는 병원체의 유전자에 대항한다. 예를 들어, 식물은 위에서 언급한 약제의 적절한 제형으로, 예를 들면 분무 또는 가루 살포에 의해 처리될 수 있다; 그러나, 식물 자체가 형질전환 생물체의 형태로 제제를 포함할 수도 있으며, 예를 들어 위독(stomach poison)의 형태로 병원체에 전달될 수도 있다. 다양한 병원체의 다양한 필수 유전자가 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 선충 내성의 경우: WO 93/10251, WO 94/17194).
본원에 설명된 억제 RNA 분자의 신규한 트랜스-킹덤 전달 방법의 또 다른 측면은 억제하고자 하는 표적 유전자가 식물 병원체 (예컨대 곤충 또는 선충)에서 단백질을 인코딩하는 방법을 제공한다. 이 측면에서, 한 방법은 병원체(예컨대 곤충 또는 선충)가 상기 식물로부터의 세포를 섭취 또는 감염시킬 때 그 병원체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 효과적인 적어도 하나의 dsRNA 분자를 형성하는, hpRNA와 같은 억제 RNA로 전사되는 DNA를 포함하는, 플라스미드와 같은 핵산 구조물을, 병원체-표적화된 식물의 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 유전자 억제는 병원체에 치명적이다. 병원체로서 가장 바람직한 것은 Phytophthora infestans, Fusarium nivale, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Blumeria graminis, Magnaporthe grisea, Sclerotinia sclerotium, Septoria nodorum, Septoria tritici, Alternaria brassicae, Phoma lingam과 같이 다른 곳에서 열거되지 않은 범위의 진균성 병원체, 및 Globodera rostochiensis, G. pallida, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Ditylenchus dipsaci, Anguma tritici and Meloidogyne hapla와 같은 선충이다.
병원성 바이러스에 대한 내성은 예를 들어 바이러스 코트 단백질, 바이러스 레플리카제, 바이러스 프로테아제, 구조 단백질, 독소 등의 발현을 감소시킴으로써 달성가능하다. 다수의 식물 바이러스 및 적합한 표적 유전자가 당업자에게 공지되어있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 내선충 식물을 수득하는데 특히 유용하다 (표적 유전자에 관해서는, 예를 들어, WO 92/21757, WO 93/10251, WO 94/17194 참조).
본 발명은 또한 생물체의 세포에 본 발명의 억제 RNA 분자를 제공하는 단계를 포함하는, 병원체 내성 생물, 특히 식물을 수득하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 억제 RNA 분자는 진핵 세포에 적어도 부분적으로 이중-가닥 RNA 분자를 제공할 수 있는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 a) 병원체의 적어도 하나의 유전자의 표적 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부와 실질적으로 동일한 적어도 하나의 제1 리보뉴클레오타이드 서열, b) 상기 제1 리보뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상보적이고 상기 제1 리보뉴클레오타이드 서열과 혼성화하여 이중-가닥 RNA 구조물을 형성하는 적어도 하나의 제2 리보뉴클레오타이드 서열, 및 c) 상기 제1 리보뉴클레오타이드 서열과 상기 제2 리보뉴클레오타이드 서열 사이에 위치하며, 상기 제1 및 상기 제2 리보뉴클레오타이드 서열 각각을 포함하는 결과적인 서열들을 후속적으로 공유결합함이 없이, 진핵생물 세포의 RNA 가공 메카니즘에 의해 제거될 수 있는, 적어도 하나의 제거가능한 RNA, 요소를 포함하는, 적어도 하나의 제3 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 좋기로는, 상기 제1 리보뉴클레오타이드 서열은 상기 병원체 게놈의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부와 65 내지 100%의 서열 동일성, 바람직하게는 75 내지 100%, 더욱 바람직하게는 85 내지 100%, 가장 바람직하게는 95 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 더욱 좋기로는, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균 및 선충류로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 유전자 변형된 박테리아의 생산을 포함하고 재조합 DNA 기술을 포함하기 때문에, 본 발명의 설명에 도움이 되도록 하기와 같이 용어를 정의한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된", "정제된"또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 본래 상태 또는 그 물질이 생산될 때 보통 수반되는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 의미한다. 예시적인 일 구체예에서, 순도 및 균질성(homogeneity)은 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 우세한 핵산 또는 특정 박테리아 종이 실질적으로 정제된다. 예시적인 일 구체예에서, 용어 "정제 된"은 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시키는 핵산 또는 단백질을 나타낸다. 전형적으로, 분리된 핵산 또는 단백질은 범위로 표현된 순도 수준을 갖는다. 어떤 성분의 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이며, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 90% 이상이다.
용어 "접촉하다"(식물체와 관련): 본원에서, 핵산 분자와 관련하여 생물체 (예컨대 식물 또는 해충 또는 초식동물)와 "접촉하다"또는 그에 의해 "섭취/흡수되다"라는 용어는 그 생물체로의 핵산 분자의 내재화를 포함하며, 이의 비제한적인 예로는: 생물체에 의한 분자 섭취(예컨대 섭식에 의함); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 생물체를 접촉시키는 것; 핵산 분자를 포함하는 용액에 생물체를 침지시키는 것; 핵산 분자를 포함하는 조성물을 생물체에 주입하는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 에어로졸 조성물을 생물체에 분무하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "발현"또는 "코딩 서열의 발현"(예를 들어, 유전자 또는 도입유전자)은 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA)의 코딩된 정보가 종종 세포의 작동, 비-작동 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정을 일컬으며, 종종 단백질 합성을 포함한다. 유전자 발현은 외부 시그널의 영향을 받을 수 있다: 예를 들어 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 제제에 세포, 조직 또는 생물체를 노출시키는 것. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA로 그리고 단백질에 이르는 모든 경로에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자의 분해, 또는 특정 단백질 분자들의 합성 후 이들의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해를 통해, 또는 이들의 조합을 작용하는 제어를 통해 일어난다. 유전자 발현은 비제한적인 예로서 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯 또는 시험관 내, 원위치 또는 생체내 단백질 활성 분석(들)을 비롯한 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수있다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다; RNA의 단일 가닥 형태; 및 RNA의 이중 가닥 형태(dsRNA). 용어 "뉴클레오타이드 서열"또는 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥에서 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 지칭한다. 용어 "리보핵산"(RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중 가닥 RNA), siRNA (짧은 간섭 RNA), mRNA (메신저 RNA), miRNA (마이크로 RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (전달 RNA)-대응하는 아실화 아미노산으로 하전되거나 방전되거나-및 cRNA (상보적 RNA)을 포괄한다. "데옥시리보핵산"(DNA)이라는 용어는 cDNA, 게놈 DNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 "핵산 분절"및 "뉴클레오타이드 서열 분절" 또는 보다 일반적으로 "분절(segment)"은 당업계의 기술자라면 게놈 서열, 리보솜 RNA 서열, 전달 RNA 서열, 메신저 RNA 서열, 오페론 서열, 및 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하거나 인코딩하기에 적합한 작은 조작된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "헤어핀 RNA"(hpRNA)이라는 용어는 임의의 자체-어닐링 이중 가닥 RNA 분자를 가리킨다. 가장 단순하게 표현하자면, 헤어핀 RNA는 단일 가닥 RNA 루프로 연결된, 어닐링 RNA 가닥들로 구성된 이중 가닥 줄기로 이루어져 있으며, "팬-핸들 RNA"라고도 칭해진다. 그러나, 용어 "헤어핀 RNA"는 또한 자체- 어닐링 이중 가닥 RNA 서열 뿐만 아니라 내부 혹(bulges) 및 루프를 포함하는 보다 복잡한 2차 RNA 구조도 포함하는 것으로 의도된다. 적용된 특정한 2차 구조는 RNA 분자의 자유 에너지에 의해 결정되며, FOLDRNA (Zuker and Stiegler (1981) Nucleic Acids Res 9(1):133-48); Zuker , M. (1989) Methods Enzymol.180:262-288)와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 다양한 상황에 대해 예측가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, RNAi에 의한 하나 이상의 식물 병원체 유전자 산물의 발현의 억제는 헤어핀 RNA (hpRNA) 간섭 또는 인트론-함유 헤어핀 RNA (ihpRNA) 간섭에 의해 수득될 수 있다. hpRNA 간섭의 경우, 발현 카세트는 단일 가닥 루프 영역 및 염기쌍 스템을 포함하는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 자체적으로혼성화하는 RNA 분자를 발현하도록 설계된다. 염기쌍 스템 영역은 그의 발현이 억제되어야하는 유전자 산물 (이 경우, 본원에 기술된 시토크롬 P450 폴리펩타이드)을 인코딩하는 내인성 메신저 RNA의 전부 또는 일부에 상응하는 센스 서열, 및 상기 센스 서열에 전적으로 또는 부분적으로 상보적인 안티센스 서열을 포함한다. 별법으로, 염기쌍 스템 영역은 억제하고자 하는 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 서열의 일부분에 상응할 수 있다. 따라서, 분자의 염기쌍 스템 영역은 일반적으로 RNA 간섭의 특이성을 결정한다. hpRNA 분자는 내인성 유전자의 발현을 억제하는데 매우 효율적이며 그들이 유도하는 RNA 간섭은 후속 세대의 식물에게로 유전된다. 예를 들어 Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl, Acad, Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk 등 (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; and Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet, 4:29-38 참조. 유전자 발현을 억제 또는 침묵시키기 위하여 hpRNA 간섭을 이용하는 방법은 예를 들어, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk 등 (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfmi 등 BMC Biotechnology 3:7, 및 미국특허공개 No. 20030175965에 개시되어 있으며; 이들 문헌 각각은 본 발명에 참조 통합된다. 생체 내에서 유전자 발현을 침묵시키는 hpRNA 구조물의 효능에 대한 일과성 분석이 Panstruga 등 (2003) Mol. Biol Rep.30:135-140(본원에 참고 문헌으로 인용됨)에 설명되어 있다.
ihpRNA의 경우, 간섭 분자는 hpRNA와 동일한 일반 구조를 갖지만, RNA 분자는 ihpRNA가 발현되는 세포에서 스플라이싱될 수 있는 인트론을 추가로 포함한다. 인트론을 사용하면 스플라이싱 후 헤어핀 RNA 분자의 루프 크기가 최소화되며, 이는 간섭 효율을 증가시킨다. 예를 들어, Smith 등 (2000) Nature 407:319-320. 실제로, Smith 등은 ihpRNA-매개 간섭을 이용한 내인성 유전자 발현의 100% 억제를 입증하였다. 내인성 식물 유전자의 발현을 억제하기 위해 ihpRNA 간섭을 사용하는 방법은 예를 들어 문헌 [Smith 등 (2000) Nature 407:319-320; 웨슬리 (Wesley) 등. (2001) Plant J 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003) Methods 30:289-295 및 미국특허 공보 제 20030180945 호]에 기술되어 있으며, 이들 문헌 각각은 본원에 참조 병합된다.
본원에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 짧은 핵산 폴리머이다. 올리고뉴클레오타이드는 보다 긴 핵산 분절의 절단에 의해 형성되거나 개별 뉴클레오티드 전구체를 중합시킴으로써 형성될 수 있다. 자동 합성기는 수백 개의 염기쌍 길이로 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있기 때문에, DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오타이드)로 구성된 올리고뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA (cDNA로 역전사됨) 서열의 증폭 기술인 PCR에 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 "프라이머"로 지칭되는데, 이것은 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오타이드를 연장시키고 상보 가닥을 복제하는 것을 허용한다.
용어 "유전자" 또는 "서열"은 어떤 방식으로 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA)의 발현을 조절할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 결합된 코딩 영역을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 (오픈 리딩 프레임, ORF)에 선행(상류) 및 후행(하류)하는 DNA(예컨대 프로모터, 인핸서, 리프레서 등)의 미번역 조절 영역 뿐만 아니라, 적용가능한 경우, 개개의 코딩 영역 (즉, 엑손) 간에 개재 서열 (즉, 인트론)도 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "구조 유전자"는 mRNA로 전사된 다음 특정 폴리펩타이드에 특징적인 아미노산 서열로 번역되는 DNA 서열을 의미한다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 핵산 결합에 의해 함께 연결된 자연 발생 뉴클레오타이드와 변형된 뉴클레오타이드 중 일방 또는 양방 모두를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 당업자가 쉽게 알 수 있듯이 비 천연 또는 유도화된 뉴클레오타이드 염기를 포함 할 수 있다. 이러한 변형의 예로는 표지, 메틸화, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드를 유사체로 치환, 인터뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 비하전 결합: 예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카바메이트 등; 하전된 결합: 예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티; 예컨대 펩타이드; 인터컬레이터; 예컨대 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이터; 알킬화제; 및 변형된 결합: 예컨대, 알파 아노머 핵산 등)을 들 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분 이중체(duplexd), 삼중체(triplexed), 헤어핀형, 원형 및 자물쇠 배열을 비롯한 임의의 위상학적 배열을 포함한다.
본원에서 DNA와 관련하여 사용되는 용어 "코딩 서열", "구조 뉴클레오타이드 서열" 또는 "구조 핵산 분자"는 적절한 조절 서열의 조절 하에, 전사 및 mRNA를 통해 폴리펩타이드로 궁극적으로 번역되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. RNA와 관련하여, "코딩 서열"이라는 용어는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 5 '말단의 번역 개시 코돈 및 3'말단의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 염기 서열을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "게놈"은 세포핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 또한 세포의 하위 세포 성분들에서 발견되는 소기관(organelle) DNA를 지칭하기도 한다. 박테리아에 적용시 용어 "게놈"은 그 박테리아 세포 내의 염색체와 플라스미드를 모두 지칭한다. 본 발명의 일부 구체예에서, DNA 분자는 박테리아의 게놈에 통합되도록 박테리아에 도입될 수 있다. 이들 구체예 및 추가의 구체예에서, DNA 분자는 염색체에 통합되거나 또는 안정한 플라스미드로서 또는 플라스미드 내에 위치할 수 있다.
2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"또는 "동일성"은 특정 비교창에서 최대로 상응하도록 정렬시 동일한 2개의 서열에서의 잔기들을 가리킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성 백분율"은 2 개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 비교창을 통해 비교함으로써 결정된 값을 지칭하는 것일 수 있으며, 비교창 내의 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 개의 서열에서 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교창에서의 총 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출한다. 기준 서열과 비교하여 모든 위치에서 동일한 서열은 기준 서열과 100% 동일하고, 그 반대도 마찬가지이다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 공지되어있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어 다음에 설명되어 있다: Smith와 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고려는 예를 들어 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에 제시되어 있다. 미국 국립생물공학정보센터(The National Center for Biotechnology: NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLASTTM; Altschul et al. (1990))은 is available from several sources, including the National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.) 및 여러 서열 분석 프로그램과 관련한 사용을 위한 인터넷 상에서 입수가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 식별을 결정하는 방법에 대한 설명은 인터넷 상의 BLASTTM "도움말"섹션에 제공되어 있다. 핵산 서열의 비교를 위해, BLASTTM (Blastn) 프로그램의 "블래스트 2 서열" 기능을 디폴트 파라미터로 설정된 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 사용하여 사용가능하다. 기준 서열과 훨씬 더 유사한 핵산 서열은 이 방법으로 평가할 때 증가된 백분율 동일성을 나타낼 것이다.
본원에서 사용된 "혼성화 가능한 (hybridizable)" 및 "상보적인 (complementary)"이라는 표현은 핵산 분자와 표적 핵산 분자 간에 안정하고 특이적 결합이 일어나는데 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2 개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2 개의 핵산 분자의 핵산 서열 간의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 그 후, 두 분자는 반대 가닥상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여 충분히 안정한 경우 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 검출 가능한 듀플렉스 분자를 형성할 수 있다. 어떤 핵산 분자가 특이적으로 혼성화가능하기 위해 그의 표적 서열과 100% 상보적일 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재하여야만 하는 서열 상보성의 양은 사용된 혼성화 조건의 함수이며, 50% -100% 사이일 수있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인접(contiguous) 핵산 서열과 관련하여 "상동 (homologous)"이라는 용어는 적절한 조건 하에서 기준 핵산 서열에 혼성화하는 인접 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 상동 서열은 약 70% 내지 100%, 또는 보다 일반적으로 약 80% 내지 100%의 서열 동일성, 예를 들어 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 실질적인 상동성 특성은 특이적 혼성화와 밀접하게 관련되어 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이 적 결합이 요구되는 조건 하에서, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions) 하에서 비표적 서열에 대한 비특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성이 있을 핵산 분자는 특이적으로 혼성화 가능하다.
조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 연결된 코딩 서열의 발현에 그 조절 서열이 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "조절 요소"는 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 관련 코딩 서열의 번역의 타이밍 및 수준/양에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중 가닥 핵산 분자의 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 전사 개시로부터 상류에 있을 수 있고 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여할 수있는 DNA 영역을 가리킨다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 시그널 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시 할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발달 제어하에 있는 프로모터의 예로는 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 목관부, 기관 또는 강막과 같은 특정 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터를 들 수 있다. 이러한 프로모터를 "조직-선호적(tissue-preferred)"라고 한다. 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이 적 (tissue-specific)"이라고 한다. "세포 유형-특이적(cell type-specific)" 프로모터는 주로 뿌리나 잎의 혈관 세포와 같은 하나 이상의 장기의 특정 세포 유형에서 발현을 구동한다. "유도성(inducible)"프로모터는 환경 조절 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 빛의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호적, 세포 유형-특이적 및 유도성 프로모터는 "비구성적(non-constitutive)"프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성적일 수있는 프로모터이다.
본 발명의 일부 구체예에서는 어떠한 유도성 프로모터든 사용가능하다. Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366 참조. 유도성 프로모터의 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터로는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠설폰아미드 제초제 약해경감제에 반응하는 옥수수의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 그의 전사 활성이 유도될 수 있는 스테로이드 호르몬 유전자의 유도성 프로모터를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다 (Schena 등 (1991) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
본원에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "유전자 변형된"은 하나 이상의 핵산 분자(들)을 세포 내로 전달하는 것을 말한다. 미생물은 핵산 분자가 박테리아에 의해 안정적으로 복제될 때 박테리아로 형질도입된 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환" 또는 "유전자 변형"된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"또는 "유전자 변형된"은 예컨대 박테리아에 분자를 도입시킬 수 있는 모든 기술을 포함한다.
"벡터"라는 용어는 DNA, RNA, 단백질 또는 폴리펩타이드를 숙주에 도입할 수있는 수단을 의미한다. 숙주 내로 도입하고자 하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 및 폴리펩타이드는 사실상 치료적 또는 예방적 속성을 가질 수 있으며; 항원을 인코딩하는 것이거나 항원일 수 있고; 본질적으로 제어가능하다. 바이러스, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 박테리아를 비롯한 다양한 종류의 벡터가 있다.
"발현 벡터"는 선택된 숙주 세포 또는 생물체에서 복제가능한 핵산이다. 발현 벡터는 자율 구조로서 복제할 수 있거나, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 숙주 세포 염색체 또는 세포 소기관의 핵산에 통합될 수 있거나, 또는 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 셔틀로서 사용되어, 숙주 세포 게놈과 함께 복제될 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 선택된 숙주 세포, 세포 소기관 또는 생물체, 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 핵산 단편에서 복제가능하고, 그에 대해 발현 벡터상의 특정 유전자(관심 유전자 포함)들이 세포, 세포 소기관 또는 생물체 내의 폴리펩타이드 또는 단백질로 전사 및 번역되는 폴리뉴클레오타이드 이거나; 또는 "발현 카세트"를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적합한 구조물이다. 이와 대조적으로, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, "카세트"는 본 발명의 발현 벡터의 절편을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 카세트의 사용은 발현 벡터의 어셈블리를 돕는다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 키메라 바이러스 또는 코스미드와 같은 레플리콘이며, 이것은 발현 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 조절 서열이 그 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절 및 제어할 때 발현 조절 서열(들) (예를 들어, 프로모터 및 선택적으로 인핸서)에 작동가능하게 연결된다.
달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 지시된 서열 뿐만 아니라 보존적으로 변형된 그의 변이체 (예, 축퇴 코돈 치환), 상보적인 (또는 보체) 서열 및 역상보 서열을 암묵적으로 포함한다. 특히, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985) 및 Rossolini 등, Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994)). 핵산 코돈의 축퇴성 때문에, 다양한 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 하기 표 1a는 어떤 핵산 코돈이 어떤 아미노산을 인코딩하는지에 대한 정보를 제공한다.
[표 1a] 아미노산 핵산 코돈
Figure pct00005
Figure pct00006
상업적으로 이용가능하지 않은 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981)에 처음 기재된 고상 포스포로아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성되거나, 또는 Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)에 설명된 바와 같이 자동 합성기를 이용하여 합성가능하다. 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)]에 기재되어있다.
"재조합"이라는 용어는 예를 들어 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 사용되는 경우, 그 세포, 생물체, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 변형 되었거나, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경, 또는 그 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래한 것임을 가리킨다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 그 세포의 천연(비재조합형 또는 야생형) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 그렇지 않으면 달리 비정상적으로 발현되거나--과발현되거나, 발현되지 않거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현할 수 있다.
"대략"및 "약"이라는 용어는 기준 수량, 수준, 값 또는 양 대비 30%까지, 또는 다른 구체예에서 20% 까지, 그리고 제 3 구체예에서는 10% 까지 변화하는 수량, 수준, 값 또는 양을 가리킨다. 본 명세서에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수를 지칭하기도 한다. 예를 들어, "박테리아"라는 용어는 단일 박테리아와 복수의 박테리아를 모두 포함한다.
본 명세서에서 "저해(supression)" 또는 "침묵화/사일런싱(silencing)" 또는 "억제(inhibition)"는 야생형 생물체에서의 표적 서열 산물의 정상 발현 수준에 대한 표적 서열 산물의 발현의 하향 조절을 나타내는데 호환적으로 사용된다. 억제는 야생형 발현 수준에 대해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%까지 감소하는 발현을 포함한다. "유효량"은 식물 병원체의 저해(supression) 또는 억제(inhibition)를 초래하는데 충분한 억제 RNA의 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 "이종(heterologous)"은 외래종으로부터 유래되거나, 또는 합성 화학적으로 설계된 핵산이거나, 동일한 종으로부터의 것이면 고의적인 인간 개입에 의해 조성 및/또는 게놈 위치 측면에서 그의 본래 형태로부터 실질적으로 변형된 핵산을 의미한다. 이종 단백질은 외래종에서 유래한 것일 수도 있고 동일한 종의 것이라면 고의적인 인간 개입에 의해 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된 것일 수도 있다. "숙주 세포"는 도입된 핵산 구조물을 함유하고 그 구조물의 복제 및/또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵세포이거나 또는 곰팡이, 효모, 곤충, 양서류, 선충류 또는 포유류 세포와 같은 진핵세포일 수 있다. 별법으로 숙주 세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물 세포이다. 단자엽 식물 숙주 세포의 예는 옥수수 숙주 세포이다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 선택된 영역에 실질적인 동일성, 실질적인 상동성 또는 실질적인 상보성을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "실질적인 동일성" 및 "실질적인 상동성"은 서로에 대해 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 서열을 나타낸다. 일반적으로, 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상동인 서열들은 약 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 동일성 백분율은 전체 서열에 기초하고, 기존 디폴트 파라미터 (GCG, GAP 버전 10, Accelrys, San Diego, CA)를 사용하여 GAP 정렬에 의해 결정된다. GAP은 일치(matches) 수를 최대화하고 서열 갭의 개수를 최소화하는 두 개의 완전한 시퀀스의 정렬을 찾기 위해 Needleman과 Wunsch의 알고리즘 ((1970) J Mol Biol 48:443-453)을 사용한다. 100% 동일성을 갖는 서열들은 동일하다. "실질적인 상보성"은 서로 상보적인 서열을 말하며, 서로 염기쌍을 형성할 수 있다. 상보적 서열을 기술할 때, 제1 서열의 모든 뉴클레오타이드가 제2 서열과 염기쌍을 이룰 경우, 이들 서열은 완전히 상보적이다.
실시예
실시예 1은: 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표적으로 하는 폴드백 RNA를 인코딩하는 헤어핀(hp) RNA 구조물을 인코딩하는 박테리아 플라스미드의 구축을 입증한다.
본 발명자들에 의해 입증된 바와 같이, 뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드 (New England BioLabs Inc.)의 NEBuilder® HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트를 사용하여 hpRNA 인코딩 플라스미드 벡터를 제작하였다. 여기서 예시적인 구체예로서 pJL-TRBO-G (Lindbo 2007)로부터 발현된 mRNA를 인코딩하는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표적으로 하기 위해 7개의 hpRNA 벡터를 제작하였다.
이 플라스미드들의 지도를 도 1-7에 나타내었다: pAD-WRKY-GHY1 (도 1), pAD-ADH-GHY2 (도 2), pOXB-WRKY-GHY3 (도 3), pOXB-ADH-GHY4 (도 4), pAD-WRKY-GHY5 (도 5), pAD-ADH-GHY6 (도 6). TMV 동원 단백질을 사용하여 설계된 하나의 hpRNA: pAD-WRKY-GHY7 (도 7)을 pJL-TRBO-G로부터의 GFP와 동원 단백질 양자 모두를 표적화하기 위해 제작하였다. 굵게 표시된 염기는 중복 서열들이다. 이탤릭체 염기는 삽입된 서열들이다.
상기 7 개의 hpRNA 중, 본 발명자들은 GFP를 센스 단편, 개재 인트론 및 GFP 안티센스 단편을 XbaI + NsiI으로 절단된 백본 플라스미드 pAD43-25 (Dunn and Handelsman 1999)에 접합시킴으로써 5개의 셔틀 벡터, 즉 pAD-WRKY-GHY1, pAD-ADH-GHY2, pAD-WRKY-GHY5, pAD-ADH-GHY6 및 pAD-WRKY-GHY7을 제작하였다. 두 벡터 pOXB-WRKY-GHY3 및 pOXB-ADH-GHY4는 XbaI로 절단된 pSF-OXB19 (Oxford Genetics Biology Engineered)의 백본 플라스미드를 사용하여 제작하였다.
플라스미드에서 hpRNA 삽입물을 제작하고 DNA 시퀀싱을 위해 사용된 예시적인 프라이머들을 하기 표 1에 나타내었다. 모든 hpRNA 지도는 SnapGene™ 소프트웨어를 사용하여 제작하였다.
실시예 2는: GFP 유전자 표적의 센스 및 안티센스 가닥 사이에 개재된 인트론을 인코딩하는 박테리아 플라스미드의 구축을 입증한다.
하나의 인트론은 Arabidopsis thaliana 추정 WRKY-유형 DNA-결합 단백질 (길이 287bp) 및 플라스미드 pJawohB-RNAi (수탁번호 AF404854) (표 9: SEQ ID NO. 26)로부터의 클로닝이었다.
또 다른 인트론은 본 발명자에 의해 Zea mays 알코올 탈수소화효소 인트론 Adh1(길이 566bp의 길이)로부터 생성되었고, 플라스미드 pMCG161 (수탁번호 AY572837)으로부터 클로닝되었다. (표 9: SEQ ID NO. 27-29)
실시예 3은: 예시적인 hpRNA의 제작 및 서열 목록을 입증한다.
이 구체예에서, 하기 표 10에 제시된 SEQ ID NO. 30-36을 포함하는 예시적인 hpRNA를 제작하였다.
실시예 4는: dsRNA 구조물의 안정한 발현을 위한 RNaselII 돌연변이 박테리아 균주의 구축을 입증한다.
이 구체예에서, 본 발명자들은 RNaselII 돌연변이주 (유전자형: endA1, recA1, gyrA96,thi, hsdR17 (rk-, mk+), relA1, supEAA, λ-, Δ(lac-proAB)X-, (i))를 작제하기 위해 대장균 JM109 lac-proAB) [F', trdD36, proAB, lac1qZΔM15], 1DE3, Promega, USA)를 제작하기 위해 예시적인 대장균 균주 JM109(DE3)을 이용하였다. 플라스미드 pSIJ8 (Jensen et al., 2015)에서 발현된 Red-매개된 상동성 재조합 시스템을 사용하여 2 개의 대장균 RNaseⅢ 돌연변이주를 만들었다.
RNaseⅢ 돌연변이주의 설계는 대장균 균주 K-12 substr. MG1655 (NCBI 기준 서열: NC_000913.3)의 rnc 유전자dp 대한 DNA 서열을 사용하여 수행되었다. 프라이머 RNaseⅢ50-5 및 RNaseⅢ50-3을 이용하여 rnc 유전자를 갖는 50bp 상동성 서열을 갖는 카나마이신 내성 유전자를 증폭시켰다. KanR로 표적화된 PCR 단편들을 Q5® High-Fidelity DNA Polymerase를 사용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pKD4를 주형으로 사용하였다 (Yin et al., 2009). KanR을 갖는 표적 PCR 단편들을 Pmini T2.0 벡터에 연결시켜 Pmini4T 플라스미드를 얻은 다음, Pmini-4T를 주형으로 삼아, 포스포로티오에이트화된 프라이머 Ec_phos_50-5 및 Ec_phos_50-3을 사용하여 표적 단편을 증폭시켰다. 돌연변이주들을 Jensen et al (Jensen et al., 2015)에 따라 생성하였다. 카나마이신 내성 마커를 함유하는 돌연변이주를 M-JM109-GHY1로 표식하였다. 카나마이신 내성을 제거하는 돌연변이주는 M-JM119-GHY2로 표식되었는데 식물에 hpRNA를 전달하는데 사용될 수 있다. 프라이머들을 표 2에 나타내었다. 돌연변이주를 확인하기 위한 PCR 증폭 분석을 도 1에 나타내었다.
실시예 5는: hpRNA 구조물의 안정한 발현을 위한 RNaseⅢ 돌연변이 박테리아 균주의 생성을 확인하기 위한 PCR 분석을 입증한다.
도 8A-C에 나타낸 바와 같이, 대장균 RNasell1 돌연변이 체의 성공적인 제조를 확인하기 위해 본 발명자들은 PCR 분석을 수행하였다. 다시, 도 8A에 입증되어 있는 바와 같이, 돌연변이주 M-JM109-GHY1을 확인하기 위해 PCR 분석을 수행하였다. 레인 1-16: 프라이머 JD-5 및 JD-3을 이용하여 M-JM109-GHY1에 대해 수행된 콜로니 PCR, 예상된 단편 크기는 1,936 bp; 야생형은 879 bp임. 가능한 정확한 돌연변이주 4, 13, 14, 15 및 16을 선택하여 LB (카나마이신, 50 μg/ml) 배지에 접종하고 추가 확인을 위해 밤새 배양하였다. 돌연변이주 13과 15는 잘 성장하였다. 이들 2 개의 돌연변이주는 본 발명자에 의해 추가로 동정되었다.
도 8B에 나타낸 바와 같이, 정제된 돌연변이주 13 및 15의 추가 동정을 실시하엿다. 2 개의 콜로니를 분석하였다. 레인 1-3: 프라이머 JD-5 및 JD-3, JD-5 및 Cat-3, 및 Cat-5 및 TD-3로 각각 제1 콜로니 돌연변이를 분석하였다. 레인 4-6: 프라이머 JD-5 및 JD-3, JD-5 및 Cat-3 및 Cat-5 및 JD-3을 각각 이용하여 두 번째 콜로니 돌연변이를 분석 하였다. 레인 7: 야생형 JM109(DE3)를 JD-5 및 JD-3로 증폭시켰다. PCR 산물의 정확한 돌연변이 크기는 1936 bp (프라이머 JD-5와 JD-3로 증폭), 1664 bp (프라이머 JD-5와 Cat-3으로 증폭), 그리고 1787 bp (프라이머 Cat-5 및 JD-3으로 증폭)이었다. 모든 DNA 서열 분석 결과가 정확하였다. 카나마이신 내성 마커를 함유하는 정확한 돌연변이주를 M-JM109-GHY1로 표식하였다.
도 C에서 볼 수 있듯이 카나마이신 내성 유전자에 대해 수행된 PCR은 프라이머 JD-5 및 JD-3 돌연변이주를 제거했으며 예상된 단편 크기는 543 bp이었다. 레인 1-8: 프라이머 JD-5 및 JD-3으로 증폭된 8개의 개별 돌연변이주. 카나마이신 내성 마커가 없는 정확한 돌연변이주를 M-JM109-GHY2로 표식하였다 (기준 레인 = M1: 100 bp DNA 래더; 레인 M2: 1 Kb DNA 래더). 모든 PCR 산물을 서열 분석을 위해 보내고 모든 서열 분석 결과를 확인하여 하기 표 11에 재현하였다 (SEQ ID NO. 37-39)
실시예 6은: 처리 대상 식물 잎에 침윤, dsRNA 또는 hpRNA를 발현 및 전달, siRNA로 가공시켜 바이러스 인코딩 유전자의 박테리아성 dsRNA-매개된 사일런싱의 예시적인 일 구체예로서 TMV 인코딩된 GFP를 불활성화시키는데 있어서의, hpRNA 분자를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 유전자 변형된 대장균 RNasell1 돌연변이주의 용도를 입증한다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 처리 대상 식물 잎에 침윤, dsRNA 또는 hpRNA를 발현 및 전달, siRNA로 가공시켜 담배 모자이크 바이러스(TMV) 인코딩된 GFP를 불활성화시키기 위해, 표시된 플라스미드를 함유하는 두 개의 대장균 RNase Ⅲ 돌연분이주(하나는 Bacillus subtilis CCB422 RNAseⅢ 돌연변이주)를 이용함으로써, 바이러스 인코딩된 유전자의 박테리아성 dsRNA-매개된 사일런싱을 입증하였다.
본 발명자들은 GFP 유전자의 저해를 목표로 하는 hpRNA를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 이용한 담배 침윤 분석을 Lindbo(Lindbo, 2007)에 따라 수행하였다. 증상을 관찰하자 GFP 시그널이 침윤 5 일, 7 일 또는 9 일 후에 UV 조사 하에서 검출되었다. 2 가지 담배 종: Nicotiana tabacum 및 Nicotiana benthamiana가 이 실시예에서 사용되었다. 예를 들어, 예시적인 실시예로서, 도 11a에서, N.tabacum의 건강하고 침윤된 잎의 UV 조사 하에서 검출된 침윤 증상 및 GFP 시그널이 입증된다.
본 발명자들은 또한 TMV 인코딩된 GFP가 벡터 pJL-TRBO-G (Lindbo 2007)로부터 발현되었음을 입증하였다. 벡터를 Agrobacterium tumefaciens (At) 내로 형질전환시키고 상이한 hpRNA를 함유하는 박테리아 RNasell1 돌연변이주로 공동-침윤시켰다. 박테리아 농도는 분광계를 사용하여 측정하였고, 모든 박테리아 농도는 OD600으로 0.9950 ~ 1.0050 사이로 조정하였다. 본 발명자들은 또한 hpRNA가 TMV-GFP 시그널을 억제하였음을 입증하였으며, 이는 벡터 pJL-TRBO-G를 함유하는 Agrobacterium GV3101과 hpRNA 함유 세균의 공동-침윤에 의해 확인되었다. 사용된 RNaseⅢ 돌연변이주 및 hpRNA를 표 3에 나타내었다.
도 10-11B에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 상이한 hpRNA를 각각 발현하는 MJM109 및 HT27 양자 모두가 TMV-인코딩된 GFP 시그널의 확산을 억제시킴을 입증하였다. 본 발명자들은 셔틀 hpRNA 벡터가 GFP 발현을 더 잘 억제시킴을 입증하였다. MJM109는 예시적인 이 구체예에서 HT27에 비해 더 나은 결과를 나타내었다.
도 11C를 추가로 나타나 있는 바와 같이, 본 발명자들은 상이한 hpRNA를 갖는 MJM109 및 HT27 양자 모두가 TMV-인코딩된 GFP 시그널의 확산에 대해 상이한 억제를 나타낸다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 셔틀 hpRNA 벡터가 GFP 발현을 더 잘 억제한다는 것을 입증하였다. 예를 들어, MXM109는 HT27에 비해 TMV-GFP 시그널의 증가된 억제를 나타낸다. 본 발명자들은 모든 hpRNA가 식물에서 RNAi 효과를 생성할 수 있는 dsRNA 구조를 생산할 수 있음을 입증하였으며, 이것은 도 11B 및 다른 곳에서 나타난 질병 증상과 일치한다.
도 10의 부호 설명:
- At: Agrobacterium tumefaciens; TMV: pJL-TRBO-G; MJM109: M-JM109-GHY2 (RNaselll 돌연변이주, 무항생제); GHY5: pAD-WRKY-GHY5; GHY6: pAD-ADH- GHY6; GHY3: pOXB-WRKY-GHY3; and GHY4: pOXB-ADH-GHY4.
도 11의 부호 설명:
- At: Agrobacterium tumefaciens; TMV, GFP를 발현하는 TMV: pJL-TRBO-G (TMV 녹색 형광 시그널); MJM109: M-JM109-GHY2 (RNaselll 돌연변이주, 무항생제); HT27, RNaselll 돌연변이주, 테트라사이클린 내성; GHY5: pAD-WRKY-GHY5; GHY6: pAD- ADH-GHY6; GHY3: pOXB- WRKY-GHY3; GHY4: pOXB-ADH-GHY4.
- A 및 G: At/TMV;
- B: At/TMV+MJM 109;
- H: At/TMV+HT27;
- C: At/TMV+MJM109/GHY5;
- D: At/TMV+MJM109/GHY6;
- E: At/TMV+MJM109/GHY3;
- F: At/TMV+MJM109/GHY4;
- I: At/TMV+HT27/GHY5;
- J: At/TMV+HT27/GHY6;
- K: At/TMV+HT27/GHY3; 및
- L: At/TMV+HT27/GHY4.
실시예 7은: hpRNA가 모델 담배 식물에서 TMV-인코딩된 GFP 시그널의 확산을 억제함을 입증한다.
도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 At/TMV 감염 후 6일에 걸쳐 담배 식물에 hpRNA를 접종하였다. 본 발명자들은 3일 이내에서는 hpRNA의 발현이 TMV-인코딩된 GFP 시그널의 확산을 억제할 수 있음을 입증하였다.
도 12의 부호 설명:
- A: 1일 후 hpRNAs 접종;
- B: 2일 후 hpRNAs 접종;
- C: 3일 후 hpRNAs 접종;
- D: 4일 후 hpRNAs 접종;
- E: 5일 후 hpRNAs 접종; 및
- F: 6일 후 hpRNAs 접종.
실시예 8은: N.tabacum 에서 Bacillus subtilis CCB422/pAD-WRKY-GHY5에 의한 담배 식물 침윤을 입증한다.
도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 hpRNA를 발현하는 유전자 변형된 B. subtilis가 N.tabacum에 성공적으로 침윤하여 At/TMV 시그널의 확산을 억제하였음을 입증하였다. 이 구체예에서, 본 발명자들은 hpRNA를 갖는 CCB422가 At/TMV 시그널의 확산을 유의적으로 억제하였음을 입증하였다.
도 13의 부호 설명:
- At: Agrobacterium tumefaciens; TMV: pJL-TRBO-G (TMV 녹색 형광 시그널); CCB422 (Bacillus subtilis RNasⅢ 돌연변이주, 스펙티노마이신 및 카나마이신 내성); GHY5: pAD-WRKY-GHY5, 및 각각 3회 반복 처리하였다. 붉은색 화살표는 침윤된 영역을 나타낸다.
- A: 블랭크 음성 대조군
- B: At/TMV (TMV 발현 GFP)
- C: CCB422 (플라스미드가 없는 박테리아만)
- D: CCB422/GHY5 (플라스미드는 있으나 TMV는 없는 박테리아)
- E: TMV+CCB422/GHY5 (TMV 및 hpRNA)
실시예 9: 소포과형성 박테리아 균주는 N. benthamiana 에서 At/TMV 시그널의 확산을 억제하는 능력이 증가한 것으로 나타났다.
도 14에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 hpRNA를 발현하는 유전자 변형된 N. benthamiana에 성공적으로 침윤하여 At/TMV 시그널의 확산을 억제하였음을 입증하였다. 이 구체예에서, 본 발명자들은 hpRNA를 갖는 소포과형성 대장균이 At/TMV 시그널의 확산을 유의적으로 억제하였음을 입증하였다. 이 구체예에서, 본 발명자들은 소포과형성 균주가 hpRNA와 같은 간섭 RNA의 능력을 증가시켜 표적 병원체 유전자 발현을 억제할 수 있음을 입증하였다.
도 14의 부호 설명:
- 우측 패널: 상단, At/TMV 처리 3회 반복; 하단, TMV+HT27/GHY5 처리 3회 반복
- At: Agrobacterium tumefaciens; TMV: pJL-TRBO-G (TMV 녹색 형광 시그널); HT27, RNaseⅢ 돌연변이주, 테트라사이클린 내성; GHY5: pAD-WRKY-GHY5, 및 각 처리는 3회 반복하였다.
- A: 블랭크 음성 대조군
- B: At/TMV
- C: HT27
- D: HT27/GHY5
- E: TMV+HT27/GHY5 .
실시예 10: 모델 식물 생물체에서 hpRNA 매개된 GFP 시그널 저해 효율의 시간-경과에 따른 입증.
본 발명자들은 소정의 시간-경과에 걸쳐 담배 식물에서 hpRNA 매개된 GFP 시그널 저해를 입증하였다. 여기서, 본 발명자들은 담배 식물에 hpRNA: MJM109-GHY2 /pAD-WRKY-GHY5를 접종한 다음, 동일한 식물에 At/TMV를 다른 날짜에 접종하였다. 도 15에 개괄적으로 나타나 있는 바와 같이, hpRNA 접종 후, 모델 담배는 변형 된 TMV 바이러스 감염으로부터 적어도 6 dpi까지 보호되었다. 도 16-17을 통해 본 발명자들은 hpRNA가 잎의 다른 침투 영역에 7 dpi 이내의 범위로 이동하였다는 것을 추가로 입증하였다. 예를 들어, 도 16-17에서, TMV-GFP는 7 dpi로 hpRNA에 의해 둘러싸인 것으로 나타났다. 이것은 표적 바이러스 유전자의 접종 및 저해의 장기적이고 지속적인 특성을 입증하는 것이다.
도 15의 부호 설명:
- A: 1일 후 At/TMV 접종
- B: 2일 후 At/TMV 접종
- C: 3일 후 At/TMV 접종
- D: 4일 후 At/TMV 접종
- E: 5일 후 At/TMV 접종
- F: 6일 후 At/TMV 접종
실시예 11: hpRNA는 담배에서 siRNA를 효과적으로 생산할 수 있고 N.tabacum에서 At/TMV 시그널의 확산을 제한할 수 있다.
본 발명자들은 hpRNA가 식물에서 효과적으로 siRNA를 생산할 수 있고 At/TMV 시그널의 확산 및 발현을 제한할 수 있음을 증명하였다. 이 구체예에서, MJM 109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5로부터 유래된 hpRNA는 전술한 바와 같이 N.tabacum에 침윤하여 siRNA로 가공된다. 도 18에 도시된 바와 같이, MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5 유도된 siRNA는 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한하였다.
도 17의 부호 설명:
- 검정색 화살표는 At/TMV 침윤 처리를 가리킨다.
- 흰색 화살표는 hpRNA (MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5) 침윤 처리를 가리킨다.
- At: Agrobacterium tumefaciens;
- TMV: pJL-TRBO-G (TMV 녹색 형광 시그널)
실시예 12: siRNA는 N.tabacum 에서 TMV-GFP 시그널의 확산을 효과적으로 제한할 수 있다.
본 발명자들은 hpRNA가 식물에서 효과적으로 siRNA를 생산할 수 있고 TMV-GFP 시그널의 확산 및 발현을 제한할 수 있음을 증명하였다. 이 구체예에서, M-JM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY7 유도된 siRNA는 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한하였다. (도 18A). 또한, 본 발명자들은 CCB422/pAD-WRKY-GHY5 유래된 siRNA가 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한한다는 것도 증명하였다. (도 18B), 이 구체예에서, 본 발명자들은 hpRNA가 N.tabacum에서 RNAi를 위한 더 많은 siRNA 생산을 투여량-의존 방식으로 유도할 수 있고 TMV-GFP 시그널의 확산을 제한할 수 있음을 보여주었다.
도 18 A-B의 부호 설명:
- 검정색 화살표는 At/TMV 침윤 처리를 가리킨다.
- 흰색 화살표는 hpRNA (MJM109-GHY2/pAD-WRKY-GHY5) 침윤 처리를 나타낸다.
- 도 18A : At : Agrobacterium tumefaciens;
- 도 18B : TMV : pJL-TRBO-G (TMV 녹색 형광 시그널)
실시예 13은: Bacillus cereus 의 동정 및 콜로니화를 입증한다.
예시적인 구체예로서, 본 발명자들은 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 셔틀 벡터 pAD43-25를 발현시키기 위한 내생 박테리아 Bacillus cereus가 담배 잎을 콜로니화할 수 있음을 입증한다.
이 예시적인 구체예에서, B. cereus 53522는 ATCC로부터 수득하였으며, 동정에 사용된 프라이머들을 표 4에 열거하였다. 정확한 PCR 단편들을 PminiT 2,0 벡터의 벡터에 접합시킨 다음, XhoI로 절단하여 정확한 크기를 조사하고 이어서 B, cereus 균주의 동일성을 확인하기 위해 DNA 서열 분석으로 올바른 클론을 동정한다 (도 9). B. cereus 53522 (UW85) 서열 분석의 결과를 표 12에 나타내었다: 16S rRNA: 1514 bp; 23S rRNA: 855 bp; motB: 574 bp; 엔도-b-1,4-글루카나아제 유전자: 659bp, rnc 유전자: 738bp; SCAP: PCR 밴드 없음.
실시예 14: Bacillus cereus 에서의 hpRNA의 형질전환 및 발현 그리고 모델 식물 생물체로의 접종 및 콜로니화.
pAD-WRKY-GHY5의 hpRNA 벡터 및 셔틀 벡터 pAD43-25를 본 발명자에 의해 Bacillus cereus 53522 균주로 형질전환한 다음 예시적인 담배 식물에 접종하여 구조 프로모터 Pupp 하에서 GFP 시그널의 발현을 확인하였다. 이 시그널은 본 발명자들에 의해 도 19에서 입증된 바 있고, 모델 담배 식물에서의 형질전환된 B. cereus의 콜로니화는 도 20에서 추가로 입증된 바 있다.
실시예 15: 헤어핀 RNA 내생 미생물 전달에 의해 매개되는 바이러스 인코딩된 GFP 단백질 축적/감염 중증도의 감소.
전술한 바와 같이, 숙주의 RNAi 머시너리에 의한 TMV-GFP RNA 전사체의 표적화는 바이러스성 RNA 분해를 초래함으로 해서 바이러스성 mRNA의 단백질로의 번역이 실패할 것으로 예상된다. 바이러스로 인코딩된 GFP에 상동적인 헤어핀 RNA의 트랜스-킹덤 전달에 의해 숙주의 RNAi 방어가 촉진됨에 따라, N.tabacum 숙주에서의 siRNA 생합성이 촉발되고 이에 의해 바이러스 인코딩된 GFP 축적의 손실 또는 감소가 일어나, 궁극적으로 바이러스 감염에 대한 내성에 기여할 것으로 예상된다.
이 가설을 평가하기 위해, TMV-GFP에 감염되거나, 또는 바이러스성 TMV-GFP 상동성 헤어핀 RNA를 인코딩하는 pAD-WRKY-GHY5 구조물과 TMV-GFP에 의해 공동-침윤된 N.tabacum 식물의 침윤 영역 및 실험 대조군으로부터 2x0.4mm 잎 디스크들을 채취하였다 (5dpi) (도 21 참조). Baumberger and Baulcombe (2005)에 따라 총 단백질 추출은 100μl의 단백질 추출 완충액을 이용하여 수행하였으며 불용성 물질을 15분 동안; 16,000g 4℃에서 펠릿화시켰다. 샘플을 PAGE로 분석하고, 세미-드라이 (semi-dry) 전달에 의해 니트로셀룰로스 막에 흡착시켰다. Rubisco 최대 서브 유닛 (RBCL)의 정량화를 허용하기 위해 웨스턴 블랏팅에 앞서 Ponceau S로 막을 염색하였다. 바이러스성 GFP는 항-GFP 항체 (Millipore 3F8.2; 1:10,000)와 함께 인큐베이션한 다음 염소 항-마우스 HRP 2차 항체 (Agrisera, 1:20,000)와 함께 인큐베이션함으로써 검출되었다. 시그널 검출 및 수집은 각각 제조업체 지침(GE)에 따라 ECL 웨스턴 검출 키트 및 ChemiDoc MP 이미징 시스템 (BioRad)을 이용하여 수행되었다. GFP 시그널 정량화는 Image Lab 소프트웨어 (BioRad)로 수행하였다.
본 발명자에 의해 도 21에서 입증된 바와 같이, GFP-hpRNA를 인코딩하는 내생 Bacillus subtilis CCB422 (Durand 등, 2012) (도 21a, b)와 TMV-GFP 바이러스의 공-침윤(co-infiltration)은 TMV-GFP 단독 침윤과 비교시, 감염된 식물에서 GFP 축적 감소를 일으켰다. 중요한 것은, 트랜스-킹덤 전달용 비히클로서 대장균 HT27을 사용하는 복제 실험 (도 21c)은 공-침윤이 수행될 때 어떠한 바이러스 인코딩된 GFP의 축적도 검출하지 못했는데, 이는 챌린지되지 않은 TMV 감염에서 관측된 GFP 축적과 강하게 대비되는 것이다. 우리의 결과는 바이러스 게놈에 상동적인 hpRNA의 트랜스-킹덤 전달이 바이러스 단백질의 바이러스 복제 및 번역을 효율적으로 하향 조절하거나 제거함을 가리키는 것이다.
실시예 16: HT27/pAD-WRKY-GFTY5에 의한 TMV-GFP mRNA 저해를 모니터링하기위한 qPCR.
1.25 리보좀 단백질 유전자 mRNA 수준을 N. tabacum 기준 유전자로서 사용하고, TMV-GFP RNA의 증폭을 표적으로 하는 프라이머들을, TMV-GFP, TMV-GFP + 박테리아 단독 및 TMV + hpRNA-GFP 발현 박테리아에 감염된 상이한 생물학적 처리시 상대적인 RNA 수준을 측정하기 위한 정량적 PCR 실험(qPCR)에 사용하였다. 상이하게 처리된 담배잎으로부터 mirVanaTM miRNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. EcoDryTM Premix 키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다. QRT-PCR은 iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix를 사용하여 수행하였다. 결과는 일반적으로 도 22 및 표 6에 도시된다.
본 발명자들은 박테리아의 존재로 인한 TMV-GFP의 감소를 입증하였다(~ 43%). 본 발명자들은 hpDNA-GFP를 발현하는 박테리아가 TMV-GFP RNA 수준에서 향상된 siRNA-매개 간섭과 일치하는, GFP RNA 수준의 90% 가까운 감소를 나타낸다는 것을 입증하였다.
표
표 1: hpRNA의 제작에 사용된 프라이머. 굵은 글씨는 중복 서열이다. 이탤릭체 염기는 삽입된 서열이다. (SEQ ID NO. 1-25)
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 3. 담배 식물 침윤 분석에 사용된 Agrobacterium 및 hpRNA를 인코딩하는 대장균 RNaseIII 돌연변이주 및 관련 플라스미드
Figure pct00010
표 4. Bacillus spp.의 동정 및 검정에 사용된 프라이머. SEQ ID No. 53-62를 위에서 아래로 또는 중간 컬럼에 나타냄
Figure pct00011
표 5: 부가적인 동원 유전자들
Figure pct00012
Figure pct00013
표 6: 도 22에서 qRT-PCR에 사용된 프라이머들.
Figure pct00014
표 7: dsRNA 전달을 증강시키는 헬퍼 유전자 균주
Figure pct00015
표 8: dsRNA 전달을 증강시키는 헬퍼 유전자
Figure pct00016
서열목록
표 9: 인트론 서열의 서열목록
Figure pct00017
표 10: 예시적인 hpRNA의 서열목록
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
표 11: RNaseIII 돌연변이주의 서열목록
Figure pct00035
Figure pct00036
표 12: B.cereus 53522(UW85) 서열목록
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
참고문헌
다음의 참고문헌들은 그 내용 전체가 본 발명에 참조 통합된다:
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
SEQUENCE LISTING <110> Pebble Labs, Inc. <120> System and Methods for the Biocontrol of Plant Pathogens <130> 90115.00130 <150> US 62/430,671 <151> 2016-12-06 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Bacteria <400> 1 ggaaaactgt atgtatttga tccttgcccg aaggttatgt acagg 45 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Bacteria <400> 2 gcagaggagg agaaagggca gattgtgtcg aca 33 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteria <400> 3 caatctgccc tttctcctcc tctgctaacg taag 34 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Bacteria <400> 4 caatctgccc tttctgtggt tggagaagct ag 32 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Bacteria <400> 5 ctccaaccac agaaagggca gattgtgtcg aca 33 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Bacteria <400> 6 aagttaaggg atgcagttta tgcatgcccg aaggttatgt acagg 45 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Bacteria <400> 7 ttgcacttga tcaaagggca gattgtgtcg aca 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Bacteria <400> 8 gtgcagctgc ggaaagggca gattgtgtcg aca 33 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Bacteria <400> 9 caatctgccc tttgatcaag tgcaaaggtc cgccttg 37 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Bacteria <400> 10 caatctgccc tttccgcagc tgcacgggtc c 31 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Bacteria <400> 11 accgcgatat ctacctcgag gttttgcccg aaggttatgt acagg 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Bacteria <400> 12 agtcagtgca ggaggagaca actttgcccg aaggttatgt acagg 45 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Bacteria <400> 13 ggaaaactgt atgtatttga tcctctagat ttaagaagga gatatacatt gcccgaaggt 60 tatgtacagg 70 <210> 14 <211> 73 <212> DNA <213> Bacteria <400> 14 ggaaaactgt atgtatttga tcctctagat ttaagaagga gatatacatt ctcggatctt 60 actacacagc agc 73 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Bacteria <400> 15 tagcagagga ggagttccct ttgcggacat cac 33 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Bacteria <400> 16 ccgcaaaggg aactcctcct ctgctaacgt aagcc 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Bacteria <400> 17 ccgcaaaggg aactgtggtt ggagaagcta gaacc 35 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteria <400> 18 ctccaaccac agttcccttt gcggacatca ctct 34 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Bacteria <400> 19 aagttaaggg atgcagttta tgcatctcgg atcttactac acagcagc 48 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Bacteria <400> 20 gcgtgcaaac gcatgaatat c 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Bacteria <400> 21 agggcctcgt gatacgcct 19 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Bacteria <400> 22 atcgtgatcg gaagtgataa ag 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteria <400> 23 gcttccgagc tctcgaattc 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Bacteria <400> 24 cgatgaacag tgccgcag 18 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Bacteria <400> 25 tgagtggccc tgtttctcg 19 <210> 26 <211> 287 <212> DNA <213> Bacteria <400> 26 ctcctcctct gctaacgtaa gcctctctgt tttttttctc tgtttctttt gaaatgaatc 60 caattagtga tgataatctg tgtttgatgt atcattgatt taacatcttg acaatgaatc 120 gtgatcggaa gtgataaagt tatgggtcaa cggtttcaaa gagagagaaa gacttttaga 180 gtcaactctc gactctttct taattatgtt attgctattt gtctcttttc ttgaagtctg 240 aacaattctt gggattgttt tgcaggttct agcttctcca accacag 287 <210> 27 <211> 566 <212> DNA <213> Bacteria <400> 27 gatcaagtgc aaaggtccgc cttgtttctc ctctgtctct tgatctgact aatcttggtt 60 tatgattcgt tgagtaattt tggggaaagc tagcttcgtc cacagttttt ttttcgatga 120 acagtgccgc agtggcgctg atcttgtatg ctatcctgca atcgtggtga acttatgtct 180 tttatatcct tcactaccat gaaaagacta gctagtaatc tttctcgatg taacatcgtc 240 cagcactgct attaccgtgt ggtccatccg acagtctggc tgaacacatc atacgatatt 300 gagcaaagat cgatctatct tccctgttct ttaatgaaag acgtcatttt catcagtatg 360 atctaagaat gttgcaactt gcaaggaggc gtttctttct ttgaatttaa ctaactcgtt 420 gagtggccct gtttctcgga cgtaaggcct ttgctgctcc acacatgtcc attcgaattt 480 taccgtgttt agcaagggcg aaaagtttgc atcttgatga tttagcttga ctatgcgatt 540 gctttcctgg acccgtgcag ctgcgg 566 <210> 28 <211> 360 <212> DNA <213> Bacteria <400> 28 tgcccgaagg ttatgtacag gaacgcacta tatctttcaa agatgacggg aactacaaga 60 cgcgtgctga agtcaagttt gaaggtgata cccttgttaa tcgtatcgag ttaaaaggta 120 ttgattttaa agaagatgga aacattctcg gacacaaact cgagtacaac tataactcac 180 acaatgtata catcacggca gacaaacaaa agaatggaat caaagctaac ttcaaaattc 240 gccacaacat tgaagatgga tccgttcaac tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa 300 ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca accattacct gtcgacacaa tctgcccttt 360 <210> 29 <211> 360 <212> DNA <213> Bacteria <400> 29 tctcggatct tactacacag cagctgcaaa gaaaagattt cagttcaagg tcgttcccaa 60 ttatgctata accacccagg acgcgatgaa aaacgtctgg caagttttag ttaatattag 120 aaatgtgaag atgtcagcgg gtttctgtcc gctttctctg gagtttgtgt cggtgtgtat 180 tgtttataga aataatataa aattaggttt gagagagaag attacaaacg tgagagacgg 240 agggcccatg gaacttacag aagaagtcgt tgatgagttc atggaagatg tccctatgtc 300 gatcaggctt gcaaagtttc gatctcgaac cggaaaaaag agtgatgtcc gcaaagggaa 360 <210> 30 <211> 7187 <212> DNA <213> Bacteria <400> 30 gaattcgagc tcggtacccg gggatcgcgt gaaagaaatt ttcggcgcag agcacgtaaa 60 tgttcaacca cactctggtg cacaagcgaa catggcagta tacttcacga ttttagagca 120 aggcgataca gtacttggta tgaatttatc tcatggtggt cacttaacac acggaagccc 180 tgttaacttc agtggagtac aatataattt cgtagaatat ggcgtggatg ctgactctca 240 ccgtattaat tacgatgatg tattagcaaa agcgaaagaa cataaaccaa aattaatcgt 300 tgcaggtgca agtgcatacc ctcgtgttat cgatttcaag cgattccgtg agattgcaga 360 tgaagtgggc gcttatttaa tggttgatat ggcacatatc gctggtttag tagctgctgg 420 tttacatcca aatccagtac cacatgcaca tttcgttaca acgacaacac ataaaacgtt 480 acgtggcccg cgtggtggta tgattttatg tgaagagcaa tttgcaaaac aaattgataa 540 atcaatcttc cctggtattc aaggtggtcc acttatgcac gtaatcgctg caaaagctgt 600 tgcgtttggt gaagcacttc aagatgattt caaaacatat gcacaaaata tcattaacaa 660 tgcgaaccgc ttagctgaag gtcttcaaaa agaaggactt acacttgttt ctggcggaac 720 agacaatcac ttaatcttga ttgatgttcg taacttagaa atcacaggta aagtagcaga 780 gcacgtatta gatgaagttg gtattacagt gaacaaaaat acaattccat ttgaaacagc 840 aagcccattt gtaacaagtg gtgtacgtat cggtacagca gctgtaacat ctcgtggttt 900 cggtttagaa gaaatggatg aaattgcgtc acttattgct tatacattaa aaaatcatga 960 aaatgaagct gcattagaag aagtacgtaa gcgtgtagaa gcgttaacta gcaaatttcc 1020 aatgtatcca aatctataat agattgaaga agactgccga gacttaattg ttttggcggt 1080 cttttttgtg gacatatatt atttttaaag tatgtataca aatgatgaat aaattttggc 1140 gatataatga aggatacagc tcccataatt ggtaaagata ctagatagat tcatcgtaaa 1200 atcatgattt tgccaaattt gcccttgaat attagtagcg ttttctttac aatcgtaaat 1260 agtgtaaaaa agcgtgcaaa cgcatgaata tcatctaaag gagagattca catgggaaaa 1320 ctgtatgtat ttgatccttg cccgaaggtt atgtacagga acgcactata tctttcaaag 1380 atgacgggaa ctacaagacg cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaatc 1440 gtatcgagtt aaaaggtatt gattttaaag aagatggaaa cattctcgga cacaaactcg 1500 agtacaacta taactcacac aatgtataca tcacggcaga caaacaaaag aatggaatca 1560 aagctaactt caaaattcgc cacaacattg aagatggatc cgttcaacta gcagaccatt 1620 atcaacaaaa tactccaatt ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt 1680 cgacacaatc tgccctttct cctcctctgc taacgtaagc ctctctgttt tttttctctg 1740 tttcttttga aatgaatcca attagtgatg ataatctgtg tttgatgtat cattgattta 1800 acatcttgac aatgaatcgt gatcggaagt gataaagtta tgggtcaacg gtttcaaaga 1860 gagagaaaga cttttagagt caactctcga ctctttctta attatgttat tgctatttgt 1920 ctcttttctt gaagtctgaa caattcttgg gattgttttg caggttctag cttctccaac 1980 cacagaaagg gcagattgtg tcgacaggta atggttgtct ggtaaaagga cagggccatc 2040 gccaattgga gtattttgtt gataatggtc tgctagttga acggatccat cttcaatgtt 2100 gtggcgaatt ttgaagttag ctttgattcc attcttttgt ttgtctgccg tgatgtatac 2160 attgtgtgag ttatagttgt actcgagttt gtgtccgaga atgtttccat cttctttaaa 2220 atcaatacct tttaactcga tacgattaac aagggtatca ccttcaaact tgacttcagc 2280 acgcgtcttg tagttcccgt catctttgaa agatatagtg cgttcctgta cataaccttc 2340 gggcatgcat aaactgcatc ccttaacttg tttttcgtgt gcctattttt tgtgaatcgc 2400 taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 2460 cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 2520 gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 2580 ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 2640 gtgcaccata caaaacatat ttcaacacaa tacaaatggg ttagttaaaa aagcaggcct 2700 tctaaaggtc tgcttttttt atttgattat gtaattttta atgccaggat gccaataagc 2760 cataacctca aatgcaccat ttgcaacctc gtcatcttct tcctcaatct tgaccagatc 2820 gccgtcctcc gcatcaccaa gattcagctc tttatgtatc tccttcaaaa tgccaccgta 2880 tccaattaac cttcgagctg ccaacgcatc atccaagtaa agcaccgtgt tcagattgtc 2940 ttcagtcacc ttattaccgc gcacacaatc cgtatcctta accggatatt tagagatttc 3000 gcgaacagct ttttgctcca tcattgcgtt ccgcacatcg ttttcaatct gttcagcgtc 3060 aatcttagct ttacctttca ctcgacgaat atcgacaatt ggagtgtaat ccaatttcat 3120 cgcctttttc caaaggctcg tccactccgc ctgcttaata tagtttttcc caaaataatt 3180 tttccttact ggtatcaaca catgaaaatg aggatgatat gtatcttctt catgattttt 3240 ggtaatctct aaagctctga aaaatccaag aaccgaagtt tttacttttt tgtactggaa 3300 cagtttccta aagccttcca tcatcgcaga aatttgtggc ttcagccgtt ctccctttac 3360 atttcgaatc gtcagcgtga gaaaaatcca tccgcagccg tactgtctat tggcttcctc 3420 tacgatcaac ttattgtgat aagcaatttt taacgacctg cgccacgcac acatcggaca 3480 taacctcact ttacaaaaat gggcttgata cagttttaac ttgcccgtct ccgggtctct 3540 cttaaacgaa agatactctg cacaactaat tagtttttca gcctttttgc catagtaagg 3600 tgccccaatc ttactctcta acgcttcgta atgctccgcc atgaggttcg tccgtctctt 3660 tttccccttc caatcccgct ttttacctgt tgcggtttta tcttcgagga tgctataatc 3720 attttcagat gaataaatca acaaaaaaac tccttctgag ctagttctct agcattctat 3780 tattttgatt cgacacctta ataatagcag aaggagtttt tacctgtcaa agaaccatca 3840 aacccttgat acacaaggct ttgacctaat tttgaaaaat gatgttgttt ctatatagta 3900 tcaagataag aaagaaaagg atttttcgct acgctcaaat cctttaaaaa aacacaaaag 3960 accacatttt ttaatgtggt ctttattctt caactaaagc acccattagt tcaacaaacg 4020 aaaattggat aaagtgggat atttttaaaa tatatattta tgttacagta atattgactt 4080 ttaaaaaagg attgattcta atgaagaaag cagacaagta agcctcctaa attcacttta 4140 gataaaaatt taggaggcat atcaaatgaa ctttaataaa attgatttag acaattggaa 4200 gagaaaagag atatttaatc attatttgaa ccaacaaacg acttttagta taaccacaga 4260 aattgatatt agtgttttat accgaaacat aaaacaagaa ggatataaat tttaccctgc 4320 atttattttc ttagtgacaa gggtgataaa ctcaaataca gcttttagaa ctggttacaa 4380 tagcgacgga gagttaggtt attgggataa gttagagcca ctttatacaa tttttgatgg 4440 tgtatctaaa acattctctg gtatttggac tcctgtaaag aatgacttca aagagtttta 4500 tgatttatac ctttctgatg tagagaaata taatggttcg gggaaattgt ttcccaaaac 4560 acctatacct gaaaatgctt tttctctttc tattattcca tggacttcat ttactgggtt 4620 taacttaaat atcaataata atagtaatta ccttctaccc attattacag caggaaaatt 4680 cattaataaa ggtaattcaa tatatttacc gctatcttta caggtacatc attctgtttg 4740 tgatggttat catgcaggat tgtttatgaa ctctattcag gaattgtcag ataggcctaa 4800 tgactggctt ttataatatg agataatgcc gactgtactt tttacagtcg gttttctaat 4860 gtcactaacc tgccccgtta gtcgccattc gccagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 4920 ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 4980 gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 5040 gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 5100 agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 5160 gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5220 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 5280 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5340 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 5400 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5460 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 5520 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 5580 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5640 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5700 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5760 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 5820 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 5880 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 5940 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6000 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6060 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6120 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6180 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 6240 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 6300 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 6360 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 6420 acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 6480 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 6540 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 6600 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 6660 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 6720 gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 6780 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 6840 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 6900 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 6960 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7020 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7080 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 7140 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaa 7187 <210> 31 <211> 7466 <212> DNA <213> Bacteria <400> 31 gaattcgagc tcggtacccg gggatcgcgt gaaagaaatt ttcggcgcag agcacgtaaa 60 tgttcaacca cactctggtg cacaagcgaa catggcagta tacttcacga ttttagagca 120 aggcgataca gtacttggta tgaatttatc tcatggtggt cacttaacac acggaagccc 180 tgttaacttc agtggagtac aatataattt cgtagaatat ggcgtggatg ctgactctca 240 ccgtattaat tacgatgatg tattagcaaa agcgaaagaa cataaaccaa aattaatcgt 300 tgcaggtgca agtgcatacc ctcgtgttat cgatttcaag cgattccgtg agattgcaga 360 tgaagtgggc gcttatttaa tggttgatat ggcacatatc gctggtttag tagctgctgg 420 tttacatcca aatccagtac cacatgcaca tttcgttaca acgacaacac ataaaacgtt 480 acgtggcccg cgtggtggta tgattttatg tgaagagcaa tttgcaaaac aaattgataa 540 atcaatcttc cctggtattc aaggtggtcc acttatgcac gtaatcgctg caaaagctgt 600 tgcgtttggt gaagcacttc aagatgattt caaaacatat 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cacaaactcg 1500 agtacaacta taactcacac aatgtataca tcacggcaga caaacaaaag aatggaatca 1560 aagctaactt caaaattcgc cacaacattg aagatggatc cgttcaacta gcagaccatt 1620 atcaacaaaa tactccaatt ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt 1680 cgacacaatc tgccctttga tcaagtgcaa aggtccgcct tgtttctcct ctgtctcttg 1740 atctgactaa tcttggttta tgattcgttg agtaattttg gggaaagcta gcttcgtcca 1800 cagttttttt ttcgatgaac agtgccgcag tggcgctgat cttgtatgct atcctgcaat 1860 cgtggtgaac ttatgtcttt tatatccttc actaccatga aaagactagc tagtaatctt 1920 tctcgatgta acatcgtcca gcactgctat taccgtgtgg tccatccgac agtctggctg 1980 aacacatcat acgatattga gcaaagatcg atctatcttc cctgttcttt aatgaaagac 2040 gtcattttca tcagtatgat ctaagaatgt tgcaacttgc aaggaggcgt ttctttcttt 2100 gaatttaact aactcgttga gtggccctgt ttctcggacg taaggccttt gctgctccac 2160 acatgtccat tcgaatttta ccgtgtttag caagggcgaa aagtttgcat cttgatgatt 2220 tagcttgact atgcgattgc tttcctggac ccgtgcagct gcggaaaggg cagattgtgt 2280 cgacaggtaa tggttgtctg gtaaaaggac agggccatcg ccaattggag 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ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc 780 ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 840 aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 900 accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 960 ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 1020 ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 1080 cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 1140 tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 1200 tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 1260 gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 1320 tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 1380 cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt 1440 cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 1500 ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccagcttcaa 1560 aagcgctctg 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Bacteria <400> 62 acgatgagcc ttctcagcaa atgcg 25

Claims (66)

  1. - 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - 식물 병원체에서 적어도 하나의 표적 서열에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀 RNA(hpRNA)를 형성할 수 있는 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물로 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 형질전환시키는 단계;
    - 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계; 및
    - 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘이 유도되는데 충분한 시간 동안 상기 핵산 구조물을 발현시키는 단계로서, 상기 RNAi 메카니즘이 식물 병원체에서 적어도 하나의 상기 표적 서열의 하향조절을 일으키는 것인 단계
    를 포함하는, 식물 병원체의 생물방제를 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 상기 단계는: 일회 이상의 침지, 분무, 주사, 에어로졸화 분출(aerosolized disbursement), 환경적인 에어로졸화 분출, 수원에서의 환경적인 에어로졸화 분출, 수성 캐리어, 용액에서의 동결건조, 냉동-건조, 마이크로캡슐화, 건조, 브러싱, 드레싱, 적하 및 코팅으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎 및/또는 쌍떡잎 식물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물은 곡물, 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 사탕수수, 기장, 해바라기, 홍화, 목화, 대두, 카놀라, 알팔파, 애기장대(Arabidopsis), 대마, 감자, 브라시카, 땅콩, 담배, 열대 과일과 꽃, 바나나, 말(duckweed), 글라디올러스, 사탕수수, 파인에플, 대추야자, 양파, 파인애플, 캐슈, 피스타치오, 꽃, 관상식물, 침엽수, 낙엽수, 포도, 감귤류, 장미, 사과, 복숭아, 딸기, 아몬드, 커피, 참나무, 콩, 콩과식물, 수박, 과즙(squashes), 양배추, 순무, 겨자, 선인장, 피칸, 아마, 고구마, 대두, 코코넛, 아보카도, 비트, 캔털롭 및 채소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물 병원체는 식물 바이러스; 식물 바이로이드; 진균; 해충, 초식동물 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 병원체를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물 바이러스는 담배 모자이크 바이러스(TMV); 토마토 반점 윌트 바이러스(TSWV); 토마토 황색 잎말림 바이러스(TYLCV); 오이 모자이크 바이러스(CMV); 감자 바이러스 Y(PVY); 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 아프리카 카사바 모자이크 바이러스(ACMV); 자두 곰보병 바이러스(PPV); 브롬 모자이크 바이러스(BMV); 감자 바이러스 X(PVX); 시트러스 트리스테자 바이러스, 보리 황색 난쟁이 바이러스, 감자 잎말림 바이러스 및 토마토 및 덤불 스턴트 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표적 서열은 바이러스의 중요 영역의 서열, 바이러스 패밀리의 보존 서열 및 상이한 바이러스 패밀리 멤버들에서 보존된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 저해되는 상기 표적 서열은 상기 담배 모자이크 바이러스의 레플리카제 유전자, 동원 단백질, 코트 단백질; 상기 토마토 반점 윌트 바이러스의 당단백질 (GPs), NSm 단백질, NSs 단백질, 바이러스 RNA 게놈 절편 L, M, S; 상기 반점 윌트 바이러스의 VI, V2, CI, C2, C3, C4, VI 단백질; 상기 오이 모자이크 바이러스의 la, 2a2b 단백질, 3a, 코트 단백질; 상기 감자 바이러스 Y의 PI, HC-Pro, P3, 6kl, CI, 6k2, NIa, Nib, CP; 상기 콜리플라워 모자이크 바이러스의 동원 단백질, 2가지 진딧물 전달 인자 (P2 및/또는 P3), 캡시드 단백질의 전구체(P4), 프로테이나제의 폴리단백질 전구체, P5, P6 단백질; 상기 아프리카 카사바 모자이크 바이러스의 AVI, AV2, ACl, AC2, AC3, AC4, BCl, BV1; 상기 자두 곰보병 바이러스의 PI, HC-Pro, P3, 6kl, CI, 6k2, NIa, Nib, CP; 상기 브롬 모자이크 바이러스이 la, 2a, 동원 단백질, 코트 단백질; 상기 감자 바이러스 X의 레플리카제, TGB1, TGB2, TGB3, 코트 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
    [청구항 8]
    제4항에 있어서, 상기 진균은 Magnaporthe oryzae; Botrytis cinerea; Puccinia spp.; Fusarium graminearum; Fusarium oxysporum; Blumeria graminis; Mycosphuerella graminicola; Colletotrichum spp.; Ustilago maydis; Melampsora lini, Phakopsora pachyrhizi 및 Rhizoctonia solani로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적 서열은 진균 필수 유전자의 주요 영역의 서열, 상이한 바이러스 패밀리들의 여러 멤버들 간의 보존된 필수 유전자 및 필수 유전자 패밀리의 보존된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항, 제7항 및 제9항에 있어서, 상기 표적 서열은: RNA의 비-코딩 영역, RNA의 코딩 영역; RNA의 스플라이스 위치를 함유하는 표적 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 핵산 구조물은 플라스미드인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 플라스미드는: pAD-WRKY-GHYl; pAD-ADH-GHY2; pOXB- WRKY-GHY3; pOXB-ADH-GHY4; pAD-WRKY-GHY5; hpRNA pAD-ADH-GHY6; 및 hpRNA pAD- WRKY-GHY7로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 서열을 포함하도록 변형된 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 식물 병원체에서 적어도 하나의 표적 서열에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀(hpRNA)를 형성할 수 있도록 구성된 상기 siRNA는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는: 비구성적 프로모터; 유도성 프로모터, 병원체-유도성 프로모터; 조직-선호적 프로모터; 조직-특이적 프로모터, 식물-특이적 프로모터, 또는 구성적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 저해된 RNaseIII를 갖는 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는: 아시도박테리아, 악티노박테리아, 알파프로테오박테리아, 아르마티모나데테스, 박테리오데스, 베타프로테오박테리아, 델타프로테오박테리아, 퍼미큐테스, 그라마프로테오박테리아, TM7, 바실러스, 에스케리치아로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 M-JM109-GHY2인 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 Bacillus subtilis CCB422인 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 대장균 HT27, 또는 HT115인 것인 방법.
  19. 제1항 및 제18항에 있어서, 저해된 RNaseIII을 갖는 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 소포과형성 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아, JC8031, 및/또는 다른 박테리아와의 나노튜브 형성을 증강시키는데 충분한 하나 이상의 옥소트로피를 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 식물 전체를 통해 이동하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘이 유도되는데 충분한 시간 동안 상기 핵산 구조물을 발현시키는 단계로서, 상기 RNAi 메카니즘이 식물 병원체에서 적어도 하나의 상기 표적 서열의 하향조절을 일으키는 것인 상기 단계는 상기 핵산 구조물을 지속적으로 발현시킴으로써 상기 식물에서 지속적인 RNAi 메카니즘을 개시하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 지속적인 RNAi 메카니즘은 상기 식물로 하여금 상기 식물 병원체 감염에 대해 야생형보다 더 큰 내성을 갖도록 하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 헬퍼 유전자를 공동-발현하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 식물 병원체에서 적어도 하나의 상이한 표적 서열에 대해 적어도 하나의 부가적인 siRNA 분자를 공동-발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자는: VrrA; SID1; SID2; AGOl; AG02; AG07; YmdB; YmdB; 스타우펜; RDE-4; HlyA; Sec- 및 Tat-분비 시그널 펩타이드; 하나 이상의 세포-침투 펩타이드 (CPPs); Tat; 안테나피디아; ACC 데아미나제; 하나 이상의 체관부 RNA 트랜스포터; PP2-A1; PSRP1; DRB1 ; DRB4; HEN1 및 STVl로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 공동-발현된 헬퍼 유전자는 상기 유전자 변형된 내생 박테리아에서 형질전환된 제2 핵산 구조물 및/또는 상기 핵산 구조물로부터 발현되는 것인 방법.
  26. 제5항에 있어서, 상기 식물은 병원체 감염된 식물을 포함하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 식물은 상기 식물 병원체에 감염된 바 없는 식물을 포함하는 방법.
  28. 제9항에 있어서, 상기 진균성 식물 병원체의 상기 하나의 표적 서열은: 상기 Magnaporthe oryzae의 MoABCl, MoMACl 및 MoPMKl, Iug6, Iug9 및 Iugl8, MoMpgl, MoEmpl, MoMhpl, MoMspl, MC69, 및 Slpl; 상기 Botrytis cinerea의 Bcpgl 및 BMP1; 상기 Puccinia spp.의 APK, 사이크로필린, 및 칼시뉴린 조절 서브유닛 및 분비 단백질; 상기 Fusarium graminearum의 MAPI, 및 MAP 키나아제 gpmkl; 상기 Fusarium oxysporum의 MAP 키나아제, pgl, 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질; 상기 Blumeria graminis의 이펙터 유전자 AvralO, 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질; 상기 Mycosphaerella graminicola의 병원성-관련 유전자, MgSlt2, ABC 트랜스포터 유전자 MgAtrl 및 MgAtr2, 분비된 단백질, 상기 Colletotrichum spp.의 CMK1, 및 clkl, 병원성-관련 단백질 10, 분비된 단백질; 상기 Ustilago maydi의 병원성-관련 유전자, Kpp2, ukcl, 분비된 단백질; 및 상기 Melampsora lini의 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 짧은 억제 리보핵산(siRNA)은 식물 병원체의 적어도 하나의 필수 유전자를 하향조절하도록 구성된 상기 짧은 억제 리보핵산(siRNA)은 식물 체관부를 통한 그의 전달을 용이하게할 수 있는 dsRNA로 통합가능한 하나 이상의 특이적인 RNA 모티프를 갖도록 구성된 짧은 억제 리보핵산(siRNA)를 포함하는 것인 방법.
  30. 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템으로서 다음 단계, 즉:
    - 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - 식물 병원체의 적어도 하나의 필수 유전자를 하향조절하도록 구성된 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물로 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 형질전환시키는 단계;
    - 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계; 및
    - 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘을 유도하는데 충분한 시간 동안 상기 핵산 구조물을 발현하는 단계로서, 상기 RNAi 메카니즘은 상기 식물 병원체의 적어도 하나의 상기 필수 유전자의 하향조절을 일으키는 것인 단계
    를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  31. 제30항에 있어서 상기 siRNA는 상기 식물 병원체의 적어도 하나의 필수 유전자의 표적 서열에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 하나 이상의 hpRNA를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 상기 단계는: 일회 이상의 침지, 분무, 주사, 에어로졸화 분출(aerosolized disbursement), 환경적인 에어로졸화 분출, 수원에서의 환경적인 에어로졸화 분출, 수성 캐리어, 용액에서의 동결건조, 냉동-건조, 마이크로캡슐화, 건조, 브러싱, 드레싱, 적하 및 코팅으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  33. 제31항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎 및/또는 쌍떡잎 식물인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  34. 제33항에 있어서, 상기 식물은 곡물, 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 사탕수수, 기장, 해바라기, 홍화, 목화, 대두, 카놀라, 알팔파, 애기장대(Arabidopsis), 대마, 감자, 브라시카, 땅콩, 담배, 열대 과일과 꽃, 바나나, 말(duckweed), 글라디올러스, 사탕수수, 파인에플, 대추야자, 양파, 파인애플, 캐슈, 피스타치오, 꽃, 관상식물, 침엽수, 낙엽수, 포도, 감귤류, 장미, 사과, 복숭아, 딸기, 아몬드, 커피, 참나무, 콩, 콩과식물, 수박, 과즙(squashes), 양배추, 순무, 겨자, 선인장, 피칸, 아마, 고구마, 대두, 코코넛, 아보카도, 비트, 캔털롭 및 채소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 식물 병원체는 식물 바이러스; 식물 바이로이드; 진균; 해충, 초식동물 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 병원체를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 상기 식물 바이러스는 담배 모자이크 바이러스(TMV); 토마토 반점 윌트 바이러스(TSWV); 토마토 황색 잎말림 바이러스(TYLCV); 오이 모자이크 바이러스(CMV); 감자 바이러스 Y(PVY); 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 아프리카 카사바 모자이크 바이러스(ACMV); 자두 곰보병 바이러스(PPV); 브롬 모자이크 바이러스(BMV); 감자 바이러스 X(PVX); 시트러스 트리스테자 바이러스, 보리 황색 난쟁이 바이러스, 감자 잎말림 바이러스 및 토마토 및 덤불 스턴트 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 바이러스 식물 병원체의 상기 적어도 하나의 필수 유전자는 바이러스의 중요 영역의 서열, 바이러스 패밀리의 보존 서열 및 상이한 바이러스 패밀리 멤버들에서 보존된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 식물 병원체의 필수 유전자는 상기 담배 모자이크 바이러스의 레플리카제 유전자, 동원 단백질, 코트 단백질; 상기 토마토 반점 윌트 바이러스의 당단백질 (GPs), NSm 단백질, NSs 단백질, 바이러스 RNA 게놈 절편 L, M, S; 상기 반점 윌트 바이러스의 VI, V2, CI, C2, C3, C4, VI 단백질; 상기 오이 모자이크 바이러스의 la, 2a2b 단백질, 3a, 코트 단백질; 상기 감자 바이러스 Y의 PI, HC-Pro, P3, 6kl, CI, 6k2, NIa, Nib, CP; 상기 콜리플라워 모자이크 바이러스의 동원 단백질, 2가지 진딧물 전달 인자 (P2 및/또는 P3), 캡시드 단백질의 전구체(P4), 프로테이나제의 폴리단백질 전구체, P5, P6 단백질; 상기 아프리카 카사바 모자이크 바이러스의 AVI, AV2, ACl, AC2, AC3, AC4, BCl, BV1; 상기 자두 곰보병 바이러스의 PI, HC-Pro, P3, 6kl, CI, 6k2, NIa, Nib, CP; 상기 브롬 모자이크 바이러스이 la, 2a, 동원 단백질, 코트 단백질; 상기 감자 바이러스 X의 레플리카제, TGB1, TGB2, TGB3, 코트 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  39. 제35항에 있어서, 상기 진균은: Magnaporthe oryzae; Botrytis cinerea; Puccinia spp.; Fusarium graminearum; Fusarium oxysporum; Blumeria graminis; Mycosphuerella graminicola; Colletotrichum spp.; Ustilago maydis; Melampsora lini, Phakopsora pachyrhizi 및 Rhizoctonia solani로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 진균 식물 병원체의 상기 적어도 하나의 필수 유전자는 진균 필수 유전자의 주요 영역의 서열, 상이한 바이러스 패밀리들의 여러 멤버들 간의 보존된 진균 유전자 및 진균 필수 유전자 패밀리의 보존된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 상기 진균 식물 병원체의 상기 적어도 하나의 필수 유전자는; 상기 Magnaporthe oryzae의 MoABCl, MoMACl 및 MoPMKl, 병원성-관련 유전자, 이펙터 Iug6, Iug9 및 lugl8, MoMpgl, MoEmpl, MoMhpl, MoMspl, MC69, 및 Slpl; 상기 Botrytis cinerea의 Bcpgl 및 BMP1; 상기 Puccinia spp.의 APK, 사이클로필린, 및 칼시뉴린 조절 서브유닛, 및 분비된 단백질; 상기 Fusarium graminearum의 MAPI, 및 MAP의 키나아제 gpmk1; 상기 Fusarium oxysporum의 MAP 키나아제, pg1, 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질; 상기 Blumeria graminis의 이펙터 유전자 Avra10, 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질; 상기 Mycosphaerella graminicola의 병원성-관련 유전자, MgSlt2, ABC 트랜스포터 유전자 MgAtrl 및 MgAtr2, 분비된 단백질; 상기 Colletotrichum spp.의 CMK1, 및 clkl, 병원성-관련 단백질 10, 분비된 단백질; 상기 Ustilago maydi의 병원성-관련 유전자, Kpp2, ukcl, 분비된 단백질; 및 상기 Melampsora lini의 병원성-관련 유전자, 분비된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  42. 제30항에 있어서, 상기 핵산 구조물은 플라스미드인 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 플라스미드는: pAD-WRKY-GHYl; pAD-ADH-GHY2; pOXB-WRKY-GHY3; pOXB-ADH-GHY4; pAD-WRKY-GHY5; hpRNA pAD-ADH-GHY6; 및 hpRNA pAD-WRKY-GHY7로 구성된 플라스미드 군으로부터의 표적 서열을 포함하도록 변형되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 상기 핵산 구조물은 식물 병원체의 적어도 하나의 필수 유전자를 하향조절하도록 구성된 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산 (siRNA)을 인코딩하며 프로모터에 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 프로모터는: 비구성적 프로모터; 유도성 프로모터, 병원체-유도성 프로모터; 조직-선호적 프로모터; 조직-특이적 프로모터, 식물-특이적 프로모터, 또는 구성적 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  46. 제30항에 있어서, 저해된 RNaseIII를 갖는 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는: 아시도박테리아, 악티노박테리아, 알파프로테오박테리아, 아르마티모나데테스, 박테리오데스, 베타프로테오박테리아, 델타프로테오박테리아, 퍼미큐테스, 그라마프로테오박테리아, TM7, 바실러스, 에스케리치아로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 M-JM109-GHY2인 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  48. 제46항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 Bacillus subtilis CCB422인 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  49. 제6항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 대장균 HT27 또는 HT115인 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  50. 제0항 및 제49항에 있어서, 저해된 RNaseIII를 갖는 상기 유전자 변형된 내 생 박테리아는 소포과형성 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아, JC8031, 및/또는 다른 박테리아와의 나노튜브 형성을 증강시키는데 충분한 하나 이상의 옥소트로피를 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  51. 제30항에 있어서, 상기 siRNA는 식물 전체를 통해 이동하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  52. 제30항에 있어서, 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘이 유도되는데 충분한 시간 동안 상기 핵산 구조물을 발현시키는 단계로서, 상기 RNAi 메카니즘이 식물 병원체에서 적어도 하나의 상기 필수 유전자의 하향조절을 일으키는 것인 상기 단계는 상기 핵산 구조물을 지속적으로 발현시킴으로써 상기 식물에서 지속적인 RNAi 메카니즘을 개시하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 지속적인 RNAi 메카니즘은 상기 식물로 하여금 상기 식물 병원체 감염에 대해 야생형보다 더 큰 내성을 갖도록 하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
    [청구항 52]
    제30항에 있어서, 적어도 하나의 헬퍼 유전자를 공동-발현하는 단계를 더 포함하는, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  53. 제52항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자는: VrrA; SID1; SID2; AGOl; AG02; AG07; YmdB; YmdB; 스타우펜; RDE-4; HlyA; Sec- 및 Tat-분비 시그널 펩타이드; 하나 이상의 세포-침투 펩타이드 (CPPs); Tat; 안테나피디아; ACC 데아미나제; 하나 이상의 체관부 RNA 트랜스포터; PP2-A1; PSRP1; DRB1 ; DRB4; HEN1 및 STVl로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  54. 제30항에 있어서, 상기 짧은 억제 리보핵산(siRNA)은 식물 병원체의 적어도 하나의 필수 유전자를 하향조절하도록 구성된 상기 짧은 억제 리보핵산(siRNA)은 식물 체관부를 통한 그의 전달을 용이하게할 수 있는 dsRNA로 통합가능한 하나 이상의 특이적인 RNA 모티프를 갖도록 구성된 짧은 억제 리보핵산(siRNA)를 포함하는 것인, 식물에 억제 RNA 분자를 전달하는 트랜스-킹덤 시스템.
  55. - 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘의 유도를 통해 식물 병원체에서 적어도 하나의 표적 유전자의 발현을 하향조절하도록 구성된 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물로 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 형질전환시키는 단계;
    - 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계
    를 포함하는, 식물에서 병원체를 저해하는 방법.
  56. 암 환자에게 투여되는, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 치료 처리의 효과 또는 효능을 평가하는 방법으로서 상기 방법은:
    - 대상자로부터 수득된 제1 샘플에서 측정된 바이오마커의 발현 수준을 시간 tj에서 대상자로부터 수득된 제2 샘플 내의 바이오마커 수준과 비교하되, 여기서 상기 바이오마커는 표 4에 기재된 군으로부터 선택되는 것이고;
    - 상기 제1 샘플에 대한 제2 샘플 내의 바이오마커 수준의 변화는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 치료가 그 대상자의 암을 치료하는데 효과적임을 가리키는 것인, 암 환자에게 투여되는, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 치료 처리의 효과 또는 효능을 평가하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 비교는 일정 기간 동안 반복되는 것인 방법.
  58. 식물에서 RNA-매개된 병원체 저해의 효능을 평가하는 방법으로서:
    - t0 시점에서 식물로부터 수득된 제1 샘플에서 측정되니 식물 병원체의 수준을 측정하는 단계,
    - 식물 병원체에서 적어도 하나의 필수 표적 유전자에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀 RNA(hpRNA)를 형성할 수 있는 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물을 갖는, 저해된 RNaselll 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - tj에서 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계;
    - 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘을 유도하도록 상기 핵산 구조물의 발현시킴으로서 상기 RNAi 메카니즘이 식물 병원체의 상기 적어도 하나의 표적 서열을 하향조절하도록 하는 단계; 및
    - t2 시점에서 식물로부터 수득된 제1 샘플에서 측정된 상기 식물 병원체의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 것인, 식물에서 RNA-매개된 병원체 저해의 효능을 평가하는 방법.
    [청구항 57]
    제58항에 있어서, 상기 비교는 일정 기간 동안 반복되는 것인 방법.
    [청구항 58]
    식물에서 RNA-매개된 병원체 저해의 효능을 평가하는 방법으로서:
    - t0 시점에서 식물로부터 수득된 제1 샘플에서 측정되니 식물 병원체의 수준을 측정하는 단계,
    - 식물 병원체에서 적어도 하나의 필수 표적 유전자에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀 RNA(hpRNA)를 형성할 수 있는 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물을 갖는, 저해된 RNaselll 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - tj에서 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계;
    - 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘을 유도하도록 상기 핵산 구조물의 발현시킴으로서 상기 RNAi 메카니즘이 식물 병원체의 상기 적어도 하나의 표적 서열을 하향조절하도록 하는 단계; 및
    - t2 시점에서 식물로부터 수득된 제1 샘플에서 측정된 상기 식물 병원체의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 것인, 식물에서 RNA-매개된 병원체 저해의 효능을 평가하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 비교는 일정 기간 동안 반복되는 것인 방법.
  60. - 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아의 유효량을 도입하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 식물 병원체에서 적어도 하나의 표적 서열에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀 RNA(hpRNA)를 형성할 수 있는 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물을 갖는 것인 단계
    를 포함하는, 병원체-감염된 식물을 치료하는 방법.
    [청구항 60]
    해충 내성 식물을 생성하는 방법으로서:
    - 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 유전자 변형된 내생 박테리아를 생성하는 단계;
    - 해충 또는 초식동물에서 적어도 하나의 필수 유전자에 대해 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 헤어핀 RNA(hpRNA)를 형성할 수 있는 적어도 하나의 짧은 억제 리보핵산(siRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조물로 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 형질전환시키는 단계;
    - 상기 유전자 변형된 내생 박테리아를 식물에 도입하는 단계; 및
    - 상기 식물에서 RNA 간섭(RNAi)를 유도하는데 충분한 시간 동안 상기 핵산 구조물을 발현시키는 단계로서, 여기서 상기 RNAi 메카니즘은 해충 또는 초식동물에서 적어도 하나의 필수 유전자에 대해 hpRNA의 dsRNA의 축적을 일으키는 것인 단계,
    - 해충 및/또는 초식동물에 의해 식물을 소비되도록 하여 해충 또는 초식동물에서 적어도 하나의 필수 유전자에 대해 hpRNA의 dsRNA가, 상기 해충 및/또는 초식동물에서 적어도 하나의 필수 유전자의 저해를 일으키는 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘을 유도하도록 하는 것인 단계
    를 포함하는, 해충 내성 식물을 생성하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 유전자 변형 내생 박테리아는 해충의 장에서 콜로니화할 수 있는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 siRNA는 곤충의 적어도 하나의 외골격 유전자의 표적 서열에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 하나 이상의 hpRNA를 포함하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 해충 또는 초식동물의 상기 적어도 하나의 필수 유전자는 해충 또는 초식동물의 중요 영역의 서열, 해충 또는 초식동물 패밀리의 보존된 서열, 및 상이한 해충 또는 초식동물 패밀리들의 멤버들 간에 보존된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 저해된 RNaseIII 활성을 갖는 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는 바실러스 및/또는 에스케리치아인 것인 방법.
    [청구항 64]
    제64항에 있어서, 상기 유전자 변형된 내생 박테리아는: M-JM109-GHY2; Bacillus subtilis CCB422, HT27, HT115, JC8031로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 적어도 하나의 헬퍼 유전자를 공동-발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자는: VrrA; SID1; SID2; AGOl; AG02; AG07; YmdB; YmdB; 스타우펜; RDE-4; HlyA; Sec- 및 Tat-분비 시그널 펩타이드; 하나 이상의 세포-침투 펩타이드 (CPPs); Tat; 안테나피디아; ACC 데아미나제; 하나 이상의 체관부 RNA 트랜스포터; PP2-A1; PSRP1; DRB1; DRB4; HEN1 및 STVl로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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