CN112063623B - 一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA及其应用。一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的dsRNA在制备防治水稻纹枯病菌的制剂中的应用。水稻纹枯病菌存在2个DCL同源基因DCL1和DCL2。本发明通过体外合成双链RNA，通过喷雾诱导的基因沉默DCLs的表达，有效抑制纹枯病菌的侵染，为水稻纹枯病菌的绿色防控提供新方法。

Description

一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA及其应用。

背景技术

水稻纹枯病是我国水稻三大病害之一，该病是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起。立枯丝核菌属于半腐生型，寄主范围广，主要包括水稻、玉米、豆类、高粱、大麦和花生等。水稻纹枯病在水稻各个生育期均有可能发生，以拔节孕穗期发病最为严重。水稻纹枯病主要危害叶鞘、叶片和茎秆，破坏传导组织，严重时叶片出现枯死，导致水稻不能正常抽穗，甚至整株死亡。近些年随着我国水稻种植模式的改变，矮秆、密植、氮肥高用量等高产栽培技术的大力推广，以及近几年直播稻、套播稻面积不断上升，水稻纹枯病呈逐年加重的趋势(Yuan et al, 2004)，具有发病广，频率高，危害大等特点，严重威胁粮食生产安全。

小分子RNAs是在真核生物中广泛存在的一类21-24核苷酸长度的非编码RNAs，主要分为 miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)两种形式。它可以与含Argonauto(AGO) 蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体，切割靶标mRNA或抑制其翻译，广泛参与植物的免疫防卫反应。在病原菌与植物长期的进化中，一些病原菌会产生新的毒性机制，通过分泌小RNA进入植物细胞内，干扰植物免疫系统。

跨界RNAi为小RNA介导的免疫开辟了一个未开发的领域。伴随着科研技术的进步，这个未知的领域逐渐被人们所熟知，并直接或间接地运用跨界RNAi技术防治一些病虫害，并取得了理想的防治效果。喷洒诱导的基因沉默(spray-induced gene silencing,SIGS)是在此理论基础上，通过合成靶标病原菌的致病基因的dsRNA，喷洒在植物表面，被真菌吸收抑制靶标，从而抑制病害的发生。这项技术已经成功应用到多种病虫害的防治中，克服了农药防治对环境和人类带来的危害，实现了病虫害的环境友好型防治。直接向寄主植物表面喷洒体外转录的 Bc-DCL1/2-dsRNA，抑制产生灰霉菌小RNA效应因子的BcDCL1和BcDCL2的表达，有效的抑制灰霉病的发生。体外转录合成烟草花叶病毒(TMV)的沉默抑制基因p126和外壳蛋白CP基因的 dsRNA分子，应用在烟草植株上，有效诱导了对TMV的抗性。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum) 是小麦赤霉病的主要致病菌种，通过喷雾CYP3-dsRNA，靶标真菌麦角甾醇的生物合成的真菌细胞色素P450羊毛甾醇C-14-a-脱甲基酶，能够抑制直接喷雾以及非喷雾叶片部位真菌的生长。

因此，随着现代分子生物学及遗传学的快速发展,以及植物与病原菌互作分子机制的更加深入的研究，喷洒诱导的基因沉默具有非常光明的应用前景及切实可行的操作性，将成为未来用于开发新的治疗植物病害控制和作物保护的有价值的工具。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA。

本发明的又一目的是提供该dsRNA的应用。

本发明的另一目的是提供水稻纹枯病菌DCL1基因和DCL2基因.

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的dsRNA在制备防治水稻纹枯病菌的制剂中的应用。

本发明所述的dsRNA的靶标序列，所述的靶标序列由SEQ ID NO.2所示的纹枯病菌的DCL1基因靶标序列和SEQ ID NO.3所示的DCL2基因靶标序列组成。

本发明所述的靶标序列在制备或筛选抑制水稻纹枯病菌的dsRNA中的应用。

水稻纹枯病菌DCL1基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

水稻纹枯病菌DCL2基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的水稻纹枯病菌DCL1基因和所述的水稻纹枯病菌DCL2基因作为靶标在制备抑制水稻纹枯病菌的制剂中的应用。

一种防治水稻纹枯病的方法，包括向水稻体外喷施本发明所述的dsRNA。

有益效果：

本发明首次提供了立枯丝核菌的DCL1基因和DCL2基因，并选择该这两个基因中的特定区段作为靶序列设计并合成了同时靶向立枯丝核菌的DCL1基因和DCL2基因的dsRNA。平板抑菌实验发现，dsRNA处理后立枯丝核菌菌丝生长畸形，侧枝上的分枝多，呈树枝状，后期立枯丝核菌形成菌核数目减少。通过水稻体外滴加dsRNA发现，dsRNA处理后能显著抑制病斑的扩展，抑制DCL1基因和DCL2基因的表达,从而达到防治病害的目的。

附图说明

图1为本发明体外合成dsRNA的检测结果图。

图2为本发明dsRNA对纹枯病菌菌核平板抑制结果图。

图3为本发明dsRNA对纹枯病菌菌丝平板抑制结果图。

图4为本发明dsRNA防治纹枯病菌结果图。

图5为通过qRT-PCR检测纹枯病菌DCL1和DCL2的表达情况

具体实施方式

实施例1

用于防治水稻纹枯病的靶标由SEQ ID NO.2所示的纹枯病菌的DCL1基因靶标序列和SEQ ID NO.3 所示的DCL2基因靶标序列组成。扩增作用靶标序列的引物为：

DCL1-F

TAATACGACTCACTATAGGGAGACAATATCGCTCGATGGATCC(SEQ ID NO.6)

DCL1-R

TACTTGCTCGGTAATCAAGGGAAGATTGCGCAATTACTGT(SEQ ID NO.7)

DCL2-F

ACAGTAATTGCGCAATCTTCCCTTGATTACCGAGCAAGTA(SEQ ID NO.8)

DCL2-R

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTGACCTCTTGCCATGATA(SEQ ID NO.9)

基因克隆PCR扩增体系

按上表体系混合试剂于八连排管中，放入PCR仪，PCR设定程序如下。

反应程序：

PCR产物电泳检测

采用琼脂糖凝胶(1％)通过水平电泳槽(120V,25min)分离提取的DNA，用EB染色液染色凝胶块，并通过凝胶成像仪观察扩增片段大小。

PCR产物的回收及纯化

将产物进行电泳检测，若实验条带与目的基因条带大小相符，即切下该段琼脂糖凝胶，使用Axygene的凝胶回收试剂盒进行产物的纯化。

(1)在紫外光照射下切下含有目的基因的琼脂糖凝胶，切碎后称量凝胶重量，以一个重量作为一个凝胶体积。

(2)将3个凝胶体积的Buffer DE-A加入离心管，与胶体混合后放入75℃水浴锅中加热，每隔2min取出上下颠倒混合至凝胶融化完全。

(3)将0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B加入，上下颠倒混合。

(4)将混合液转移到试剂盒内提供的2mL离心管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

(5)将700μL Buffer W1加入，12000rpm离心1min，弃滤液。

(6)将700μL Buffer W2加入，12000rpm离心30s，弃滤液，重复一次。

(7)将制备管置回2mL离心管中，空离1min。

(8)往制备膜中间加入25-30μL 65℃去离子水，12000rpm离心3min，进行DNA的洗脱。

实施例2

体外合成dsRNA是根据

RNAi试剂盒说明书(Life Technologies,Carlsbad, CA)，通过PCR分别将T7启动子序列导入RNAi片段的5'端和3'端。纯化后，利用两端含有 T7启动子的DNA片段进行体外转录。合成的dsRNA序列如SEQ ID NO.1所示，该dsRNA能同时靶向DCL1上的SEQ ID NO.2所示基因序列和DCL2上的SEQ ID NO.3所示基因序列。

体外转录的dsRNA加入80μl Nuclease-free Water，可以直接加2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠沉淀。

实施例3

体外转录的dsRNA，使用前将浓度调整到40ngμl^-1，使用RNase-free水，体外合成YFP-dsRNA作为负对照。

平板抑制效果实验：将保存于4℃中的水稻纹枯病菌接种到PDA平板上活化，在28℃培养箱中已培养2d左右，待真菌长满平板后，用灭菌的打孔器从菌落外边缘(取菌落中靠近边缘的部分)均匀打取直径为8mm的圆形菌丝块，接种于PDA平板的中央；取20μl dsRNA(40 ngμl^-1)滴在菌丝块上面，放置于28℃培养箱中培养，不同时间点观察dsRNA对纹枯病菌菌核和菌丝生长的影响。结果见图2和图3

实施例4

20μl dsRNA(40ngμl^-1)滴在水稻叶片样本的表面。然后，5mm直径纹枯病菌菌丝块应用于含有dsRNA的相同的位置。叶片3天后观察发病情况。水稻叶片经dsRNA处理后，与水处理组相比，显示出较轻的病害症状(图4)。同时，提取水稻叶片RNA，通过qRT-PCR检测纹枯病菌DCL1和DCL2的表达情况。结果发现，和对照相比，dsRNA处理组能显著抑制纹枯病DCL1和DCL2的表达水平(图5)。

检测所用引物：

DCL1-F2:TTATGCTGCTCAAACAC

DCL1-R2:GTAGCGGTAACTGGGAT

DCL2-F2:ACGAAAGGACCTGAATC

DCL2-R2:CAATAAGAGGCTGCTGTA。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caauaucgcu cgauggaucc ccgacccuug uugcuuuagu uacggggaac aaccagcccg 60

agcgcgagcu caccauucac aagggagauu cuuuugucaa aauaaagaua caccguggcu 120

gccuucucga auuugcuucu gaggaggaua aacuggcccg gcucgaagca augcaacgcu 180

acaguaauug cgcaaucuuc ccuugauuac cgagcaagua gaacuugcau uucgcuacac 240

auugaaucuu uggcguauuc uuggaaacaa gcaauaugac aguccuuccg gcgaauuggc 300

guauuuugug cuuccuguca aauuuggucc gaauuucgag ccuacccgua uugcucgcac 360

gaccucgauu gaaccgugca uaucauggca agaggucaac 400

<210> 2

<211> 114

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )

<400> 2

gattcttttg tcaaaataaa gatacaccgt ggctgccttc tcgaatttgc ttctgaggag 60

gataaactgg cccggctcga agcaatgcaa cgctacagta attgcgcaat cttc 114

<210> 3

<211> 199

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )

<400> 3

cttgattacc gagcaagtag aacttgcatt tcgctacaca ttgaatcttt ggcgtattct 60

tggaaacaag caatatgaca gtccttccgg cgaattggcg tattttgtgc ttcctgtcaa 120

atttggtccg aatttcgagc ctacccgtat tgctcgcacg acctcgattg aaccgtgcat 180

atcatggcaa gaggtcaac 199

<210> 4

<211> 4329

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )

<400> 4

atggccgatt ctgcgatcac acaggtggct gttgcagagg ccacaggaag gttaataccc 60

cgtttatatc agcaagagat cttccaacga gctgtcaacg aaaatgtgat ttgcgcgatg 120

gacaccggaa gtgggaaaac ccaaatcgca gttatgctgc tcaaacacat catgtcacta 180

cggccagcag actctaatcc aaaaaaggtc gcagtatttc tcgtagcttc tgtccccttg 240

gcggagcaac agggagactt cctagaatcc cagttaccgc tacacgtgaa tgtacgtcca 300

gtatttcttc tgcttgctgg cgcttatgca gacggtcaga aattctatgg ggcaatgggg 360

gtcgactatt gggatcgaga acgctgggcc aaggcctttg cggaatcaga cgttatggtt 420

atgacagctc aggtatttca cgacttgcta aaccatgcgc attggagtat cgataaggct 480

caccactgca acaagaatca tgtttacgca caaatcatga gaacacacta ccaccattgt 540

ccggtcagcg aacggccgcg catatttgga atgactgcga gtccgatatt caatattcgc 600

aaccctgcac aatcgctcgc gcaactccaa gaaactatgg atgccaaagt tctggctgtg 660

aaggacaatg ttcttgaatt ggcgttgaat gcacccaagc cccaagagtt tgttatggag 720

tgtcctcctc ctagttcgga ctactctgat tacccaaggc ctaccatgtg gtccgtagta 780

tccgagtttg agaacctgct attccccgat cccgacgacc ttaaagatct aacttcgcga 840

tacaaacatg cactcaatga gctgggacct ctagccgccg attatttcgt gcttcttttt 900

attcggcgag ccatcgaaaa gagtactgtc ggatcgtccg aattaggcgc ctacttctcg 960

agagcgagtt cattggcccc cgagactggt ggggattcaa gcccagtggc tggccagacc 1020

tggtcggatt tggacaacgc atacaacgaa catctggcta cgatccaaga gcgagcaaga 1080

ggacttgaca aatcgcagat gatgtcttgg ctcacgccca agttgaagat tctaatctcc 1140

atcctcgagg ccaatcgggc tgatgatttc agtgctttaa tcttcgtcga gcaacgccag 1200

gttgcatctg cactcgcctg gctgttgccc cttgttccag agttgcgaga ctgggtcaaa 1260

gcagctgctc ttgtaggtca cggcgatgga agcagggcag gtttcgaggg aagtggtatg 1320

gctcatgcag cacaacggtc tactgttcgc aatttccgct cgggcagcat caatctcgtt 1380

attgcaacat cagttgctga ggaaggtctc gatttccagg cctgcaaact cgtggtacgt 1440

ctcgatgctc cgcagaccat ggtaggatac cttcagagcc ggggacgggc tcgcaaacac 1500

gattctgctt atgtcgtgtt aacggatcca gagggcgcta aacgataccg tgggtttcga 1560

ggggctgaac ctcatctacg gcgcatatac cagcgtatta gtgaagaaga ggcgcaacaa 1620

gatggtgaaa tggacgttga agaagaagag gacgttgata acgaacgcta tgtcgtcaaa 1680

tccactggcg cagttgttac tccttcgacc gccatcggcc tcttgcattt gtggtgctcc 1740

cagctcgagg tcgaccgatt taccaagcct ccagcaccag agtttcatat tactggtaaa 1800

tacatgtgca aaatctccgc tcctccgtgc attctcaacc ctgcactttc tgggcccata 1860

catggtcccc ttaaaaaaac acgagatggc gctcgacgtg cagctgcctt tctttttgtc 1920

caaaaactac acaagctcga gatattcgac gattatctat tgccttttaa gaaaaggagc 1980

tcaaaagccg atgacctatc ccaacgcctg gacggcactc ttcgaaggga gggcgaactt 2040

ttcgatacga ttacgccctg gggcgatgta tggcactctg gctctcccgt ttggatgaac 2100

ccaatatcgc tcgatggatc cccgaccctt gttgctttag ttacggggaa caaccagccc 2160

gagcgcgagc tcaccattca caagggagat tcttttgtca aaataaagat acaccgtggc 2220

tgccttctcg aatttgcttc tgaggaggat aaactggccc ggctcgaagc aatgcaacgc 2280

tacagtaatt gcgcaatctt ctgggctatt actgcccgaa agcttcctcc ccgttccact 2340

tgcttgattg ctccgttgat tggtccagaa ggactccctg actatgatag gatgtcaaat 2400

ctagccaccc acgctgtgaa gctttccaag gaagagtggc tgaacccaga gcttgtaggt 2460

agtcttgtca tggaagccca ccgactcggc tccaccctct acgagttttt gggaatcaag 2520

acgggtgttg acctgtcctc ttgtccaatc tcactcgaag atggcaccaa gtgccgagaa 2580

aatgctcatg aaacgtaccg atcctactgg gaggctgcta cgggcacagt taaaaggggg 2640

cttgctttag atatacccga aggcgatcat tggcttgaac ttgtctccat atccaaggcg 2700

caattacaat ctcataatgg cttatatggc ctagtcaaga ttacaggtag cgaacaaccg 2760

accgcaaagc catctcagat cgtcacccca tctcatatgg cccgaatatc tccaattcca 2820

gccgatattg taagaatcgt aactcacctc cccaacctct tggggcaaat gacggtacta 2880

ttccggatcg actcggccaa agaaatccta cgaacaaatg gcgtaccgtt agaactctta 2940

ctcgaagctc tgacactccc ttccgttcaa gccggcttcg actaccagcg cttagaaacc 3000

atcggagact ccgttctcaa agtatctatg tgcactcatc ttttcataaa gtaccaaggt 3060

catcacgagg gacaattatc cgccatgaag gatagcgtag tttcaaacgc taatctcatg 3120

agagtaggca ggcagtctcc gttatctcga ttcctcatta ctggttcgat gccgacgcgt 3180

agaacatgga gccctccagc atctccaacc atcagcgaaa cacaggacga ttctggtgaa 3240

caagatgatt ccaacgaaca gaaggacgat tctaacgaac agaaggaaaa cgacagcaaa 3300

ggagagtttg agaaaacttc tttccatacc aagagtcttg ctgattgcac agagtcaaca 3360

ctcggtgcaa cctaccttag ccgtggtgtc gaagccgccc tcgaggtagg ggaggcgcta 3420

gggcttcctc ttggcggaac aacaccatgg catttgcgcc gagaagtaga cgtttttgcg 3480

agaaaaagcg agataactat gctctttgct cctgtagagg agaaacttgg atacaagttt 3540

aagaacgctt cccttgttgc cgaagcattc acgcatacag cctacgatct atcacagggg 3600

ccctcatata atcgtctaga gttccttgga gattcgcttt tcgatcttta tgtggtcaag 3660

ttcatgtacc tgaaattccc caagatgaca ccagggcaaa tgtcttgggc acgtagccga 3720

cttgtaaacg catccacgtt cggaaagcta gctgtgggac tcgaacttca taaacacatc 3780

ctcacttcat cagcaaacct ccagaaagca gttgctagct ttgcgcagga ggttgaagaa 3840

atatcattag aagaaattct tcagatttgc tggaagattg atgcgcccaa ggccattagt 3900

gacgtattcg aggccatctt tggggcgatt tatgtcgatt cgtcttttaa tctcgaactc 3960

acatttgagc acatccatcg agtcatggcc aacattatgg aatatgtcac gccagttatg 4020

cagggggacc caacttcgga gctggttcgc tgggtcgcgt cacagggctg cgaagcccaa 4080

gggagcacga tattcagctc aagttcaaac agtagagctt cgaccaatga tacagttgaa 4140

acaaccgttc atggtcgtac tatctcacgg gtgacagccg caacttccaa gcttgcgagg 4200

ccgatggcag ccgagcaagc actgaatatt ctaaaggacg aaactcatga ctatgcatta 4260

tccaagattt gttcatgccc gcgtgcaaag ctcaaacgga aggcttccga tcctatcatt 4320

ctggagtga 4329

<210> 5

<211> 4281

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )

<400> 5

atgacccggg aacggaactc ccaacgggag atcggctgtc ggacaggggg tagttccact 60

ttctccgcgt ttgagcacgg agctggattc aatggtcctc taggtagtcc tttagggagg 120

attggaattg gacatacctt ccaggggata ggttctaggc aatttgattt ccagctctca 180

gaagccacac gctacagtgc actcccgcga accatgagcc acctaaatag agctgctccc 240

ggaagtggtg gccttccact cacttctggt tcttctcttt cacctggtgg gctcaagccc 300

cctaggcttg gtggtctcgc tcctggagtc agcaccgcaa ttctgagcag taatacgtat 360

gaagaggacg cccggcgagt atatgatggt ctggactcca gtgctaaacc caaggcttcc 420

ctttatacac catctacatc cggttccagc ttcaatcatg tatggtttaa agaactgagg 480

caagggctag caatcacccc agcatcttac gcactcctag cgctggatcg tggtctaata 540

aagctatctc ggctgtcgca tctcatagtg gacgatgctc acctggttgc cctggaagat 600

ctttcatccc ctctttctac aatacttttg gatcattatg gaaaactacc tactgccgga 660

cggccgcgcg ttctaggtct aactcactac cctttggaac tagaagccaa ttttggatac 720

tctgctctgc gtatggaaca attattggat gctcggatct tgggtaatct tgatgcgaaa 780

agagtagaag tagctcacga tgccaataga ctggaagttt cagtgcttga gtatgaatcc 840

cgtaaaggag cactgcccgt actccctcca ggtttccatc cggcttttga agcagcaact 900

ctggaattag ggggctggtg tgttcctctg ttctcgttat ttaatcctga ttcggattca 960

gagggtctaa tcatggacaa gaggactatt acaatacccc tgttggaagg aatatccctg 1020

gatcagacat cgaaacttaa tgagatcctg aaatatttga acgctgcatc aatgtcatcg 1080

cactttcggt gcatcataat tgaggatttc aagaacgggt taatcaacac ccttatatgt 1140

accgagtcta ttttaagcag catagatgga gacgtttgtt ctcatgttat ctgtggcgcg 1200

agcctgacat ttttagctga gcggggcaat cgggagcact atcaagttgc cagggatatc 1260

ctaaagatgg acaactcaat ctataattgg gttttgaata tgaatgtcga cggagcacca 1320

agtcccccaa agccattggc gaattgtcgc cggtttaatc aatattccat tatcattggt 1380

ccgtcgcgcg aaagctcacg agaaagcccc tatatccaag atccaattat tggttctaga 1440

atctatatac aggagtccga agaggtgttt taccgatttt tggccaacag agctgaagaa 1500

gatgccgctc taataccggt caaagtattt tcttatgagc gagtttctgt ggaaaacact 1560

gatctcaagg atcactggtg ctgcacaatc cggacaaact catgcgaccc acctctcgaa 1620

atccacgggg aaccttcgtt gtgtaaggcc ctagctagga gttctgcttg ctttcgcgcg 1680

tgctttacac tattcaacct tggcttactc ccttcttcct ttttcccgtc gcgtcccttg 1740

cacacttgga aacatggtat attacagcca cccaagaaca gggtggctat agacacgtat 1800

tatccacctg tgctaccact gttttggcac aactgcctgc ttgcggcccc atctaaattg 1860

ttttacccct acttgattca attctcgatg ggatcacaaa ctggtttata tccaagcatg 1920

atactattga tccgaattcc cctgggcgat atcaaggaat tctcagtgtt ccccaaccag 1980

actgagctca aagtatccct cagtcaatgt gcaccccttt ccttgattac cgagcaagta 2040

gaacttgcat ttcgctacac attgaatctt tggcgtattc ttggaaacaa gcaatatgac 2100

agtccttccg gcgaattggc gtattttgtg cttcctgtca aatttggtcc gaatttcgag 2160

cctacccgta ttgctcgcac gacctcgatt gaaccgtgca tatcatggca agaggtcaac 2220

gacttggttt cgttccgagt gcgaccccta aaatgtaaca acgtggatga gatgtggctg 2280

gatttaatga atggtgtcat tcaggaccgt tcgaacgaat ttactcgtag gtttgagaat 2340

gccaagctac gaaaggacct gaatccacta tcattgatca tgcaagacaa gcctggagag 2400

ccccagatat cgttgttgga ctattataga acccaccggc atgagttcga gggcattcaa 2460

aacctacagc agcctcttat tgaagcgact ttgttacctg gccttgcaaa ccagctcaac 2520

ccccaggagc ccaccgtcca aaagacaacc aactaccttg tgccggaaat atgctacgtc 2580

tccagtattc ccgccccaac tttccggaca gcatcgctcc tcccatctgt gatctggcat 2640

atcgagaatg tattgattgc caaggaagtc aacttgacgt ttttccaagg tcaaatacag 2700

gatgagcttg ttgcacatgc actctgttcc cgtatggccc atcgcacgtt tagctacgag 2760

agactcgaat ttttaggtag gcaccacatt gttccccaca tgtttgactc aatgcgtctt 2820

atttatgcag gagatacttt tatcaaatat gctgcatccg cttacctata tggtgttgaa 2880

ccaactgcac cttccggggt tctacattca aaacggcaga aaatggtcaa taacagatcc 2940

ttatggttgg gggcccaggc gctgggcctg ccgccgtgca ttcaatcgga tgtgttccga 3000

cctaagcaat gggtcatccc caatgttttg atatcaaaga aaagccctat tcatggagag 3060

aacccaggat ttaccgggca agctcagttg ctaaactcta gacagtattc acgtcagatt 3120

ccaccaaaaa ccattgcgga tgtggtcgag gccatgattg gcgccgctct tttgagcgga 3180

ggcgaggagt tagccttttc cgtagccaaa actctgggct ttgacaccct caaaacctgt 3240

gactggctcg atgttatttc ctacgcaccc aacaagtcga tgactatgaa ggagtctgat 3300

cacaagggag aaactttgga tgggctcata aagatcatag gcgtttcatt agacaatcct 3360

gagctactat tacaagcgat ggtacgcata ttcctcagta taatcaaact tgaagttcaa 3420

ctgagaactg tgcagcaaca cgcatcaatg gcgagatctt ccgaatcata cgaacgccta 3480

gagttcttgg gggacgccgt tctagatatg ctggttgtgc aatcgttctt ctcggatgaa 3540

gaggaatggt cgcctcatag catgaccctg atcaagagta gcatggtctc taacagagcc 3600

ctcgcaatca tctgtatcga gtcaggttta catcaatact tgatgcacga tataaattct 3660

ctggcacaaa gcatcgtaac attcatagat gaagtccaaa aatgcaaaca gattgctcgg 3720

actgatgcac aacgtttgaa gtattggtcc aaattagtcg caccaaaggc cttgggagat 3780

gtggttgagt ccctcttggg ggcaatttat atttcttctg gatttagcat tactcgagtg 3840

aagacagtct atgatcgcgt attgaagccc ttttacgacc ggtacataga taagaaagct 3900

atgctaacac accccatgtc tcgactcatg aagaggttgg agtcaatcgg atgtcgatca 3960

ttcggggttg cgaaggctga aacgcagctt ccaaacggag gaactgggtt caagtgtgaa 4020

gtcaaaatcc atggccaaat aattgcgcag gcagcatctg agaaagccca gcaggccatt 4080

aaagatgcca cagaacgagc actaaactta cttgatgcac agcctgaccg tgttctggcc 4140

aattgtacgt gtagagctgg gcctcaagga aagaagcgca aaagagtgtc aatggaggat 4200

gcggaagaag gagaaattgt tgaagcactt cctggagatg atgcagacca cccgattgac 4260

gttgatatgt ttgatttttg a 4281

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg agacaatatc gctcgatgga tcc 43

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacttgctcg gtaatcaagg gaagattgcg caattactgt 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acagtaattg cgcaatcttc ccttgattac cgagcaagta 40

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg agagttgacc tcttgccatg ata 43

Claims (6)

1.一种抑制水稻纹枯病菌的dsRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的dsRNA在制备防治水稻纹枯病菌的制剂中的应用。

3.权利要求1所述的dsRNA的靶标序列，其特征在于所述的靶标序列由SEQ ID NO.2所示的纹枯病菌的DCL1基因靶标序列和SEQ ID NO.3所示的DCL2基因靶标序列组成。

4.权利要求3所述的靶标序列在制备或筛选抑制水稻纹枯病菌的dsRNA中的应用。

5.水稻纹枯病菌DCL1基因和水稻纹枯病菌DCL2基因作为靶标在制备抑制水稻纹枯病菌的制剂中的应用;其中所述的水稻纹枯病菌DCL1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述的水稻纹枯病菌DCL2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种防治水稻纹枯病的方法，其特征在于包括向水稻体外喷施权利要求1所述的dsRNA。

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