CN117721124B

CN117721124B - 稻瘟菌基因MoMIT1及其应用

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Publication number: CN117721124B
Application number: CN202410037225.8A
Authority: CN
Inventors: 王一; 李成云; 王春; 杨鑫云; 杨可昕
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2024-01-10
Filing date: 2024-01-10
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2044-01-10
Also published as: CN117721124A

Abstract

本发明公开一种稻瘟菌基因MoMIT1及其应用，特别是其在调控稻瘟菌菌株致病力和调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除片段，将其导入稻瘟菌原生质体，利用同源重组方法将MoMIT1基因从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体△Momit1。实验表明：MoMIT1基因影响了稻瘟菌产孢能力，敲除菌株△Momit1不产生分生孢子，敲除菌株△Momit1致病能力显著降低，且显著低于野生型；证明稻瘟菌基因MoMIT1为稻瘟菌的致病相关基因。同时，MoMIT1基因能调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力。本发明所提供的MoMIT1基因应用在稻瘟病的防控方面具有重要意义。

Description

稻瘟菌基因MoMIT1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种稻瘟菌基因MoMIT1及其应用，具体涉及稻瘟菌基因MoMIT1在调控稻瘟菌致病力中的应用以及在调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力中的应用。

背景技术

水稻稻瘟病，又名稻热病，是水稻真菌性病害，其致病菌无性世代为半知菌稻梨孢菌(Pyricularia oryzae Cavara)，有性世代为子囊菌巨座壳属稻巨座壳(Magnaportheoryzae B.C.Couch)。我国每年因稻瘟病造成减产约100万吨。水稻稻瘟病作为对全世界水稻损失最严重，分布最广泛的病害，具有显著的经济重要性。

稻瘟菌主要以菌丝体或分生孢子在病谷、病稻草上越冬，成为翌年的初侵染源。干燥时，分生孢子可存活半年至1年，病组织内的菌丝体可存活1年以上；潮湿时，经2～3个月便死亡。

稻瘟菌对水稻的侵染过程主要包括：(1)分生孢子随风雨传播，并粘附在水稻叶片表面；(2)分生孢子萌发，形成芽管；(3)芽管分化形成附着胞；(4)附着胞分化形成侵染钉；(5)侵染钉穿透寄主细胞，并在寄主细胞内形成侵染菌丝，在细胞间进行扩展。稻瘟菌主要靠分生孢子侵染水稻叶片，当分生孢子接触寄主表皮后，萌发形成发芽管，发芽管又特异性分化产生附着胞，附着胞形成侵染钉穿透寄主表皮继而持续进入寄主细胞中，致使寄主植物在侵染后5-7天左右出现症状。可见，分生孢子是稻瘟菌侵染的首要环节。当稻瘟菌菌株不能产生分生孢子时，也就不存在后续侵染水稻，其致病力大大减弱。

水稻稻瘟病是影响水稻生产的重要病害，对水稻稻瘟病菌功能基因的研究有利于了解稻瘟病菌的侵染机制，为防治稻瘟病提供新的思路。现有技术中尚未有公开稻瘟菌基因MoMIT1，也没有公开MoMIT1基因对稻瘟菌致病能力影响的相关报道。经检索，也没有MoMIT1基因调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力的报道。

发明内容

针对以上技术问题，本发明拟提供一种稻瘟菌基因MoMIT1及其应用，具体涉及稻瘟菌基因MoMIT1在调控稻瘟菌致病力中的应用以及在调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力中的应用。

本发明公开稻瘟菌基因MoMIT1，所述的MoMIT1基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述的MoMIT1基因编码的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还保护所述的MoMIT1基因在降低稻瘟菌致病力中的应用。

进一步地，所述的应用为以下(1)～(2)中的至少一项：

(1)所述的MoMIT1基因在调控稻瘟菌生长发育中的应用；

(2)所述的MoMIT1基因在抑制产孢能力中的应用。

进一步地，所述的MoMIT1基因在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用。

进一步地，所述的MoMIT1基因在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用，所述的防治是通过阻断或抑制MoMIT1基因的表达来实现的。

进一步地，所述的MoMIT1基因在防治由稻瘟菌导致的稻瘟病中的应用，所述的阻断或抑制MoMIT1基因表达的方式是采用所述MoMIT1基因的反义RNA或siRNA。

进一步地，所述的MoMIT1基因用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由稻瘟菌导致的稻瘟病。

本发明还保护所述的MoMIT1基因在调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供稻瘟菌基因MoMIT1，通过构建基因敲除片段，将其导入稻瘟菌原生质体，利用同源重组方法将MoMIT1基因从稻瘟菌中敲除，获得敲除突变体ΔMomit1。对致病性测定结果表明，敲除突变体ΔMomit1的致病力显著低于野生型。上述试验证明，稻瘟菌基因MoMIT1为稻瘟菌的致病相关基因。

实验证明，△Momit1敲除菌株不能产生分生孢子；离体接种菌丝后，野生型菌株可以产生稻瘟病菌梭形病斑，而△Momit1敲除菌株不能产生典型病斑；△Momit1敲除菌株处理的水稻比野生型菌株YN125处理的水稻发病轻，说明MoMIT1可能参与了稻瘟菌的致病过程，对水稻的侵染能力显著减弱。稻瘟菌基因MoMIT1能调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力。本发明研究有助于深入阐明稻瘟菌的致病分子机制，为开发有效稻瘟菌杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1为稻瘟菌基因MoMIT1的基因注释图；

图2为MoMIT1基因敲除菌株PCR产物进行电泳检测结果图；

图3为潮霉素磷酸转移酶抗性基因替换到目的基因所在位置结果确认图；

图4为基因敲除菌株△Momit1与野生型菌株产孢能力比较图；

图5为基因敲除菌株△Momit1与野生型菌株形成的病斑长度比较图；

图6为二价锰离子对敲除菌株△Momit1与野生型菌株对菌丝生长影响比较图；

图7为二价锰离子对敲除菌株△Momit1与野生型菌株对菌落面积影响比较图；

图8为二价锰离子对敲除菌株△Momit1与野生型菌株生长的生物量的影响比较图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

1.实验材料

1.1供试菌株及植物

供试菌株为稻瘟病菌野生型菌株YN125，该菌株保藏名称为Magnaporthe oryzaeYN125，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学；保藏日期：2023年12月25日；其微生物保藏编号：CCTCC No M 20232679。水稻材料为丽江新团黑谷。

1.2细菌及质粒载体

大肠杆菌Escherichia coli菌株DH5α；质粒pCX62。

2.实验方法

2.1稻瘟菌基因MoMIT1

2.1.1MoMIT1基因注释

MoMIT1基因DNA共有5539个碱基，含有15个内含子，16个外显子，含有1496个氨基酸，其编码的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示。通过氨基酸序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中进行了比对，比对结果表明该蛋白含有腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)结合位点，属于ABC转运蛋白(ATP-binding cassettetransporter)。MoMIT1基因注释图如图1所示。

2.2稻瘟菌基因MoMIT1敲除菌株的获得

2.2.1敲除载体构建

1.以YN125稻瘟病菌DNA为模版，使用不同引物分别对目标基因的上下游片段进行扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增片段段大小符合要求后，切胶回收DNA片段。所述的引物如下，引物序列分别如SEQ ID NO：3-6所示；

MoMIT1基因上游片段克隆

4854up-f：CGGGCCCCCCCTCGAGGCCTGTGAATTTGCCATGTT

4854up-r：TACCGTCGACCTCGAGGGCTGGTGGTGCGAGAATG

MoMIT1基因下游片段克隆

4854down-f：ATCCACTAGTTCTAGACTTGAACCCGAAAGTATAAAA

4854down-r：TGGCGGCCGCTCTAGAGGATGTTTAGGTGCTGGC

2.使用限制性内切酶切断敲除载体pCX62潮霉素抗性基因上游相应的多克隆位点，37℃，反应4h后，置于80℃反应5min，使酶失活；

3.使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切载体，酶切载体片段大小符合要求后，切胶回收；

4.使用同源重组酶连接目标片段和载体，反应体系如下：

表1同源重组反应体系

5.将反应后的体系加入到大肠杆菌T1感受态中，冰浴30min后，42℃水浴90s，再冰浴2min后，加入500μL的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床培养1h；

6.将培养后的菌液4000rpm离心1min后，弃上清液，重新加入100mL LB液体培养基重悬后，涂布于含有50μg/L氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)LB固体培养基，37℃过夜培养；

7.挑出在含有Amp固体培养基中长出来的单菌落，加入PCR反应液中，进行菌落PCR，反应体系如下：

表2菌落PCR反应体系

8.使用凝胶电泳检测PCR扩增产物，选取两个条带大小正确的菌落，加入5mL LB液体培养基，37℃，180rpm过夜培养后，提质粒，送昆明硕擎生物有限公司测序；

9.对上游连接成功的敲除载体使用限制性内切酶切断潮霉素抗性基因下游多克隆位点，37℃，反应4h后，置于80℃反应5min，使酶失活；

10.使用同源重组酶进行连接，方法同步骤4-步骤7；

11.使用菌落检测下游连接片段，选取两个条带大小正确的菌落，加入5mL LB液体培养基，37℃，180rpm过夜培养后，提质粒，送昆明硕擎生物有限公司测序；

12.将测序成功的质粒置于4℃保存，用于后续转化。

2.2.2质粒提取方法

1.挑取平板长出的单个菌落，接种到含有相应抗性抗生素的5mL LB液体培养基中，180rpm，37℃过夜培养；

2.将过夜培养的菌液12000rpm离心1min，倒上清；

3.加入250μL solution1溶液，使用涡旋振荡仪震荡均匀；

4.加入250μL solution2溶液，反复翻转离心管数次，至菌液澄清；

5.加入350μL solution3溶液，反复翻转离心管数次，至产生白色絮状沉淀；

6.12000rpm，室温离心10min；

7.吸上清至Hibind DNA Mini column，并放入收集管中；

8.12000rpm，室温离心2min，倒掉滤出液；

9.在滤膜上加500μL HBC缓冲液，12000rpm，室温离心2min，倒掉滤出液；

10.加入700μL Wash缓冲液，12000rpm，室温离心2min，倒掉滤出液，重复该步骤一次；

11.将不含洗脱液的Hibind DNA Mini column放入收集管中，12000rpm，室温离心2min。除去膜上多余洗脱液；

12.将Hibind DNA Mini column放入新的1.5mL离心管中，加入30-50μL ddH₂O，12000rpm，室温离心2min；

13.将离心后的滤液再加入到滤膜上，12000rpm，室温离心2min；

14.将提取完的质粒放入-20℃保存。

2.2.3胶回收方法

1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，将胶块放入1.5mL离心管中；

2.向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块(胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热)，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5-10min)；

3.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)10μL，均匀混合至溶液恢复黄色；当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇；

4.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

5.将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液；

6.将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30s，弃滤液；

7.将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1min；

8.将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入30μL灭菌水或Elution Buffer，室温静置1分钟；

9.室温12,000rpm离心1min洗脱DNA。

2.2.4稻瘟病菌原生质体制备和转化

1.挑取少量稻瘟病菌丝于YEG液体培养基(0.5％酵母提取物和2.5％葡萄糖)中，放入恒温摇床，培养温度为28℃，转速为160rpm；

2.在超净工作台中使用高温灭菌的漏斗和Miracloth过滤收集菌丝，用无菌水冲洗收集到的菌丝至菌丝颜色变白后，用1M的蔗糖溶液洗涤菌丝1-2次后，用灭菌滤纸尽量吸干菌丝水分；

3.配制20mg/mL的溶壁酶蔗糖溶液，并用细菌过滤膜过滤，将干燥的菌丝转移至溶壁酶溶液中，放入恒温摇床中，80rpm，30℃裂解2-3h，期间使用显微镜检测原生质体裂解情况；

4.将裂解完全的原生质体使用Miracloth过滤至灭菌离心管中，使用1M蔗糖溶液洗涤2次；

5.将含有滤液的离心管放入离心机中，4℃，4000rpm，离心10分钟后，弃上清液，用20mL的1×STC溶液重悬沉淀；

6.将重悬于STC溶液的原生质体在4℃，4000rpm，离心10分钟后，弃上清液，加入适当体积的1×STC溶液重悬，使原生质体浓度在1×10⁸个/mL；

7.将构建好的敲除载体(2.5μg)加入50μL原生质体溶液中，室温静置20分钟；

8.加入50μL的PTC溶液，室温静置20分钟；

9.加入1mL TB3液体培养基后，置于恒温摇床，28℃，80rpm，过夜培养；

10.在过夜培养的TB3培养基中加入含有潮霉素B(200mg/L)的新融化的TB3固体培养基，倒入培养皿中，凝固后，在培养基上层再加入含有潮霉素B(250mg/L)的融化的TB3固体培养基，凝固后放入恒温培养箱中，28℃，黑暗培养5-7天。

2.2.5敲除转化子确认方法

1.将在TB3上层培养基上长出的单菌落分别转移到含有潮霉素B的PSA培养基中，28℃，黑暗培养5天；

2.提取培养5天后新长出的菌丝；

3.以转化子DNA为模板，使用基因特异性引物进行扩增，具体方法同上，使用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，所述的特异性引物如下，特异性引物序列SEQ ID NO：7-12所示；

MoMIT1基因敲除检测引物

第一对

4854f：AGGCTGTCCTTTGTGGGT

4854r：AAATGGCAGATACTCGTGGT

第二对

4854ko-f：GGTTGTCAAGGTAAAGCC

H853-r ACAGACGTCGCGGTGAGTT

第三对

H708-f：GCCGTGGTTGGCTTGTAT

4854ko-r：AGATTGAGTGGTCGCAGC

2.3稻瘟菌敲除突变体的表型观察

菌丝生长统计方法：将保存在-80℃的含有菌丝的滤纸片在PSA培养基上活化。七天后，使用直径为0.7cm的打孔器对菌落边缘进行打孔，使用接种针将菌块移至新的PSA和CM培养基上，七天后观察菌落形态和测量菌落直径。试验设置3个生物学重复。产孢量统计方法：将菌丝放入含有玻璃珠的液体马铃薯蔗糖培养基中，置于摇床120rpm，28℃培养2天后，将菌液均匀涂在燕麦固体培养基中，光照培养7-10天后，用5mL无菌水洗下孢子，并用纱布过滤。取20μL的菌液滴在血球计数板上，置于显微镜下统计孢子数量。试验设置3个生物学重复。

3结果与分析

3.1稻瘟菌基因MoMIT1敲除菌株的确认

筛选出在含有潮霉素抗性培养基长出的转化子进行DNA提取，其中共筛选到转化子356个。使用不同引物进行扩增验证，得到3个MoMIT1基因敲除菌株△Momit1(如图2所示)。通过对条带进行测序结果表明，潮霉素磷酸转移酶抗性基因已经被替换到目的基因所在的位置上(如图3所示)。

3.2基因敲除菌株△Momit1的致病力的研究

3.2.1MoMIT1影响了稻瘟菌产孢能力比较

通过对△Momit1敲除菌株和野生型菌株的菌丝生长和产孢能力进行比较(图4)，结果表明，△Momit1敲除菌株与野生型菌株在菌丝生长直径上并没有显著差异。通过使用燕麦培养基产孢培养基对菌株产孢能力进行分析发现：野生菌株在产孢培养基上形成的菌落边缘有黑色霉层，而△Momit1敲除菌株在产孢培养基中只产生白色的气生菌丝。使用无菌水洗去菌丝过滤制成孢子悬浮液后发现：△Momit1敲除菌株不能产生分生孢子。

3.2.2基因敲除菌株△Momit1与野生型菌株形成的病斑长度和菌丝量比较

由于基因敲除菌株不能产生分生孢子，因此通过菌丝离体致伤接菌的方法在水稻叶片上分别接野生型和突变菌株菌丝。离体接种菌丝后，野生型菌株可以产生稻瘟病菌梭形病斑，而突变菌株不能产生典型病斑。

对病斑长度进行测量，结果如图5所示，发现野生型菌株形成的病斑长度为1.47cm，极显著大于敲除菌株△Momit1形成病斑长度为0.33cm。同时，对生物量进行了统计发现，接种野生型后病斑处的菌丝量为50.33，极显著大于接种敲除菌株△Momit1后形成病斑处菌丝生物量的6.14。

因此，以上结果表明敲除菌株△Momit1致病能力显著降低。

3.3稻瘟菌基因MoMIT1调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力

锰离子作为微量营养元素对生长发育、免疫功能、能量代谢和抗氧化防御有着重要作用。但是过量的锰会对细胞造成毒性，在农业生产中，以锰为原料的杀菌剂应用广泛，其主要原因是作用靶点多，病原菌不容易产生抗药性。

细胞中分布很多锰离子相关转运蛋白，在锰缺乏或者过量时负责细胞内锰的平衡。MntR作为细胞内维持锰离子平衡的重要调控因子，与二价锰离子结合后具有DNA结合活性。在细胞内二价锰离子缺乏时，MntR转录调控受到抑制，使二价锰离子吸收通道表达，如MntABCD和MntH，将胞外锰离子运输到胞内。当胞内锰离子含量过高时，MntR激活锰离子输出通道MneP和MneS，将胞内过量锰运出到外界环境中。

发明人发现稻瘟菌基因MoMIT1能调控稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力。

3.3.1锰离子对稻瘟病菌菌丝生长影响

将浓度为1M的MnCl₂母液加入完全固体培养基(complete medium，CM培养基，含有0.6％酵母提取物，0.6％水解酪蛋白，1％蔗糖和1.5％琼脂)，配成含有不同浓度MnCl₂的CM培养基，以不加MnCl₂的培养基作为对照。用打孔器在菌落边缘选取直径为0.7cm的菌丝块，用接种针将菌丝块置于培养基中间位置。接菌七天后，统计菌落直径。

分别将得到的转化子和野生型菌株接种至含有6mM和10mM MnCl₂的CM培养基中，七天后观察抑制情况(如图6和图7)。结果表明，在6mM MnCl₂时，△Momit1基因敲除菌株抑制率与野生型相比没有显著差异，而在10mM MnCl₂处理后野生型菌丝生长基本受到完全抑制，而△Momit1基因敲除菌株菌丝仍可以生长，因此，△Momit1基因敲除菌株对二价锰离子胁迫下表现为耐受。

3.3.2锰离子对稻瘟病菌生长生物量的影响

通过摇菌方法对敲除菌株在MnCl₂胁迫下的生物量进行统计。在液体CM培养基中添加MnCl₂母液至终浓度达到2mM，加入菌丝后，摇床培养2天。2天后滤出菌丝烘干至恒重，称量△Momit1基因敲除菌株的生物量明显大于野生型，结果如图8所示，说明△Momit1敲除菌株提高了对锰离子的耐受能力。

Claims

1.一种稻瘟菌基因MoMIT1，其特征在于：所述的MoMIT1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2.抑制权利要求1所述的稻瘟菌基因MoMIT1的表达在抑制稻瘟菌致病力中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抑制稻瘟菌致病力具体为降低稻瘟菌产孢能力和/或减少稻瘟菌菌丝量。

4.抑制权利要求1中所述的稻瘟菌基因MoMIT1的表达在提高稻瘟菌抗二价锰离子胁迫能力中的应用。