CN113462691B - 一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用。本发明抑制匍枝根霉的dsRNA序列如SEQ ID NO.1所示，本发明公开了dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。本发明首次提供了匍枝根霉dcl1和p450基因，并选择其非保守区序列作为靶标序列，根据该靶标序列，设计上下游引物，用于扩增靶标序列，并在靶标序列的两端加上T7序列，合成了dsRNA。平板抑菌实验发现，dsRNA能够显著抑制匍枝根霉菌丝的延伸和扩散。向桃体外喷施dsRNA发现，加入dsRNA的桃，其软腐病症状明显减轻，从而达到防治桃软腐病的目的。

Description

一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用。

背景技术

匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)隶属于毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucorales)、匍枝根霉属(Rhizopus stolonifer)，是一种强寄生性病原菌，一旦侵入宿主体内，就会迅速生长繁殖。匍枝根霉可以侵染桃、杏、梨、猕猴桃、甜瓜、葡萄、金针菇、甘薯等果蔬，造成软腐病，给农业生产带来了巨大的损失。目前国内外普遍采用酸性硫酸钙、二氧化氯、山梨酸钾等化学杀菌剂来抑制匍枝根霉的生长，但长期使用化学杀菌剂不仅会使微生物产生抗性，而且会危害人体的健康。因此，亟待寻找一种高效、安全和环保的病原菌防治方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用，dsRNA能显著抑制匍枝根霉的生长，从而达到防治桃软腐病的目的。

为解决上述技术问题，本发明提供一种抑制匍枝根霉的dsRNA，其序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种匍枝根霉抑制剂，包括上述的dsRNA。

本发明还提供上述的dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。

本发明还提供上述的dsRNA的靶标序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供上述的dsRNA的靶标序列在制备或筛选抑制匍枝根霉的dsRNA中的应用。

本发明还提供匍枝根霉dcl1和p450基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

本发明还提供上述的匍枝根霉dcl1和p450基因作为靶标在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。

本发明还提供一种防治桃软腐病的方法，包括向桃体外喷施上述的dsRNA或上述的匍枝根霉抑制剂。

随着分子生物学的快速发展，一种基于特定靶标基因的高效沉默方法-RNAi成为农作物真菌性病害防治的重要手段。RNAi是指在内源性或外源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导下，同源mRNA特异性降解，从而导致靶标基因的表达沉默的过程。将dsRNA导入病原菌体内的方法主要分为宿主诱导的基因沉默(Host-induced genesilencing，HIGS)和喷雾诱导的基因沉默(Spray-induced gene silencing，SIGS)。HIGS是在病原菌宿主植物体内表达能合成靶向病原菌相关基因dsRNA的元件，然后通过跨界传递，将dsRNA效应因子输送至病原菌体内，通过RNAi下调效应抑制病原菌的生长来保护植物免受其害的一种方法。SIGS则是通过直接向植物组织喷洒靶向病原体关键基因的dsRNA制剂以抑制相关基因表达，从而实现病害防治的目的。SIGS喷咋的RNAi制剂主要成分是dsRNA，无毒无残留，且操作方便、靶向精准，能解决HIGS存在的脱靶效应和转基因植物的安全性问题，更具应用潜力。目前已在部分病虫害防治中得到了使用，实现了病虫害的环境友好型防治。

本发明所达到的有益效果：本发明首次提供了匍枝根霉dcl1和p450基因，并选择其非保守区序列作为为靶标序列，根据该靶标序列，设计上下游引物，用于扩增靶标序列，并在靶标序列的两端加上T7序列，合成了dsRNA。平板抑菌实验发现，dsRNA能够显著抑制匍枝根霉菌丝的延伸和扩散。向桃体外喷施dsRNA发现，加入dsRNA的桃，其软腐病症状明显减轻，通过qRT-PCR检测匍枝根霉dcl1和p450基因的表达情况，发现dsRNA处理组能显著抑制匍枝根霉dcl1和p450基因的表达水平，从而达到防治桃软腐病的目的。

附图说明

图1为本发明体外合成dsRNA的检测结果图；

图2为本发明dsRNA对匍枝根霉的离体抑制结果图；

图3为本发明dsRNA对匍枝根霉菌丝抑制效果图；

图4为本发明dsRNA防治桃软腐病结果图；

图5为通过qRT-PCR检测匍枝根霉dcl1和p450基因的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1：匍枝根霉dcl1和p450基因全长cDNA及靶标片段的获得

用于防治匍枝根霉的靶标由SEQ ID NO.2所示的dcl1基因靶标序列和p450基因靶标序列组成。基于匍枝根霉的基因组数据库，采用生物学信息法对匍枝根霉dcl1和p450基因进行搜索，获得匍枝根霉dcl1和p450基因全长cDNA序列，用Snap Gene Viewer软件得到非保守区序列，即为靶标序列。根据该靶标序列，采用Primer Premier软件设计上下游引物，用于扩增靶标序列。

扩增靶标序列的引物为：

dcl1-F：AGGACCTTGGAGTTGT(SEQ ID NO.5)

dcl1-R：AAACATTGGGATTACG(SEQ ID NO.6)

p450-F:TCTTACTTGTTGCCAAAC(SEQ ID NO.7)

p450-R：GTCGCATAAAGGGAGG(SEQ ID NO.8)

PCR扩增体系为：

组分	用量
		2×Vazyme Lamp Master Mix	50μL
Primer F	4μL
		Primer R	4μL
Template DNA	12μL
		dd H2O	up to 100μL

按上表体系混合试剂于200μL离心管中，放入PCR仪，PCR设定程序如下：

PCR产物电泳检测：

采用琼脂糖凝胶(2％)通过水平电泳槽(120V，25min)分离DNA，用gel red染色液染色凝胶块，并用凝胶成像仪观察扩增片段的大小。

PCR产物的回收及纯化：

将大小正确的产物切下，用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化DNA，具体步骤如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等倍体积的溶液PN，50℃水浴放置，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步得到的溶液加到吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，重复两次。

(6)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

(7)将吸附柱放在一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μL ddH₂O，室温放置2min。12000rmp离心2min收集DNA溶液。

实施例2：dcl1和p450靶标序列dsRNA的获得

首先通过PCR将T7启动子导入靶标序列的5’和3’端，纯化后以两端带有T7启动子的DNA片段作为模板，采用In vitro Transcription T7 Kit试剂盒体外合成dsRNA，具体步骤如下：

(1)配置下列反应液

组分	用量
		10×Transcription Buffter	2μL
ATP solution	2μL
		GTP solution	2μL
CTP solution	2μL
		UTP solution	2μL
RNase Inhibitor	0.5μL
		T7 RNA Polymerase	2μL
PCR产物	20ng～1μg
		Rnase free dH2O	加至20μL
Total	20μL

(2)将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应1～2小时。

(3)Dnase I处理：转录反应后，向其中加入2μL RNase free DNaseⅠ，混匀。37℃反应30min。

(4)dsRNA的沉淀和纯化

a.反应液体积低于100μL时，加入RNase free dH₂O补足至100μL。

b.加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，涡旋震荡，12000rpm室温离心2min。

c.上层(水层)移至新的tube中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋震荡，12000rpm室温离心2min。

d.上层(水层)移至新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠、等体积的异丙醇，充分混合均匀。

e.室温放置5min后，15000rpm室温离心5min。

f.除去上清，80％乙醇洗净沉淀。

g.干燥后加入30μL RNase-free水。

图1为本发明体外合成dsRNA的检测结果图。

实施例3：dcl1和p450基因dsRNA在防治匍枝根霉中的应用

体外转录的dsRNA，使用前调整浓度至20ng/μL(使用RNase-free水)。

从南京众彩蔬菜批发市场购进若干新鲜桃，选取大小均匀、成熟度一致的桃，清洗、消毒，并置于通风橱中吹干。

(1)离体实验

取匍枝根霉孢子液划线分离，挑取单菌落接种至平板中央，待菌丝铺满平板时，在平板边缘取新鲜菌丝接种于PDA平板的中央，取20μL dsRNA(20ng/μL)滴在菌丝边缘后置于25℃培养箱培养，每隔1d观察dsRNA对匍枝根霉菌丝生长的影响。结果表明dsRNA能够显著抑制菌丝的延伸和扩散(图2、3)。

(2)活体实验：

用枪头在桃表面扎上深浅一致的伤口，取10μL dsRNA(20ng/μL)滴在伤口处，同时加入10μL匍枝根霉孢子液(10⁵/mL)，置于25℃培养箱中贮存，4d后观察发病情况。与对照相比，加入dsRNA的桃，其软腐病症状明显减轻(图4)。同时，用镊子将桃表面的匍枝根霉刮下，液氮速冻，提取RNA，通过qRT-PCR检测匍枝根霉dcl1和p450基因的表达情况。

检测所用引物：

dcl1-F：GGACCTTGGAGTTGT(SEQ ID NO.9)

dcl1-R：AACATTGGGATTACG(SEQ ID NO.10)

p450-F：TGCTGAAGCGGTGATCAAGT(SEQ ID NO.11)

p450-R：GCAACAAAGAACACCGCCAT(SEQ ID NO.12)

结果发现，与对照相比，dsRNA处理组能显著抑制匍枝根霉dcl1和p450基因的表达水平(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 299

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggaccuugg aguugugaua uuauguggaa aacaaugcug accgaucugg aacgccgcau 60

ggcaagacaa acacaagauu uggaaagaga agcuuugauc gaugaagauu uagcacucaa 120

agaaacacau gaauugauug auacaauuga aucuccucgu aaucccaaug uuuucuuacu 180

uguugccaaa caaauauaca ccuuuuuuca aguaccaagu aaucugcguc auuuaccuag 240

uguuuccuuu uuuucuaugg cuaaaucuua uuugacaaga gaaccucccu uuaugcgac 299

<210> 2

<211> 299

<212> DNA

<213> 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)

<400> 2

aggaccttgg agttgtgata ttatgtggaa aacaatgctg accgatctgg aacgccgcat 60

ggcaagacaa acacaagatt tggaaagaga agctttgatc gatgaagatt tagcactcaa 120

agaaacacat gaattgattg atacaattga atctcctcgt aatcccaatg ttttcttact 180

tgttgccaaa caaatataca ccttttttca agtaccaagt aatctgcgtc atttacctag 240

tgtttccttt ttttctatgg ctaaatctta tttgacaaga gaacctccct ttatgcgac 299

<210> 3

<211> 4761

<212> DNA

<213> 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)

<400> 3

atgagcgatt acgtggataa gacagtcaaa tatgttccac ttgaacccaa agagaacagg 60

atgaacgaag gagatcagtc acggctagcg aaatatttgg agccacaatt tctcaatgca 120

acaccagaca gcaaaaccag agatttaggc tttattgaac tcatcgacag tgagcgactc 180

gatatggaag aagaagacga caaggacttt ttgattgata aagaacaggc ggaacaagca 240

gctgtattag cacctcgtga atatcaatat gaactttacc agaaagcttt aaaggaaaat 300

gtgattactg ttttggatac aggtgcagga aaaaccttga tttcagtcat gttgataaag 360

caaatgacaa cattagaaag agaagctcgt ttaactcgtc gtgagactaa attagctttt 420

ttcttggtgg atcgtgtacc acttgttttt caacaagcaa gtgttattca agctaactgt 480

gatgttgctt tggagttcat gtgtggtgaa atggatgttg acaactggtc agagaagaaa 540

tggaaaactg ttttcgaaga aaacgatgtt tgtgttatga cagcccagat atttttagac 600

gcactctatc acggatttat tagtattgac aaggcgcatt taattatttt cgacgagtgt 660

catcatgcaa caaaaaaaca tccattcaat ttgatcatga gagaatttta cgaccgttgc 720

ccgatagaga agagacccaa gatatttggc atgacagctt ctcctatgca ttcaaaatct 780

agtgtagaaa ctagcgtaat tcaattggag agaaatatga attcacgcgt ttacacagca 840

gctagcgcaa atcaactgaa catctcaaat aatccaacaa aggaaatcac actactttat 900

atgccatcac caagatacga ggaaacttca atgacaaaga gaatccgaga aaagatcggc 960

gctattccaa gatacaagcg ttgctttgtt attacaaaag acattcttta tcaactagga 1020

ccttggagtt gtgatattat gtggaaaaca atgctgaccg atctggaacg ccgcatggca 1080

agacaaacac aagatttgga aagagaagct ttgatcgatg aagatttagc actcaaagaa 1140

acacatgaat tgattgatac aattgaatct cctcgtaatc ccaatgttta tgacattaca 1200

caattttctc caaaaatcgc aaaactgata caggtggtca gttttcttgt ggataacttt 1260

gaacagtttt gtggtattat ctttgtcgaa cgaagacata ctgctattgc cttacaaaag 1320

ctcatcgatt ctttggattc actttcaaaa atcagatgtg gtatcttgat tggacacggt 1380

tcgtccgacg aaggagatgt acagatgacc ttcaaagaac aaaacaaagt gatccaaaaa 1440

tttagatcag gtcaattaaa tatccttatt gctacaaacg ttgctgaaga aggattagat 1500

atccaacctt gtaattttgt tattagattt gactttttca atacactgat cgcttatatc 1560

caatcaagag gaagagctcg ttgtaaagat tcaaaatatc tcatcatgat tgaagacaaa 1620

aatatgagcc aaatgggcac cttggacgag tttagaatgt tggaagaggc aatgaaagga 1680

ttttgtcaag ctttacccgc agaaagaaat gtggcaaaca agttttcagt gggcaatgaa 1740

ggttatgagt cggacgacga ttacgattca gacgaggatt atttggagag cgctattacc 1800

gatctggaaa caggagcaac tattacaaaa cagaacgctg taccgctaat tcacagatat 1860

tgtagcaatc ttccctctga cagtttttgt gttttaaagc ccatctttga gcattcggcg 1920

tcgggtgaag gctacaaatg caccttgatc ttgccaagta atgctgctat tcaaagggta 1980

gaatcgcctt atgttcgatc caaaaattta gctagagctc tcgttgcctt gcaagcatgc 2040

tctgaactca aacaagttga tgctttggat agacatttgt tgcctcgtaa tattcgaaag 2100

gaaattcttg gtgagatggc agctcaatat gatgaaaatg gttacattat tggtagtaga 2160

cgtcgtcatg gattatacca gaagcgaaca cctaaatttt gggagagaga agtagaagaa 2220

gaggagaata tcgatgtcga agacaatgaa gatttactaa aagcaactca aatagccaag 2280

aaagatgaag atgaagatgg ttatgaaaat aaagaatcta cgaaagatcc tctagcagct 2340

atagtacacg atactaaaga atctctcctg ttggatctta gtgttgagga aaaaccccag 2400

acgatcccaa atttgctgac ggaagtcaat ttaactgaac ctgacacaaa taacgaagag 2460

caaaaggtcg aagaagaacc agaagaggag gtggaagaag aagaactagg agaaggtcct 2520

ttctcattct ggtttaatat tcttgaagtt attactgaaa acggcaagtt tgaaaataga 2580

gaatttcgcc gcttgtgtct tattaccaga aagccattta tcgcccttcc agatctgacc 2640

ttattccaca agagccagcc atttacagtg aaaatacgtg tcattagaac tgaattgacc 2700

ttaaatagag aatgtgtgtt acttctttca gaatatacca tgagtttaat gagagagtta 2760

atgaacaaag aatatcactg ccctattgtc gaaattcctt attttattgt tccattgatc 2820

agaaattgcg agcacttgaa atacgaagaa ctttcagaag aagaattgaa aaatattgta 2880

gattggagtc aagtgaattc tatcaaaaac catacaaata tacccgttgt tttatcagaa 2940

gtagaagatc cctccgacct tatcatcatt gacaactctg atcactttcg ccgatatatt 3000

gttacagaca ttcgccatga tatgaatcct aaaagtgccg tacctgaggg acgcaaagtt 3060

cgtgaaaccg gttatgccac cttttcagaa ttttacaacc aactcggcga caaatttgtc 3120

atcaatgact acgaacaacc tatgctcgaa gtcgaaagaa tcaagagaac aatgaattat 3180

ctgtatccgg gtgtcattga agatgctaaa gtgaaaggag cggtacatac ttgggtagtc 3240

ccccaattct gtagtcagta ctttattagt gccagtgttt atgtagccat gttgatggtg 3300

ccctcaataa tgacacgaat cgactccatt ttactctgct atgatgcccg tgaacggtat 3360

gatttgccta ttaacgatga atatatgctt gaagcataca ccatgccatc tgcaagtatg 3420

gagatgaatt atgaacgatt agagacgctt ggagattctt tgctgaaatt cattgccacc 3480

attcgtctgt acatcaactt ccctttcagt aacgaaggtg aacttcatca tctacgtatt 3540

cgtgttgtat gtaacagagc aatgtacaga gctgccaagc gtctcaaatt ttatcgctat 3600

gttaccagcc aaacattcaa ccgtcgatac tggcgcccgc ctcactttac aagctcagcc 3660

gacaatgcag aaaccattga agcactcaat aagcacagac tttcagacaa aacgttggct 3720

gatattgtgg aagcgtcttt aggtgcaggt tatctcagca acggtctcga aggttgtctt 3780

cacacagcta ttcaaatgca aatacctttt gatcaaatcc aaaagtgggc cgacttcaat 3840

atagcctttg aagaatcacg aaagtcagta ccacctcgtg ctgaggtcaa ggcgctccgt 3900

ttattgaact tgcaaaaaat tcaaacgctc ataggacgag aatttgagaa acctctgttg 3960

atcgtcgaag ccctcacaca cgcaagtctg cctaatgcaa ccgcgccatg ctatcaacgt 4020

ttagaattct tgggtgatgc tattttagat ttcttggtca ttcgatacct gtatacaaaa 4080

taccctgatt ttggacctgg tcagattacg actctgaaag attcttgtgt aaataaccag 4140

gtgctgggta tcatttgttt gaacaatgga cttcacaagc atatcatcca ctactctgga 4200

aaactcgtta gatctatcga gtttttagaa aacgaagtgc aggagctcaa ggatacaggc 4260

aaagctgtag gagaatattg ggcagatttg aatataccca aagttttatc ggatgttgtc 4320

gaaagtatgt tgggtgcttc atttgtggat gccaagtttg acctggcgcc ttgtgaagca 4380

ttatttgaaa ggtggtttgt acccatcttt gatgaaaacg tcacgcctga acgtgtcaag 4440

attcatccta tgcgtaaatt gcttacagac ttacaggctt ttggttgtga tagttttatg 4500

cttagaaatc attcgacagg atccgaaggg ccagaaagtc aaaagtgtgt tatcttcctt 4560

cacgataagc ctttagcttg tggtgctgat tggaatatta aggtcgctag aagacgtgcg 4620

gctgaaaaag caagtgaacg tttggtcgac gaaccagaat tgttggaatc tgtctgtaat 4680

tgtagagttg cagctgttaa gcgaggatta ttagccgaaa aagaagtaga actcgttgaa 4740

catgaagatg atctgtatta a 4761

<210> 4

<211> 1572

<212> DNA

<213> 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)

<400> 4

atgaacactc tcactgaaaa ttacattaca attttagaaa aattcaatcg attagctaaa 60

tcaaaatcca agacatctta tgttacagca gctattttct tacttgttgc caaacaaata 120

tacacctttt ttcaagtacc aagtaatctg cgtcatttac ctagtgtttc ctttttttct 180

atggctaaat cttatttgac aagagaacct ccctttatgc gacatcaaag aatcacatct 240

catgctatat ccaaaggaaa tggtttttat ctgagtagaa tacctgttgg atggacagtt 300

tatattgctg attcggtagc tgctaaacaa ttattactaa aaacagaaaa tttccccaaa 360

tcacatagaa ggttaaatac actaggaaaa aaaagtattt ctgcacaatt tctgggtgct 420

gataatattg ttatgactaa tggtgaaaca tggaaaaagc aaagaaaaat gatgaatcct 480

atatttcatc gtttgatgcc tatcaagaca atggcaagtg tagtccccac tttattctct 540

gttattgaaa aaggtgatgg aagggttcct attacgaccg ccatgaaaga tttcacattg 600

gatatacttg gtttgactat ctttgatttt gatttccaga ctctgaatgg tgatcctgaa 660

aattgggctt ctacttacaa tgtagtgacg gattctttgt ttgatccttt ttcaagtgtc 720

ttgacttact ttgaacaatt cttgatttat gtttatccca aaagaaggag aagtgctgaa 780

gcggtgatca agttgaataa aaagtttgat caattaaccg agcagaagcg agcaaatatt 840

cgaaatggta tctttagtca aaagcctgat aatgaaaagg atttgcttac attgatgctt 900

gagggtgaaa aggatggcca agctctgata tctaatgaag aattaagaca caacatggcg 960

gtgttctttg ttgcaggtca tgacactact gcgaatactc tatcattttg cttgtatcat 1020

atcgccaaag ataagcgtat acaacaaaag ttaagaaagg aaattcttga tattcttggt 1080

gatgaaccta tagacattga gcccacactt gaagaattga aacaaatgaa atacatgaat 1140

ttggttctta aagaaaatct tcgaatgaac aacacttttg atttattgtt tccaagacag 1200

gtgagcaaag acacaagttt ggcaggtaca tttattccaa agggtactac cttggctatt 1260

gatgcttgtg ctattcatcg tgatgcaaga aactggaaaa atcctggtga attcttacct 1320

gaaagatttg atgaaggagg tgatcaagaa ggtcatgaag gcttgacttg ggttcccttt 1380

ggtaatggat ctagacaatg tattggaatg aattttagtt tgacggaaca aagacttacc 1440

ttggctatgt tgttgagaaa atatgaggtt gatgtaccca aggattctat tcattatgat 1500

cgcattgtat acgatagacc tgtgtctgct tctcctctgt cattggaatt gaagtttaaa 1560

aagcgttact aa 1572

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggaccttgg agttgt 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacattggg attacg 16

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcttacttgt tgccaaac 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgcataaa gggagg 16

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaccttgga gttgt 15

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacattggga ttacg 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgctgaagcg gtgatcaagt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaacaaaga acaccgccat 20

Claims (6)

1.一种抑制匍枝根霉的dsRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种匍枝根霉抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的dsRNA。

3.权利要求1所述的dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的dsRNA的靶标序列在制备或筛选抑制匍枝根霉的dsRNA中的应用，其特征在于，所述dsRNA的靶标序列如SEQ ID NO.2所示。

5.匍枝根霉dcl1和p450基因作为靶标在制备如权利要求2所述的匍枝根霉抑制剂中的应用，其特征在于，所述匍枝根霉dcl1和p450基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

6.一种防治由匍枝根霉侵染导致的桃软腐病的方法，其特征在于，包括向桃体外喷施权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的匍枝根霉抑制剂。