CN114292316B - 一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，公开了一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用，所述小麦条锈菌分泌蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述条锈菌分泌蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明将条锈菌分泌蛋白基因Spg1的沉默片段导入小麦植株中，获得的条锈菌分泌蛋白基因沉默植株，接种条锈菌发现沉默该分泌蛋白基因的转基因植株抗病性显著提升，对条锈菌主要的优势小种抗性表现出抗性。本发明在小麦抗锈病遗传改良方面提供了新的途径，在小麦材料创制方面具有广阔的应用前景。本发明证明可以通过干扰条锈菌分泌蛋白基因Spg1来改良小麦的抗病性状，从而用于培育出抗锈的抗病材料。

Description

一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用。

背景技术

目前，小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformisf.sptritici,Pst)引起的严重危害小麦的真菌病害。一般条锈病发生年份造成的小麦产量损失约为5％，而在大流行年份造成的损失高达50％-80％，严重时甚至绝收。

小麦生长的全生育期均可发生，病害发生初期病叶部位出现橘黄色的孢子堆，随着叶片表皮破裂，散出黄色粉状物即夏孢子，随风力传播再次侵染小麦，从而完成侵染循环。

小麦条锈菌是一种严格的活体寄生菌，这种类型的病菌包括，白粉菌、霜霉菌等，在侵染过程中能形成高度特化的侵染结构—吸器，通过吸器从寄主体内吸收营养，同时病菌分泌一些蛋白到寄主体内，这些蛋白被称为“分泌蛋白”，这些蛋白能够通过多种方式抑制植物的免疫反应，从而促进病菌的侵染。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：对于小麦条锈病的防治大部分是直接使用化学药剂，化学药剂的频繁使用容易使病菌产生耐药性，也会造成环境污染，因此寻求生物防治手段防治条锈病一样重大。

解决以上问题及缺陷的难度为：采用qRT-PCR的方法，明确条锈菌效应基因参与到条锈菌对小麦的致病过程中。借助病毒诱导的病菌基因沉默体系，初步鉴定了效应基因Spg1在条锈菌致病中的重要功能。利用RNAi技术创制了初步鉴定到的条锈菌效应基因Spg1的基因沉默转基因植株，并对接种条锈菌进行表型鉴定，证实了条锈菌效应基因Spg1的RNAi植株表现出对条锈菌的抗性显著提升。

解决以上问题及缺陷的意义为：鉴定条锈菌关键致病因子，对于研究条锈菌致病的过程及致病机制具有非常重要的意义。在寄主中导入鉴定获得的致病因子RNA片段，在条锈菌接种后寄主诱导的病菌基因沉默的过程，从而获得寄主对条锈菌的抗性，为培育抗条锈病的小麦品种提供重要的资源。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用。

本发明是这样实现的，一种小麦条锈菌分泌蛋白，所述小麦条锈菌分泌蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述条锈菌分泌蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明的另一目的在于提供一种所述小麦条锈菌分泌蛋白在小麦抗条锈病品种改良中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种小麦条锈菌分泌蛋白在小麦抗病品种培育中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种小麦条锈菌分泌蛋白的小麦条锈菌效应鉴定方法，所述抗病基因的功能鉴定方法包括以下步骤：

第一步，基于qRT-PCR方法，明确条锈菌效应基因Spg1是否参与到条锈菌侵染寄主的过程中；

第二步，利用寄主诱导的基因沉默技术，明确条锈菌效应基因Spg1在条锈菌侵染小麦中的致病功能。

进一步，所述第一步具体包括：以条锈菌延伸因子基因PsEF1为内参，利用条锈菌效应基因Spg1的特异片段引物进行qRT-PCR，确定条锈菌效应基因Spg1在条锈菌侵染小麦的侵染初期，活体寄生阶段，侵染后期及产孢阶段的表达量。

进一步，所述第二步具体包括：首先，在条锈菌和小麦数据库里进行BLASTn分析，获得Spg1所特有的基因片段设计Spg1-γ引物并构建Spg1-γ载体，通过测序确定Spg1-片段成功构建到γ载体上。

进一步，所述第二步之后需要：通过体外转录实验制备接毒用的RNA产物，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第14天检测叶片表面条锈菌产孢情况进行观察统计，明确效应基因Spg1的功能。

本发明的另一目的在于提供一种由所述效应基因沉默的转基因植株。

本发明的另一目的在于提供一种所述的转基因植株的获得方法，所述获得方法首先将在构建Spg1的RNAi载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得Spg1-RNAi的转基因植株。

本发明的另一目的在于提供一种所述转基因植株在对条锈菌的抗性验证中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用寄主诱导的病菌基因的基因沉默瞬时体系，初步确定条锈菌效应基因Spg1条锈菌侵染小麦中的致病性功能。将条锈菌效应基因Spg1特异片段克隆入表达载体，利用农杆菌介导的转基因技术转化小麦幼胚，获得转基因沉默植株，表型鉴定发现其对小麦条锈菌表现出显著抗性。本发明证明可以条锈菌分泌蛋白基因Spg1改良小麦的抗病性状，从而用于培育出抗锈的抗病材料。

本发明证明了条锈菌分泌蛋白基因Spg1在条锈菌侵染小麦中的重要作用。鉴定发现Spg1转基因沉默植株对田间流行小种都表现出抗性。接种条锈菌14天时，Spg1的沉默植株中的条锈菌的生物量比对照相比减少了24.1-46.4％，起到了较好订的防控条锈菌侵染的效果。

本发明利用该分泌蛋白基因创制了广谱抗锈的小麦材料，从而为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦资源。

附图说明

图1是本发明实施例提供的小麦条锈菌效应鉴定方法的流程图。

图2是本发明实施例提供的小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1的表达谱分析示意图。

图3是本发明实施例提供的小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1沉默片段图解及特异性沉默效应基因Spg1表型结果示意图。

图4是本发明实施例提供的获得小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1沉默载体图。

图5是本发明实施例提供的获得的小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1沉默小麦的再生植株示意图。

图6是本发明实施例提供的小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1沉默植株PCR检测结果示意图。

图7是本发明实施例提供的小麦条锈菌分泌蛋白基因Spg1沉默植株接种条锈菌主要流行小种表型结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的小麦条锈菌效应鉴定方法包括以下步骤：

S101：基于qRT-PCR方法，明确条锈菌效应基因Spg1是否参与到条锈菌侵染寄主的过程中；

S102：利用寄主诱导的基因沉默技术，明确条锈菌效应基因Spg1在条锈菌侵染小麦中的致病功能。

本发明提供的小麦条锈菌效应鉴定方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的仅仅是一个具体实施例而已。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1

本发明证明了条锈菌分泌蛋白基因Spg1在条锈菌侵染小麦中的重要作用。

经鉴定发现Spg1转基因沉默植株对田间流行小种都表现出抗性，因此，可以利用该分泌蛋白基因创制了广谱抗锈的小麦材料，从而为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦资源。

接种条锈菌14天时，Spg1的沉默植株中的条锈菌的生物量比对照相比减少了24.1-46.4％，起到了较好的防控条锈菌侵染的效果。

本发明实施例提供的条锈菌分泌蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1:atgtcacattccaactctgcaatgcctaccggctcatcatcatcatcctcaacaaccaccacggggggagcaccaactagtagtaatccaccaccatccagcaatcaaagtgaagataagaactcagtcgtcatcaaggtcggaatggtcggagattcgcagatcggtaaaacaagtttaatggtcaaatatgtcgaaggaagttttgatgaagattacatacaaacactaggtgtgaacttcatggagaagacaatctccatccgaaatacggagataaccttctcgatctgggatttaggaggccaacgggaattcgtgaacatgttgccattagtatgtaacgatgcagtagccatactattcatgtttgatctcagtagaaaatcaaccttaaactctatcaaagaatggtatcgtcaagctagaggattcaacaagactgctatcccgtttctgatcggaaccaaatacgaccatttcgcagcattctcaaaagacgaacaagaagagatcacacgacaatctcggaggttcgcaaaggcaatgagagcgccattaatattctgttcaacatcacactcaatcaatgtacaaaaaatcttcaaaatcgttctatccaaagcatttgatctcaagtgcacgatacccgaaatcaccggtagtggagaaccattattgatctatcttgatgtctaa

本发明实施例提供的条锈菌分泌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2:mshsnsamptgssssssttttggaptssnpppssnqsedknsvvikvgmvgdsqigktslmvkyvegsfdedyiqtlgvnfmektisirnteitfsiwdlggqrefvnmlplvcndavailfmfdlsrkstlnsikewyrqargfnktaipfligtkydhfaafskdeqeeitrqsrrfakamraplifcstshsinvqkifkivlskafdlkctipeitgsgeplliyldv

实施例2

本发明提供一种小麦条锈菌效应鉴定方法包括以下步骤：

第一步，基于qRT-PCR方法，明确条锈菌效应基因Spg1是否参与到条锈菌侵染寄主的过程中。

具体方法为：以条锈菌延伸因子基因PsEF1为内参，利用条锈菌效应基因Spg1的特异片段引物进行qRT-PCR，确定条锈菌效应基因Spg1在条锈菌侵染小麦的不同侵染阶段(侵染初期，活体寄生阶段，侵染后期及产孢阶段)的表达量；

SEQ ID NO：3：

内参引物：

正向引物：PsEF1-F:ttcgccgtccgtgatatgagacaa；反向引物：PsEF1-R：atgcgtatcatggtggtggagtga。

SEQ ID NO：4：

基因定量引物：

正向引物：Spg1-qRT-F:tgggatttaggaggc；反向引物：Spg1-qRT-R：aaggttgattttctactgag。

第二步，利用寄主诱导的基因沉默技术，明确条锈菌效应基因Spg1在条锈菌侵染小麦中的致病功能。

具体步骤为：首先，在条锈菌和小麦数据库里进行BLASTn分析，获得Spg1所特有的基因片段设计Spg1-γ引物并构建Spg1-γ载体，通过测序确定Spg1-片段成功构建到γ载体上。

接着，通过体外转录实验制备接毒用的RNA产物，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第14天检测叶片表面条锈菌产孢情况进行观察统计，从而明确效应基因Spg1的功能。

实施例3

本发明提供由效应基因沉默的转基因植株，首先将在构建Spg1的RNAi载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得了Spg1-RNAi的转基因植株，并验证了转基因植株对条锈菌的抗性是否显著提高。

SEQ ID NO：5：

沉默片段的载体构建引物：

正向引物：Spg1-RNAi-F：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcagcgtagtctgggacgtcgtatgggtaaggtcggaatggtcg

反向引物：Spg1-RNAi-F：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacgtatttcggatgga

下面街二号实验对本发明的技术效果作详细的描述。

本实验的防治条锈菌效果：利用瞬时体系沉默条锈菌效应基因Spg1后，接种14天的条锈菌的生物量较对照植株下降了53.48％和43.67％。利用瞬时体系沉默条锈菌效应基因Spg1后，接种14天时间用Image J软件对发病叶片表面的孢子堆进行了统计，结果发现Spg1沉默的植株叶片表面的孢子堆下较对照分别下降了51.18％和42.15％。利用转基因体系获的稳定的条锈菌效应基因Spg1沉默植株在接种条锈菌14天时，Spg1的沉默植株中的条锈菌的生物量比对照相比减少了24.1-46.4％，证实了沉默条锈菌效应基因Spg1的转基因植株对条锈菌有较好的防控效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 小麦条锈菌分泌蛋白、鉴定方法、转基因植株及应用

<140> 2021115800921

<141> 2021-12-22

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcacatt ccaactctgc aatgcctacc ggctcatcat catcatcctc aacaaccacc 60

acggggggag caccaactag tagtaatcca ccaccatcca gcaatcaaag tgaagataag 120

aactcagtcg tcatcaaggt cggaatggtc ggagattcgc agatcggtaa aacaagttta 180

atggtcaaat atgtcgaagg aagttttgat gaagattaca tacaaacact aggtgtgaac 240

ttcatggaga agacaatctc catccgaaat acggagataa ccttctcgat ctgggattta 300

ggaggccaac gggaattcgt gaacatgttg ccattagtat gtaacgatgc agtagccata 360

ctattcatgt ttgatctcag tagaaaatca accttaaact ctatcaaaga atggtatcgt 420

caagctagag gattcaacaa gactgctatc ccgtttctga tcggaaccaa atacgaccat 480

ttcgcagcat tctcaaaaga cgaacaagaa gagatcacac gacaatctcg gaggttcgca 540

aaggcaatga gagcgccatt aatattctgt tcaacatcac actcaatcaa tgtacaaaaa 600

atcttcaaaa tcgttctatc caaagcattt gatctcaagt gcacgatacc cgaaatcacc 660

ggtagtggag aaccattatt gatctatctt gatgtctaa 699

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser His Ser Asn Ser Ala Met Pro Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser Asn Pro Pro Pro

20 25 30

Ser Ser Asn Gln Ser Glu Asp Lys Asn Ser Val Val Ile Lys Val Gly

35 40 45

Met Val Gly Asp Ser Gln Ile Gly Lys Thr Ser Leu Met Val Lys Tyr

50 55 60

Val Glu Gly Ser Phe Asp Glu Asp Tyr Ile Gln Thr Leu Gly Val Asn

65 70 75 80

Phe Met Glu Lys Thr Ile Ser Ile Arg Asn Thr Glu Ile Thr Phe Ser

85 90 95

Ile Trp Asp Leu Gly Gly Gln Arg Glu Phe Val Asn Met Leu Pro Leu

100 105 110

Val Cys Asn Asp Ala Val Ala Ile Leu Phe Met Phe Asp Leu Ser Arg

115 120 125

Lys Ser Thr Leu Asn Ser Ile Lys Glu Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly

130 135 140

Phe Asn Lys Thr Ala Ile Pro Phe Leu Ile Gly Thr Lys Tyr Asp His

145 150 155 160

Phe Ala Ala Phe Ser Lys Asp Glu Gln Glu Glu Ile Thr Arg Gln Ser

165 170 175

Arg Arg Phe Ala Lys Ala Met Arg Ala Pro Leu Ile Phe Cys Ser Thr

180 185 190

Ser His Ser Ile Asn Val Gln Lys Ile Phe Lys Ile Val Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Phe Asp Leu Lys Cys Thr Ile Pro Glu Ile Thr Gly Ser Gly Glu

210 215 220

Pro Leu Leu Ile Tyr Leu Asp Val

225 230

Claims (1)

1.小麦条锈菌分泌蛋白在小麦抗条锈病品种改良中的应用，其特征在于，所述应用是将小麦条锈菌分泌蛋白的RNAi载体导入小麦植株内使得条锈菌效应基因沉默；所述条锈菌分泌蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2，条锈菌效应基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

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