CN114350672A - 一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术技术领域，公开了一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用，小麦转录因子TaCBF1d氨基酸序列为SEQ ID NO：1；将在小麦和条锈菌互作中的关键基因通过植物表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得了TaCBF1d的转基因植株，并验证了转基因过表达植株对条锈菌主要的流行小种表现出广谱抗性。本发明利用反向遗传学方法分析TaCBF1d转录因子基因，TaCBF1d基因受到条锈菌分亲和小种的诱导，采用病毒介导的基因沉默技术沉默TaCBF1d基因，确定TaCBF1d基因在小麦抗条锈病中起正调作用，并利用该转录因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦材料。

Description

一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术技术领域，尤其涉及一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用。

背景技术

目前，小麦是全球种植面积最广泛、产量最大的禾谷科作物之一，是全球超过25亿人口的主粮。由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦生产上危害最为严重的真菌病害之一，条锈病频繁爆发的根本原因是条锈菌毒性频繁变异。在过去的50年里，由于基因型相似、抗源相同的抗病品种广泛种植，单一抗病基因对条锈菌造成了巨大的选择压力，条锈菌毒性迅速变异，一旦病原菌群体毒性变异，现有品种的抗性就会被克服，从而导致病害的大爆发，创制广谱、持久的抗病材料是防控小麦条锈病的根本途径。

由转录因子介导的基因表达转录调控是植物对病原菌侵染的防御反应的重要组成部分。CBF类转录因子能够特异性识别真核生物启动子中的CCAAT框，在真核生物细胞核内发挥转录调控功能。近年来CBF转录因子的研究主要集中在对植物抵抗非生物逆境调控上，而其在植物应对病原菌侵染中的作用及作用机制还鲜有报道。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前没有将CBF转录因子应用于植物应对病原菌侵染中的相关技术。

解决以上问题及缺陷的难度为：采用反向遗传学方法筛选鉴定关键的转录因子需要大量的筛选鉴定工作，对于鉴定获得的转录因子基因利用转基因的手段创制抗病品系。

解决以上问题及缺陷的意义为：寻找与植物免疫特别是调控因子相关的重要基因，对培育持久抗小麦条锈病品种具有重要的意义。小麦抗病基因的发掘及利用是能够给与小麦作物改良的最为经济有效的措施，培育广谱抗锈的小麦品种对于防治小麦条锈病的流行至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用。

本发明是这样实现的，一种小麦转录因子TaCBF1d，所述小麦转录因子TaCBF1d氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

进一步，所述小麦转录因子TaCBF1d编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用。

进一步，所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用方法包括：

利用植物植物基因工程技术将小麦转录因子TaCBF1d基因转化入小麦细胞，得到表达TaCBF1d转录因子的小麦品种。

进一步，所述应用还包括：

构建包含小麦转录因子TaCBF1d基因的植物表达载体；用利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦幼胚；得到TaCBF1d转基因小麦。

本发明的另一目的在于提供一种基于所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用方法改良、培育的TaCBF1d转基因小麦。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用的方法，所述验证方法包括：

获取TaCBF1d转基因小麦，对获得的TaCBF1d转基因小麦进行分子检测，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性，确定表达TaCBF1d转录因子的小麦品种的抗条锈病特性。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述TaCBF1d转基因小麦的抗性的方法，所述TaCBF1d转基因小麦的抗性验证方法包括：

获取TaCBF1d转基因小麦，对获得的TaCBF1d转基因小麦进行分子检测，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性。

本发明的另一目的在于提供一种所述小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病中的功能鉴定，所述功能鉴定方法包括：

步骤一，基于qRT-PCR以延伸因子基因TaEF1-α为内参，利用转录因子基因TaCBF1d的特异引物进行实时定量PCR，确定TaCBF1d基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；

步骤二，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默转录因子基因TaCBF1d，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第12天检测叶片表面是否出现漂白状，若是，则表示病毒接种成功。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用反向遗传学方法分析TaCBF1d转录因子基因，TaCBF1d基因受到条锈菌分亲和小种的诱导，采用病毒介导的基因沉默技术沉默TaCBF1d基因，确定TaCBF1d基因在小麦抗条锈病中起正调作用。将TaCBF1d基因克隆入表达载体，利用农杆菌介导的转基因技术转化小麦幼胚，获得的转基因小麦植株对小麦条锈菌表现出广谱抗性。本发明证明可以利用TaCBF1d基因改良小麦及其他作物的抗病性状，从而培育出抗小麦条锈病的新型广谱抗病材料。

本发明将在小麦和条锈菌互作中的关键基因通过植物表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得了TaCBF1d的转基因植株，并验证了转基因过表达植株对条锈菌主要的流行小种表现出广谱抗性。

本发明证明了TaCBF1d转录因子参与小麦对条锈菌的正调控作用。

TaCBF1d转基因植株对田间流行的多种小种CYR32，CYR33和CYR34都表现出抗性，因此，可以利用该转录因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦材料。

本发明的提供了一种小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用。

本发明目的在于提供一种所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法流程图。

图2是本发明实施例提供的转录因子TaCBF1d基因的表达谱分析示意图。

图3是本发明实施例提供的TaCBF1d基因沉默片段图解及特异性沉默TaCBF1d基因表型结果示意图。

图4是本发明实施例提供的获得TaCBF1d过表达载体图。

图5是本发明实施例提供的获得的TaCBF1d过表达植株的再生植株示意图。

图6是本发明实施例提供的TaCBF1d过表达植株PCR检测结果示意图。

图7是本发明实施例提供的转TaCBF1d过表达植株接种条锈菌主要流行小种表型结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明证明了TaCBF1d转录因子参与小麦对条锈菌的正调控作用。TaCBF1d转基因植株可以利用该转录因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈品种的培育提供了优良的小麦材料。

本发明的提供了一种小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用，也可用适用于其它作物的抗病性提高的方面。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d氨基酸序列为SEQ ID NO：2：mepssqrepvvgvatagsqaypppaaypapampaaippgsqpavpfpanpaqlsaqhqlvyqqaqqfhqqlqqqqqqqlrefwatqmeeieqatdfknhtlplarikkimkadedvrmisaeapvvfakacevfileltlrswmhteenkrrtlqkndiaaaitrtdiydflvdiiprddmkeeglglprvglppaalgapadayppyyyvpaqqvpgvgmmyggqqghpvayawqqpqgqqaeeapeeqqqspsn。

本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d编码ORF序列为SEQ ID NO：1：

atggagccatcctcgcagcgtgagcctgtcgtgggtgtggccactgctgggtcacaagcatatcctcctcctgctgcctatccagctccagccatgcctgccgccattcctcctggctcgcagccagcagtgccattcccagctaatccagctcaactcagtgctcaacaccaactggtttaccaacaagcccagcaatttcaccaacaactgcagcaacagcagcagcagcaacttcgtgagttctgggctactcaaatggaagagattgagcaggcaactgacttcaagaaccacaccttaccactggcaaggataaaaaagataatgaaggctgacgaggatgtccggatgatctccgcagaagctcctgttgtctttgcaaaggcatgcgaggtgtttatcttagagttgacacttaggtcatggatgcacactgaggagaacaagcgccggaccttgcagaagaatgacattgcggctgccattaccaggactgacatctacgacttcttggtggacatcattcccagggatgacatgaaggaggaaggccttgggcttccgagggtgggcttgccacctgctgctctaggggcaccggctgatgcctatcctccttattactatgtgccagcacagcaggtacccggagtaggaatgatgtatggtggtcagcagggtcacccagtggcatatgcgtggcagcagcctcaagggcaacaggccgaggaggctcctgaagagcagcagcagtctccctcaaactag。

本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用方法包括：

利用植物植物基因工程技术将小麦转录因子TaCBF1d基因转化入小麦细胞，得到表达TaCBF1d转录因子的小麦品种。

本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用还包括：

构建包含小麦转录因子TaCBF1d基因的植物表达载体；用利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦幼胚；得到TaCBF1d转基因小麦。

如图1所示，本发明实施例提供的小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法包括：

S101，获取TaCBF1d转基因小麦，对获得的TaCBF1d转基因小麦进行分子检测；

S102，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性，确定表达TaCBF1d转录因子的小麦品种的抗条锈病特性。

本发明实施例提供的功能鉴定方法包括：

基于qRT-PCR以延伸因子基因TaEF1-α为内参，利用转录因子基因TaCBF1d的特异引物进行实时定量PCR，确定TaCBF1d基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；

利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默转录因子基因TaCBF1d，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第12天检测叶片表面是否出现漂白状，若是，则表示病毒接种成功。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1：

本发明实施例提供的用于小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病品种改良中的应用。

本发明的小麦转录因子基因TaCBF1d的编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

本发明的小麦转录因子基因TaCBF1d氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明植物优选单子叶植物能够被小麦条锈病菌成功侵染定制的禾谷类作物，特别优选小麦。

本发明实施例提供的用用于小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病品种改良中的应用包括以下步骤：

利用病毒诱导的转基因方法在小麦中进行瞬时的沉默实验，小麦的抗病性显著减弱，说明TaCBF1d在小麦与条锈菌互作中起正调控作用。

利用农杆菌介导的遗传转化的方法创制TaCBF1d过表达植株，对转基因植株接种主要流行小种，进行表型鉴定发现TaCBF1d-OE植株对条锈菌表现出广谱抗性；

SEQ ID NO：3：

正向引物：TaCBF1d-cDNA-F：atggagccatcctcgcagc，反向引物：TaCBF1d-cDNA-R：ctagtttgagggagactgctgctg。

本发明实施例提供的用于小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病品种改良中的应用，首先，为了明确初步分析TaCBF1d在小麦与条锈菌互作中的功能，对TaCBF1d在条锈菌侵染小麦的亲和非亲和体系的不同阶段进行表达谱分析，结果发现TaCBF1d在非亲和体系中条锈菌侵染48h表达量达到最高，而在亲和体系中的表达几乎没有变化。说明TaCBF1d可能参与到小麦对条锈菌抗性中发挥功能。

SEQ ID NO：4：

定量引物：正向引物：TaCBF1d-qRT-F：agcgtgagcctgtcgt，反向引物：TaCBF1d-qRT-R：ccagttggtgttgagca。

内参引物：正向引物：TaEF1-F：tggtgtcatcaagcctggtatggt，反向引物：TaEF1-R：actcatggtgcatctcaacggact。

本发明实施例提供的用于小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病品种改良中的应用，利用病毒诱导的瞬时沉默技术，分别对TaCBF1d的两个特异片段进行了沉默。在小麦生长16d进行摩擦接种。接种后放置于24℃黑暗100％保湿24h，随后放置到24℃光照16h，黑暗8h光周期的生长培养箱中。接种7d后可以观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明病毒接种成功。接种条锈菌无毒性小种CYR23，放置到保湿箱内16℃黑暗保湿24h，接着转置于16℃光照16h，14℃黑暗8h光周期的生长培养箱中。待接种14d可以观察沉默TaCBF1d的叶片上产生了孢子堆。说明TaCBF1d参与到小麦对条锈菌的抗性中。

SEQ ID NO：5：

沉默片段的载体构建引物：

片段1-正向引物：TaCBF1d-Vigs-2AS-F：ccttaattaagctgatgcctatcctcctt，反向引物：TaCBF1d-Vigs-2AS-R：ataagaatgcggccgcgcctgttgcccttga。

片段2-正向引物：TaCBF1d-VIigs-1AS-F：ccttaattaaagcgtgagcctgtcgt，反向引物：TaCBF1d-Vigs-1AS-R：ataagaatgcggccgcccagttggtgttgagca。

本发明实施例提供的用于小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病品种改良中的应用，通过农杆菌介导的遗传转化获得的转基因植株进行PCR检测，选取了T2代的L12和L15两个株系分别接种主要流行小种CYR32，CYR33和CYR34，结果发现TaCBF1d过表达植株对条锈菌表现出广谱抗性。

SEQ ID NO：6：

过表达载体构建引物：正向引物：TaCBF1d-HA-F：ttggagagaacacgggggacttctagaatggagccatcctcgca，反向引物：TaCBF1d-HA-R：gagaaaaactagaaatttaccctcccagatctagcgtagtctgggacgtcgtatgggtagtttgagggagactgctgct。

图6中L12和L15为阳性植株示意图。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 西北农林科技大学

<120>一种小麦转录因子TaCBF1d及其应用

<160> 5

<210>1

<211> 256

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

MEPSSQREPVVGVATAGSQAYPPPAAYPAPAMPAAIPPGSQPAVPFPANPAQLSAQHQLVYQQAQQFHQQLQQQQQQQLREFWATQMEEIEQATDFKNHTLPLARIKKIMKADEDVRMISAEAPVVFAKACEVFILELTLRSWMHTEENKRRTLQKNDIAAAITRTDIYDFLVDIIPRDDMKEEGLGLPRVGLPPAALGAPADAYPPYYYVPAQQVPGVGMMYGGQQGHPVAYAWQQPQGQQAEEAPEEQQQSPSN

<210>2

<211> 771

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

atggagccatcctcgcagcgtgagcctgtcgtgggtgtggccactgctgggtcacaagcatatcctcctcctgctgcctatccagctccagccatgcctgccgccattcctcctggctcgcagccagcagtgccattcccagctaatccagctcaactcagtgctcaacaccaactggtttaccaacaagcccagcaatttcaccaacaactgcagcaacagcagcagcagcaacttcgtgagttctgggctactcaaatggaagagattgagcaggcaactgacttcaagaaccacaccttaccactggcaaggataaaaaagataatgaaggctgacgaggatgtccggatgatctccgcagaagctcctgttgtctttgcaaaggcatgcgaggtgtttatcttagagttgacacttaggtcatggatgcacactgaggagaacaagcgccggaccttgcagaagaatgacattgcggctgccattaccaggactgacatctacgacttcttggtggacatcattcccagggatgacatgaaggaggaaggccttgggcttccgagggtgggcttgccacctgctgctctaggggcaccggctgatgcctatcctccttattactatgtgccagcacagcaggtacccggagtaggaatgatgtatggtggtcagcagggtcacccagtggcatatgcgtggcagcagcctcaagggcaacaggccgaggaggctcctgaagagcagcagcagtctccctcaaactag

<210>3

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atggagccatcctcgcagc

ctagtttgagggagactgctgctg

<210>4

<211> 81

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

agcgtgagcctgtcgt

ccagttggtgttgagca

tggtgtcatcaagcctggtatggt

actcatggtgcatctcaacggact

<210>5

<211> 119

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

ccttaattaagctgatgcctatcctcctt

ataagaatgcggccgcgcctgttgcccttga

ccttaattaaagcgtgagcctgtcgt

ataagaatgcggccgcccagttggtgttgagca

<210>6

<211> 123

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

ttggagagaacacgggggacttctagaatggagccatcctcgca

gagaaaaactagaaatttaccctcccagatctagcgtagtctgggacgtcgtatgggtagtttgagggagactgctgct

Claims (10)

1.一种小麦转录因子TaCBF1d，其特征在于，所述小麦转录因子TaCBF1d氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述小麦转录因子TaCBF1d，其特征在于，所述小麦转录因子TaCBF1d编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

3.一种如权利要求1-2任意一项所述小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用。

4.一种如权利要求1-2任意一项所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用。

5.如权利要求4所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用，其特征在于，所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用方法包括：

利用植物植物基因工程技术将小麦转录因子TaCBF1d基因转化入小麦细胞，得到表达TaCBF1d转录因子的小麦品种。

6.如权利要求4所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用，其特征在于，所述应用还包括：

构建包含小麦转录因子TaCBF1d基因的植物表达载体；用利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦幼胚；得到TaCBF1d转基因小麦。

7.一种基于如权利要求3-6任意一项所述小麦转录因子TaCBF1d在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用方法改良、培育的TaCBF1d转基因小麦。

8.一种验证如权利要求3所述小麦转录因子TaCBF1d在改良小麦条锈菌引起的小麦条锈病中的应用的方法，其特征在于，所述验证方法包括：

获取TaCBF1d转基因小麦，对获得的TaCBF1d转基因小麦进行分子检测，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性，确定表达TaCBF1d转录因子的小麦品种的抗条锈病特性。

9.一种验证如权利要求7所述TaCBF1d转基因小麦的抗性的方法，其特征在于，所述TaCBF1d转基因小麦的抗性验证方法包括：

获取TaCBF1d转基因小麦，对获得的TaCBF1d转基因小麦进行分子检测，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性。

10.一种如权利要求1-2任意一项所述小麦转录因子TaCBF1d在小麦抗锈病中的功能鉴定，其特征在于，所述功能鉴定方法包括：

步骤一，基于qRT-PCR以延伸因子基因TaEF1-α为内参，利用转录因子基因TaCBF1d的特异引物进行实时定量PCR，确定TaCBF1d基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；

步骤二，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默转录因子基因TaCBF1d，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第12天检测叶片表面是否出现漂白状，若是，则表示病毒接种成功。

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