CN116375838A - 小麦翻译起始因子TaeIF4A及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种小麦翻译起始因子TaeIF4A及其应用。小麦翻译起始因子TaeIF4A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码小麦翻译起始因子TaeIF4A的ORF序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用转基因技术获得小麦翻译起始因子TaeIF4A过表达植株，可以显著增强小麦对条锈病致病菌的抗性。本发明揭示了TaeIF4A作为正调控因子在提高小麦条锈病抗性中的用途，为抗条锈病小麦品种的选育和改良提供材料。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及小麦翻译起始因子TaeIF4A及其应用。
背景技术
小麦是全球人类的主要食物来源和植物蛋白的主要来源，是最重要的粮食作物之一。然而，小麦生产面临着众多非生物和生物胁迫特别是病原的挑战，其中小麦条锈病菌是影响最严重的病原菌之一。由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici）引起的小麦条锈病是影响小麦产量的重要因素。小麦条锈病是造成我国小麦减产的主要病害之一。条锈病几乎隔年流行，年均减产10%以上。种植抗病品种被认为是防治条锈病最为经济有效的措施，而小麦品种抗病性丧失是小麦锈病防控中面临的巨大威胁。挖掘抗病相关基因，解析其作用机理，进而创制持久广谱抗病材料，对小麦抗条锈病品种的培育和条锈病的有效防控具有深远意义，通过抗病育种提高农作物对病原物的抗性是实施病害的绿色防控的重要策略。
蛋白质是生物功能的执行者，蛋白质的翻译受到精细、严格且复杂的调控。相对于转录水平的调控而言，这种翻译水平的调控过程可以更加快速有效地调节基因表达，保证细胞对于内外刺激做出的一个迅速有效的反应，对于维持细胞稳态和生理功能具有重要作用。真核翻译起始因子4A （eukaryotic initiation factor 4A，eIF4A）属于DEAD - boxRNA解旋酶家族，具有RNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的RNA解旋酶活性。以前的研究表明eIF4A家族成员在蛋白翻译起始、胚胎发育等多种生命过程中发挥着重要的作用。在植物中，eIF4A被发现在非生物胁迫中也发挥独特的作用。在拟南芥中过表达甜菜BveIF1A使拟南芥对NaCl的耐受性增强。eIF4AIII转录水平在寒冷和高温条件下均显着增高，纯合的eIF4AIII T-DNA插入突变体对冷和热胁迫更为敏感，而eIF4AIII回补可以恢复非生物胁迫抗性。通过结构和进化分析，珍珠粟（Pennisetum glaucum）的eIF4A保守的基序都参与植物发育阶段的反应和胁迫耐受性。将PgeIF4A转入花生中，增加了花生对干旱和盐分胁迫的适应力。
现有研究表明eIF4A基因参与多种逆境胁迫应答，具有一因多效的特点，是一类综合改良作物抗逆性的候选基因。但eIF4A响应非生物胁迫的具体机理尚未有深入的研究，eIF4A在生物胁迫方面的研究更为缺乏。目前，小麦条锈病的防治方法以化学防治为主，使用化学农药给环境和食品安全所带来的危害已引起人们的普遍关注。抗病育种是防治小麦条锈病最为经济有效的措施之一。但抗病基因的挖掘周期长，抗病品种的培育难度大，而且条锈菌毒性变异快，导致该病害在防治中一直难以实现持久的控制。因此，创制广谱、持久的抗病材料是防控小麦条锈病的根本途径和关键技术。
发明内容
本发明目的在于解决传统抗病育种存在生殖隔离和远缘杂交不亲和性，在较短培育周期内难以实现目标性状的定向改良；同时，条锈菌毒性变异快，致使小麦条锈病持久防控在当前技术条件下尚存在诸多困难。
基于上述目的，本发明提供了小麦翻译起始因子TaeIF4A及其应用来解决本领域内的这种需要。本发明旨在进一步探索小麦天然免疫防御机制，挖掘在条锈菌入侵小麦的防御反应中起正调控作用的抗病基因，通过开展基因功能研究，为利用该抗病基因创制小麦抗病材料防控小麦条锈病提供新路径。
为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述小麦翻译起始因子用非倾斜字体“TaeIF4A”表示，小麦翻译起始因子基因或编码ORF序列用倾斜字体“TaeIF4A”表示。当然，本领域普通技术人员根据本发明的记载，可以清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。
一方面，本发明涉及小麦翻译起始因子TaeIF4A，所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列如SEQID NO：2所示。
本发明利用反向遗传学方法分析TaeIF4A转录因子基因，TaeIF4A基因受条锈菌诱导表达，采用病毒介导的基因沉默技术沉默TaeIF4A基因，确定TaeIF4A基因在小麦抗条锈病中起正调作用。
如上所述小麦翻译起始因子TaeIF4A在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，可以利用该基因改良小麦及其他作物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。为此，本发明请求保护小麦翻译起始因子TaeIF4A，以及小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列在小麦抗条锈病品种培育中的应用。
为利用小麦翻译起始因子TaeIF4A及小麦翻译起始因子TaeIF4A基因，本领域普通技术人员结合现有技术，可以实现所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列受农杆菌介导的遗传转化表达，在小麦与条锈菌互作中具有正调控作用，过表达所述小麦翻译起始因子TaeIF4A能增强小麦对条锈病病菌的抗性。
为利用小麦翻译起始因子TaeIF4A及小麦翻译起始因子TaeIF4A基因，实现小麦抗条锈病品种，本发明提供了一种小麦抗条锈病品种培育方法，其包括：在植株内表达所述的小麦翻译起始因子TaeIF4A或在所述植株内转入所述的小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列。
本领域普通技术人员结合现有技术，可以实现将所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列转化入所述植株的细胞，得到基因编辑所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的植物品种。
本领域普通技术人员结合现有技术，可以实现构建包含所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码ORF序列的编辑载体；利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化所述植株幼胚，得到基因编辑所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的植物品种。
进一步地，本发明提供的小麦抗条锈病品种培育方法中，所述植株为单子叶植物，所述单子叶植物优选为禾谷类作物，所述禾谷类作物为更优选为小麦。
与现有技术相比，本发明的有益效果或优点：
（1）与传统抗病育种技术相比，植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面、持续、广谱的保护。eIF4A属于综合改良作物抗逆性的候选基因，仅应用于非生物胁迫，例如干旱胁迫或盐胁迫中，但eIF4A响应非生物胁迫的具体机理尚未有深入的研究，eIF4A在生物胁迫方面的研究更为缺乏。本发明通过基因功能研究，发现小麦翻译起始因子TaeIF4A基因过表达植株能够增强小麦对条锈菌的抗性，证明了TaeIF4A基因作为正调控因子在提高小麦条锈病抗性中的用途，可用于抗条锈病小麦品种的选育。
（2）本发明提供了一种小麦抗条锈病品种培育方法。该方法借助基因工程技术，在小麦植株体内过表达小麦翻译起始因子TaeIF4A，增强小麦对条锈病病菌的抗性。经验证，采用本发明方法获得的转基因小麦对条锈菌主要的流行小种表现出抗性。小麦翻译起始因子TaeIF4A转基因植株对田间流行的CYR31等多种小种表现出抗性，因此，可以利用该转录因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈病品种的培育提供了优良的小麦材料。
附图说明
图1为小麦翻译起始因子TaeIF4A基因的表达谱分析示意图。su11-CYR23为TaeIF4A基因受条锈菌CYR23侵染的诱导，su11-CYR31为TaeIF4A基因受条锈菌CYR31侵染的诱导。
图2为特异性沉默小麦翻译起始因子TaeIF4A基因表型结果示意图。Mock为野生型小麦水源11；BSMV为大麦条纹花叶病毒；TaPDS为小麦八氢番茄红素脱氢酶；γ为空载体。
图3为获得小麦翻译起始因子TaeIF4A过表达载体图。LB和RB为同源臂；BAR为除草剂筛选标记基因；ZmUbi为启动子；GusPlus为β葡萄糖苷酸酶报告基因；T-NOS为终止元件。
图4为获得的小麦翻译起始因子TaeIF4A过表达植株的再生植株示意图。
图5为小麦翻译起始因子TaeIF4A过表达植株PCR检测结果及qRT-PCR检测结果示意图。Water为水；WT为小麦品种Fielder；L3-1，L6-1和L9-1为TaeIF4A过表达的小麦；PC为质粒，阳性对照；Marker为DL2000 DNAMarker。
图6为转小麦翻译起始因子TaeIF4A过表达植株接种条锈菌CYR31小种表型结果示意图。WT为小麦品种Fielder；L3-1和L9-1为TaeIF4A过表达的小麦。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例
本发明实施例提供了小麦翻译起始因子TaeIF4A在小麦抗锈病品种改良中的应用。
构建包含小麦翻译起始因子TaeIF4A基因的植物表达载体；用利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦幼胚；得到TaeIF4A转基因小麦。
如图1所示，本发明实施例提供的小麦翻译起始因子TaeIF4A在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法包括：
（1）获取TaeIF4A转基因小麦，对获得的TaeIF4A转基因小麦进行分子检测；
（2）对T1代的转基因植株接种条锈菌，鉴定转基因植株对条锈菌的抗性，确定表达TaeIF4A翻译起始因子的小麦品种的抗条锈病特性。
本发明实施例提供的功能鉴定方法包括：
通过摩擦接种将条锈菌生理小种CYR23、CYR31新鲜夏孢子接种到小麦品种“水源11”二叶正面，对照以无菌水涂抹接种。接种后的幼苗于16℃黑暗条件下保湿24 h，然后取出置于常规条件下培养。分别于接种后0、6、12、18、24、36、48、72、96、120 h 和168 h收集对照与接菌后小麦叶片，利用RNA提取试剂盒（购自北京华越洋生物）提取RNA，利用逆转录酶M-MLV（购自Thermo Fisher）进行反转录，以延伸因子TaEF1-α作为内参，利用TaeIF4A定量引物进行定量PCR，2—△△CT方法计算TaeIF4A的相对表达量，结果发现TaeIF4A在非亲和体系中（接种CYR23）条锈菌侵染12 h表达量达到最高，而在亲和体系（接种CYR31）条锈菌侵染24h表达量达到最高，见附图1，说明TaeIF4A可能参与到小麦对条锈菌抗性中。
定量引物：
TaeIF4A-qRT-F：GTGAGGACCAAAGGAT；
TaeIF4A-qRT-R：AACCACGGGAAAGCAT。
内参引物：
TaEF1-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT；
TaEF1-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT。
本发明实施例提供的用于小麦翻译起始因子TaeIF4A在小麦抗锈病品种改良中的应用，利用病毒诱导的瞬时沉默技术，分别对TaeIF4A的两个特异片段进行了沉默。在小麦生长16 d进行摩擦接种。接种后放置于24℃黑暗100%保湿24 h，随后放置到24℃光照16 h，黑暗8 h光周期的生长培养箱中。接种7 d后可以观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，沉默TaPDS后小麦叶片上呈现出漂白状，表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子，并采集接菌0h、24h及120h的小麦样品，进行qRT-PCR检测TaeIF4A基因的沉默效率则证明病毒接种成功。接种条锈菌无毒性小种CYR23，放置到保湿箱内16℃黑暗保湿24 h，接着转置于16℃光照16 h，14℃黑暗8 h光周期的生长培养箱中。待接种14 d可以观察沉默TaeIF4A的叶片上产生了孢子堆，见附图2。实验结果初步说明TaeIF4A在小麦与条锈菌互作中发挥正调控免疫的作用。
沉默片段1的载体构建引物：
TaeIF4A-Vigs-1AS-F：TTTTTAGCTAGCTGATTAATTAACTGTTCTGGAATCCTTCA；
TaeIF4A-Vigs-1AS-R：TCCGTTGCTAGCTGAGCGGCCGCTTCTCAATTTGCTGTGC。
沉默片段2的载体构建引物：
TaeIF4A-Vigs-2AS-F：TTTTTAGCTAGCTGATTAATTAAGTGAGGACCAAAGGAT；
TaeIF4A-Vigs-2AS-R：TCCGTTGCTAGCTGAGCGGCCGCAACCACGGGAAAGCAT。
利用TaeIF4A过表达载体构建引物扩增出基因全长，通过Gateway反应将扩增片段构建到过表达载体 pANIC6E（植物免疫实验室提供）。将构建的TaeIF4A-pANIC6E质粒（如附图3所示）转化农杆菌感受态 EHA105。通过旱区作物逆境生物学国家重点实验室的转基因平台，利用农杆菌介导的遗传转化的方法将质粒转化到小麦品种“Fielder”（植物免疫实验室提供）幼胚，获得T0 代再生苗（如附图4所示）。
过表达载体构建引物：
TaeIF4A-HA-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATGGCAGGAATGGCACC；
TaeIF4A-HA-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCACAGAAGGTCGGCAAC。
对获得的TaeIF4A转基因小麦进行分子检测及定量检测，结果如附图5所示，表明TaeIF4A-L3和L9为阳性植株；同时对获得的T1代转基因植株和对照野生型“Fielder”的二叶通过摩擦接种的方法接种条锈菌生理小种CYR31的新鲜夏孢子（植物免疫实验室提供），接种后置于16°C黑暗保湿箱内保湿24小时，取出后放回光照培养箱继续培养，试验结果如图6所示。
由图5可知，PCR检测结果表明过表达的载体确实转入了小麦，qRT-PCR检测结果证明TaeIF4A过表达植株的表达量与野生型相比有显著增加。如附图6所示，接菌14天后发现与对照野生型“Fielder”相比，TaeIF4A-OE植株产孢明显减少，表明TaeIF4A过表达的转基因小麦对条锈菌的抗性增强。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (6)
1.小麦翻译起始因子TaeIF4A，其特征在于，所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的基因开放阅读框序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的小麦翻译起始因子TaeIF4A在小麦抗条锈病品种培育中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码开放阅读框序列受农杆菌介导的遗传转化表达，在小麦与条锈菌互作中具有正调控作用，过表达所述小麦翻译起始因子TaeIF4A增强小麦对条锈病病菌的抗性。
4.一种小麦抗条锈病品种培育方法，其特征在于，在小麦植株内表达权利要求1所述的小麦翻译起始因子TaeIF4A或在所述小麦植株内转入权利要求1所述的小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码开放阅读框序列。
5.根据权利要求4所述的小麦抗条锈病品种培育方法，其特征在于，包括：将所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码开放阅读框序列转化入所述小麦植株的细胞，得到基因编辑所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的植物品种。
6.根据权利要求4所述的小麦抗条锈病品种培育方法，其特征在于，包括：构建包含所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的编码开放阅读框序列的编辑载体；利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦植株幼胚，得到基因编辑所述小麦翻译起始因子TaeIF4A的植物品种。
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