CN103848903B - DNA修复蛋白HmDRP、其编码基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DNA修复蛋白HmDRP、其编码基因及其用途。本发明涉及DNA修复蛋白HmDRP，特征在于其氨基酸序列由SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列所编码。本发明还涉及DNA修复蛋白HmDRP的基因片段，其特征在于所述基因片段的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本发明还涉及包含DNA修复蛋白HmDRP的基因DNA序列的表达载体和转化体。另外，本发明还涉及制备DNA修复蛋白HmDRP的方法。本发明涉及的DNA修复蛋白HmDRP通过表达载体导入生物细胞后在热损伤修复方面具有显著功能。

Description

DNA修复蛋白HmDRP、其编码基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因克隆，具体涉及一种DNA修复蛋白HmDRP、其编码基因及其用途。

背景技术

DNA修复蛋白是一类修复诱变性和毒性DNA损伤的蛋白，如果这些DNA损伤得不到及时修复，就会导致细胞产生突变、衰老或死亡。DNA修复蛋白和它们的修复机制非常保守，从细菌到人类，广泛存在于生物中。

Ku蛋白是存在于真核生物中一种DNA修复蛋白，发现于患有自身免疫性疾病的病人细胞。由紧密相关的异源二聚体（70KDa和80KDa亚基）和470KDa的催化亚基（DNA-PKcs）组成。该蛋白主要参与由生理的氧化反应，化疗药物和电离辐射引起DNA双链断裂的修复。Ku蛋白在真核生物中高度保守，蛋白中间有与DNA结合的核心部位，两端又有各自的独特部位。Ku70和Ku80的N-端有vWa结构域，可被DNA-PKcs磷酸化，但Ku70的C端为染色体/DNA结合区-SAP，Ku80的C端有一个参与蛋白-蛋白相互作用的韧性臂，C末端为Ku与DNA-PKcs结合部位。实验证明Ku蛋白与dsDNA末端的结合没有序列特异性。原因可能是Ku70/Ku80-DNA结合核心结构域与DNA结合时，形成圆环包围DNA，将断裂的双链结合在一起。

Ku蛋白与细胞DNA损伤修复和辐射敏感性有着紧密联系，其功能及表达是否正常，关系到DNA-PK对DSBs的修复能力。Ku70/Ku80功能缺失的细胞有不同的表现。研究表明Ku80缺陷细胞的NHEJ活性降低了≥90%。TamuraK等从拟南芥中克隆到Ku70/Ku80基因，并研究了这两个基因的表达与DSBs的关系。用博来霉素处理悬浮培养的拟南芥细胞，发现Ku70/Ku80的表达量可比对照组高三倍以上。因为博来霉素可以有效诱发细胞DSBs的产生，推测Ku70/Ku80与DSBs修复有关。一系列拟南芥Ku70/Ku80突变体的获得，大大促进了拟南芥Ku70/Ku80蛋白基因功能的研究。这类突变体一般都对DNA损伤诱变剂具有高度敏感性，如博来霉素、甲萘醌和离子辐射等。LiuPF等的最新研究表明：物理因素—热害同样会导致植物细胞DNA损伤。拟南芥在热害胁迫下，能够显著诱导拟南芥Ku蛋白基因的表达，且表达量与损伤时间密切相关。

在真核生物中，同源重组是DNA双链断裂修复的一种重要途径。RAD52基因群和同源重组紧密相关。该基因群主要包括RAD50，RAD58/MRE11，XRS2，RPA1，RAD51，RAD52，RAD54，RAD55，RAD57和RAD59。其中RAD51和RAD54是同源重组中的两个关键成分。RAD51蛋白在进化上非常保守，从细菌到哺乳动物都有其同源物。RAD51家族成员的功能非常特别，它们和DNA一起形成螺旋状核蛋白丝，并且促进DNA配对和链的转换，该步骤是同源重组的一个基本步骤。体外实验表明RAD51和RAD54形成螺旋状核蛋白，其可以促进DNA链间的交换。RAD52和RAD55/57主要是作为RAD51蛋白和单链DNA结合蛋白-RPA的媒介，克服突触前纤维形成时RPA的抑制作用。RAD54蛋白是类Swi2/Snf2家族中的一员，需依赖DNA/ATP激酶激活来分离和改造DNA双链的蛋白复合物，在同源重组中的功能主要与DNA的同源搜索有关。其机制已在基因组和生物化学水平得到广泛证明。实验发现RAD54蛋白具有双链DNA拓扑结构修饰活性，该活性在DNA链的交换汇中起重要作用，RAD54蛋白通过修饰目标双链DNA的拓扑结构，使他们更利于DNA的配对。

在耐辐射球菌中，DNA修复蛋白对于其耐热性具有重要作用。DNA修复蛋白基因pprA，recA和irrE的缺失会导致高温条件下存活率的降低。这暗示着DNA修复蛋白对于耐辐射球菌在高温下的存活具有重要作用。在细胞中，对双链DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）进行44℃热处理，该酶会发生失活。而DNA修复蛋白Ku70/Ku80可以恢复热失活的DNA依赖蛋白激酶的活性。

真姬菇（Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow）又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇等，是一种食药兼用的珍稀食用菌。属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属（HypsizygusmarmoreusGen.）。其自然分布于欧洲、北美、西伯利亚和日本等北温带地区，是春秋冬季生木腐菌，属于中偏低温型食用菌，主要生长在山毛榉及其他阔叶树的枯木、风倒木和树桩上。

随着各种生物技术的发展，动植物和细菌中的DNA修复蛋白已经有较多的研究，但大多数是研究DNA修复蛋与紫外和辐射引起的DNA损伤修复的关系，而与热损伤修复有关的研究甚少。

目前尚未在食用菌中克隆出具有热损伤修复功能的DNA修复蛋白基因。

发明内容

本发明人基于上述领域的空白，从真姬菇中克隆分离出DNA修复蛋白HmDRP基因并获得表达该蛋白的Cdna,并证明了该蛋白可以保护细胞使其减少热损伤死亡率。

本发明的目的在于提供：

DNA修复蛋白HmDRP，其特征在于其氨基酸序列由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列所编码。

编码所述的DNA修复蛋白HmDRP的基因片段。

所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

包含所述基因片段的表达载体。

所述表达载体为DRP-pET32a。

一种转化体，其特征在于包含所述表达载体。

具有热损伤修复功能的融合蛋白，其功能区的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列所编码。

制备所述融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将所述的表达载体转化宿主细胞获得转化体，

2）培养所述转化体并进行诱导表达，

3）从诱导表达产物中分离表达的融合蛋白。

所述方法，其特征在于宿主细胞是大肠杆菌。

所述的DNA修复蛋白HmDRP在热损伤修复方面的用途。

所述用途，其特征在于：将所述表达载体导入到生物细胞中使其表达所述的DNA修复蛋白HmDRP从而获得热损伤修复能力。

本发明从真姬菇中分离DNA修复蛋白HmDRP基因，本发明人采用本领域技术人员熟知的生物信息学手段，并通过生物技术方法，扩增出大小分别约1542bp和924bp的片段为真姬菇DNA修复蛋白基因的中间片段。基于所述中间片段，本发明人利用成熟的RACE技术分别扩增得到目的基因的5`端和3`端，再利用生物信息学手段在拼接的虚拟序列上设计用于扩增目的基因ORF全长的引物。再经过一系列生物技术方法，扩增出全长2517bp的具有如SEQIDNo.1所述序列的cDNA片段真姬菇为DNA修复蛋白HmDRP基因的ORF全序列。这是本发明的显著特点之一，即克隆得到了真姬菇DNA修复蛋白HmDRP基因的ORF全序列。

本发明还提供了一种用于宿主细胞热损伤修复的方法。本发明人将DNA修复蛋白HmDRP基因的ORF全序列连接至重组载体构建含有DNA修复蛋白HmDRP基因的原核表达载体并转化宿主细胞，通过诱导使得HmDRP蛋白在宿主细胞中表达。将含有所述表达载体的宿主细胞、不含所述表达载体的宿主细胞以及含有不含DNA修复蛋白HmDRP基因的表达载体的宿主细胞共同进行热处理，发现含有所述转化体的宿主细胞存活率得到显著提高。

此外，本发明还提供了一种制备所述重组HmDRP蛋白的方法，即利用生物技术方法将DNA修复蛋白HmDRP基因的ORF全序列连接至重组载体，构建含有DNA修复蛋白HmDRP基因的原核表达载体并转化宿主细胞，获得含有所述表达载体的转化体。培养转化体，可从培养物中获得真姬菇DNA修复蛋白HmDRP。

附图说明

图1为pMD19-TSimplevector质粒图谱。

图2为表达载体pET32a(+)质粒图谱。

图3为真姬菇菌株的基因组DNA电泳图谱：泳道1～3：均为基因组DNA。

图4为真姬菇菌株总RNA电泳图谱：泳道1～3：均为RNA。

图5为DNA修复蛋白HmDRP基因cDNA序列部分片段电泳图谱：M：Marker；泳道1～2：分别以P1/P2，P3/P4为引物的PCR扩增产物。

图6为含有HmDRP基因cDNA序列部分片段的菌液PCR产物电泳图谱：泳道M：DNAMarker；泳道1～4为含有HmDRP基因cDNA序列部分片段的菌液PCR产物（1～2，3～4分别为以P1/P2，P3/P4为引物的菌液PCR产物）。

图7为HmDRP基因cDNA序列部分片段同源性比对结果。

图8为HmDRP基因cDNA3'和5'RACE产物电泳图谱：A：3'RACE产物；B：5'RACE产物。

图9为含有HmDRP基因cDNA3'和5'RACE产物的菌液PCR电泳检测图谱：A：3'RACE产物；B：5'RACE产物。

图10为HmDRP基因ORF扩增电泳图谱：泳道M：Marker；泳道1～2：DNA修复蛋白HmDRP基因ORF扩增产物。

图11为含有HmDRP基因ORF的菌液PCR电泳图谱：泳道M：Marker；泳道1～2：含有HmDRP基因ORF的菌液PCR扩增产物。

图12为使用ProtScale程序对HmDRP基因拼接的cDNA全长对应编码的氨基酸序列的疏水结构的分析图谱。

图13为HmDRP基因拼接的cDNA全长对应编码的氨基酸序列跨膜结构的预测分析图谱。

图14为HmDRP基因拼接的cDNA全长对应编码的氨基酸序列功能位点分析图谱。

图15为HmDRP基因拼接的cDNA全长对应编码的氨基酸序列保守结构域分析图谱。

图16为HmDRP基因拼接的cDNA全长对应编码的氨基酸序列与其他物种中DNA修复蛋白系统进化树分析图谱。

图17为HmDRP基因DNA序列扩增电泳图谱：泳道M：Marker；泳道1～2：HmDRP基因DNA的PCR扩增产物。

图18为含有HmDRP基因DNA序列菌液PCR电泳图谱：M：Marker；泳道1～3：含有HmDRP基因DNA序列菌液PCR扩增产物。

图19为HmDRP基因加酶切位点的cDNA全长PCR产物电泳图谱：M：Marker；泳道1～2：HmDRP基因加酶切位点的cDNA全长PCR扩增产物。

图20为含有HmDRP基因加酶切位点的cDNA全长的菌液PCR电泳图谱：M：Marker；泳道1～6：含有HmDRP基因加酶切位点的cDNA全长的菌液扩增产物。

图21为重组质粒DRP-pET32a双酶切产物电泳检测图谱：M：Marker；泳道1～2：重组质粒DRP-pET32a双酶切产物。

图22为重组HmDRP蛋白诱导表达后的SDS-PAGE图：M：蛋白质Marker；泳道1：IPTG诱导pET32a转化的菌液；泳道2：IPTG诱导的DRP-pET32a转化的菌液；泳道3：未经诱导的DRP-pET32a转化的菌液。

图23为热损伤（50℃）条件下DNA修复蛋白HmDRP影响大肠杆菌存活率的图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行具体说明，这并不限制本发明的范围。

DNA修复蛋白HmDRP

本文涉及DNA修复蛋白HmDRP，在本文中有时也简称为“HmDRP”、“DNA修复蛋白”、“HmDRP蛋白”、“蛋白”。根据本文的一个实施方案，DNA修复蛋白HmDRP选自其中每个蛋白包含与SEQIDNo.1编码的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列的蛋白的组。根据本文的一个实施方案，DNA修复蛋白HmDRP是真姬菇来源的DNA修复蛋白。本文涉及的DNA修复蛋白HmDRP具有热损伤修复功能。根据本文的一个实施方案，DNA修复蛋白HmDRP可以降低大肠杆菌的热损伤。

DNA

本文还涉及一种编码上述所有DNA修复蛋白HmDRP的DNA，其是该蛋白的编码序列。

用于本说明书的术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。

编码序列的边界通常由开放阅读框（Openreadingframe,ORF）决定，所述开放阅读框（ORF）通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

根据本文的一个实施方案，DNA具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。

重组载体

本文还涉及重组载体，其包含编码上述DNA修复蛋白HmDRP的DNA。

本文涉及的重组载体包含编码上述所有的融合蛋白的DNA序列、启动子、转录和翻译终止信号。本文中所述的DNA序列可以和其它调控序列结合在一起，产生重组载体，该载体可以包括一个或多个（数个）方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码肽段的DNA序列。备选的，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列来表达本文的DNA序列。在制备重组载体的过程中，将编码序列导入载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

启动子、转录信号、翻译终止信号以及其它调控序列是任何本领域普通技术人员能够可以根据常规选择而确定的。

重组载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的构建。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

pET原核表达载体系统是现今所知在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。pET32a是pET载体系统中应用较广泛的一个，其带有氨苄青霉素抗性基因，具有T7启动子和Lac操纵子，末端有T7终止子，可以通过IPTG诱导来调控外源基因的表达。pET32a表达载体的优点在于表达的蛋白以融合的形式存在，避免了被细胞蛋白酶降解的可能性，并且TrxA标签使融合蛋白的纯化过程简化。

根据本文的一个实施方案，本文的重组载体是pET32a(+)。优选地，该重组载体是通过以下步骤构建：

将SEQIDNO:1所示的DNA片段插入质粒pET32a(+)的多克隆位点，得到重组载体。

根据本文的一个实施方案，本文的重组载体是pMD19-TSimplevector，优选地，该重组载体是通过以下步骤构建：

将SEQIDNO:1所示的DNA片段插入质粒pMD19-TSimplevector的多克隆位点，得到重组载体。

转化体

本文还涉及转化体，其是将包含编码上述DNA修复蛋白HmDRP的DNA导入宿主细胞而得到的转化体。

本文涉及的转化体可用于蛋白质的生产，通过将包含本文DNA序列的载体导入宿主细胞而得到该转化体，并在适当的培养基中培养该转化体，可以用来生产所需要的目标蛋白质。

术语“宿主细胞”包括母体细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于母体细胞。宿主细胞可以是在本文的蛋白基因的克隆产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何大肠杆菌属细胞。宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个具体的方面，宿主细胞可以是真菌细胞。在一个具体的方面，真菌宿主细胞可以是食用菌细胞，包括但不限于真姬菇、香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头、竹荪、松口蘑（松茸）、口蘑、红菇、杏鲍菇、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌、块菌。

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，是分子生物学产业化发展的重要工具。此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好以及适应范围广等优点，因此本发明选用原核表达系统中的大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主菌。

根据本文的一个实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌。根据进一步的实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌BL21。根据进一步的实施方案，细菌宿主细胞是大肠杆菌DH5α。

DNA修复蛋白HmDRP热损伤修复的方法

本文还涉及DNA修复蛋白HmDRP热损伤修复的方法，其包括：

将DNA修复蛋白HmDRP的基因连接到上述质粒载体上构成重组载体；

将重组载体导入宿主细胞而得到转化体；以及

利用培养基培养该转化体，将转化体置于热环境中进行热处理并观察存活率。

其中，转化体的培养可以使用包含碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的常规营养培养基来进行，作为碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等糖类，乙醇、甲醇等醇类，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等有机酸类，废糖蜜等。作为氮源，可以单独或混合使用例如氨气、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等。此外，作为无机盐，可以使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。此外，培养基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、生物素等各种维生素等营养素。此外，在培养中，可优化培养基的氮源、碳源、无机离子，从而能够进一步促进细菌的生长和融合蛋白的表达。

培养通常在通气搅拌、振荡等需氧条件下进行。对培养温度没有特殊限制，只要是宿主微生物能够生长繁育的温度即可，此外，对培养过程中的pH也没有特殊限制，只要是宿主微生物能够生长繁育的pH即可。培养中的pH调整可以通过添加酸或碱来进行。

根据本文的一个实施方案诱导培养条件是：37℃振荡培养2.5～3h，待OD600达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃诱导8h。

根据本文的一个实施方案，进行上述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶质是10g/LNaCl，5g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨和100μg/L氨苄青霉素。

主要试剂

MaximaHotStartPCRMasterMix（2×）、DreamTaqPCRMasterMix（2×）和DNAMarker购于Thermo公司；Advantage2PolymeraseMix和RACEcDNAAmplicationKit，购于Clontech公司；KOD-Plus-Neo高保真酶，购于东洋纺株式会社；RT-PCR，BamHI和XhoI限制性内切酶、T4DNA连接酶均购于TaKaRa公司；氨苄青霉素钠购于生工生物工程（上海）股份有限公司；FungalRNAKit和PlasmidMiniKitII购于OMEGA生物技术公司；EZSpinColumnDNAGelExtractionKit，购于BioBasic公司。其他试剂，如马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、丙烯酰胺（Acr）、亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、CTAB、乙酸钠、Tris、浓盐酸、过硫酸铵（APS）、SDS、BPB、甘油、2-ME（β-巯基乙醇）、甘氨酸、考马斯亮蓝R250、异丙醇、冰醋酸、乙醇、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）均为国产分析纯。

氨苄青霉素（Amp）贮存液（100mg/mL）：1g氨苄青霉素钠盐溶于少量的水中，加水定容至10mL，过滤除菌，分装成小份，于-20℃贮存。

DNA提取缓冲液：2.5%CTAB，100mMTris-HCl（pH8.0），20mMEDTA（pH8.0），1.4MNaCl，121℃灭菌20min备用。

3MCH3COONa（pH8.0），121℃灭菌20min备用。

SDS-PAGE电泳所用试剂配制（参照《分子克隆》）：

1、30%丙烯酰胺单体贮存液（T=30%）：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）1.0g。先用80mL双蒸水搅拌溶解，直至溶液变成透明，再用双蒸水定容至100mL。0.45μm滤膜去杂质，于棕色瓶4℃保存。

2、1.5MTris-HCl(pH8.8)：Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存备用。

3、1.0MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存备用。

4、10%过硫酸铵（APS）：1gAPS加ddH2O至10mL。

5、5×SDS-PAGELoadingBuffer：

加去离子水溶解后定容至5mL，小份分装后（500μL）于室温保存。使用前将25μL的2-ME（β-巯基乙醇）加到每小份中。加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。

6、10×Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH8.3）

Tris30g

甘氨酸94g

SDS10g

加ddH2O，1mol·L-1盐酸调节pH值至8.3，定容至1000mL。

7、考马斯亮蓝染色液：

滤纸滤去颗粒后，室温保存。

8、考马斯亮蓝脱色液

冰醋酸100mL

乙醇50mL

ddH2O850mL

9、5%浓缩胶和8%分离胶配方

表1.5%浓缩胶和8%分离胶配方

主要培养基：

PDA固体培养基：每升培养基含马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌20min待用。

LB固体培养基：每升培养基含蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂20g，pH7.0，121℃灭菌20min待用。

LB液体培养基：每升培养基含蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0，121℃灭菌20min待用。

主要仪器设备

恒温振荡培养箱，制冰机，超低温冰箱、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、超净工作台、自动蒸汽高压灭菌、电热恒温培养箱、微量移液器、PCR仪、电泳仪、分光光度仪、双垂直电泳槽、复日生物显微图像分析系统。

生物材料的来源和记载出处

本发明所用真姬菇菌株为白真姬菇G12，由青岛农业大学农业应用真菌室保藏。克隆所用大肠杆菌（E.Coli）菌株为DH5α，表达载体为pET32a（+），质粒结构如图2所示。表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，均为本实验室保存。克隆载体为pMDTM19-TSimpleVector，质粒结构如图1所示，购于TaKaRa公司。

白真姬菇G12，在PDA固体培养基上，于25℃恒温培养；菌株于4℃保存。

大肠杆菌DH5α，BL21（DE3），均在LB培养基上，于37℃恒温培养12～16h；菌株于-70℃保存于含15%甘油的LB培养基中；含有转化质粒的大肠杆菌DH5α菌株，-40℃保存于含有100μg/mLAmp、15%甘油的LB培养基中。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1DNA修复蛋白HmDRP基因cDNA序列部分片段的克隆

方法

步骤1.总RNA的提取、检测和定量

1）取0.1g菌丝，参照FungalRNAKit试剂盒说明书进行真姬菇RNA提取。

2）确定RNA的质量：取1μLRNA加到99μLDEPC处理水中，稀释100倍，用紫外光光度计测260nm和280nm的OD值，并计算它们的比值，来分析RNA的浓度和纯度。总RNA（μg）=OD₂₆₀×40μg/mL×100(稀释倍数)×总RNA溶液体积(μL)/1000；OD_260/280在1.8～2.0视为抽提的RNA的纯度很高。

3）确定RNA的完整性和污染情况。取3μL样品溶液进行琼脂糖凝胶电泳，观察28SrRNA和18SrRNA条带的亮度。如28SrRNA亮度约为18SrRNA的两倍，说明RNA完整性较好。

4）电泳检测的方法：用DEPC处理水配制1×TAE的电泳缓冲液和制作1.0%的琼脂糖凝胶。用70%酒精（用DEPC处理水进行配制）浸泡电泳槽、梳子、模板，最大限度的抑制RNase的活性。

步骤2.HmDRP基因cDNA部分片段扩增

1.兼并引物设计

登录NCBI/EBI数据库，根据登录的双色蜡蘑（XP_001874891.1）、云芝（EIW60353.1）、米曲霉（EIT76630.1）、假花耳（EJU03425.1）等DNA修复蛋白的保守序列，使用DNAMAN结合Premier5.0程序设计两对兼并引物P1/P2和P3/P4，用于HmDRP基因cDNA序列部分片段的扩增。

2.HmDRP基因部分片段cDNA第1链和第2链的扩增

参照PrimeScriptRT-PCRkit说明书，具体操作如下：

1）在RNase-free的0.2mL的PCR管中混合以下试剂：

2）在PCR仪上进行变性，退火反应

65℃5min

4℃2～3min

离心数秒使混合液聚集于PCR管底部。

3）在上述反应液中加入以下试剂：

4）在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

反应液于-20℃保存或直接用于cDNA第二链的扩增。

5）部分片段cDNA第2链的扩增：

将上述所得逆转录反应溶液为模板，分别以P1/P2，P3/P4（序列如SEQIDNO.4～7）为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL。以提取的RNA为阴性对照。具体加样如下：

PCR扩增反应条件条件为：

对退火温度进行梯度设置，并对反应体系中各种反应物的浓度进行摸索，以获得最优结果。扩增结束后，取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果。

步骤3.目的基因部分片段的回收纯化、连接和转化

回收纯化

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切下所需目的基因片段用BBI的DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

PCR扩增产物与T载体连接

最佳连接反应条件的确定：

外源DNA与载体的比例：根据外源片段和载体的分子量大小，计算连接体系中需要加入的各DNA片段的含量，一般插入片断DNA分子摩尔数：载体DNA分子摩尔数=3～8:1。

回收的PCR产物，与pMD^TM19-simpleT载体构建重组质粒，根据T载体使用说明书，具体操作如下：

在0.2mL的PCR管中依次加入下列试剂：

16℃连接过夜。

重组质粒的转化

a)大肠杆菌DH5α，感受态细胞的制备采用CaCl₂/MgCl₂法，具体步骤参照《分子克隆实验指南》第三版第96页。

b)采用热激发将质粒向大肠杆菌中转化，具体步骤参照《分子克隆实验指南》第三版第96页。将转化后的菌液均匀涂布于含Amp的LB琼脂平板上，37℃过夜培养至长出单克隆菌落。观察菌落的生长状况，并用灭菌牙签挑取数个单菌落分别接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养16h，取菌液进行PCR检测。

步骤4.菌液PCR鉴定、重组质粒的提取与测序分析

菌液PCR鉴定

以单菌落进行扩大培养的菌液为模板，利用通用引物M13R/M13F（序列如SEQIDNO.8～9所示）进行PCR扩增反应。反应体系为25μL。以无菌水为阴性对照。具体加样如下：

PCR反应条件：

注：延伸时间根据每分钟延伸1kb进行设定

取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对菌液PCR鉴定为阳性的菌落提取质粒。

重组质粒的提取

采用PlasmidMiniKitII试剂盒进行质粒提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。

测序分析

将鉴定为阳性的质粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件和NCBI网站的blastx程序对测序结果进行相似性分析。

结果

1.本发明所提真姬菇总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图4所示。电泳结果呈现明显的28SrRNA、18SrRNA两条带，且28SrRNA条带的亮度大约是18SrRNA的2倍，表明RNA无降解或降解较少。经紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm的吸光度值，OD_260/280的比值为1.8～2.0，表明RNA纯度较高。以上结果表明所提取的真姬菇总RNA能够满足RT-PCR，RACE等后续试验的要求。

2.以设计的两对简并引物P1/P2，P3/P4（序列如SEQIDNO.4～7所示）为引物，以逆转录的cDNA为模板，分别进行PCR扩增。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别在1500bp和900～1000bp处有一条带（如图5所示），与预期结果基本吻合，初步判断为目的条带。

3.挑取连接转化后在Amp平板上长出的单菌落并进行摇菌扩大培养，进行菌液PCR验证，结果如图6，在1500bp和1000bp左右处能够扩增出条带，与预期相符，初步认为目的片段已转入质粒。

4.对鉴定为阳性的菌液提取质粒，将质粒送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，由测序结果知，PCR扩增片段分别为1542bp，924bp。利用NCBI网站的blastx软件，进行同源性分析。结果如图7所示。该中间片段与许多物种的DNA修复蛋白基因有很高的同源性，与双色蜡蘑DNA修复蛋白氨基酸序列的同源性高达88%。确定PCR扩增片段为真姬菇DNA修复蛋白基因的中间片段。

实施例2DNA修复蛋白HmDRP基因完整的ORF的克隆

方法

步骤1.HmDRP基因cDNA末端序列扩增

根据得到目的基因cDNA的部分片段序列，应用PrimerPremier5.0软件设计特异引物UP1（SEQIDNO.10）和UP2（SEQIDNO.11）与试剂盒提供的接头引物进行3'RACE扩增，设计特异引物DP1（SEQIDNO.12）、DP2（SEQIDNO.13）和DP3（SEQIDNO.14）与试剂盒提供的接头引物进行5'RACE扩增。

3'，5'RACEReadycDNA合成

1）在经DEPC处理水处理的0.2mLPCR薄壁管中加入下列试剂：

若为3'RACEReadycDNA：1.5μL总RNA，1μL3'RACECDSPrimer，用RNase-FreeddH₂O补至4.75μL。

若为5'RACEReadycDNA：1.5μL总RNA，1μL5'RACECDSPrimer，用RNase-FreeddH₂O补至3.75μL。

2）混匀，短暂离心。

3）在预热的PCR仪上，72℃温育3min。（使用有热盖的PCR仪，以避免由于蒸发作用而减少反应液的体积）。

4）42℃温育2min。

5）14000rpm短暂离心使成分聚集管底。

对于5'RACEcDNA合成反应，加入1μLSMARTerⅡAoligo

6）在上述0.2mL的PCR管中再加入下列试剂（已有4.75μL）：

7）混匀，短暂离心，收集反应液于管底。

8）42℃温育90min（在PCR仪上操作）。

9）70℃加热10min，以灭活反转录酶（在PCR仪上操作）。

加Tricine-EDTA缓冲液进行稀释（如果总RNA不大于200ng，加入20μL缓冲液进行稀释；如果总RNA大于200ng，加入100μL缓冲液进行稀释）。

10）将样品于-20℃保存。

3'RACE扩增HmDRP基因cDNA3'末端

为反应体系配制主混合液。配制原则：主混合液体积为所有反应所需体积和一个额外反应所需体积之和。对于50μL的PCR反应体系，混合试剂及其体积量如下：

混合均匀（避免产生泡沫），短暂离心收集溶液于管底。

按表2的顺序，在0.2mL灭菌的PCR薄壁管中加入PCR反应成分，轻柔混合，进行3'RACEPCR扩增。

3'RACEPCR反应条件为：

对温度进行梯度设置，对反应体系进行摸索，以获得最优反应体系。扩增结束后取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后凝胶成像系统拍照，观察结果。

表2.3'RACEPCR反应成分

5'RACE扩增HmDRP基因cDNA5'末端

按表3的顺序，在0.2mL灭菌的PCR薄壁管中加入PCR反应成分，轻柔混合，进行5'RACEPCR扩增。

表3.5'RACEPCR反应成分

5'RACEPCR反应条件：

根据试验结果，对退火温度进行梯度摸索，对反应体系的各种条件进行摸索。扩增结束后取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后用凝胶成像系统拍照，观察结果。步骤2.扩增产物的回收、克隆、鉴定与测序

对3'RACE和5'RACE的PCR产物进行回收纯化，将回收纯化的目的片段连入pMD19-TSimple载体后，导入大肠杆菌DH5α进行筛选。挑取单克隆菌落，接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃，180rpm，过夜培养。将菌液PCR鉴定为阳性的菌落提取质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序并进行序列分析。具体方法见实施例1的步骤3。

步骤3.HmDRP基因完整ORF的扩增

根据目的基因部分片段、3'末端和5'末端序列部分片段重叠，利用DNAMAN软件进行拼接目的基因cDNA全长，用DNAMAN软件和NCBI网站的blastx程序对测序结果进行相似性分析。

根据全长序列拼接结果，使用PrimerPremier5.0结合DNAMAN6.0程序设计引物ORF1/ORF2（序列如SEQIDNO.15～16所示）来扩增完整的ORF及基因全长。以5'RACEreadycDNA为模板，采用TOYOBO公司的KOD-Plus高保真酶进行PCR扩增，以扩增真姬菇HmDRP基因的完整ORF。在PCR薄壁管中分别加入以下成分：

PCR扩增程序为：

对退火温度进行梯度设置，对反应体系进行摸索，以获得最优反应体系。扩增结束后取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统拍照，观察结果。

将剩余45μL产物进行回收纯化，连接和转化（方法同实施例1步骤3），对菌液PCR鉴定结果为阳性的菌落提取质粒（方法同实施例1步骤3），送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与拼接结果进行比较，用DNAMAN软件和NCBI网站的blastx程序对测序结果进行相似性分析。

结果

1.HmDRP基因cDNA3'和5'末端扩增及全序列拼接结果

根据实施例1中得到的目的基因-DNA修复蛋白基因cDNA的中间片段序列，应用PrimerPremier5.0软件设计特异引物UP1和UP2与试剂盒提供的接头引物进行3'RACE扩增，设计特异引物DP1（SEQIDNO.12）、DP2（SEQIDNO.13）和DP3（SEQIDNO.14）与试剂盒提供的接头引物进行5'RACE扩增。结果如图8所示，3'RACE扩增出2条目的片段，分别为1100bp和900bp左右；5'RACE扩增出3条目的片段，长分别约1200bp，1100bp，800bp。将所得目的片段回收纯化，然后连接到pMD19-TSimple载体上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经Amp选择后，挑取单菌落经扩大培养，进行菌液PCR，菌液PCR结果如图9所示，3'RACE在1200bp和1000bp左右，5'RACE在1000bp，1200bp，1500bp左右处有目的条带，初步认为目的片段成功插入载体。对菌液PCR结果为阳性的菌落提取质粒，将阳性质粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。3'RACE扩增片段分别长1065bp、991bp，均含有PolyA+结构，去除接头序列，利用NCBI网站的blastx软件，进行同源性分析。结果显示它们与双色蜡蘑的DNA修复蛋白序列具有91%的一致性，确定扩增片段为HmDRP基因cDNA的3'端；5'RACE扩增片段为1194bp、1042bp、842bp，均含有接头序列和起始密码子，去除接头序列，利用NCBI网站的blastx软件，进行同源性分析。结果显示它们与多个物种的DNA修复蛋白有很高的同源性，最高可达79%，确定扩增片段为HmDRP基因cDNA的5'端。根据部分cDNA片段、3'RACE和5'RACE扩增产物部分片段重叠，使用DNAMAN软件进行序列拼接，得到HmDRP基因cDNA全序列。剔除接头序列，拼接得到一条2609bp如SEQIDNo.2所述的序列。应用NCBI的ORFfinder软件对全长cDNA序列进行可读框架分析，结果发现，5'非编码区长54bp，3'非编码区长92bp，其开放阅读框（ORF）位于55～2517位核苷酸之间，全长2463bp，编码820个氨基酸。

基于拼接所得的HmDRP基因cDNA全序列，设计用来扩增完整的ORF及基因全长的引物ORF1和ORF2（序列如SEQIDNO.15～16所示），以5'RACEreadycDNA为模板扩增出一条约2600bp的条带（图10）。将PCR扩增产物回收纯化，连入pMD19-TSimple载体，然后导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经Amp筛选，挑取单菌落扩大培养，做菌液PCR鉴定。菌液PCR鉴定结果如图11所示，可扩增出一条2600bp左右的条带。将菌液PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒后送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果表明，该cDNA片段全长2517bp，含有完整的开放读码框2463bp，核苷酸序列如SEQIDNo.1中所示，编码氨基酸序列全长820个氨基酸残基，分子量为92.9kDa，因此确定为DNA修复蛋白HmDRP基因的ORF全序列。

2.HmDRP推导蛋白序列分析

通过Protparam程序（http://web.expasy.org/protparam/）分析推测HmDRP一级结构，结果如下：

氨基酸残基数目：820

分子量（Mv）：92.9kDa

理论等电点（pI）：9.18

负电荷残基（Asp+Glu）：104

正电荷残基（Arg+Lys）：128

氧O1209

硫S29

分子式:C4131H6632N1168O1209S29

原子总数:13169

半衰期：30hours（mammalianreticulocytes，invitro）

>20h（yeast，invivo）

>10h（Escherichiacoli，invivo）

不稳定系数：35.07，是一种稳定蛋白。

脂肪系数：85.89，表明为其脂溶性蛋白。

使用ProtScale程序对HmDRP的疏水结构进行分析（图12）。对预测结果进行分析，发现HmDRP的疏水最大值/位置是2.52/275，疏水最小值/位置是-2.80/78，蛋白的亲水和疏水结构基本交错得非常紧密，从预测图可见HmDRP是一个亲水性的蛋白。

利用psipred程序（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）对HmDRP二级结构分析，结果显示：HmDRP的二级结构是由23个α螺旋和15个β折叠，另外还一些无规则的卷曲所构成，其中α螺旋的数量远大于β折叠。

HmDRP跨膜结构预测见图13，在113～133，649～673区域有两个由内向外的跨膜螺旋，分值分别为677，585；在355～373区域有一个由外向内的跨膜螺旋，分值为898（分值超过500，即为显著性结果），说明此蛋白至少存在3跨膜结构区。

采用Prosite程序和NCBI的CDD数据库对推测的氨基酸序列的功能位点和保守域进行分析（结果见图14、图15），表明该蛋白具有DNA修复蛋白的特征功能序列，DNA修复蛋白Rad54N端保守区、解螺旋酶保守区和SNF2家族N端等。从上述结果可以推断我们所获得的基因序列为一种属于SNF2家族的DNA修复蛋白。

将推导的蛋白氨基酸序列与NCBI中protein数据库中已登录其他生物SNF2家族的DNA修复蛋白序列，采用blastp进行蛋白同源性检索，发现该序列与其他物种的同类蛋白有50～86%的相似性。其中与双色蜡蘑（XP_001874891.1）、粉孢革菌（EIW85115.1）、云芝（EIW60353.1）、白腐菌（EMD38006.1）、污叉丝孔菌（EJF65856.1）DNA修复蛋白的相似度较高，分别达到86%，82%，84%，80%，81%。

对推导的蛋白氨基酸序列和GenBank同源性获得其他物种DNA修复蛋白的氨基酸序列进行系统进化树分析，结果见图16，发现真姬菇DNA修复蛋白首先与双色蜡蘑的聚为一小类，再和粉孢革菌的聚为一类，表明真姬菇、双色蜡蘑和分孢革菌的亲缘关系较近。而其与吸血蝠和青蓝藻的相距最远，表明它们的亲缘关系最远。

实施例3DNA修复蛋白HmDRP基因DNA序列扩增

方法

步骤1.真姬菇基因组DNA提取

刮取菌丝0.1g，利用CTAB法提取DNA，具体步骤参照《分子克隆实验指南》第三版。所提DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。

步骤2.HmDRP基因DNA序列扩增

以真姬菇菌丝基因组DNA为模板，ORF1/ORF2（序列如SEQIDNO.15～16所示）为引物，采用TOYOBO公司的KOD-Plus高保真酶进行PCR扩增，以扩增HmDRP基因的DNA序列。在PCR薄壁管中分别加入以下成分：

PCR扩增程序：

对延伸温度进行梯度设置，对反应体系进行摸索，以获得最优反应体系。扩增结束后取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统拍照，观察结果。

将剩余45μL产物进行回收纯化，连接和转化（方法同实施例1步骤3），对菌液PCR结果鉴定为阳性的菌落提取质粒（方法同实施例1步骤3），送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与cDNA序列进行比较，确定该基因内含子和外显子的位置。

结果

1.真姬菇总DNA提取及鉴定

将步骤一获得的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图3所示，可见所提DNA条带整齐，单一，表明所提基因组DNA杂质少，无降解。经紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm的吸光度值，OD_260/280的比值为1.8～2.0，表明DNA纯度较高。说明其可用于下一步试验。

2.HmDRP基因DNA序列扩增结果

以基因组DNA为模板，ORF1/ORF2（序列如SEQIDNO.15～16所示）为引物进行目的基因DNA序列扩增，PCR扩增结果见图17，在3000～3500bp间有一条带。

将PCR产物回收纯化后，连入载体pMD19-TSimple，然后导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经Amp筛选，挑取单菌落扩大培养，进行菌液PCR鉴定。结果如图18所示，在3000～3500bp间有一条带，与预期结果相符。

将菌液PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒后送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果见SEQIDNo.3，该基因片段全长3123bp。从起始密码子到终止密码子，将基因组DNA与cDNA序列相比较，发现该基因含有11个内含子和12个外显子，其内含子长度大部分处于50～100bp之间，大部分内含子和外显子的边界符合标准的GT-AG内含子剪接法则，其中，第7个和第10个内含子不符合该法则。

实施例4DNA修复蛋白HmDRP基因融合蛋白的诱导表达

方法

步骤1.DNA修复蛋白HmDRP基因原核表达载体的构件与转化

根据已得到的完整开放阅读框序列重新设计带有酶切位点的引物DF和DR（序列如SEQIDNO.17～18所示），以HmDRP基因的全长cDNA为模板进行扩增，反应体系为50μL。具体加样如下：

DreamTaqTM PCR Master Mix（2×）	25μL
		PrimerDF（20μM）	2μL
PrimerDR（20μM）	2μL
		模板	1μL
Nuclease-free H2O	20μL
		Total	50μL

PCR扩增反应条件为：

扩增结束后，取5μLPCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果。PCR产物经凝胶电泳鉴定正确后，将其余PCR扩增产物中的目的基因片段进行回收纯化。将回收的目的片段进行BamHI和XhoI双酶切，同时将表达载体pET32a进行双酶切，将酶切产物纯化后16℃连接过夜。连接产物转化DH5α，在氨苄青霉素抗性的LB平板上进行筛选，通过菌液PCR、双酶切筛选阳性质粒，并对阳性质粒测序验证。构建成功的表达质粒命名为DRP-pET32a，将测序正确的质粒转化BL21感受态细胞。

步骤2.融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析

将含有正确重组质粒的BL21菌液接种到5mLLB（含100μg/mLAmp）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1mL菌液加到100mLLB（含100μg/mLAmp）液体培养基中。37℃振荡培养2.5～3h，待OD600达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃诱导8h。同时设立只含pET-32a质粒的大肠杆菌BL21诱导后的对照，对照组处理同上。取1mL的表达菌液于4℃10000rpm离心5min，收集菌体沉淀。在菌体沉淀中加入100μL的1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热5min，4℃10000rpm离心10min，收集上清液，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

SDS-PAGE凝胶电泳所用分离胶浓度为8%，浓缩胶浓度为5%，所采用浓缩胶电压为80V，分离胶电压为100V进行电泳。电泳结束后观察结果并分析。

结果

1.加酶切位点的HmDRP基因完整ORF的扩增

以实施例2中所得到的HmDRP基因的全长cDNA为模板，以DF/DR为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图19所示：M为3000bp的Marker，1、2号泳道为PCR扩增产物片段，其大小在2000bp到3000bp之间，与目的基因的序列长度（2517bp）基本一致，初步证明成功扩增得到目的基因。

2.重组表达载体的构建

将分别经过双酶切的目的基因片段和pET32a质粒进行连接后转化大肠杆菌DH5α，对过夜后在LB固体平板上长出的单菌落进行摇菌扩大培养，取菌液PCR扩增，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性单菌落。电泳图如图20所示：泳道1至6的条带均在2000bp至3000bp之间，说明所挑取的6个单菌落均为阳性。

对菌液PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒后进行双酶切，酶切后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图21所示：左边为10000bp的Marker，泳道1和2均为重组质粒双酶切的结果，切开后载体在5900bp左右，目的基因在2500bp左右，与预期结果相符。

3.融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析

表达载体DRP-pET32a转化大肠杆菌BL21(DE3)，液体扩大培养后采用IPTG诱导重组蛋白表达。同时以空载体pET32a转化的BL21(DE3)菌作对照，进行IPTG诱导。诱导温度均为37℃，IPTG浓度为0.5mM，诱导时间为8h。所要表达的DNA修复蛋白推导的氨基酸序列全长为820个氨基酸残基，大约93kDa。由于采用融合表达，所以加上载体上的蛋白标签后表达得到的蛋白大约为110kDa。表达结果如SDS-PAGE凝胶电泳图（图22）所示：1号泳道为经过诱导的仅含空载体pET32a的BL21(DE3)菌体的全蛋白，2号泳道为经过诱导的含DRP-pET32a重组表达载体的BL21(DE3)菌体的全蛋白。3号泳道为未经过诱导的含DRP-pET32a重组表达载体的BL21(DE3)菌体的全蛋白。从图22中可以看出，2号泳道即重组蛋白表达菌在IPTG诱导下于大约110kDa的位置出现一条明显的蛋白条带，而1号泳道即空载体pET32a转化的BL21(DE3)菌和3号泳道即未经诱导的重组表达菌在与2号泳道中对应的位置处没有条带。因为该蛋白带的大小与之前预期的重组蛋白大小相近，说明表达菌经IPTG诱导后有重组蛋白的显著表达。

实施例5DNA修复蛋白HmDRP热损伤修复功能

方法

通过测定大肠杆菌高温处理后的存活率来研究真姬菇DNA修复蛋白降低热损伤的能力。将含有重组质粒DRP-pET32a的大肠杆菌BL21和只含有pET32a质粒的大肠杆菌BL21做相同处理，然后转入50℃进行不同时间的热损伤处理。整个处理过程如下：

1）含两种质粒的大肠杆菌在LB液体培养基中过夜培养后，吸取1mL菌液，加入到100mL新鲜LB液体培养基（含Amp100μg/mL）中，37℃，180rpm培养至OD600=0.6，吸取500μL培养液加入50ml的新鲜LB液体培养基（含Amp100μg/ml，IPTG0.5mM）中。

2）37℃，180rpm培养2h后，将培养液转入50℃，分别培养0min，30min，60min，90min，120min，150min。

3）将处理后的菌液适当稀释后取50μL涂布于LB平板（Amp100μg/mL，IPTG0.5mM）上，每个梯度3个重复，37℃过夜培养后统计存活率。

结果

将IPTG诱导后的细菌进行50℃热损伤处理，分别于0、30、60、90、120、150min时取等量的菌液适当稀释后涂布到固体LB平板（Amp100μg/mL，IPTG0.5mM）上，每个梯度3个重复，37℃过夜培养后通过菌落计数测定大肠杆菌的存活率。相关的存活率数据示于表4。从图23中可以看到，热损伤30min后，含重组蛋白的大肠杆菌有89.6%的存活率，而对照大肠杆菌存活率仅为67.2%。热损伤150min后，对照大肠杆菌存活率为25.6%，而含重组蛋白的大肠杆菌有32.8%的存活率。由此说明DNA修复蛋白在大肠杆菌受到热损伤时可以对DNA起到保护作用，降低高温对DNA所造成的伤害，从而增强了大肠杆菌的存活能力。但随着热害时间的增长，含重组蛋白的大肠杆菌的存活率与对照组的存活率差距明显减小，这可能是由于随着热害时间的增长，DNA修复蛋白会逐渐发生降解所造成的。通过对大肠杆菌BL21(DE3)的热损伤试验可以看出，真姬菇的DNA修复蛋白对由于高温而对大肠杆菌所造成的损害具有保护作用，这使得大肠杆菌在高温下的存活能力增强。

表4.热损害（50℃）条件下DNA修复蛋白对大肠杆菌存活率的影响

热害时间/min	0	30	60	90	120	150
							DRP-pET32a存活率/%	100	89.6	84.7	76.2	56.5	32.8
pET32a存活率/%	100	67.2	61.5	57.4	46.3	25.6

Claims (10)

1.具有热损伤修复功能的DNA修复蛋白HmDRP，其特征在于，以真姬菇为材料克隆而得，其氨基酸序列由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列所编码。

2.编码权利要求1所述的DNA修复蛋白HmDRP的基因片段。

3.根据权利要求2所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

4.包含权利要求2或3所述基因片段的表达载体。

5.一种转化体，其特征在于包含权利要求4所述表达载体。

6.具有热损伤修复功能的融合蛋白，其功能区的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列所编码。

7.制备权利要求6所述融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞获得转化体，

2)培养所述转化体并进行诱导表达，

3)从诱导表达产物中分离表达的融合蛋白。

8.权利要求7所述方法，其特征在于宿主细胞是大肠杆菌。

9.权利要求1所述的DNA修复蛋白HmDRP在热损伤修复方面的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：将权利要求4所述的表达载体导入到生物细胞中使其表达所述的DNA修复蛋白HmDRP从而获得热损伤修复能力。