CN1989243A - P180表达单元 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子和表达单元本身、用于基因中改变或引发转录率和/或表达率的方法、包含所述表达单元的表达盒、具有改变或引发的转录率和/或表达率的基因修饰微生物和用于通过培养基因修饰微生物制备生物合成产物的方法。

Description

P180表达单元
本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子和表达单元本身、用于改变或引发基因转录率(transcription rate)和/或表达率(expression rate)的方法、包含表达单元的表达盒、具有改变或引发的转录率和/或表达率的基因修饰微生物和用于通过培养基因修饰微生物制备生物合成产物的方法。
多种生物合成产物例如精细化学品，尤其如氨基酸、维生素和蛋白质，通过细胞天然代谢过程产生，并且用于工业的众多领域，包括食品、饲料、化妆品、饲料工业、食品工业和制药工业。统称为精细化学品/蛋白质的这些物质尤其包含有机酸、蛋白原性(proteinogenic)氨基酸和非蛋白原性(non-proteinogenic)氨基酸、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素和辅因子以及蛋白质和酶。它们工业规模的产生通过培养已经开发用来产生并分泌大量所需要特定物质的细菌最可取地进行。特别适合于此目的生物是革兰氏阳性非病原细菌的棒状细菌(coryneformbacteria)。
已知氨基酸通过棒状细菌菌株、特别谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的发酵制备。由于极为重要，持续对改进这种生产方法的改进工作。方法改进可涉及发酵技术手段，例如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的组成，例如发酵期间的糖浓度，或者形成产物的工作步骤，例如离子交换层析或喷雾干燥，或者微生物本身固有的性能特性。
此外，重组DNA技术方法通过扩增单个基因并研究对精细化学品/蛋白质产生的影响多年来已经类似地应用于产生精细化学品/蛋白质的棒杆菌属菌株的菌株改进。
用于开发用来产生精细化学品、氨基酸或蛋白质的方法或者用于提高或改进用来产生精细化学品、氨基酸或蛋白质的已有方法生产率的其它途径是提高或改变一个或多个基因的表达和/或通过合适的多核苷酸序列影响mRNA的翻译。在本上下文中，影响可以包含基因表达的提高、降低或其他参数，如时序表达模式。
细菌调节序列中的多种成分对技术人员为已知。区分了又称作操纵基因的用于调节物的结合位点、又称作-35区和-10区的用于RNA聚合酶全酶的结合位点和也称作核糖体结合位点或SD序列的用于核糖体16S RNA的结合位点。
为本发明目的，又称作SD序列的核糖体结合位点序列意指位于翻译起始密码子上游直至20个碱基的多核苷酸序列。
文献中(E.coli and S.typhimurium，Neidhardt F.C.1995 ASM Press)报道不但SD序列的多核苷酸序列的组成即碱基的序列串，而且SD序列中所包含的多核苷酸序列与翻译起始密码子的距离均显著影响翻译起始速率。
具有启动子活性的核酸序列可以多种方式影响mRNA的形成。将其活性不依赖生物生理生长期的启动子称为组成型启动子。另一些启动子则响应于外部化学刺激或物理刺激，例如氧、代谢物、热、pH等。其它启动子则表现它们强烈依赖于不同生长期的活性。例如，文献中描述了微生物的指数生长期期间显示特别显著活性的启动子或微生物静止期期间显示恰当活性的启动子。启动子的两个特征均可有益地影响精细化学品和蛋白质产生的生产率，这取决于代谢途径。
例如，生长期间关闭基因的表达但最佳生长后开启该基因表达的启动子可用于调节控制代谢物产生的基因。经修饰的菌株虽然表现与初始菌株相同的生长参数，但是每个细胞产生更多产物。这类修饰既可以提高升产量(titer)(g产物/升)，又可以提高碳源产量(C yield)(g产物/g碳源)。
已经有可能分离棒杆菌属种中能使用以提高或减弱基因表达的那些核苷酸序列。受调节的这些启动子可以提高或降低基因的转录率，这取决于细胞的内部和/或外部条件。在某些情况下，称作诱导物的特定因子的存在可以刺激自启动子的转录率。诱导物可以直接或间接地影响自启动子的转录。称作抑制物的另一类因子能够降低或抑制来自启动子的转录。与诱导物类似，抑制物也能够直接或间接地作用。不过，受温度调节的启动子也为已知。因此，此类启动子的转录水平例如可以通过将生长温度提高至高于细胞正常生长温度而提高或降低。
迄今已描述来自谷氨酸棒杆菌的少数启动子。在DE4440118中描述来了自谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶基因启动子。将该启动子插入编码蛋白质的结构基因上游。将这种构建体转化至棒状杆菌后，出现对该启动子下游结构基因表达的调节。一旦将适宜诱导物添加至培养基则立即诱导结构基因的表达。
Reinscheid等，Microbiology 145：503(1999)描述了来自谷氨酸棒杆菌的pta-ack启动子和报告基因(氯霉素乙酰转移酶)间的转录性融合。在含有乙酸的培养基上生长的包含这种转录性融合的谷氨酸棒杆菌细胞表现报告基因提高的表达。与此相比，在葡萄糖上生长的转化细胞未显示报告基因提高的表达。
Pa’tek等，Microbiology 142：1297(1996)描述了能够增强谷氨酸棒杆菌细胞中报告基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的某些DNA序列。将这些序列在一起相互比较以定义谷氨酸棒杆菌启动子的共有序列。
能够用来调节基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的另一些DNA序列在专利WO 02/40679中描述。这些分离的多核苷酸代表可用于提高或用于降低基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的表达单元。该专利还描述了在其中来自谷氨酸棒杆菌的表达单元与异源基因结合的重组质粒。本文中所述的将来自谷氨酸棒杆菌的启动子与异源基因融合的方法尤其可应用于调节氨基酸生物合成的基因。
本发明的一个目的是提供具有有利特性的其它启动子和/或表达单元。我们发现通过使用这样的具有启动子活性的核酸，实现了用于转录基因的目的，其中该核酸包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或
B)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或
C)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或
D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
根据本发明，“转录”意指从DNA模板开始产生互补性RNA分子的过程。蛋白质如RNA聚合酶、所谓的σ因子和转录调节蛋白参与此过程。随后将合成的RNA用作翻译过程中的模板，然后产生具有生物合成活性的蛋白质。
产生具有生物合成活性的蛋白质的形成率是转录率和翻译率的结果。可以根据本发明影响两种效率，并且因此影响微生物中产物形成率。
根据本发明，“启动子”或“具有启动子活性的核酸”意指与待转录的核酸功能性连接并调节此核酸转录的核酸。
在本上下文中，“功能性连接”意指例如以如此方式依次排列具有启动子活性的本发明核酸之一和待转录的核酸序列以及根据需要其它调节元件，例如确保转录核酸的核酸序列和例如终止子，以至每个调节元件能够在转录核酸序列时充分行使其功能。因此，化学意义上的直接连接不是绝对必需。遗传控制序列例如增强子序列能够自更远位置甚至自其它DNA分子对靶序列执行其功能。优选这样的排列，其中将待转录的核酸序列置于本发明启动子序列之后(即3’末端)以便两种序列共价地连接在一起。在本上下文中，启动子序列和待转基因表达的核酸序列间的距离优选地小于200bp、特别优选地小于100bp、非常特别优选地小于50bp。
根据本发明，“启动子活性”意指特定时间内通过启动子形成的RNA的量，即转录率。
根据本发明，“特异启动子活性”意指特定时间内对于每一启动子通过该启动子形成的RNA的量。
根据本发明，术语“野生型”意指适宜的初始微生物。
根据上下文，术语“微生物”意指本发明的初始微生物(野生型)或本发明的基因修饰微生物或这两种微生物。
优选地，并且尤其在不能清楚规定微生物或野生型微生物的情况下，“野生型”在任何情况下意指用于启动子活性或转录率的改变或引发、表达活性或表达率的改变或引发和提高生物合成产物的含量的参考生物。
在一个优选的实施方案中，这种参考生物是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
在一个优选的实施方案中，所用的初始微生物已经能够产生需要的精细化学品。在本上下文中，在棒杆菌属(Corynobacterium)细菌的特别优选的微生物和特别优选的精细化学品L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸中，特别优选已经能够产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的那些初始微生物。它们特别优选是其中例如编码天冬氨酸激酶的基因(ask基因)下调或者反馈抑制取消或降低的棒杆菌。这类细菌具有例如导致ask基因中反馈抑制下降或取消的突变，例如突变T311I。
在关于与野生型相比基因的“引发的启动子活性”或转录率情况下，因此与野生型相比，引发了不以这种方式存在于野生型中的RNA形成。
在关于与野生型相比基因的改变的启动子活性或转录率情况下，因此与野生型相比，改变了特定时间所产生的RNA的量。
在本上下文中，“改变”优选地意指提高或降低。
例如，这可以通过提高或降低本发明内源性启动子的特异启动子活性，例如通过突变启动子或通过刺激或抑制启动子进行。
另一种可能是例如通过具有启动子活性的本发明核酸或通过具有提高的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录而实现提高的启动子活性或转录率，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
通过具有启动子活性的本发明核酸或通过具有提高的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录优选地由如下方式实现：
将本发明具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的一个或多个核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在导入的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸控制下进行，或
将一个或多个基因导入微生物基因组，以至一个或多个所导入基因的转录在具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明内源性核酸控制下进行，或
将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸，以及功能性连接的一个或多个待转录核酸。
具有启动子活性的本发明核酸包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或
B)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或
C)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或
D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表来自谷氨酸棒杆菌的推定性膜蛋白(P180)的启动子序列。SEQ.ID.NO.1与野生型的启动子序列对应。
本发明还涉及这样的具有启动子活性的核酸，其包含通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列。
用于本发明启动子的本发明其它天然实例能够例如自基因组序列已知的多种生物通过同一性比较来自数据库的核酸序列与如上所述的序列SEQ.ID.NO.1轻易地找到。
本发明的人工启动子序列可自序列SEQ.ID.NO.1开始通过人工变异和突变轻易地找到，例如通过替换、插入或缺失核苷酸。
术语“替换”意指一个或多个核苷酸替换一个或多个核苷酸的描述。“缺失”意指通过直接连接替换核苷酸。“插入”意指将核苷酸插入核苷酸序列，由一个或多个核苷酸形式上替换直接连接。
两种核酸间的同一性在所有情况下意指遍及核酸全部长度的核苷酸的同一性，尤其借助Informax(USA)的软件Vector NTI Suite 7.1，使用如下所设定参数的Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitivemultiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2)：151-1)，通过比较而计算的同一性：
多重比对参数：
缺口开放罚分(Gap opening penalty)  10
缺口延伸罚分(Gap extension penalty)  10
缺口分离罚分范围(Gap separation penalty range)  8
缺口分离罚分(Gap separation penalty)    关闭
比对延迟的同一性(identity for alignment delay)％  40
残基特异性缺口  关闭
疏水残基缺口    关闭
转换权重(Transition weighing)  0
配对比对参数：
FAST算法     开启
K-tuple大小  1
缺口罚分     3
窗口大小     5
最佳对角线数(Number of best diagonals)  5
具有与序列SEQ.ID.NO.1至少90％同一性的核酸序列因此意指与序列SEQ.ID.NO.1比较后，特别是根据具有以上参数设置的以上程序性算法比较显示至少90％同一性的核酸序列。
特别优选的启动子显示与核酸序列SEQ.ID.NO.1 91％，更优选地92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，特别优选地99％的同一性。
启动子的其它天然实例能够从以上所述核酸序列开始，特别从序列SEQ.ID.NO.1开始通过杂交技术以本身已知的方式自基因组序列未知的多种生物更轻易找到。
因此，本发明的又一方面涉及具有启动子活性的核酸，其包含严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的的核酸序列。该核酸序列包含至少10个，更优选地多于12个、15个、30个、50个或特别优选地多于150个核苷酸。
根据本发明，杂交在严格条件下发生。杂交条件在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.的Molecular Cloning(A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第9.31-9.57页中或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
严格杂交条件特别意指：
在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt杂交溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性和剪切的鲑精DNA组成的溶液中在42℃温育过夜，随后在65℃以0.1×SSC洗涤滤膜。
“功能等同的片段”对具有启动子活性的核酸序列意指具有基本相同或高于初始序列的特异启动子活性的片段。
“基本相同的”意指表现初始序列特异启动子活性至少50％、优选地60％、更优选地70％、更优选地80％、更优选地90％、特别优选地95％的特异启动子活性。
“片段”意指具有由实施方案A)、B)或C)所述启动子活性的核酸的部分序列。这些片段优选地具有核酸序列SEQ.ID.NO.1的多于10个、但更优选地多于12个、15个、30个、50个或特别优选地多于150个连接的核苷酸。
特别优选地使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作为启动子，即用于转录基因。
SEQ.ID.NO.1已在Genbank登录号AP005283中描述而未注明其功能。因此，本发明还涉及具有启动子活性的本发明的新核酸序列。
本发明特别涉及具有启动子活性的核酸，其包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或
B)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或
C)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或
D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段，条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
以上所提及具有启动子活性的全部核酸还可以自核苷酸结构单元以本身已知的方式通过化学合成制备，例如通过双螺旋的重叠互补的各个核酸结构单元的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可以例如通过亚磷酰胺法(phosphoramidite method)(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York第896-897页)以已知方式进行。添加合成性寡核苷酸并使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段填补缺口及连接反应以及常用的克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述。
本发明还涉及表达单元用来表达基因的用途，其中所述表达单元包含具有启动子活性的本发明核酸之一和额外地功能性连接的确保翻译核糖核酸的核酸序列。
根据本发明，表达单元意指具有表达活性的核酸，即与基因或待表达核酸功能性连接，调节该基因或该核酸的表达即转录和翻译的核酸。
“功能性连接”在本上下文中意指例如以如此方式依次排列本发明的表达单元之一和待转基因表达的核酸序列以及根据需要其它调节元件例如终止子，以至每个调节元件能够在转基因表达该核酸序列时充分行使其功能。因此化学意义的直接连接不是绝对必需。遗传控制序列例如增强子序列能够自更远位置甚至自不同DNA分子对靶序列执行其功能。优选这样的排列，在其中将待转基因表达的核酸序列置于本发明表达单元序列之后(即3’末端)以便两种序列共价地连接在一起。此时，表达单元序列和待转基因表达的核酸序列间的距离优选地少于200bp、特别优选地少于100bp、非常特别优选地少于50bp。
根据本发明，“表达活性”意指特定时间内由表达单元所产生的蛋白质的量，即表达率。
根据本发明，“特异表达活性”意指对于每一表达单元特定时间内由所述表达单元所产生的蛋白质的量
在关于与野生型相比基因的“引发的表达活性”或表达率情况下，因此与野生型相比，引发了不以这种方式存在于野生型中的蛋白质产生。
在关于与野生型相比基因的“改变的表达活性”或表达率情况下，因此与野生型相比，改变了特定时间内所产生的蛋白质的量。
在本上下文中，“改变”优选地意指提高或降低。
这可以通过提高或降低内源性表达单元的特异活性例如通过将表达单元突变或通过刺激或抑制表达单元而进行。
还可以例如通过本发明表达单元或通过具有提高的特异表达活性的表达单元调节微生物中基因的表达实现提高的表达活性或表达率，其中所述基因相对于表达单元为异源。
通过本发明表达单元或通过具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中基因的表达优选地由如下方式实现：
将一个或多个本发明表达单元导入微生物基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的本发明表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
将一个或多个基因导入微生物基因组，以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，该内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
将一个或多个核酸构建体导入微生物，该核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有改变的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
本发明的表达单元包含如上所述具有启动子活性的本发明核酸和额外地功能性连接的确保翻译核糖核酸的核酸序列。
在优选的实施方案，本发明的表达单元包含：
E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或
F)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或
G)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或
H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2代表来自谷氨酸棒杆菌的推定性膜蛋白(P180)表达单元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2与野生型表达单元的序列对应。
本发明还涉及这样的表达单元，其包含通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列。
用于本发明表达单元的本发明其它天然实例能够自基因组序列已知的多种生物通过同一性比较来自数据库的核酸序列与如上所述序列SEQ.ID.NO.2轻易地找到。
表达单元的本发明人工序列可自序列SEQ.ID.NO.2开始通过人工变异和突变轻易地找到，例如通过替换、插入或缺失核苷酸。
具有与序列SEQ.ID.NO.2至少90％同一性的核酸序列因此意指与序列SEQ.ID.NO.2比较后，特别是根据具有以上参数设置的以上程序性算法比较后显示至少90％同一性的核酸序列。
特别优选的表达单元显示与核酸序列SEQ.ID.NO.2的91％，优选地92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，特别优选地99％同一性。
表达单元的其它天然实例能够从基因组序列未知的多种生物自以上所述的核酸序列、特别是自序列SEQ.ID.NO.2开始通过杂交技术以本身已知的方式更轻易地找到。
因此，本发明又一方面涉及表达单元，其包含严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列。该核酸序列包含至少10个、更优选地多于12个、15个、30个、50个或特别优选地多于150个核苷酸。
“杂交”意指严格条件下多核苷酸或寡核苷酸与基本互补的序列结合的能力，同时在这些条件下不出现非互补性对象间的非特异性结合。为此，序列应该优选地具有90-100％互补性。例如将互补序列能够与另一个互补性序列特异性结合的特性用于DNA或RNA印迹技术或者用于PCR或RT-PCR的引物结合。
根据本发明，杂交在严格条件下发生。此类杂交条件在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.的Molecular Cloning(A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第9.31-9.57页中或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
严格杂交条件特别意指：
在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt杂交溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性和剪切的鲑精DNA组成的溶液中在42℃温育过夜，随后在65℃以0.1×SSC洗涤滤膜。
本发明的核苷酸序列还可能产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物。这类探针和引物通常包含这样的核苷酸序列的区域，其在严格条件下杂交至本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少大约12个、优选地至少大约25个连续核苷酸，例如大约40、50或75个连续核苷酸。
根据本发明还包含了含有所谓的沉默突变或与具体提到的序列比较根据特定来源或宿主生物的密码子使用得到修饰的核酸序列以及天然存在的变体，例如其剪接变体或等位基因变体。
“功能等同的片段”对表达单元意指具有基本相同于或高于初始序列的特异表达活性的片段。
“基本相同的”意指表现初始序列特异表达活性至少50％、优选地60％、更优选地70％、更优选地80％、更优选地90％、特别优选地95％的特异表达活性。
“片段”意指由实施方案E)、F)或G)所描述的表达单元的部分序列。这些片段优选地具有核酸序列SEQ.ID.NO.2的多于10个，但更优选地多于12个、15个、30个、50个或特别优选地多于150个连接的核苷酸。
特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作为表达单元，即用于表达基因。
本发明还涉及本发明的新表达单元。
本发明特别地涉及这样的表达单元，其包含具有启动子活性的本发明核酸和额外地功能性连接的确保翻译核糖核酸的核酸序列。
本发明特别优选地涉及表达单元，其包含
E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或
F)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或
G)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或
H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段，条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本发明的表达单元包含一个或多个如下遗传元件：负10(“-10”)序列；负35(“-35”)序列；转录序列开始、增强子区；和操纵基因区。
这些遗传元件优选地对棒状菌的种呈特异性，尤其对谷氨酸棒杆菌是特异的。
以上提及的全部表达单元还可以自核苷酸结构单元以本身已知的方式通过化学合成制备，例如通过双螺旋的各个重叠性互补的核酸结构单元的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可以例如通过亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York第896-897页)以已知方式进行。添加合成性寡核苷酸并使用DNA聚合酶Klenow片段填补缺口及连接反应以及常用的克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述。
本专利中用于本发明的方法和技术对受过微生物学技术和重组DNA技术训练的技术人员为已知。此类技术和方法的实例是用于生长细菌细胞、将分离的DNA分子插入宿主细胞、以及分离、克隆和测序分离的核酸分子等的方法和技术。这些方法描述于如下众多标准文献来源中：Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in BacterialGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1992)；M.Singer和P.Berg，Genes&Genomes，University ScienceBooks，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biologyand Medicine，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，编者B.R.Glick和J.E.Thompson，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)和P.F.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本发明的全部核酸分子优选地为分离的核酸分子形式。“分离的”核酸分子与该核酸存在的天然来源中的其它核酸分子分离，并且若该分子通过重组技术制备，还可以基本不含其他细胞性物质或培养基，或者若该分子通过化学方式合成，还可以基本不含化学前体或其它化学品。
本发明还包含与已经具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其部分。
本发明的启动子和/或表达单元特别有利地可例如用于通过如下所述的发酵制备生物合成产物的改进的方法中。
本发明的启动子和/或表达单元特别具有的优势是在微生物中它们通过应激诱导。有可能通过合适地控制发酵过程以便为提高所需基因的转录率/表达率特异性地控制这种应激诱导。特别在产生L-赖氨酸时，这种应激期很早地达到以至此时可以很早地实现所需基因的提高的基因转录率/表达率。
具有启动子活性的本发明核酸可用于改变即提高或降低，或者用于引发与野生型比较微生物中基因的转录率。
本发明的表达单元可用于改变即提高或降低，或者用于引发与野生型比较微生物中基因的表达率。
具有启动子活性的本发明核酸和本发明的表达单元还能起到调节和增强微生物尤其棒杆菌属诸种中多种生物合成产物如精细化学品、蛋白质、尤其氨基酸产生的作用。
本发明因此涉及通过如下方式改变或引发与野生型比较微生物中基因的转录率的方法：
a)改变与野生型比较微生物中具有启动子活性的本发明内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节内源性基因的转录，或
b)通过具有启动子活性的本发明核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
根据实施方案a)，改变或引发与野生型比较微生物中基因的转录率可通过改变即提高或降低微生物中特异启动子活性进行。这可以通过将具有启动子活性的本发明核酸序列定向突变即通过定向替换、缺失或插入核苷酸进行。提高或降低的启动子活性通过替换RNA聚合酶全酶结合位点(也即技术人员所知的-10区和-35区)内的核苷酸实现。此外，还通过缺失核苷酸或插入核苷酸缩减或扩大所述RNA聚合酶全酶结合位点彼此间的距离而实现。此外还通过将用于调节蛋白(也即技术人员所知的阻抑蛋白和激活蛋白)的结合位点(也即技术人员所知的操纵基因)在接近RNA聚合酶全酶结合位点的空间安置，以至这些调节蛋白与启动子序列结合后减弱或增强RNA聚合酶全酶的结合活性和转录活性，或将此酶置于新调节性影响下。
相对于“特异启动子活性”，与野生型比较提高或降低意指特异活性与本发明具有启动子活性的野生型核酸比较，即例如与SEQ.ID.NO.1比较提高或降低。
根据实施方案b)，改变或引发与野生型比较微生物中基因的转录率可通过具有启动子活性的本发明核酸或通过实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录而进行，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
这优选地由如下方式实现：
b1)将一个或多个具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸控制下进行，或
b2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明内源性核酸控制下进行，或
b3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸，和功能性连接的一个或多个待转录核酸。
因此还有可能通过如下方式改变，即提高或降低野生型内源性基因的转录率：
根据实施方案b1)，将一个或多个具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
根据实施方案b2)，将一个或多个内源性基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入内源性基因的转录在具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明内源性核酸控制下进行，或
根据实施方案b3)，将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸，和功能性连接的一个或多个待转录的内源性核酸。
还有可能通过如下方式引发与野生型比较外源性基因的转录率：
根据实施方案b2)，将一个或多个外源性基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入外源性基因的转录在具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明内源性核酸控制下进行，或
根据实施方案b3)，将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的本发明核酸，和功能性连接的一个或多个待转录外源性核酸。
根据实施方案b2)的基因插入还可以通过将基因整合至编码区或非编码区进行。插入优选地在非编码区内进行。
根据实施方案b3)的核酸插入还可以以染色体或染色体外方式进行。核酸构建体优选地进行染色体性插入。染色体性整合是指外源DNA片段插入宿主细胞的染色体。此术语还用于外源DNA片段和宿主细胞染色体相应区域间的同源重组。
在实施方案b)中，还优选地使用根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的本发明核酸。在实施方案b)中，如实施方案a)所述，这些核酸可以在微生物中存在或产生，或以分离的形式导入微生物。
“内源性”意指野生型基因组内已经存在的遗传信息，例如基因。
“外源性”意指野生型基因组内不存在的遗传信息，例如基因。
对于通过具有启动子活性的本发明核酸对转录的调节而言，术语“基因”优选地意指包含待转录的区域，即例如调节翻译的区域，和编码区以及根据需要其它调节元件例如终止子的核酸。
对于此后所描述通过本发明的表达单元对表达的调节而言，术语“基因”优选地意指包含编码区和根据需要其它调节元件例如终止子的核酸。
“编码区”意指编码蛋白质的核酸序列。
对于基因和具有启动子活性的核酸而言，“异源性”意指在具有启动子活性的本发明核酸调节下所用的基因在野生型中不转录，但是产生野生型中不存在的新功能性联系，并且具有启动子活性的本发明核酸和特异性基因的功能性组合在野生型中不存在。
对于基因和表达单元而言，“异源性”意指在本发明的表达单元调节下所用的基因在野生型中不表达，但是产生在野生型中不存在的新功能性联系，并且本发明表达单元和特异性基因的功能性组合在野生型中不存在。
本发明在一个优选的实施方案中还涉及通过如下方式用于提高或引发与野生型比较微生物中基因的转录率的方法：
ah)提高与野生型比较微生物中具有启动子活性的本发明内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节内源性基因的转录，或
bh)通过具有启动子活性的本发明核酸或通过根据实施方案a)的具有提高的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
通过具有启动子活性的本发明核酸或通过根据实施方案ah)的具有提高的特异启动子活性的本发明核酸调节微生物中基因的转录优选地由如下方式实现：
bh1)将一个或多个具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的本发明核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的本发明核酸控制下进行，或
bh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的本发明内源性核酸控制下进行，或
bh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的本发明核酸，和功能性连接的一个或多个待转录核酸。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及通过如下方式用于降低与野生型比较微生物中基因的转录率的方法：
ar)降低与野生型比较微生物中具有启动子活性的本发明内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节内源性基因的转录，或
br)将根据实施方案a)的具有降低的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组，以至内源性基因的转录在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行。
本发明还涉及通过如下方式用于改变或引发与野生型比较微生物中基因的表达率的方法：
c)改变与野生型比较微生物中本发明内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
d)通过本发明的表达单元或通过根据实施方案c)的具有改变的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
根据实施方案c)，改变或引发与野生型比较微生物中基因的表达率可通过改变，即提高或降低微生物中的特异表达活性进行。这可以通过将具有启动子活性的本发明核酸序列定向突变，即通过定向替换、缺失或插入核苷酸进行。例如扩大SD序列和翻译起始密码子间的距离通常导致特异表达活性的改变、减弱或增强。特异表达活性的改变还可以通过缺失或插入核苷酸缩短或扩展SD区(核糖体结合位点)序列离翻译起始密码子的距离实现。此外还通过如此方式改变SD区的序列以至对互补性3’侧16SrRNA的同源性增强或减弱。
对“特异表达活性”而言，与野生型比较提高或降低意指与野生型的本发明表达单元比较即例如与SEQ.ID.NO.2比较特异活性的提高或降低。
根据实施方案d)，改变或引发与野生型比较微生物中基因的表达率可通过本发明的表达单元或通过根据实施方案c)的具有改变的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中基因的表达而进行，其中所述基因相对于表达单元为异源。
这优选地由如下方式实现：
d1)将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的表达单元控制下进行，或
d2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有改变的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
因此有可能通过如下方式改变即提高或降低野生型内源性基因的表达率：
根据实施方案d1)，将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的表达单元控制下进行，或
根据实施方案d2)，将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
根据实施方案d3)，将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有改变的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
还有可能通过如下方式引发与野生型比较外源性基因的表达率：
根据实施方案d2)，将一个或多个外源性基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
根据实施方案d3)，将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有改变的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的外源性核酸。
根据实施方案d2)的基因插入还可以通过将基因整合至编码区或非编码区进行。插入优选地在非编码区内进行。
根据实施方案d3)的核酸插入还可以以染色体或染色体外方式进行。核酸构建体优选地进行染色体性插入。
核酸构建体此后也称作表达盒。
在实施方案d)中，还优选使用根据实施方案c)的具有改变的特异表达活性的本发明表达单元。在实施方案d)中，如实施方案d)中所述，这些表达单元可以在微生物中存在或产生，或以分离的形式导入微生物。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及用于通过如下方式提高或引发与野生型比较微生物中基因的表达率的方法：
ch)提高与野生型比较微生物中本发明内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dh)通过本发明的表达单元或通过根据实施方案c)的具有提高的特异表达活性的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
通过本发明的表达单元或通过根据实施方案c)的具有提高的特异表达活性的表达单元调节微生物中基因的表达优选地由如下方式实现：
dh1)将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在所导入的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及用于通过如下方式降低与野生型比较微生物中基因的表达率的方法：
cr)降低与野生型比较微生物中本发明内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dr)将根据实施方案cr)的具有降低的特异表达活性的表达单元导入微生物基因组，以至内源性基因的表达在所导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行。
在如上所述用于改变或引发微生物中基因的转录率和/或表达率的本发明方法的一个优选实施方案中，基因选自编码来源于精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸，其中基因根据需要可以含有进一步的调节元件。
在如上所述用于改变或引发微生物中基因的转录率和/或表达率的本发明方法的一个特别优选的实施方案中，基因选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中基因根据需要可以含有其它调节元件。
在一个特别优选的实施方案中，来自氨基酸生物合成途径中的蛋白质选自：天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节蛋白LuxR、转录调节蛋白LysR1、转录调节蛋白LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸输出蛋白载体蛋白、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出蛋白、生物素连接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和亚基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节蛋白、RXN2910调节蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸外排蛋白(effluxprotein)、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
如上所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质中优选的蛋白质和编码这些蛋白质的核酸分别是微生物来源的蛋白质序列和核酸序列，优选来自棒杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)细菌，优选地来自棒状细菌，特别优选地来自谷氨酸棒杆菌。
来自氨基酸生物合成途径的特别优选的蛋白质序列和编码这些蛋白质的相应核酸序列的实例、涉及其的参考文献及其在参考文献中的编号在表1列出：
蛋白质 编码蛋白质的核酸 参考文献 参考文献中的SEQ.ID.NO.
天冬氨酸激酶 ask或lysC EP1108790 DNA：281蛋白质：3781
天冬氨酸-半醛脱氢酶 asd EP1108790 DNA：331蛋白质：3831
二氢吡啶二羧酸合成酶 dapA WO0100843 DNA：55蛋白质：56
二氢吡啶二羧酸还原酶 dapB WO0100843 DNA：35蛋白质：36
内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶 ddh EP1108790 DNA：3494蛋白质：6944
二氨基吡啶羧酸脱羧酶 lysA EP1108790 DNA：3451Prot.：6951
赖氨酸输出蛋白 lysE EP1108790 DNA：3455Prot.：6955
精氨酰-tRNA合成酶 argS EP1108790 DNA：3450Prot.：6950
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 zwf WO0100844 DNA：243Prot.：244
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 gap WO0100844 DNA：187Prot.：188
3-磷酸甘油酸激酶 pgk WO0100844 DNA：69Prot.：70
丙酮酸羧化酶 pycA EP1108790 DNA：765
蛋白质 编码蛋白质的核酸 参考文献 参考文献中的SEQ.ID.NO.
Prot.：4265
磷酸丙糖异构酶 tpi WO0100844 DNA：61Prot.：62
生物素连接酶 birA EP1108790 DNA：786Prot.：4286
PEP羧化酶 pck EP1108790 DNA：3470Prot.：6970
高丝氨酸激酶 thrB WO0100843 DNA：173Prot.：174
苏氨酸合成酶 thrC WO0100843 DNA：175Prot.：176
苏氨酸输出载体蛋白 thrE WO0251231 DNA：41Prot.：42
苏氨酸外排蛋白 RXA2390 WO0100843 DNA：7Prot.：8
苏氨酸脱水酶 ilvA EP1108790 DNA：2328Prot.：5828
高丝氨酸O-乙酰转移酶 metA EP1108790 DNA：727Prot：4227
胱硫醚γ-合成酶 metB EP1108790 DNA：3491Prot：6991
胱硫醚β-裂合酶 metC EP1108790 DNA：2535Prot：6035
依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶，- metH EP1108790 DNA：1663Prot：5163
O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶 metY EP1108790 DNA：726Prot：4226
亚甲基四氢叶酸还原酶 metF EP1108790 DNA：2379Prot：5879
D-3-磷酸甘油酸脱氢酶 serA EP1108790 DNA：1415Prot：4915
磷酸丝氨酸磷酸酶1 serB WO0100843 DNA：153
蛋白质 编码蛋白质的核酸 参考文献 参考文献中的SEQ.ID.NO.
 Prot.：154
磷酸丝氨酸磷酸酶2 serB  EP 1108790  DNA：467Prot：3967
磷酸丝氨酸磷酸酶3 serB  EP 1108790  DNA：334Prot.：3834
磷酸丝氨酸氨基转移酶 serC  WO 0100843  DNA：151Prot.：152
丝氨酸乙酰转移酶 cvsE  WO 0100843  DNA：243Prot.：244
半胱氨酸合成酶I cvsK  EP 1108790  DNA：2817Prot.：6317
半胱氨酸合成酶II CvsM  EP 1108790  DNA：2338Prot.：5838
高丝氨酸脱氢酶 hom  EP 1108790  DNA：3452Prot.：6952
不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶 metE  WO 0100843  DNA：755Prot.：756
丝氨酸羟甲基转移酶 glyA  WO 0100843  DNA：143Prot.：144
硫酸盐还原作用中的蛋白质 RXA247  EP 1108790  DNA：3089Prot.：6589
硫酸盐还原作用中的蛋白质 RXA248  EP 1108790  DNA：3090Prot.：6590
硫酸腺苷酰转移酶亚基1 CvsN  EP 1108790  DNA：3092Prot.：6592
硫酸腺苷酰转移酶亚基2 CvsD  EP 1108790  DNA：3093Prot.：6593
磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶 CvsH  WO 02729029  DNA：7Prot.：8
铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶 RXA073  WO 0100842  DNA：329Prot.：330
铁氧还蛋白NADP-还原酶 RXA076  WO 0100843  DNA：79
蛋白质 编码蛋白质的核酸 参考文献 参考文献中的SEQ.ID.NO.
Prot.：80
转录调节蛋白LuxR luxR WO0100842 DNA：297蛋白质：298
转录调节蛋白LysR1 lysR1 EP1108790 DNA：676蛋白质：4176
转录调节蛋白LysR2 lysR2 EP1108790 DNA：3228蛋白质：6728
转录调节蛋白LysR3 lysR3 EP1108790 DNA：2200蛋白质：5700
苹果酸-醌氧化还原酶 mqo WO0100844 DNA：569蛋白质：570
转酮酶 RXA2739 EP1108790 DNA：1740Prot：5240
转醛酶 RXA2738 WO0100844 DNA：245Prot：246
OPCA opcA WO0100804 DNA：79Prot：80
1-磷酸果糖激酶1 pfk1 WO0100844 DNA：55蛋白质：56
1-磷酸果糖激酶2 pfk2 WO0100844 DNA：57蛋白质：58
6-磷酸果糖激酶1 6-pfk1 EP1108790 DNA：1383蛋白质：4883
6-磷酸果糖激酶2 6-pfk2 DE10112992 DNA：1蛋白质：2
果糖-1，6-二磷酸酶1 fbr1 EP1108790 DNA：1136蛋白质：4636
丙酮酸氧化酶 poxB WO0100844 DNA：85蛋白质：86
RXA00655调节蛋白 RXA655 US2003162267.2 DNA：1Prot.：2
RXN02910调节蛋白 RXN2910 US2003162267.2 DNA：5
蛋白质 编码蛋白质的核酸 参考文献 参考文献中的SEQ.ID.NO.
Prot.：6
6-磷酸葡萄糖内酯酶 RXA2735 WO0100844 DNA：1Prot.：2
来自氨基酸生物合成途径中特别优选的蛋白质序列和编码该蛋白质的相应核酸序列的又一实例是又称作fbr2的果糖-1，6-二磷酸酶2的序列(SEQ.ID.NO.15)以及编码果糖-1，6-二磷酸酶2的相应核酸序列(SEQ.ID.NO.14)。
来自氨基酸生物合成途径中特别优选的蛋白质序列和编码该蛋白质的相应核酸序列的又一实例是在硫酸盐还原作用中也称作RXA077的蛋白质(SEQ.ID.NO.17)以及编码硫酸盐还原作用中该蛋白质的相应核酸序列(SEQ.ID.NO.16)。
来自氨基酸生物合成途径中其它特别优选的蛋白质序列任何情况下中具有表1中对该蛋白质所示的氨基酸序列，其中相应蛋白质在表2/列2对该氨基酸序列所指示氨基酸位置中的至少一个氨基酸位置中具有与表2/列3相同行中所示相应氨基酸不同的一个蛋白原性氨基酸。在另一个优选的实施方案中，蛋白质在表2/列2对该氨基酸序列所指示氨基酸位置中的至少一个氨基酸位置中具有如表2/列4相同行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白质是氨基酸生物合成途径中突变的蛋白质，具有有利的特性并且因此特别适用于通过本发明的启动子表达相应核酸并适用于产生氨基酸。例如突变T311I导致对ask的反馈抑制的关闭。
可通过常规方法制备编码如上所述来自表2的突变蛋白质的相应核酸。
制备编码突变蛋白质的核酸序列的合适起点是例如可自美国典型培养物保藏中心在编号ATCC13032下得到的谷氨酸棒杆菌菌株的基因组，或表1中所引用的核酸序列。为使突变蛋白质的氨基酸序列逆向翻译为编码这些蛋白质的核酸序列，有利地使用欲向其中导入核酸序列或其中存在该核酸序列的生物的密码子使用。例如，对于谷氨酸棒杆菌，使用谷氨酸棒杆菌密码子使用是有利的。特定生物的密码子使用可以自描述源于目的生物的至少一个蛋白质和一个编码该蛋白质的基因的数据库或专利申请以本身已知的方式确定。
表2中的信息应当以如下方式理解：
在1列“身份”中，显示相对于表1中每种序列的清晰命名。
在列2“氨基酸位置”中，相应的编号指来自表1的对应多肽序列的氨基酸位置。因此“氨基酸位置”列中“26”意指相应所示多肽序列的氨基酸位置26。位置的编号自氨基末端+1开始。
在列3 “氨基酸野生型”中，相应字母指来自表1序列的对应野生型株中列2所示位置处的氨基酸-由单字母编码代表。
在列4“氨基酸突变”中，相应字母指对应突变株中列2所示的位置处的氨基酸-由单字母编码代表。
在列5 “功能”中，显示相应多肽序列的生理功能。
对于具有特定功能(列5)和特定初始氨基酸序列(表1)的突变蛋白质，列2、3和4描述至少一个突变，并且对于某些序列描述多种突变。这类多种突变总是指以上每一情况下(表1)最接近的初始氨基酸序列。术语特定氨基酸序列“氨基酸位置中的至少一个氨基酸位置”优选地意指对列2、3和4中该氨基酸序列所描述突变的至少一个突变。
蛋白原性氨基酸的单字母编码：
A丙氨酸
C半胱氨酸
D天冬氨酸
E谷氨酸
F苯丙氨酸
G甘氨酸
H组氨酸
I异亮氨酸
K赖氨酸
L亮氨酸
M甲硫氨酸
N天冬酰胺
P脯氨酸
Q谷氨酰胺
R精氨酸
S丝氨酸
T苏氨酸
V缬氨酸
W色氨酸
Y酪氨酸
表2
列1 列2 列3 列4 列5
身份 氨基酸位置 氨基酸野生型 氨基酸突变 功能
ask 317 S A 天冬氨酸激酶
311 T I
279 A T
asd 66 D G 天冬氨酸-半醛脱氢酶
234 R H
272 D E
285 K E
20 L F
dapA 2 S A 二氢吡啶二羧酸合成酶
84 K N
85 L V
dapB 91 D A 二氢吡啶二羧酸还原酶
83 D N
ddh 174 D E 内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶
235 F L
列1 列2 列3 列4 列5
237 S A
lysA 265 A D 二氨基吡啶羧酸脱羧酶
320 D N
332 I V
argS 355 G D 精氨酰-tRNA合成酶
156 A S
513 V A
540 H R
zwf 8 S T 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
150 T A
321 G S
gap 264 G S 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
pycA 7 S L 丙酮酸羧化酶
153 E D
182 A S
206 A S
227 H R
455 A G
458 P S
639 S T
1008 R H
1059 S P
1120 D E
pck 162 H Y PEP羧化酶
241 G D
829 T R
thrB 103 S A 高丝氨酸激酶
190 T A
133 A V
138 P S
thrC 69 G R 苏氨酸合成酶
478 T I
RXA330 85 I M 苏氨酸外排蛋白
 列1  列2  列3  列4  列5
 161  F  I
 195  G  D
 hom  104  V  I  高丝氨酸脱氢酶
 116  T  I
 148  G  A
 59  V  A
 270  T  S
 345  R  P
 268  K  N
 61  D  H
 72  E  Q
 lysR1  80  R  H  转录调节蛋白LysR1
 lysR3  142  R  W  转录调节蛋白LysR3
 179  A  T
 RXA2739  75  N  D  转酮酶
 329  A  T
 332  A  T
 556  V  I
 RXA2738  242  K  M  转醛酶
 opcA  107  Y  H  OpcA
 219  K  N
 233  P  S
 261  Y  H
 312  S  F
 65  G  R  天冬氨酸-1-脱羧酶
 33  G  S  6-磷酸葡萄糖内酯酶
在以上所述用于改变或引发微生物中基因的转录率和/或表达率的本发明方法，和此后描述用于产生基因修饰微生物、此后所述的基因修饰微生物，以及此后所述用于产生生物合成产物的方法中，将具有启动子活性的本发明核酸、本发明的表达单元、以上所述的基因和以上所述的核酸构建体或表达盒导入微生物，尤其棒状细菌优选地通过SacB方法进行。
SacB方法对技术人员为已知并且例如在S ch_fer A，Tauch A，J_gerW，Kalinowski J，Thierbach G，Pühler A.；Small mobilizablemulti-purpose cloning Vectors derived from the Escherichia coli PlasmidspK18 and pK19：selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutamicum，Gene.1994 Jul 22；145(1)：69-73和BlomfieldIC，Vaughn V，Rest RF，Eisenstein BI.；Allelic exchange in Escherichia coliusing the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101replicon；Mol Microbiol.1991 Jun；5(6)：1447-57中描述。
在以上所述本发明方法的一个优选实施方案中，改变或引发微生物中基因的转录率和/或表达率通过将具有启动子活性的本发明核酸或本发明的表达单元导入微生物进行。
在以上所述本发明方法的另一个优选实施方案中，改变或引发微生物中基因的转录率和/或表达率通过将将以上所述的核酸构建体或表达盒导入微生物进行。
本发明因此也涉及表达盒，其包含
至少一个本发明的表达单元
至少一个其它待表达的核酸序列，即待表达的基因
和
根据需要其它遗传控制元件，例如终止子，
其中至少一个表达单元和待表达的其它核酸序列功能性地连接在一起，并且待表达的其它核酸序列相对于所述表达单元为异源。
待表达的核酸序列优选地是编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的至少一个核酸。
待表达的核酸序列特别优选地选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸。
来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质如上所述并且它们的实例在表1和表2中描述。
如此选择本发明表达盒中表达单元与待表达基因的相对物理位置以便所述表达单元调节待表达基因的转录并优选地调节其翻译，因此能够产生一个或多个蛋白质。在本上下文中，“能够产生”包含产生的组成性增加、在特异性条件下产生的减弱或阻抑和/或在特异性条件下提高产生。在本上下文中，“条件”包含：(1)将成分添加至培养基、(2)自培养基中移出成分、(3)将培养基中的一种成分替换为第二种成分、(4)提高培养基温度、(5)降低培养基温度和(6)调节空气条件，例如在保持培养基的氧浓度或氮浓度。
本发明还涉及包含以上所述的本发明表达盒的表达载体。
载体对于技术人员为众所周知并且例如可以在“Cloning Vectors”(编者Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)找到。此外，载体意指技术人员所知的全部其它载体，如噬菌体、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒、以及线形DNA或环形DNA。这些载体可以在宿主生物中进行自主性复制或染色体性复制。
合适的和特别优选的质粒是在棒状细菌中复制的那些质粒。众多已知的质粒载体如pZ1(Menkel等，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns等，Gene 102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene 107：69-74(1991))是以隐蔽性质粒(crypticplasmid)pHM1519、pBL1或pGA1为基础。其它质粒载体例如pCLiK5MCS或者基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的那些载体质粒可以以同样方式使用。
同样适合的是这样的质粒载体，借助这些质粒载体，通过整合至染色体扩增基因的方法可例如Remscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))所述用于复制和扩增hom-thrB操纵子。在此方法中，将完整基因克隆至能够在宿主(通常是大肠杆菌)中复制而不能在谷氨酸棒杆菌中复制的载体。合适载体的实例是pSUP301(Sirnon等，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Sch_fer等，Gene 145，69-73(1994))，Bernard等，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等1991，Journal of Bacteriology 173：4510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，Gene 41：337-342)。随后通过转化将包含待扩增基因的质粒载体转移至目的谷氨酸棒杆菌菌株。用于转化的方法在例如Thierbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述。
本发明还涉及基因修饰微生物，在其中遗传修饰导致与野生型比较改变或引发至少一个基因的转录率的并且取决于
a)改变微生物中至少一个根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节至少一个内源性基因的转录，或
b)通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
如以上对方法所述，通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录由如下方式实现：
b1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
b2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
b3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸，和功能性连接的一个或多个待转录核酸。
本发明还涉及具有至少一个基因与野生型比较升高或引发的转录率的基因修饰微生物，其中
ah)提高与野生型比较微生物中根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，其中所述核酸调节内源性基因的表达，或
bh)微生物中基因的转录通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案ah)的具有提高的特异启动子活性的核酸调节，其中基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
如以上对方法所述，通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有提高的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录由如下方式实现：
bh1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
bh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
bh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸，和功能性连接的一个或多个待转录核酸。
本发明还涉及具有至少一个基因与野生型比较降低的转录率的基因修饰微生物，其中
ar)降低与野生型比较微生物中至少一个根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节至少一个内源性基因的转录，或
br)将一个或多个根据实施方案a)的具有降低的启动子活性的核酸导入微生物基因组，以至至少一个内源性基因的转录在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行。
本发明还涉及基因修饰微生物，在其中遗传修饰导致与野生型比较改变或引发至少一个基因的表达率，并且取决于
c)改变与野生型比较微生物中至少一个根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，其中内源性表达单元调节至少一个内源性基因的表达，或
d)通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达，其中基因相对于表达单元为异源。
如以上对方法所述，通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由如下方式实现：
d1)将一个或多个根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
本发明还涉及具有至少一个基因与野生型比较提高或引发的表达率的基因修饰微生物，其中
ch)提高与野生型比较微生物中至少一个根据权利要求2或3所述的内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dh)微生物中基因的表达通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的权利要求2或3的表达单元调节，其中基因相对于表达单元为异源。
如以上对方法所述，通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由如下方式实现：
dh1)将一个或多个根据权利要求2或3的表达单元导入微生物基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在所导入的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
本发明还涉及具有至少一个基因与野生型比较降低的表达率的基因修饰微生物，其中
cr)降低与野生型比较微生物中至少一个根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节至少一个内源性基因的表达，或
dr)将一个或多个具有降低的表达活性的根据权利要求2或3的表达单元导入微生物以至至少一个内源性基因的表达在所导入具有降低的表达活性的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行。
本发明还涉及其中包含根据权利要求2或3的表达单元和功能性连接的待表达基因的基因修饰微生物，其中所述基因相对于表达单元为异源。
基因修饰微生物特别优选地包含本发明的表达盒。
本发明特别优选地涉及包含载体，特别包含穿梭载体或质粒载体的基因修饰微生物，特别是棒状细菌，其中所述载体携带至少一个根据本发明所定义的重组核酸构建体。
在基因修饰微生物的一个优选的实施方案中，以上所述的基因是至少一个编码来自化学品生物合成途径的蛋白质的核酸。
在基因修饰微生物的一个特别优选实施方案中，以上所述的基因是选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中基因可以根据需要含有其它调节元件。
来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质选自：天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节蛋白LuxR、转录调节蛋白LysR1、转录调节蛋白LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸输出蛋白载体蛋白质、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出蛋白、生物素连接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节蛋白、RXN2910调节蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸外排蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶.
来自氨基酸生物合成途径的蛋白质和基因的特别优选的实例在表1和表2描述。
优选的微生物或基因修饰微生物是细菌、藻类、真菌或酵母。
特别优选的微生物尤其是棒状细菌。
优选的棒状细菌是棒杆菌属的细菌，特别是以下种：谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebaterium melassecola)和Corynebacterium efficiens的细菌，或是短杆菌属的细菌，特别黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)。
棒杆菌属和短杆菌属的特别优选的细菌选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、热产氨棒杆菌FERM BP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、Corynebacterium efficiensDSM 44547、Corynebacterium efficiensDSM44548、Corynebacterium efficiensDSM 44549、黄色短杆菌ATCC14067、乳发酵短杆菌ATCC13869、叉开短杆菌ATCC14020、谷氨酸棒杆菌KFCC10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608。
缩写KFCC指韩国典型培养物保藏中心，缩写ATCC指美国典型培养物保藏中心，缩写DSM指德意志微生物保藏中心。
棒杆菌属和短杆菌属中的其它特别优选细菌列于表3：
细菌 保藏号
属 种 ATCC FERM NRRL CECT NCIMB CBS NCTC DSMZ
短杆菌属 产氨短杆菌(B.ammoniagenes) 21054
短杆菌属 产氨短杆菌 19350
短杆菌属 产氨短杆菌 19351
短杆菌属 产氨短杆菌 19352
短杆菌属 产氨短杆菌 19353
短杆菌属 产氨短杆菌 19354
短杆菌属 产氨短杆菌 19355
短杆菌属 产氨短杆菌 19356
短杆菌属 产氨短杆菌 21055
短杆菌属 产氨短杆菌 21077
短杆菌属 产氨短杆菌 21553
短杆菌属 产氨短杆菌 21580
短杆菌属 产氨短杆菌 39101
短杆菌属 butanicum 21196
短杆菌属 叉开短杆菌 21792 P928
短杆菌属 黄色短杆菌 21474
短杆菌属 黄色短杆菌 21129
短杆菌属 黄色短杆菌 21518
短杆菌属 黄色短杆菌 B11474
短杆菌属 黄色短杆菌 B11472
短杆菌属 黄色短杆菌 21127
短杆菌属 黄色短杆菌 21128
短杆菌属 黄色短杆菌 21427
短杆菌属 黄色短杆菌 21475
短杆菌属 黄色短杆菌 21517
短杆菌属 黄色短杆菌 21528
短杆菌属 黄色短杆菌 21529
短杆菌属 黄色短杆菌 B11477
短杆菌属 黄色短杆菌 B11478
短杆菌属 黄色短杆菌 21127
短杆菌属 黄色短杆菌 B11474
短杆菌属 希氏短杆菌(B.healii) 15527
短杆菌属 ketoglutamicum 21004
短杆菌属 ketoglutamicum 21089
短杆菌属 ketosoreductum 21914
短杆菌属 乳发酵短杆菌 70
短杆菌属 乳发酵短杆菌 74
短杆菌属 乳发酵短杆菌 77
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21798
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21799
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21800
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21801
短杆菌属 乳发酵短杆菌 B11470
短杆菌属 乳发酵短杆菌 B11471
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21086
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21420
短杆菌属 乳发酵短杆菌 21086
短杆菌属 乳发酵短杆菌 31269
短杆菌属 扩展短杆菌(B.Linens) 9174
短杆菌属 扩展短杆菌 19391
短杆菌属 扩展短杆菌 8377
短杆菌属 解石蜡短杆菌(B.paraffinolyticum) 11160
短杆菌属 种 717.73
短杆菌属 种 717.73
短杆菌属 种 14604
短杆菌属 种 21860
短杆菌属 种 21864
短杆菌属 种 21865
短杆菌属 种 21866
短杆菌属 种 19240
棒杆菌属 嗜乙酰乙酸棒杆菌 21476
棒杆菌属 嗜乙酰乙酸棒杆菌 13870
棒杆菌属 乙酰谷氨酸棒杆菌 B11473
棒杆菌属 乙酰谷氨酸棒杆菌 B11475
棒杆菌属 乙酰谷氨酸棒杆菌 15806
棒杆菌属 乙酰谷氨酸棒杆菌 21491
棒杆菌属 乙酰谷氨酸棒杆菌 31270
棒杆菌属 嗜乙酸棒状杆菌 B3671
棒杆菌属 产氨棒状杆菌 6872 2399
棒杆菌属 产氨棒状杆菌 15511
棒杆菌属 fujiokense 21496
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 14067
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 39137
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21254
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21255
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 31830
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13032
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 14305
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 15455
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13058
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13059
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13060
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21492
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21513
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21526
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21543
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13287
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21851
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21253
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21514
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21516
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21299
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21300
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 39684
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21488
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21649
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21650
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19223
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13869
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21157
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21158
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21159
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21355
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 31808
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21674
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21562
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21563
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21564
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21565
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21566
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21567
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21568
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21569
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21570
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21571
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21572
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21573
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21579
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19049
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19050
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19051
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19052
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19053
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19054
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19055
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19056
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19057
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19058
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19059
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19060
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 19185
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 13286
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21515
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21527
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21544
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21492
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B8183
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B8182
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B12416
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B12417
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B12418
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 B11476
棒杆菌属 谷氨酸棒杆菌 21608
棒杆菌属 百合棒状杆菌(C.Lilium) P973
棒杆菌属 nitrilophilus 21419 11594
棒杆菌属 种 P4445
棒杆菌属 种 P4446
棒杆菌属 种 31088
棒杆菌属 种 31089
棒杆菌属 种 31090
棒杆菌属 种 31090
棒杆菌属 种 31090
棒杆菌属 种 15954 20145
棒杆菌属 种 21857
棒杆菌属 种 21862
棒杆菌属 种 21863
缩写含义如下：
ATCC：美国马里兰州洛克维尔美国典型培养物保藏中心
FERM：日本千叶发酵研究所
NRRL：美国伊利诺伊州皮若亚美国北方农业研究所培养物保藏中心
CECT：西班牙瓦伦西亚普通微生物保藏中心
NCIMB：英国阿伯丁国家工业和海洋细菌保藏中心
CBS：荷兰巴恩真菌保藏所
NCTC：英国伦敦国家典型培养物保藏中心
DSMZ：德国不伦瑞克德意志微生物保藏中心
通过具有启动子活性的本发明核酸和本发明的表达单元，借助以上所述本发明的方法有可能将本发明基因修饰微生物的以上所述代谢途径调节为朝向特定的生物合成产物。
为此目的，例如导致特定生物合成产物的代谢途径通过引发或提高此生物合成途径的基因转录率或表达率而增强，所述生物合成途径中蛋白质提高的量导致所需的生物合成途径的这些蛋白质提高的总活性，因此导致朝向所需生物合成产物的增强的代谢流量。
此外，自特定生物合成产物分流的代谢途径可通过降低这种分流性生物合成途径的基因转录率减弱，该分流性生物合成途径中蛋白质降低的量导致不想要的生物合成途径中这些蛋白质降低的总活性，因此额外导致朝向所需生物合成产物的增强的代谢流量。
本发明的基因修饰微生物能够产生例如来自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或来自甘油和乙醇的生物合成产物。
本发明因此涉及用于通过培养本发明的基因修饰微生物产生生物合成产物的方法。
取决于所需的生物合成产物，必须提高或降低多种基因的转录率或表达率。通常，改变多种基因的转录率或表达率是有利的，即提高基因组合的转录率或表达率和/或降低基因组合的转录率或表达率是有利的。
在本发明的基因修饰微生物中，基因的至少一个改变即提高或降低的转录率或表达率可归因于具有启动子活性的本发明核酸或本发明的表达单元。
此外，基因修饰微生物中其它基因额外改变的即额外提高或额外降低的转录率或表达率可以但不是必需来自具有启动子活性的本发明核酸或本发明的表达单元。
本发明因此还涉及用于通过培养本发明的基因修饰微生物产生生物合成产物的方法。
优选的生物合成产物是精细化学品。
术语“精细化学品”为本领域所认知，其包括已用于多种工业的由生物体产生的分子，其中所述工业例如但不限于药学工业、农业工业和化妆品工业。此类化合物包括有机酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人编辑的生物技术(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相关化合物(Nucleotides and related compounds)，561-612页，VCH：Weinheim及其中所含参考文献中所述)、脂类、饱和和不饱和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳香胺、香草醛和靛蓝)、维生素和辅因子(如在Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“维生素”(“Vitamins”)，443-613页(1996)VCH：Weinheim及其中的参考文献；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病”论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press，(1995))、酶以及在Gutcho(1983)通过发酵的化学品(Chemicals by Fermentation)，Noyes DataCorporation，ISBN：0818805086和其中的参考文献中所述的所有其它化学品。这些精细化学品中的某些化学品的代谢和用途进一步阐述如下。
I.氨基酸代谢及用途
氨基酸包含所有蛋白质的基本结构单元，并且为所有生物体的正常细胞功能所必需。术语“氨基酸”为本领域所认知。蛋白原的氨基酸有20种，为蛋白质的结构单元，在蛋白质中它们通过肽键连接，非蛋白原的氨基酸(已知成百种非蛋白原的氨基酸)在蛋白质中通常不存在(参见Ulmann工业化学百科全书(Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry))，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim(1985))。氨基酸可为D-或L-构型，尽管在天然存在的蛋白质中发现的唯一类型通常为L-氨基酸。已充分说明了20种蛋白原氨基酸中每一种在原核和真核细胞中的生物合成和降解途径(参见例如，Stryer，L.生物化学(Biochemistry)，第三版，578-590页(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)，这样称呼是因为由于它们生物合成的复杂性，必须从食物中摄取它们，它们被简单的生物合成途径转化为其余11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)。高等动物能够合成这些氨基酸中的一部分氨基酸，但必需氨基酸必须从食物中摄取，以进行正常的蛋白质合成。
除了它们在蛋白质生物合成中的功能外，这些氨基酸本身还是令人感兴趣的化学品，并且许多已发现在食品、动物饲料、化学品、化妆品、农业和药学工业中具有多种应用。赖氨酸不仅对人的营养而且对单胃动物如禽和猪都是一种重要的氨基酸。谷氨酸盐是最常用的调味添加剂(谷氨酸单钠盐，MSG)，并且广泛用于食品工业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于药学工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于药学工业和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是广泛使用的动物饲料添加剂。(Rehm等人(编辑)，生物技术(Biotechnology)，第6卷，第14a章中的Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technicalproduction and use，466-502页，VCH：Weinheim)。还发现这些氨基酸可用作前体，用于合成合成的氨基酸和蛋白质，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨以及在其他Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim，1985中所述的物质。
在可产生它们的生物体如细菌中已充分描述了这些天然氨基酸的生物合成(细菌氨基酸生物合成及其调节的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。谷氨酸通过还原胺化α-酮戊二酸(柠檬酸循环中的中间体)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下来由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成为三步，由3-磷酸甘油(糖酵解中间体)开始，在氧化、氨基转移和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均产生自丝氨酸；在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中前者通过高半胱氨酸与丝氨酸缩合，后者通过侧链β-碳原子转移至四氢叶酸。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途径中合成自糖分解和磷酸戊糖途径的前体赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，它们的不同仅在预苯酸合成后的最后两步。色氨酸也从这两种起始分子产生，但其合成为11步的途径。酪氨酸也可在苯丙氨酸羟化酶催化的反应中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸均为丙酮酸盐(糖酵解的终产物)的生物合成产物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸均通过转化天冬氨酸而形成。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸在一个复杂的9步途径中从一种活化糖--5-磷酸核糖-1-焦磷酸形成。
为细胞蛋白质合成所需的过量氨基酸不能被贮藏，并被降解以提供用于细胞主要代谢途径的中间体(综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，21章，“氨基酸降解和尿素循环”495-516页(1988))。虽然细胞可将不想要的氨基酸转化为有用的代谢中间体，从所需用于合成氨基酸的能量、前体分子和酶来说，氢基酸的产生是昂贵的。因此对于氨基酸的生物合成受到反馈抑制调节并不让人吃惊，其中特定氨基酸的存在起到减缓或完全终止其自身产生的作用(关于氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，24章：”氨基酸和血红素的生物合成”575-600页(1988))。因此，任一特定氨基酸的输出受到细胞中存在的该氨基酸量的限制。
II.维生素、辅因子和营养成分的代谢和用途
维生素、辅因子和营养成分包含高等动物不能合成且必须摄取的另一类分子，虽然它们易于被其它生物体如细菌合成。这些分子自身为生物活性物质或为在多种代谢途径中作为电子载体或中间体的生物活性物质的前体。除了它们的营养价值外，这些化合物作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它操作辅助剂也具有重要的工业价值(这些化合物的结构、活性和工业应用的概述参见例如，Ullman工业化学百科全书(Ullman’s Encyclopediaof Industrial Chemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996)。术语”维生素”为本领域认知，包括生物体行使正常功能所需的营养素，且该生物体自身不能合成它们。维生素组和包含辅因子和营养性化合物。术语“辅因子”包括进行正常酶促活性所需的非蛋白原化合物。此类化合物可为有机的或无机的，本发明的辅因子优选有机的。术语“营养成分”包括促进植物和动物尤其是人的健康食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂和某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
已大量描述了这些分子在可产生它们的生物体如细菌中的生物合成(Ullman工业化学百科全书(Ullman’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病”论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press：Champaign，IL X，374 S)。
硫胺素(维生素B1)由嘧啶和噻唑部分通过化学偶联产生。核黄素(维生素B2)由鸟苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素接下来用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起来称为‘维生素B6’的化合物类(例如，吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商业上使用的维生素B6盐酸盐)均为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸(R)-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵产生。泛酸生物合成的最后步骤由ATP-驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合组成。负责转化为泛解酸、β-丙氨酸和泛酸缩合生物合成步骤的酶是已知的。泛酸盐的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5步酶促步骤进行。泛酸盐、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸盐的形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(维生素B5原)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的产生。
已详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰辅酶A的生物合成，并鉴定了几种所涉及的基因。发现许多相应的蛋白质也参与Fe-簇合成，属于nifS蛋白质类。硫辛酸衍生自辛酸，并在能量代谢中作为辅酶，此时其成为丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的一部分。叶酸盐为一组这样的物质，其均为叶酸衍生物，来自于L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已详细研究了某些微生物中始于生物转化代谢中间体鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成。
类可啉(如钴胺素且尤其是维生素B12)和卟啉属于一组四吡咯环体系的化学品。维生素B12的生物合成太复杂，目前尚未彻底解释清楚，但许多涉及的酶和物质已知。烟酸(烟酸盐)和烟酰胺为吡啶衍生物，也称为‘烟酸’。烟酸为重要的辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它们的还原形式的前体。
这些化合物的大规模产生很大程度上依赖于无细胞的化学合成，虽然这些化学品中的一些如核黄素、维生素B6、泛酸盐和生物素也已通过微生物的大规模培养物产生。只有维生素B12是仅通过发酵产生的，因为其合成的复杂性。体外方法需要耗费材料和时间，通常以高的代价耗费。
III.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途
嘌呤和嘧啶代谢基因及它们相应的蛋白质为治疗肿瘤和病毒感染的重要靶标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包括构成核酸、辅酶和核苷酸的含氮碱基。术语“核苷酸”包括核酸分子的基本结构单元，其由含氮碱基、戊糖(对RNA而言，该糖为核糖，对DNA而言，该糖为D-脱氧核糖)和磷酸组成。术语“核苷”包括作为核苷酸前体的分子，但其不含核苷酸所具有的磷酸单元。通过抑制这些分子的生物合成，或抑制它们形成核酸分子的代谢，可抑制RNA和DNA合成；通过以靶向癌细胞的方式抑制这种活性，可抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。
此外，有不形成核酸分子但作为能量贮存体(即AMP)或作为辅酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了这些化学品通过影响嘌呤和/或嘧啶代谢对这些医学适应症的用途(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)“作为化学治疗剂的嘧啶和嘌呤从头生物合成的强力抑制剂”医学研究述评(Med.Res.Reviews)10：505-548)。对参与嘌呤和嘧啶代谢的酶的研究集中在研发可用作如免疫抑制剂或抗增生剂的新药上(Smith，J.L，(1995)“核苷酸合成中的酶”结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)5：752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23：877-902)。但是，嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸具有其它应用：用作一些精细化学品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、叶酸盐或核黄素)生物合成的中间体，作为细胞的能量载体(例如，ATP或GTP)，和本身作为化学品，通常作为增味剂(例如，IMP或GMP)或用于一些医药用途(参见例如，Kuninaka，A.(1996)生物技术中的核苷酸和相关化合物(Nucleotides and Related Compounds inBiotechnology)第6卷，Rehm等人编辑.VCH：Weinheim，561-612页)。同样，参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶越来越多地用作靶，研发用于作物保护的抗这些酶的化学品包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
已阐释了这些化合物在细菌中的代谢(综述参见例如，核酸研究和分子生物学进展(Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology)，第42卷，Academic Press中的Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)“嘌呤核苷酸的从头生物合成”，259-287页；和生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology)，Wiley：纽约一书中的Miehal，G.(1999)“核苷酸和核苷”，第8章)。嘌呤代谢已是深入研究的主题，其对细胞的正常功能是必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢可引起严重疾病，如痛风。嘌呤核苷酸从核糖-5-磷酸开始，经过一系列步骤，通过中间体化合物次黄苷-5’-磷酸(IMP)，产生鸟苷-5’-单磷酸(GMP)或腺苷-5’-单磷酸(AMP)，由此易于形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量贮存体，这样它们的降解可提供细胞内用于许多不同生物化学过程的能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-单磷酸(UMP)而进行。UMP接下来转化为胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式通过一步还原步骤从核苷酸的二磷酸核糖形式产生为核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。通过磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。
IV.海藻糖的代谢及用途
海藻糖由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1连接组成。它通常作为甜味剂用于食品工业，为干的或冷冻食品和饮料中的添加剂。但它也用于药学、化妆品和生物技术工业(参见例如，Nishimoto等人(1998)美国专利号5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.生物技术趋势(Trends Biotech.)16(1998)：460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.Biotech.Ann.Rev.2(1996)：293-314；和Shiosaka，M.J.Japan 172：(1997)97-102)。海藻糖通过酶从许多微生物产生，并天然释放入环境介质中，从中可用本领域公知的方法收集海藻糖。
特别优选的生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸和核苷、蛋白原性和非蛋白原性氨基酸、脂类和脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素和辅因子、酶和蛋白质。
优选的有机酸是酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸。
优选的核苷和核苷酸例如在Rehm等编辑的Biotechnology，第6卷，VCH：Weinheim第561-612页Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and relatedcompounds及其中出现的参考文献内描述。
此外，优选的生物合成产物额外地是脂类、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸例如花生四烯酸、二醇例如丙二醇和丁二醇、糖类例如透明质酸和海藻糖、芳香化合物例如芳香胺、香草醛和靛蓝、维生素和辅因子((如在Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“维生素”(“Vitamins”)，443-613页(1996)VCH：Weinheim及其中的参考文献；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病”论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press，(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等，(1998)Sicence 282：63-68)以及在Gutcho(1983)通过发酵的化学品(Chemicals by Fermentation)，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086和其中的参考文献中所述的所有其它化学品。
特别优选的生物合成产物是氨基酸，特别优选地是必需氨基酸，特别是L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸和L-苏氨酸、L-高丝氨酸、尤其L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。氨基酸，例如赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸，此后在任何情况下意指氨基酸的L形式和D形式，优选地是L形式，即例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。
本发明特别涉及用于通过培养基因修饰微生物产生赖氨酸的方法，其中所述基因修饰微生物具有至少一个基因的与野生型比较提高或引发的表达率，其中
ch)提高与野生型比较微生物中本发明至少一个内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dh)通过本发明的表达单元或通过根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
并且基因选自如下核酸：编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码转录调节蛋白LuxR的核酸、编码转录调节蛋白LysR1的核酸、编码转录调节蛋白LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出蛋白的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸和编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
如以上对方法所述，通过本发明的表达单元或通过根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中这些基因的表达由如下方式实现：
dh1)将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的本发明表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个这些基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有提高的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
以上所述用于制备赖氨酸的方法的一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、转录调节蛋白LuxR的活性、转录调节蛋白LysR1的活性、转录调节蛋白LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出蛋白活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性和生物素连接酶活性。
以上所述用于制备赖氨酸方法的又一个尤其优选的实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出蛋白活性、苏氨酸外排蛋白活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脱羧酶活性和苏氨酸合成酶活性。
至少一个以上所述活性中的那些额外提高或额外降低的活性可以，但不必须由具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明的表达单元引发。
本发明还涉及用于通过培养基因修饰微生物产生甲硫氨酸的方法，其中所述基因修饰微生物具有至少一个基因的与野生型比较提高或引发的表达率，其中
ch)提高与野生型比较微生物中本发明至少一个内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dh)通过本发明的表达单元或通过根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
并且其中基因选自如下核酸：编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ-合成酶的核酸、编码胱硫醚β-裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合成酶I活性的核酸、编码半胱氨酸合成酶II活性的核酸、编码依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性的核酸、编码不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶活性的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶活性的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH还原酶活性的核酸、编码铁氧还蛋白活性的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节蛋白的核酸和编码RXN2910调节蛋白的核酸。
如以上对方法所述，由本发明的表达单元或由根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中这些基因的表达由如下方式实现：
dh1)将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个这些内源性基因的表达在导入的本发明表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个这些基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入基因的表达在本发明内源性表达单元的控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，其根据需要具有提高的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
以上所述用于制备甲硫氨酸方法的又一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性、胱硫醚β-裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合成酶I活性、半胱氨酸合成酶II活性、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节蛋白的活性和RXN2910调节蛋白的活性。
以上所述用于制备甲硫氨酸方法的又一个特别优选实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合成酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性和二氨基吡啶羧酸(diaminopicolinate)脱羧酶活性。
至少一个以上所述活性中的那些额外提高或额外降低的活性可以，但不必要由具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明的表达单元引发。
本发明还涉及通过培养基因修饰微生物产生苏氨酸的方法，其中所述基因修饰微生物具有至少一个基因的与野生型比较提高或引发的表达率，其中
ch)提高与野生型比较微生物中本发明至少一个内源性表达单元的特异表达活性，其中所述内源性表达单元调节内源性基因的表达，或
dh)通过本发明的表达单元或通过根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
并且基因选自如下核酸：编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码的核酸丙酮酸羧化酶、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合成酶的核酸、编码苏氨酸输出蛋白载体蛋白的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出蛋白的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸外排蛋白的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸和编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
如以上对方法所述，由本发明的表达单元或由根据实施方案ch)的具有提高的特异表达活性的本发明表达单元调节微生物中这些基因的表达由如下方式实现：
dh1)将一个或多个本发明的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个这些内源性基因的表达在导入的本发明表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个这些基因导入微生物基因组以至一个或多个所导入基因的转录在本发明内源性表达单元的控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含本发明的表达单元，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，和功能性连接的一个或多个待表达核酸。
以上所述用于制备苏氨酸方法的一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、苏氨酸合成酶活性、苏氨酸输出蛋白载体蛋白的活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸外排蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性和高丝氨酸脱氢酶活性.
以上所述用于制备苏氨酸的方法的一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出蛋白活性、乙酰乳酸合酶活性、乙醇酮酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、二羟酸脱水酶活性和二氨基吡啶羧酸脱羧酶活性。
至少一个以上所述活性中的那些额外提高或额外降低的活性可以，但不必须由具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明的表达单元引发。
在酶的情形时，术语蛋白质的“活性”意指相应蛋白质的酶活性，并且对于其它蛋白质的情况例如结构蛋白或转运蛋白意指该蛋白质的生理活性。
酶通常能够将底物转换为产物或催化此转换步骤。
因此，酶“活性”意指特定时间内由酶转所换的底物量或由酶所形成的产物量。
因此，当活性与野生型比较提高时，特定时间内由酶转所换的底物量或由酶所形成的产物量与野生型比较提高。
对于此前和此后所描述的所有活性，“活性”的这种提高优选地升高“野生型活性”的至少5％、还优选地至少20％、还优选地至少50％、还优选地至少100％、更优选地至少300％、甚至更优选地至少500％、尤其至少600％。
因此，当活性与野生型比较降低时，特定时间内由酶转所换的底物量或由酶所形成的产物量与野生型比较降低。
降低的活性优选地意指基于多种细胞生物学机制的微生物中该酶功能的部分或基本完全抑制或阻断。
活性的降低包含酶的定量性减少直至基本完全没有酶(即缺乏可检测的相应活性或缺乏可免疫学检测的酶)。微生物中的活性与野生型比较优选地降低至少5％、还优选地至少20％、还优选地至少50％、还优选地100％。“降低”还特别意指完全没有相应的活性。
基因修饰微生物中和野生型中特定酶的活性，以及因此酶活性的提高或降低可以通过已知方法测量，如酶测定法。
例如，丙酮酸羧化酶意指表现转换丙酮酸为草酰乙酸的酶活性的蛋白质。
因此，丙酮酸羧化酶活性意指特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白质所转换的丙酮酸量或所形成的草酰乙酸量。
因此，当丙酮酸羧化酶活性与野生型比较提高时，特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白质所转换的丙酮酸量或所形成的草酰乙酸量与野生型比较提高。
这种“丙酮酸羧化酶活性”提高优选地提高了“野生型丙酮酸羧化酶活性”的至少5％、还优选地至少20％、还优选地至少50％、还优选地至少100％、更优选地至少300％、甚至更优选地至少500％、尤其至少600％。
此外，例如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性意指磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的酶活性。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶意指表现转化草酰乙酸为烯醇磷酸丙酮酸的酶活性的蛋白质。
因此，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性意指特定时间内由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶蛋白质所转换的草酰乙酸量或所形成的烯醇磷酸丙酮酸量。
当磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性与野生型比较降低时，因此特定时间内由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶蛋白质所转换的草酰乙酸量或所形成的烯醇磷酸丙酮酸量与野生型比较降低。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的降低包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的定量性减少直至基本上完全没有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(即缺乏可检测的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的性或缺乏可免疫学检测的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性与野生型比较优选地降低至少5％、还优选地至少20％、还优选地至少50％、还优选地100％。特别地，“降低”还意指完全没有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
活性的额外提高可以以多种方式进行，例如通过在表达水平和蛋白质水平关闭抑制性调节机制，或通过与野生型比较提高编码以上所述蛋白质的核酸的基因表达。
与野生型比较提高编码以上所述蛋白质的核酸的基因表达可以类似地以多种方式进行，例如通过激活剂诱导基因，或如上所述通过提高启动子活性或提高表达活性，或通过将一个或多个基因拷贝导入微生物。
提高编码蛋白质的核酸的基因表达也意指根据本发明操纵微生物固有的内源性蛋白质的表达。
如上所述，这可以例如通过改变基因的启动子序列和/或表达单元序列实现。这种导致基因表达率提高的改变可以例如通过缺失或插入DNA序列进行。
如以上所述，还可能通过施加外源性刺激改变内源性蛋白质的表达。这可以通过特定的生理条件即通过施加外来物质进行。
技术人员可单独或组合地借助其它不同方法以实现基因表达的提高。因此例如，可以提高适宜基因的拷贝数，或可以突变在结构基因上游的启动子和调节区域或者核糖体结合位点。还有可能通过诱导型启动子提高发酵期间的表达。延长mRNA寿命的方法同样地改进了表达。类似地还通过阻止酶蛋白质的降解增强酶活性。基因或基因构建体可以以变动的拷贝数存在于质粒中或在染色体中整合并扩增。作为备选，还有可能通过改变培养基组成和控制培养而实现相关基因的过量表达。
技术人员尤其可以在Martin等(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102，93-98(1991))、欧洲专利0472869、美国专利4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991)、Reinscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994)、LaBarre等(Journal of Bacteriology 175，1001-1007(1993))。专利申请WO96/15246、Malumbres等(Gene 134，15-24(1993))、日本公开的说明书JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60：512-538(1996)和众所周知的遗传学和分子生物学教科书中找到有关此方面的参考。
除了表达或增强基因以外，消除不需要的副反应可能额外地有利于生物合成产物的产生，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的产生(在Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编者)的Overproduction of MicrobialProducts，Academic Press，London，UK，1982中的Nakayama：“Breedingof Amino Acid Producing Microorganisms”)。
在一个优选的实施方案中，编码如上所述蛋白质之一的核酸的基因表达通过将编码相应蛋白质的至少一个核酸导入微生物提高。导入核酸可以以染色体方式进行或以染色体外方式进行，即通过提高染色体上的拷贝数和/或提高在宿主微生物中复制的质粒上的基因拷贝。
例如导入以包含核酸的表达盒形式的核酸优选地以染色体方式进行，尤其通过以上所述SacB方法。
为此目的原则上有可能使用编码一种如上所述蛋白质的任意基因。
当包含内含子的基因组核酸序列来源于真核时，如果宿主微生物不能够或不可能使之能够表达相应蛋白质时，优选地使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
相应基因的实例列于表1和表2。
微生物中以上所述的活性优选地通过至少一个如下方法降低：
●导入用于诱导共抑制的至少一个有义核糖核酸序列或导入确保其表达的表达盒。
●导入抗相应基因、RNA或蛋白质的至少一个DNA结合因子或蛋白质结合因子或导入确保其表达的表达盒。
●导入引起RNA降解的至少一个病毒核酸序列或导入确保其表达的表达盒。
●导入引起基因功能丧失的至少一个构建体，例如在基因的可读框中生成终止密码子或移码，例如通过在基因中产生插入、缺失、倒位或突变。有可能并且优选地经同源重组通过定向插入至目的靶基因或导入针对靶基因的序列特异性核酸酶生成基因敲除的突变体。
●导入具有降低的启动子活性的启动子或导入具有降低的表达活性的表达单元。
技术人员清楚本发明范围内还可以使用降低活性或功能的其它方法。例如导入蛋白质的显性失活变体或确保其表达的表达盒也可以是有利的。
对于这些方法中的每一单独方法还有可能导致蛋白质的量、mRNA的量和/或蛋白质的活性降低。组合地使用这些方法也是可以考虑的。其它方法对技术人员为已知并且可以包括干预或抑制蛋白质加工、蛋白质或其mRNA转运、抑制核糖体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译延长或翻译终止。
在本发明产生生物合成产物的方法中，培养基因修饰微生物的步骤后是自微生物和/或自培养肉汤中分离生物合成产物。这些步骤可同时进行和/或优选地在培养步骤后进行。
可以培养本发明的基因修饰微生物以便用分批法(分批培养)或用补料分批法或重复的补料分批法连续或不连续地产生生物合成产物，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。已知的培养方法简述可在Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科书或在Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科书中找到。
待使用的培养基必须以适当方式满足相应菌株的需要。在“Manual ofMethods for General Bacteriology”of the American Society forBacteriology(Washington D.C.，USA，1981)”手册中存在用于多种微生物的培养基的描述。
根据本发明可使用的这些培养基通常包含一个或多个碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。
优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。优良碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖还可以通过将复杂化合物如糖精制中的糖蜜或其它副产物添加至培养基而加入。添加多种碳源的混合物也可以是有利的。其他可能的碳源是油类和脂类例如大豆油、向日葵油、花生油和可可脂、脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸、醇例如甘油、甲醇或乙醇，以及有机酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机氮化合物或无机氮化合物或包含这些化合物的原料。氮源的实例包含氨气或铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸，或者复杂氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其它。氮源可以单独地使用或作为混合物使用。
培养基中可存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
为产生精细化学品，尤其甲硫氨酸，有可能使用无机硫化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物作为硫源，也可以使用有机硫化物如硫醇和硫醇类作为硫源。
有可能使用磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或其相应含钠盐作为磷源。
可将螯合剂添加至培养基以便维持溶液中的金属离子。特别适合的螯合剂包含二羟苯酚如邻苯二酚或原儿茶酸盐或有机酸如柠檬酸。
根据本发明所用的发酵培养基通常还包含其它生长因子如维生素或生长促进剂，所述其它生长因子包含例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐常常源自培养基的复杂成分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。还可以将合适的前体添加至培养基。化合物在培养基中的确切组成很大程度上取决于特定的实验并且对每个特定的情形将单独决定。优化培养基的信息可从教材“Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach”(编者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN0 19 9635773)中得到。生长培养基还可以自供应商处购买，如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。
所有培养基成分通过加热(20分钟121℃和1.5 bar)或除菌过滤作用灭菌。各成分可以一起灭菌，或根据需要分别灭菌。所有培养基成分可以在培养开始时存在或任选地连续添加或分批添加。
培养基的温度通常在15℃至45℃间，优选地在25℃至40℃间，并且发酵期间维持恒定或改变。培养基的pH应当在5-8.5的范围，优选地在7.0附近，用于培养的pH可以在培养期间通过添加碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸控制。泡沫的产生可通过施加消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇控制。质粒的稳定性可以通过将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基维持。需氧条件可以通过将氧气或含氧的气体混合物例如空气导入培养基维持。培养基的温度通常是20℃至45℃。培养持续进行直至目的产物的形成达到最大。此目标通常在10小时至160小时内达到。
以此方式所得到发酵肉汤中干物质的含量通常在7.5至25％重量间。
额外有利的是至少在结束阶段，尤其在30％发酵时间阶段将发酵在糖限制下运行。这意味在此期间将发酵培养基中可利用糖的浓度维持在0至3g/l，或降低。
生物合成产物自发酵肉汤和/或自微生物的分离根据所需的生物合成产物以及生物合成副产物的物理/化学特性以本身已知的方式分离。
例如随后可以进一步加工发酵肉汤。根据要求，生物质(biomass)可以自发酵肉汤通过分离方法完全或部分地分离，如离心法、过滤法、倾析法或这些方法的组合，或者完全留在发酵肉汤内。
随后发酵肉汤可以借助旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器通过已知方法浓缩，如反向渗透法或纳米过滤法。随后，这种浓缩的发酵肉汤可以通过冷冻干燥法、喷雾干燥法、喷雾造粒法或其它方法制成。
然而，还有可能纯化生物合成产物，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸等。为此目的，除去生物质后，使用合适树脂层析包含产物的肉汤，杂质或者目的产物完全或部分地保留在层析树脂上。这些层析步骤根据需要可使用相同或不同层析树脂重复。技术人员可熟练地选择合适的层析树脂以及它们最高效的用途。纯化的产物可以通过过滤或超滤浓缩并且贮存在该产物最具稳定性的温度。
生物合成产物可以多种形式产生，例如以其盐形式或酯形式。
所分离化合物的特性和纯度可通过现有技术测定。这些技术包括高效液相层析法(HPLC)、光谱方法、染色方法、薄层层析法、NIRS、酶测定法和微生物测定法。这些分析性方法总结于：Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCH：Weinheim，第89-90页，第521-540页，第540-547页，第559-566页，第575-581页和第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry andMolecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)Applicationsof HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第17卷。
现在通过如下非限制性实施例更详细地描述本发明：
实施例1.构建载体pSK1Cat
将穿梭载体pMT1(Follettie等(1993)J.Bacteriol.175：4096-4103)用限制性酶XhoI和BamHI消化，随后用Klenow片段处理并再次连接。得到的质粒名为pMT1-del。将载体pMT1-del用限制性酶BglII和XbaI消化。2.5kb片段包含来自谷氨酸棒杆菌的pSR1 ori并且连接至已经同样地用BglII和XbaI消化的2kb plasposon pTnMod-Okm(Dennis und Zylstra(1998)Appl. Environ.Microbiol.64：2710-2715)。得到的载体名为pSK1。plasposon pTnMod-Okm的片段携带用于大肠杆菌的pMB1复制起点和卡那霉素抗性标志(Tn903)。不带启动子的Cat基因借助寡核苷酸引物A(SEQ.ID.NO.4)和B(SEQ.ID.NO.5)，使用载体pKK232-8(SEQ.ID.NO.3)作为模板通过如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press中所述的标准方法借助聚合酶链式反应(PCR)扩增。载体和插入物用限制性酶BglII和KpnI消化后，将PCR产物连接至载体pSK1。质粒命名为pSK1Cat(图1)。
寡核苷酸引物A SEQ.ID.NO.4
5’-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-3’
寡核苷酸引物B SEQ.ID.NO.5
5’-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-3’
实施例2.构建质粒pSK1Ptac
质粒pKK223-3 SEQ.ID.NO.6包含tac启动子(Ptac)。该启动子经限制性酶BamHI消化后分离，并且将该片段克隆至经BamHI线性化的载体pSK1Cat SEQ ID。质粒命名为pSK1Ptac(图2)。
实施例3.克隆P180(SEQ.ID.NO.1)
谷氨酸棒杆菌AS019E12的染色体DNA使用Eikmanns等(1994)Microbiology 140：1817-1828的方法自指数期晚期的细胞分离，随后用限制性酶Sau3AI部分消化。将得到的0.4-1.0kb大小的片段连接至经限制性酶BamHI线性化的载体pSK1Cat。使用Follettie等(1993)J.Bacteriol.175：4096-4103的方法，将连接混合物通过电穿孔转化至谷氨酸棒杆菌AS019E12。将细胞在含有5μg/ml氯霉素的平板涂布。分离并分析在这些平板上生长的单个菌落中的质粒。一个如此质粒是pSK1CatP180，其包含启动子P180(SEQ.ID.NO.1)。该启动子位于编码推定性膜蛋白的基因上游区域。插入物大小为182bp。
实施例4.谷氨酸棒杆菌AS019E12的氯霉素抗性
在30℃仅包含质粒pSK1Cat(图1)的谷氨酸棒杆菌细胞在具有5μg/ml氯霉素浓度的MB平板(Follettie等(1993)J.Bacteriol.175：4096-4103)和MCGC平板(von der Osten等(1989)Biotechnol.Lett.11：11-16)上不能生长。Cat基因未表达。与此相反，包含质粒pSK1CatPtac(图2)的谷氨酸棒杆菌细胞在具有40μg/ml氯霉素浓度的MB平板和MCGC平板上生长。当氯霉素浓度大于40μg/ml，生长十分微弱或者根本不能观察到。包含质粒pSK1CatP180的细胞能够在氯霉素浓度大于40μg/ml的MB和MCGC平板上生长。
实施例5.大肠杆菌的氯霉素抗性
包含质粒pSK1CatPtac(图2)的大肠杆菌细胞在具有400μg/ml氯霉素浓度的LB平板(Sambrook等(1989)Molecular cloning-A laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory，第二版.，Cold Spring Harbor，N.Y.)上生长。在600μg/ml氯霉素浓度下不能观察到生长。包含质粒pSK1CatP180的细胞能够在600μg氯霉素浓度生长在LB平板上。
实施例6.构建质粒pSK1PtacmetA
metA基因借助寡核苷酸引物C SEQ.ID.NO.7和D SEQ.ID.NO.8，使用质粒pSL75(Park等(1998)Mol. Cells 8：286-294)作为模板，通过如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press中所述的标准方法借助聚合酶链式反应(PCR)扩增。将PCR产物用限制性酶EcoRI和PstI消化并连接至事先已经用限制性酶EcoRI和PstI消化的载体pKK223-3 SEQ.ID.NO.6。得到的质粒名为pSL314。将包含构建体PtacmetA的质粒pSL314(图3)的1.4kb BamHI/PstI片段连接至已用限制性酶BamHI和PstI线性化的质粒pSK1Cat(图1)。位于质粒中的Cat基因随后通过PstI/KpnI消化作用缺失。将质粒经T4DNA聚合酶处理后再连接。得到的质粒名为pSK1PtacmetA(图4)。
寡核苷酸引物C SEQ.ID.NO.7
5’-TAGA ATTCATGCCCACCTCG-3’
寡核苷酸引物D SEQ.ID.NO.8
5’-TACTGCAGGAGATCCCTGTCT-3’
实施例7.构建质粒pSK1P180metA
P19 SEQ.ID.NO.9中大约180bp片段借助寡核苷酸引物E(SEQ.ID.NO.10)和F(SEQ.ID.No.11)，使用如Innis等(1990)PCR Protokols，AGuide to Methods and Applications，Academic Press中所述的标准方法借助聚合酶链式反应(PCR)扩增，随后用限制性酶BamHI和PstI消化，然后插入事先已同样地用BamHI和PstI线性化的质粒pSK1Cat(图1)。得到的质粒pSK1CatP180(图5)用限制性酶PstI和KpnI线性化以便将Cat基因替换为metA基因。metA基因借助寡核苷酸引物G(SEQ.ID.NO.12)和H(SEQ.ID.NO.13)和模版pSL75(Park等(1998)Mol.Cells 8：286-294)，按照如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press中所述的标准方法借助聚合酶链式反应(PCR)扩增，随后用限制性酶KpnI和PstI切割。将metA基因产物和线性化的质粒pSK1CatP180(图5)连接以产生质粒pSK1P180metA(图6)。
寡核苷酸引物E SEQ.ID.NO.10
5’-GCGGATCCTAATAAAGGTGGAGAA-3’
寡核苷酸引物F SEQ.ID.NO.11
5’-GTCGAAGCTCGGCGGATTTG-3’
寡核苷酸引物G SEQ.ID.NO.12
5’-GCCTGCAGAGGATTTCATGCCC-3’
寡核苷酸引物H SEQ.ID.NO.13
5’-GGGGTACCCTGTCTATTTGTCGT-3’
实施例8.测定高丝氨酸乙酰转移酶活性
为测定P180的相对活性，将质粒pSK1Cat、pSL75、pSK1PtacmetA和pSK1P180metA通过Eikamnns等(1994)Microbiology 140：1817-1828的方法电穿孔入谷氨酸棒杆菌AS019E12。质粒pSL75包含具有其天然启动子的metA基因。高丝氨酸乙酰转移酶(metA)活性在不同生长条件下通过Park等(1998)Mol.Cells 8：286-294中所述的方法测定。细胞在MB培养基(Follettie等(1993)J.Bacteriol.175：4096-4103)或MCGC培养基(vonder Osten等(1989)Biotechnol.Lett.11：11-16)生长至达到静止期。通过Jetten和Sinsky(1993)FEMS Microbiol.Lett.111：183-188的方法制备粗提取物。结果汇编在下表。
              高丝氨酸乙酰转移酶(nmol min-1mg-1)
菌株  质粒  MB  MCGC   MCGC
 -甲硫氨酸   +甲硫氨酸a
谷氨酸棒杆菌AS019E12  pSK1CatpSK1PtacmetApSK1P180metApSL75  18240440270  37052210903960   18206567304
a将10mM甲硫氨酸添加至培养基
附图：
图1显示pSK1Cat的质粒图(A)以及BamHI克隆位点的核苷酸序列(B)。B中划线的序列代表用于生成测序寡核苷酸的区域。指出了起始密码子和BamHI克隆位点。
图2显示pSK1Ptac的部分核苷酸序列。启动子Ptac以斜体显示。还显示了Ct基因的-35区和-10区、RBS和起始密码子。
图3显示pSL314的部分核苷酸序列。插入物以斜体显示。还显示了metA基因的-35区和-10区、RBS和起始密码子。
图4显示psK1PtacmetA的部分核苷酸序列。不带CAT基因的质粒pSK1Cat显示为黑色，而PtacmetA显示为蓝色。还显示了metA的-10区和-35区、RBS以及起始密码子和终止密码子。
图5显示pSK1CatP180的部分核苷酸序列。质粒pSK1Cat显示为黑色，而P180显示为蓝色。还显示了cat基因的-10区和-35区、RBS和起始密码子。
图6显示pSK1P180metA的部分核苷酸序列。不带cat基因的质粒pSK1Cat显示为黑色，而P180显示为红色且metA为蓝色。还显示了metA的-10区和-35区、RBS以及起始密码子和终止密码子。
                     序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>P180表达单元
<130>AE 20040553
<160>17
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>182
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(182)
<223>
<400>1
agttaactgc gttaataaag gtggagaata agttgtttcc aagatcaatt caaggaaagt     60
tgcattttcg caggtcagtg ttacccccta agactacccc tttccattgc atacaaagga    120
aatacatata gacttttggg cattagatta cctcgataaa agtttaggga atctaaattc    180
at                                                                   182
<210>2
<211>375
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(375)
<223>表达单元
<400>2
agttaactgc gttaataaag gtggagaata agttgtttcc aagatcaatt caaggaaagt     60
tgcattttcg caggtcagtg ttacccccta agactacccc tttccattgc atacaaagga    120
aatacatata gacttttggg cattagatta cctcgataaa agtttaggga atctaaattc    180
attgatcaag acttgctgtc gcctagctct aattcacttg agcccggctg ctaaaggtca    240
agatcattga atgcactact tgctagcagt catctgaaaa aacgacgttg gttcgtagtc    300
gctggaaatt taataattcc tccgtcccct tcaactaggg ggtggaaacc cgactatttc    360
cgaaggacta ttctc                                                     375
<210>3
<211>5094
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5094)
<223>质粒
<400>3
ttcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct     60
gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg    120
ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccagggaat    180
tcccggggat ccgtcgacct gcagccaagc ttgagtagga caaatccgcc gagcttcgac    240
gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt    300
tgatatatcc caatcgcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg    360
tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa    420
taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc    480
ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg    540
ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga    600
cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct    660
ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt    720
gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt    780
caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt    840
tcatcatgcc gtctgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta    900
ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac    960
gcctggtgct acgcctgaat aagtgataat aagcggatga atggcagaaa ttcgtcgagg   1020
cggcacctcg ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga   1080
actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc   1140
agccgcacgc ggcgcatctc ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac   1200
agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg   1260
cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta   1320
gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct   1380
cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt   1440
aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg   1500
gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat   1560
ggcctttttg cgtttctaca aactcttcct gtcgtcatat ctacaagcca tccccccaca   1620
gatacggtaa actagcctcg tttttgcatc aggaaagcag ctgttttggc ggatgagaga   1680
agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt   1740
tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac   1800
gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat   1860
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg   1920
gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa   1980
cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag   2040
aaggccatcc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa ctcttcctgt cgtcatatct   2100
acaagccatc cccccacaga tacggtaaac tagcctcgtt tttgcatcag gaaagcagtc   2160
gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg   2220
gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac   2280
gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg   2340
tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg   2400
gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa   2460
gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg   2520
tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag   2580
catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga   2640
ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca   2700
gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg   2760
tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga   2820
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc   2880
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg   2940
cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca   3000
tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta   3060
aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg   3120
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca   3180
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac   3240
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac   3300
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg   3360
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac   3420
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat   3480
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag   3540
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac   3600
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt   3660
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt   3720
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc   3780
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga   3840
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac   3900
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc   3960
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct   4020
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca   4080
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct   4140
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca   4200
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc   4260
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg   4320
cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct   4380
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa   4440
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta   4500
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc   4560
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg   4620
agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa   4680
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg   4740
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc   4800
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg   4860
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat   4920
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata   4980
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc   5040
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaa         5094
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(27)
<223>引物
<400>4
ggaagatctt tcaagaattc ccaggca                                         27
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(26)
<223>引物
<400>5
ggggtaccta ccgtatctgt gggggg                                          26
<210>6
<211>4991
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(4991)
<223>质粒
<400>6
ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg     60
attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa    120
aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac    180
ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt    240
gcagtcgata agctccggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc    300
acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc    360
cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg    420
ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca gatctagcgg cgcattaagc gcggcgggtg    480
tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg    540
ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg    600
ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt    660
tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt    720
tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta    780
tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggactag accaccattc    840
cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag    900
tcgcataagg gagagcgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc    960
cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa   1020
ctcgtaggac aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg   1080
agcgcgacga tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa   1140
gccttcgtca ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc   1200
atggcggccg acgcgctggg ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg ctggatggcc   1260
ttccccatta tgattcttct cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt gcaggccatg   1320
ctgtccaggc aggtagatga cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct cgcggctctt   1380
accagcctaa cttcgatcac tggaccgctg atcgtcacgg cgatttatgc cgcctcggcg   1440
agcacatgga acgggttggc atggattgta ggcgccgccc tataccttgt ctgcctcccc   1500
gcgttgcgtc gcggtgcatg gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc cggcggcacc   1560
tcgctaacgg attcaccact ccaagaattg gagccaatca attcttgcgg agaactgtga   1620
atgcgcaaac caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca   1680
cgcggcgcat ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt   1740
cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga   1800
tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat   1860
gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca   1920
ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat   1980
ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc   2040
ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa   2100
cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatt   2160
cccccttaca cggaggcatc aagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg   2220
ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga   2280
acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct   2340
cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac   2400
agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt   2460
tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg   2520
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata   2580
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact   2640
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta   2700
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag   2760
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc   2820
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta   2880
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg   2940
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc   3000
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac   3060
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac   3120
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg   3180
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga   3240
aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt   3300
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag   3360
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct   3420
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg   3480
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat   3540
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc   3600
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg   3660
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct   3720
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca   3780
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg   3840
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg   3900
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc   3960
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag   4020
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg   4080
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag   4140
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat   4200
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg   4260
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca   4320
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca   4380
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat   4440
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag   4500
aaaaataaac aaaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcagga tggccttctg   4560
cttaatttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc cgggccgttg   4620
cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta ctcaggagag cgttcaccga   4680
caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg   4740
cctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt   4800
tcacttctga gttcggcatg gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat   4860
tctgttttat cagaccgctt ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct   4920
ctcatccgcc aaaacagaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta   4980
ccgagctcga a                                                        4991
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>7
tagaattcat gcccacctcg                                                 20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(21)
<223>引物
<400>8
tactgcagga gatccctgtc t                                               21
<210>9
<211>228
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(228)
<223>
<400>9
aagcttacgc agccgtaagt tttgagtatc gaaaaatttc cacgtcaagt taactgcgtt     60
aataaaggtg gagaataagt tgtttccaag atcaattcaa ggaaagttgc attttcgcag    120
gtcagtgtta ccccctaaga tacccctttc cattgcatac aaaggaaata catatagact    180
tttgggcatt agattacctc gataaaagtt tagggaatct aaattcat                 228
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(24)
<223>引物
<400>10
gcggatccta ataaaggtgg agaa                                            24
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>11
gtcgaagctc ggcggatttg                                                 20
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>12
gcctgcagag gatttcatgc cc                                              22
<210>13
<211> 23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物
<222>(1)..(23)
<223>引物
<400>13
ggggtaccct gtctatttgt cgt                                             23
<210>14
<211>1005
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1005)
<223>
<400>14
atg aac cta aag aac ccc gaa acg cca gac cgt aac ctt gct atg gag       48
Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu
1               5                   10                  15
ctg gtg cga gtt acg gaa gca gct gca ctg gct tct gga cgt tgg gtt       96
Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val
            20                  25                  30
gga cgt ggc atg aag aat gaa ggc gac ggt gcc gct gtt gac gcc atg      144
Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met
        35                  40                  45
cgc cag ctc atc aac tca gtg acc atg aag ggc gtc gtt gtt atc ggc      192
Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly
    50                  55                  60
gag ggc gaa aaa gac gaa gct cca atg ctg tac aac ggc gaa gag gtc      240
Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val
65                  70                  75                  80
gga acc ggc ttt gga cct gag gtt gat atc gca gtt gac cca gtt gac      288
Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp
                85                  90                  95
ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc aac gca att tcc att ctc      336
Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu
            100                 105                 110
gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat cca tcc tcc gtc ttc tac      384
Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr
        115                 120                 125
atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc gca ggc aag atc gac atc      432
Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile
    130                 135                 140
gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg gtg gca aag tcc aag gga      480
Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly
145                 150                 155                 160
atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg ctt gac cgt cct cgc cac      528
Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His
                165                 170                 175
atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca ggc gca aag gtt cgt ctc      576
Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu
            180                 185                 190
atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt gca gca gct cag gat tcc      624
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser
        195                 200                 205
aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc gga acc cca gaa ggc atc      672
Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile
    210                 215                 220
atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt ggc gaa atc cag ggc atc      720
Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile
225                 230                 235                 240
ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag aag gca cac gac gct ggt      768
Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly
                245                 250                 255
ctg gtt ctt gat cag gtt ctg cac acc aac gat ctg gtg agc tcc gac      816
Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp
            260                 265                 270
aac tgc tac ttc gtg gca acc ggt gtg acc aac ggt gac atg ctc cgt      864
Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg
        275                 280                 285
ggc gtt tcc tac cgc gca aac ggc gca acc acc cgt tcc ctg gtt atg      912
Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met
    290                 295                 300
cgc gca aag tca ggc acc atc cgc cac atc gag tct gtc cac cag ctg      960
Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu
305                 310                 315                 320
tcc aag ctg cag gaa tac tcc gtg gtt gac tac acc acc gcg acc         1005
Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr
                325                 330                 335
<210>15
<211>335
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>15
Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val
            20                  25                  30
Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met
        35                  40                  45
Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val
65                  70                  75                 80
Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp
                85                  90                  95
Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr
        115                 120                 125
Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile
    130                 135                 140
Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly
145                 150                 155                 160
Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His
                165                 170                 175
Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu
            180                 185                 190
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser
        195                 200                 205
Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile
    210                 215                 220
Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile
225                 230                 235                 240
Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly
                245                 250                 255
Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp
            260                 265                 270
Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg
        275                 280                 285
Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met
    290                 295                 300
Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr
                325                 330                 335
<210>16
<211>1365
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1365)
<223>
<400>16
atg aat gat gag aat att caa agc tcc aac tat cag cca ttc ccg agt       48
Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser
1               5                   10                  15
ttt gac gat tgg aaa cag atc gag gtg tcg ctc tta gat gtc atc gaa       96
Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu
            20                  25                  30
tcc tca cgc cat ttt tot gat ttg aaa gat agc act gat cgt tct gcg      144
Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala
        35                  40                  45
tta gat gct gcg cta gag aga gca aaa aga gct gcc gca gtt gat acc      192
Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr
    50                  55                  60
aat gcc ata gaa gga atc ttc caa act gat cgc ggt ttt acc cat aca      240
Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr
65                  70                  75                  80
gtt gca acg cag gta ggg gct tgg gag caa caa atg gcg atg aaa ggc      288
Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly
                85                  90                  95
aaa cat gtt aag cct gcg ttt gac gat act cta gaa ggc ttt gag tat      336
Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr
            100                 105                 110
gtt ctc gat gca gta act ggt aga act cca atc tct cag caa tgg att      384
Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile
        115                 120                 125
aga aat ttg cac gcc gtc att ctg cgg agc caa gaa agc cac gag gtt      432
Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val
    130                 135                 140
ttt aca gcc gtt gga gtc caa aat cag gcg ctt cag aaa ggc gag tat      480
Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr
145                 150                 155                 160
aaa act cag cca aat agt cca cag cgc tca gat gga tct gta cat gca      528
Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala
                165                 170                 175
tac gcc cca gtt gaa gat act cct gct gaa atg gct aga ttt att tca      576
Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser
            180                 185                 190
gaa ctt gaa tct aag gaa ttc tta gca gcc gag aag gtt att caa gct      624
Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala
        195                 200                 205
gcc tat gcc cac tat gct ttc gta tgt att cat cct ttt gca gat ggg      672
Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly
    210                 215                 220
aat gga cga gtt gca cga gcc ttg gct agt gtt ttt cta tac aaa gat      720
Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp
225                 230                 235                 240
cct ggt gtc cct ctc gta atc tac caa gat caa cgc aga gat tac atc      768
Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile
                245                 250                 255
cat gct cta gaa gca gcg gac aag aat aac ccg ctc ctg ctg att aga      816
His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg
            260                 265                 270
ttc ttt gct gaa cga gtg acc gat act att aac tct att atc gtt gat      864
Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp
        275                 280                 285
ctc act acc ccg atc gcg ggt aaa tct ggt tcg gct aag ctt tcg gat      912
Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp
    290                 295                 300
gcg cta cgc ccc act cgc gta tta cca gaa tta cat gat gct gca cat      960
Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His
305                 310                 315                 320
agg ctc caa gaa agt tta ttt aca gaa atc cga tct cga ttg gat gaa     1008
Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu
                325                 330                 335
gaa gga aaa agg aat ggg ttg gag ttt cta ctt caa cgg att ttt atc     1056
Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile
            340                 345                 350
ggt tcc cca ttc aat ctg cca gag ggc tat aac gct ttc cct gat agc     1104
Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser
        355                 360                 365
tat tgt ctg acc tta gct ttc aat agc aac tct cca aaa caa atc ttc     1152
Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe
    370                 375                 380
cac ccg cta tcc ata gta ata gca gct cga gat ggg aaa aga gcg agc     1200
His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser
385                 390                 395                 400
agc gac ctc gtg gca gct act tct att gga tac aac ttt cac gct tac     1248
Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr
                405                 410                 415
gga cgt gaa gtc gag cct gtt gtt act gaa agc ttt cga gaa cgt gtg     1296
Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val
            420                 425                 430
aaa att tac gcc gac ggg att gta gat cac ttc tta acc gaa ctg gct     1344
Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala
        435                 440                 445
aaa aag ttt caa cag aat taa                                         1365
Lys Lys Phe Gln Gln Asn
    450
<210>17
<211>454
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>17
Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser
1               5                   10                  15
Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu
            20                  25                  30
Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala
        35                  40                  45
Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr
    50                  55                  60
Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr
65                  70                  75                  80
Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly
                85                  90                  95
Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr
            100                 105                 110
Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile
        115                 120                 125
Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val
    130                 135                 140
Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala
                165                 170                 175
Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Ara Phe Ile Ser
            180                 185                 190
Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala
        195                 200                 205
Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly
    210                 215                 220
Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp
225                 230                 235                 240
Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile
                245                 250                 255
His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg
            260                 265                 270
Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp
        275                 280                 285
Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp
    290                 295                 300
Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His
305                 310                 315                 320
Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu
                325                 330                 335
Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile
            340                 345                 350
Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser
        355                 360                 365
Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe
    370                 375                 380
His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser
385                 390                 395                 400
Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr
                405                 410                 415
Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val
            420                 425                 430
Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala
        435                 440                 445
Lys Lys Phe Gln Gln Asn
    450

Claims (48)

1.具有启动子活性的核酸用于基因转录的用途，所述核酸包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或
B)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或
C)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或
D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
2.表达单元用于基因表达的用途，所述表达单元包含根据权利要求1的具有启动子活性的核酸和额外地包含功能性连接的确保翻译核糖核酸的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的用途，其中表达单元包含：
E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或
F)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或
G)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或
H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段。
4.根据权利要求3所述的用途，其中表达单元由序列SEQ.ID.NO.2的核酸组成。
5.具有启动子活性的核酸，其包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或
B)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或
C)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或
D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段，条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.表达单元，其包含根据权利要求5的具有启动子活性的核酸和额外地包含功能性连接的确保翻译核糖核酸的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的表达单元，其包含
E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或
F)通过替换、插入或缺失核苷酸而衍生自该序列并具有与序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或
G)严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或
H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段，条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.用于通过如下方式改变或引发与野生型比较微生物中基因的转录率的方法
a)改变与野生型比较微生物中根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，其中所述内源性核酸调节内源性基因的转录，或
b)通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中的基因转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中的基因转录由如下方式实现
b1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物的基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
b2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
b3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸，以及功能性连接的一个或多个待转录的核酸。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中为提高或引发与野生型比较微生物中基因的转录率
ah)提高与野生型比较微生物中调节内源性基因转录的根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，或
bh)通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有提高的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有提高的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录由如下方式实现
bh1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸导入微生物的基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
bh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
bh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸，以及功能性连接的一个或多个待转录的核酸。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中为降低与野生型比较微生物中基因的转录率
ar)降低与野生型比较微生物中调节内源性基因转录的根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，或
br)将根据实施方案a)的具有降低的特异启动子活性的核酸导入微生物的基因组，以至内源性基因的转录在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行。
13.用于通过如下方式改变或引发与野生型比较微生物中基因的表达率的方法
c)改变与野生型比较微生物中调节内源性基因表达的根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
d)通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案c)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由以下方式实现
d1)将一个或多个根据权利要求2或3的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的表达单元控制下进行，或
d2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元具有改变的特异表达活性，以及功能性连接的一个或多个待表达核酸。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中为提高或引发与野生型比较微生物中基因的表达率
ch)提高与野生型比较微生物中调节内源性基因表达的根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
dh)通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的根据权利要求2或3的的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由如下方式实现
dh1)将一个或多个根据权利要求2或3的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组，以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以及功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中为降低与野生型比较微生物中基因的表达率
cr)降低与野生型比较微生物中调节内源性基因表达的根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
dr)将根据实施方案cr)的具有降低的特异表达活性的表达单元导入微生物的基因组，以至内源性基因的表达在所导入具有降低的表达活性的表达单元控制下进行。
18.根据权利要求8至17任一项中所述的方法，其中基因选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中基因可以根据需要包含其它调节元件。
19.根据权利要求所述的18方法，其中来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节蛋白LuxR、转录调节蛋白LysR1、转录调节蛋白LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸输出蛋白载体蛋白、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出蛋白、生物素连接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和亚基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节蛋白、RXN2910调节蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸外排蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
20.表达盒，其包含
a)至少一个根据权利要求2或3的表达单元和
b)至少一个其它待表达的核酸序列，和
c)根据需要其它遗传控制元件，
其中至少一个表达单元和其它待表达的核酸序列功能性连接在一起，并且其它待表达的核酸序列相对于表达单元为异源。
21.根据权利要求20所述的表达盒，其中其它待表达的核酸序列选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸。
22.根据权利要求21所述的表达盒，其中来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节蛋白LuxR、转录调节蛋白LysR1、转录调节蛋白LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸输出蛋白载体蛋白、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出蛋白、生物素连接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和亚基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节蛋白、RXN2910调节蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸外排蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
23.表达载体，其包含根据权利要求20至22任一项中所述的表达盒。
24.基因修饰微生物，其中遗传修饰导致改变或引发与野生型相比至少一个基因的转录率并且取决于
a)改变微生物中调节至少一个内源性基因转录的至少一个根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，或
b)通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
25.根据权利要求24所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录由如下方式实现
b1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物的基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
b2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
b3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有改变的特异启动子活性的核酸，以及功能性连接的一个或多个待转录的核酸。
26.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其具有至少一个基因与野生型比较提高或引发的转录率，其中
ah)提高与野生型比较微生物中调节内源性基因转录的根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，或
bh)通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案ah)的具有提高的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸为异源。
27.根据权利要求26所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求1的具有启动子活性的核酸或通过根据实施方案a)的具有改变的特异启动子活性的根据权利要求1的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录由如下方式实现：
bh1)将根据权利要求1的一个或多个具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸导入微生物的基因组，以至一个或多个内源性基因的转录在所导入的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸控制下进行，或
bh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的转录在根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的内源性核酸控制下进行，或
bh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求1的具有启动子活性，根据需要具有提高的特异启动子活性的核酸，以及功能性连接的一个或多个待转录的核酸。
28.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其具有至少一个基因与野生型比较降低的转录率，其中
ar)降低与野生型比较微生物中调节至少一个内源性基因转录的至少一个根据权利要求1的具有启动子活性的内源性核酸的特异启动子活性，或
br)将根据实施方案a)的具有降低的启动子活性的一个或多个核酸导入微生物的基因组以至至少一个内源性基因的转录在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行。
29.基因修饰微生物，其中遗传修饰导致与野生型比较改变或引发至少一个基因的表达率，并且取决于
c)改变与野生型比较微生物中调节至少一个内源性基因表达的至少一个根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
d)通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
30.根据权利要求29所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由如下方式实现：
d1)将一个或多个根据权利要求2或3的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，或
d3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元根据需要具有改变的特异表达活性，以及功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
31.根据权利要求29或30所述的具有至少一个基因与野生型比较提高或引发的表达率的基因修饰微生物，其中
ch)提高与野生型比较微生物中调节内源性基因表达的至少一个根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
dh)通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元为异源。
32.根据权利要求31所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3的表达单元或通过根据实施方案a)的具有提高的特异表达活性的根据权利要求2或3的表达单元调节微生物中基因的表达由如下方式实现：
dh1)将一个或多个根据权利要求2或3的表达单元导入微生物的基因组，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以至一个或多个内源性基因的表达在导入的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh2)将一个或多个基因导入微生物的基因组以至一个或多个所导入基因的表达在根据权利要求2或3的内源性表达单元控制下进行，所述内源性表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，或
dh3)将一个或多个核酸构建体导入微生物，其中所述核酸构建体包含根据权利要求2或3的表达单元，所述表达单元根据需要具有提高的特异表达活性，以及功能性连接的一个或多个待表达的核酸。
33.根据权利要求29或30所述的具有至少一个基因与野生型比较降低的表达率的基因修饰微生物，其中
cr)降低与野生型比较微生物中调节至少一个内源性基因表达的至少一个根据权利要求2或3的内源性表达单元的特异表达活性，或
dr)将一个或多个具有降低的表达活性的根据权利要求2或3的表达单元导入微生物的基因组，以至至少一个基因的表达在所导入具有降低的表达活性的根据权利要求2或3的表达单元控制下进行。
34.基因修饰微生物，其包含根据权利要求2或3的表达单元和功能性连接的待表达基因，其中所述基因相对于表达单元为异源。
35.根据权利要求34所述的基因修饰微生物，其包含权利要求20至22任一项中所述的表达盒。
36.根据权利要求24至35任一项中所述的基因修饰微生物，其中基因选自编码来自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸和核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类和脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸和编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中基因可以根据需要包含其它调节元件。
37.根据权利要求36所述的基因修饰微生物，其中来自氨基酸生物合成途径中的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节蛋白LuxR、转录调节蛋白LysR1、转录调节蛋白LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸输出蛋白载体蛋白、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出蛋白、生物素连接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和亚基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节蛋白、RXN2910调节蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸外排蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
38.用于制备生物合成产物的方法，其通过培养根据权利要求24至37任一项中所述的基因修饰微生物进行。
39.用于通过培养根据权利要求24、25、31或32任一项中所述的基因修饰微生物制备赖氨酸的方法，其中基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码转录调节蛋白LuxR的核酸、编码转录调节蛋白LysR1的核酸、编码转录调节蛋白LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出蛋白的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸和编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、转录调节蛋白LuxR的活性、转录调节蛋白LysR1的活性、转录调节蛋白LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出蛋白活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性和生物素连接酶活性。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出蛋白活性、苏氨酸外排蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性和苏氨酸合成酶活性。
42.用于通过培养根据权利要求24、25、31或32任一项中所述的基因修饰微生物制备甲硫氨酸的方法，其中基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ-合成酶的核酸、编码胱硫醚β-裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合成酶I的核酸、编码半胱氨酸合成酶II的核酸、编码依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶的核酸、编码不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白活性的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节蛋白的核酸和编码RXN2910调节蛋白的核酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性、胱硫醚β-裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合成酶I活性、半胱氨酸合成酶II活性、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用中的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节蛋白的活性和RXN2910调节蛋白的活性。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合成酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性和二氨基吡啶羧酸脱羧酶活性。
45.用于通过培养根据权利要求24、25、31或32任一项中所述的基因修饰微生物制备苏氨酸的方法，其中基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码磷酸丙糖异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合成酶的核酸、编码苏氨酸输出蛋白载体蛋白的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出蛋白的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸外排蛋白的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸和编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较提高的活性：天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖异构酶活性、苏氨酸合成酶活性、苏氨酸输出载体蛋白的活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸外排蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶活性。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中基因修饰微生物额外地具有至少一个选自如下活性的与野生型比较降低的活性：苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出蛋白活性、乙酰乳酸合酶活性、乙醇酮酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依赖辅酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、二羟酸脱水酶活性和二氨基吡啶羧酸脱羧酶活性。
48.权利要求38至47任一项中所述的方法，其中在培养步骤之后和/或期间自培养基分离并且根据需要纯化生物合成产物。
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