JP3731004B2 - ワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、DNA構造、そのDNA構造を含んでいる複製可能な発現ベクター、そのDNA構造を含んでいる弱毒化細菌、及びかかる弱毒化細菌を含んでいるワクチンに関する。
近年、細菌の芳香環生合成経路に関する遺伝子に非復帰突然変異を導入することによって弱毒化したサルモネラ菌株を基にした、新しい世代のサルモネラ経口生ワクチンが出現した。そのような菌株は、例えばEP−A−0322237に開示されている。上記サルモネラ経口生ワクチンは、ヒト及び動物のサルモネラ症用ワクチンとして有望であることを示しているが、それはまた、免疫系へ異種抗原を供給するためのキャリアとして効果的に使用することもできる。混合サルモネラワクチンは、ウィルス、細菌、及び寄生生物由来の抗原を供給するのに使用されて、遺伝子組み替え抗原に対する分泌性、体液性、及び細胞媒介性免疫応答を引き出した。混合サルモネラワクチンは、一回経口投与による多種ワクチン供給システムとしての大きな可能性を示す[C. Hormaeche et al, FEMS Symposium No. 63, Plenum, New York; pp 71-83, 1992]。
混合サルモネラワクチンを開発するに当たって克服すべき問題がある。主に考慮すべき点は、免疫応答を充分に誘発させ得るように、サルモネラワクチン中の遺伝子組み替え抗原について高レベルの形質発現を得ることである。しかしながら、高水準の異種抗原の発現が未調整のままだと、毒性を有し、また、細胞の生存能力に影響を及ぼす可能性があり[I. Charles and G. Dougan, TIBTECH 8, pp 117-21, 1990]、ワクチンを無効にし、又は組み替えDNAを無駄にしてしまう。この問題に対して、いくつかの解決案、例えば、エッセンシャル遺伝子である”オン−オフ”プロモータを担持しているプラスミドからの形質発現、又はサルモネラ染色体への異種遺伝子の組み込み等が述べられている。
上記問題を克服するための別の取り組み方としては、イン ビボで誘導することができるプロモータの使用があるだろう。そのようなプロモータの一つに、嫌気性条件下で誘導される大腸菌亜硝酸塩還元酵素のプロモータnirBがある。我々が先に行った国際特許出願PCT/GB93/01617には、nirBプロモータを含む構造を用いて形質転換した細菌を含有するワクチン組成物が記載されている。
本発明は、誘導可能な異種プロモータ、詳しくは、ストレス誘導タンパク質をコードするhtrA遺伝子のためのプロモータを含んでいるDNA構造の調製に関する。
htrA遺伝子は、K. Johnson et al, Mol. Microbios 1991; 5:401-7、及びそこで引用された文献に記載されており、42℃を超える温度に反応して生産される熱ショックタンパク質をコードしている遺伝子の一例である。
従って、本発明の最初の局面は、1又はそれ以上の異種タンパクをコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータ塩基配列を含んでいるDNA構造を提供する。
その一態様として、本発明は、上記定義にかかるDNA構造であって、2以上の異種タンパクからなる融合タンパクをコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータ塩基配列を含んでいるものを提供する。
融合タンパクを構成しているタンパク質同士は、可撓性のヒンジ領域によって連結していてもよい。
本発明の他の局面は、第1及び第2の異種タンパクをコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータ塩基配列を含むDNA構造であって、その第1の異種タンパクが、破傷風毒素(テタヌストキシン)のフラグメントC或いは1又はそれ以上のそのエピトープを含む抗原性配列であるものを提供する。
本発明のさらに他の局面は、上記定義にかかるDNA構造を含んでいる複製可能な形質発現因子であって、細菌への利用に適したものを提供する。
本発明のさらに他の局面は、上記定義にかかる構造によって形質発現されており、好適には実質的に純粋な状態の融合タンパクを提供する。
本発明のさらに他の局面は、上記定義にかかるDNA構造を用いて弱毒化細菌を形質転換することを特徴とする弱毒化細菌の調製方法を提供する。
本発明のさらにまた別の局面は、上記定義にかかるDNA構造を含んでいる宿主細胞、例えば、そのような細菌細胞を提供する。そのDNA構造は、染色体の外にある状態、例えばプラスミドの中に存在していてもよく、あるいはそれ自体知られている方法により宿主(例えば細菌)の染色体中に組み込まれていてもよい。
さらに本発明は、上記定義にかかる弱毒化ワクチン又はそこから形質発現させた融合タンパクと、薬学的に許容し得る担体とを含有することを特徴とするワクチン組成物も提供する。
第1及び第2のタンパク質は、異種タンパク質であることが好ましく、ポリペプチド免疫原であることが特に好ましい。例えば、それらは、ウィルス、細菌、菌類、酵母、又は寄生生物に由来する抗原性配列であってもよい。特に、第1のタンパク質は、破傷風毒素のフラグメントC又はそのエピトープを含んでいる抗原性配列であることが好ましい。
第2のタンパク質は、病原性有機体の抗原決定群であることが好ましい。例えば、その抗原決定群は、ウィルス、細菌、菌類、酵母、又は寄生生物に由来する抗原性配列であってもよい。
第1及び/又は第2の異種タンパク質として用いられるウィルスの抗原性配列としては、例えば、HIV−1やHIV−2のようなヒト免疫不全ウィルス(HIV)のタイプ、HIV−1やHIV−2のようなHIV由来のCD4受容体結合部位、A型、B型、又はC型肝炎ウィルス、タイプ2やタイプ14のようなヒトのライノウィルス、単純ヘルペスウィルス、タイプ2やタイプ3のポリオウィルス、口蹄疫病ウィルス(FMDV)、狂犬病ウィルス、ロタウィルス、インフルエンザウィルス、コクサッキーウィルス、例えばタイプ16パピローマウィルスのようなヒトのパピローマウィルス(HPV)、それらのE7タンパク質、E7タンパク質又はそのエピトープを含んでいるフラグメント、そして、サル免疫不全ウィルス(SIV)等に由来する配列がある。
細菌に由来する抗原の例としては、百日咳菌[Bordetella pertussis](例えば、P69タンパク質及び糸状赤血球凝集素(FHA)抗原[filamentous haemagglutinin antigens])、コレラ菌[Vibrio cholerae]、炭そ菌[Bacillus anthracis]、そして、大腸菌非耐熱性毒素Bサブユニット(LT−B)[E. coli heat Labile toxin B subunit]、大腸菌K88抗原、エンテロトキシン原性大腸菌抗原[enterotoxigenic E. coli antigens]等の大腸菌抗原に由来するものがある。他の抗原の例としては、細胞表面抗原CD4、マンソン住血吸虫P28グルタチオン S−トランスフェラーゼ抗原(P28抗原)[Schistoma mansoni P28 glutathione S-transferase antigens]、そして吸虫類、マイコプラスマ属、回虫類、条虫類、トラコーマクラミジア、マラリア寄生虫(例えば、熱帯熱マラリア原虫[Plasmodium falciparum]等のプラスモディウム属やバベシア属に属する寄生虫)の抗原があり、また、上記各抗原由来の免疫原エピトープをコードするペプチドなどがある。
好ましい抗原には、完全な長さのマンソン住血吸虫P28、免疫原性P28 aa 115−131ペプチド(これはB細胞及びT細胞エピトープを含む)のオリゴマー(例えば2分子、4分子、8分子からなるオリゴマー)、ヒトパピローマウィルスE7タンパク、単純ヘルペス抗原、口蹄疫病ウィルス抗原、サル免疫不全ウィルス抗原、例えばジフテリア毒素のガングリオシド結合領域のようなジフテリア毒素抗原が含まれる。
本願で用いられる際、htrAプロモータとは、かかるプロモータ自体、又は、その一部や誘導体であって、ある形質をコードしている塩基配列の発現をプロモートする能力を備えたものを意味する。好ましい塩基配列は、
であり、これはhtrAプロモータを含んでいる。
本発明の構造においてDNA塩基配列は、2以上のタンパクからなり、隣接し合うそのタンパク同士がヒンジ領域によって区別される融合タンパク質をコードしていてもよい。ヒンジ領域とは、ドメイン間に空間的及び一時的な分離を生じさせることによって、第1及び第2の両タンパクとは関係の無い折り畳みが生じるように設計された領域である。
ヒンジ領域は、典型的には、アミノ酸のプロリン及び/又はグリシンを高い割合でコードしている配列である。ヒンジ領域は、アミノ酸のプロリン及び/又はグリシンで全てが構成されていてもよい。
ヒンジ領域は、グリシン−プロリンのジペプチド単位を1又はそれ以上含んでいてもよい。
このヒンジ領域は、例えば、アミノ酸を約15個まで含んでいてもよく、例えば、少なくとも4個、好ましくは6〜14個であって、第1及び第2のタンパク間に可撓性を与えるような数のアミノ酸を含ませることができる。
その一態様として、ヒンジ領域は、抗体イムノグロブリンのヒンジドメインと実質的に対応したものとすることができる。IgG抗体のヒンジ領域は特にプロリンが豊富であり[T.E. Michaelson et al. J. Biol. Chem. 252, 883-9 1977]、抗原結合性ドメインと末端ドメインの間に柔軟な連結を生じさせると考えられている。
如何なる理論にも拘束される意図はないが、プロリンは、このアミノ酸の特徴である環状構造が、プロリン残基と隣接アミノ酸とを連結するペプチド結合のまわりでの回転を阻止することにより、ヒンジの剛直部分を形成すると考えられている。この性質は、プロリン残基とこれに隣接する残基が、整然としたアルファヘリックス構造やベータストランド構造になることを阻止すると考えられている。柔軟性は、非常に限られた立体化学的要求しか持っていない最も単純なアミノ酸であるグリシンにより与えられると考えられている。グリシンは、ヒンジ中の柔軟な関節として機能すると考えられている。他のアミノ酸、特にかさばる側鎖を有しないもの、例えばアラニン、セリン、アスパラギン、スレオニン等がグリシンと取って代わってもよい。
好ましい一態様において、ヒンジ領域は、4個以上のアミノ酸からなり、
−[X]p−Pro−[Y]q−Pro−[Z]r−
の配列で定義されるアミノ酸鎖である。
ここで、Proはプロリン、XとYはおのおの独立してグリシン又はかさばらない側鎖を有するアミノ酸、Zは何らかのアミノ酸、pは正の整数、qは1から10までの正の整数、そしてrは0又は0より大きな正の整数である。
ヒンジ領域は、第1及び第2の両タンパクとは異種の、はっきり区別できる領域とすることができる。また、ヒンジ領域は、第1タンパクのカルボキシ末端部又は第2タンパクのアミノ末端部によって規定することができる。
本発明は、最も好ましい局面において、ヒンジ領域によって連結された第1及び第2ポリペプチド免疫原をコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータを含んでいるDNA分子であって、第1ポリペプチド免疫原が破傷風毒素のフラグメントC又はそのエピトープを含むものを提供する。
本発明の別の好ましい局面においては、ヒンジ領域によって連結された第1及び第2ポリペプチド免疫原をコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータを含んでおり、細菌に利用するのに適しており、複製可能な形質発現ベクターであって、第1ポリペプチド免疫原が破傷風毒素のフラグメントC又はそのエピトープを含むものが提供される。
また別の局面において、本発明は、第1のタンパクをコードするDNAに対して作動可能に連結されたhtrAプロモータを含んでおり、その3’末端からヒンジ領域をコードするDNA塩基配列が延在し、その下流に1又はそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位があるDNA構造を提供する。
かかるタンパク質は、上記定義にかかる抗原性タンパクであることが好ましく、TetCフラグメント又はそのエピトープであるのが特に好ましい。
ヒンジ領域によって連結された第1及び第2の異種タンパクについての安定した形質発現は、イン ビボにおいて得ることができる。異種タンパクは、弱毒化細菌内で形質発現させることができ、その弱毒化細菌はワクチンとして使用できる。
弱毒化細菌は、サルモネラ、ボルデテラ、ビブリオ、ヘモフィルス、ナイセリア、そしてエルジニアの各属から選んでよい。もしくは、弱毒化細菌は、エンテロトキシン原性大腸菌の弱毒化株であってもよい。好ましくは、次の各種を挙げることができる。:チフス菌[S. typhi]−ヒトチフスの原因;ネズミチフス菌[S. typhimurium]−いくつかの動物種でのサルモネラ症の原因;腸炎菌[S. enteritidis]−ヒト食中毒の原因;豚コレラ菌[S. choleraesuis]−豚のサルモネラ症の原因;百日咳菌[Bordetella pertussis]−百日咳菌の原因;インフルエンザ菌[Haemophilus influenzae]−髄膜炎の原因;淋菌[Neisseria gonorrhoeae]−淋病の原因;エルジニア[Yersinia]−食中毒の原因。
細菌の弱毒化は、細菌の芳香族アミノ酸生合成経路に関する遺伝子の非復帰突然変異に起因するものであってもよい。芳香族アミノ酸生合成経路の分岐点に位置する化合物であるコリスミ酸の合成にかかわる遺伝子は少なくとも10個ある。これらのうちの幾つかは、細菌ゲノム上の広範に異なる位置に配列している。例えば、aro−A(5−エノールピルビルシキメート−3−フォスフェート シンターゼ;5−enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、aro−C(コリスメート シンターゼ;chorismate synthase)、aro−D(3−ジヒドロキネート デヒドラターゼ;3-dihydroquinate dehydratase)、及び、aro−E(シキメート デヒドロゲナーゼ;shikimate dehydrogenase)等がそれである。従って、突然変異はaro−A、aro−C、aro−D又はaro−E遺伝子に起こってもよい。
しかしながら、弱毒化細菌は、その芳香族アミノ酸生合成経路に関する2個の異なる遺伝子のそれぞれに非復帰突然変異を内包していることが好ましい。あるいは弱毒化細菌は、その芳香族アミノ酸生合成経路中の非復帰突然変異と、htrA、OmpR又はOsmCのような調節遺伝子中の非復帰突然変異とを内包していることが好ましい。好適な弱毒化細菌の例は、例えば、EP−A−0322237やEP−A−0400958等に開示されている。
本発明にかかるDNA構造を含んでいる弱毒化細菌は、ワクチンとして使用することができる。また、細菌によって発現させた融合タンパク(好ましくは実質的に純粋な状態である)も、ワクチンの調製に使用することができる。例えば、精製されたTetC−P28融合タンパクは、それ自体が免疫原性を有することが見出された。従って、本発明はさらなる局面において、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、及び活性成分として上記定義にかかる弱毒化細菌又は融合タンパクを含有することを特徴とするワクチン組成物を提供する。
ワクチンは1又はそれ以上の適当なアジュバントを含有していてもよい。
ワクチンは、患者に経口投与できるように凍結乾燥した状態、例えばカプセルに入った状態で提供すると有益である。そのようなカプセルは、腸溶性コーティング、例えばユードラジット”S”[Eudragit "S"]、ユードラジット”L”[Edragit "L"]、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等を含有する腸溶性コーティングを備えていてもよい。これらのカプセル剤は、そのまま用いてもよいし、あるいは凍結乾燥材料を投与前に元に戻して、例えば懸濁剤として用いてもよい。有機体の生存率を確保するためには、適切なpHの緩衝液で戻すのが有利である。弱毒化細菌及びワクチンを過度の胃酸から保護するためには、各回のワクチン投与前に重炭酸ナトリウム剤を投与するのが有利である。あるいは、ワクチンは、注射投与用、鼻腔内投与用、又は哺乳動物投与用[intramammary administration]投与用に調製してもよい。
ワクチン組成物は、粘膜への供給用、例えば、経口投与、経鼻腔内投与、経気管支内投与等に適合させるのが好ましい。
本発明のDNA構造を含んでいる弱毒化細菌は予防又は宿主の治療に用いてもよい。宿主は、主にヒト宿主であるが、動物宿主であってもよい。従って、微生物とりわけ病原体に起因する感染症は、本発明による弱毒化細菌の有効量を投与することによって阻止される。そして、細菌は、異種タンパク又は微生物に対する抗体を上昇させ得るタンパクを発現する。適用量は、宿主の身長と体重、処方されたワクチンのタイプ、異種タンパクの性質等の様々な因子に依存するであろう。
本発明の弱毒化細菌は、弱毒化細菌を上記定義にかかるDNA構造を用いて形質転換することによって調製してもよい。あらゆる適切な形質転換手法を利用して差し支えなく、例えば、エレクトロポレーション[electroporation]を利用できる。このようにして、タンパクを発現し得る弱毒化細菌又はその細菌にとっては異種のタンパクが得られる。弱毒化細菌の培養菌は、好気性条件の下で生育させてもよい。すると、異種タンパクの発現をごく僅かに押さえたままで、ワクチンを処方するのに充分な量の細菌を調製することができる。
発現ベクターは、htrAプロモータ、転写終結部位、翻訳開始及び終止コドンを含む適切な転写及び翻訳調節要素を備えており、また、適切なリボソーム結合部位を備えている。ベクターは、典型的には複製起点を含んでおり、所望により抗生物質抵抗性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を含む。ベクターは、例えばプラスミドであっても差し支えない。
本発明を以下の実験例と添付の図面を参照しつつ説明するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
ここで図1は、htrAプロモータを含んでいる、本発明の一局面にかかるプラスミドpHTRA1の構成を模式的に示す図である。
図2は、htrAプロモータ及びヒンジ領域に連結される破傷風毒素C−フラグメントをコードするDNAを含んでいるプラスミドpHTRA2の構成を模式的に示す図である。
図3は、プラスミドpTECH2の構造を説明したものである。
図4は、中間体プラスミドpBD907の構造を説明したものである。
図5は、図1に示された手順に従って調製されたプラスミドpHTRA1の構造を示したものである。
図6は、図2に示された手順に従って調製された生産物であるプラスミドpHTRA2の構造を示したものである。
図7A乃至7Bは、プロモータnirB、groE及びhrtAに対する温度変化の影響を説明したものである。
図8は、マクロファージ内におけるhtrA、nirB及びgroEからのlacZの発現を示したものである。
実験例 1
htrA−TetC−ヒンジ構造の調製
図1からわかるように、htrAプロモータと破傷風毒素Cフラグメントをコードする遺伝子とを含んでいるベクターを調製するための出発材料は、プラスミドpTETnir15であった。その構造と調製方法は、我々の先の国際出願PCT/GB93/01617(公開番号WO94/03615)及びそこでの引用文献、例えばWO−A−92159689に開示されている。
プラスミドpTETnir15は、破傷風毒素のC−フラグメント(TetC)をコードする遺伝子に連結したnirBプロモータを含んでいる。図1に示すように、pTETnir15をSacII及びBamHIで消化し、生じた2.9kb及び813bpのフラグメントをゲル精製した。2.9kbのフラグメントは、百日咳菌の糸状赤血球凝集素(FHA)遺伝子に由来する1.74kbフラグメントにつながれた。この1.74kbフラグメントは、SEQ.ID.NO.7に示された塩基配列を有する。生じたプラスミドをpBD907と称した。図5に、このプラスミドの制限地図を示す。中間体プラスミドpBD907を調製する目的は、nirBプロモータ塩基配列をhtrAプロモータ塩基配列に置き換えることができるように、TetCフラグメント中に存在するEcoRI部位を除去することにあった。これは、プラスミドpBD907をEcoRIとBglIIで消化することによって成し遂げられた。生じた4535bpフラグメントをゲル精製し、htrAプロモータを含んでいる次の55bpオリゴヌクレオチドにつないだ。
Oligo−1
Oligo−2
生じた中間体プラスミドpINT中のプロモータの存在は、DNA塩基配列決定によって確認した。それから、プラスミドpINTをSacII及びBamHIIで消化し、pTETnir15由来の813bpにつないで、プラスミドpHTRA1を形成した。pHTRA1のDNA塩基配列をSEQ.ID.NO.4に示す。そのhtrA領域は、最初の55塩基対により定義され、塩基配列
を有する。
SEQ.ID.NO.4に関し、GAACTTが−35ボックスであり、TCTGAが−10ボックスである。513塩基対及び2235塩基対に、それぞれSacII及びAlwN 1制限部位がある。
プラスミドpHTRA1は、ネズミチフス菌株BRD509(1992年10月12日付をもって承認番号NCTC12716の下に寄託)を形質転換するのに使用され、生じたBRD935と称する株について、標準法によりTetCフラグメントの形質発現を検査した。BRD935株は、ナショナル コレクション オブ タイプ カルチャー、コリンデール、ユナイテッド キングダム[National Collection of Type Cultures, Colindale, United Kingdom]に1995年1月27日付をもって承認番号NCTC12883の下に寄託された。
図2に示すように、プラスミドpHTRA1は、TetCフラグメントのC−末端に”ヒンジ”領域が存在する部分的変更が加えられた構成を調製するのに使用された。”ヒンジ”領域を表現するヌクレオチド塩基配列は、プラスミドpTECH2から得た。このpTECH2は、SEQ.ID.NO.5に述べられたDNA塩基配列を有し、533位及び2304位にそれぞれSacII及びAlwNI制限部位を備えている。このプラスミドの調製方法は、我々の先の国際出願PCT/GB93/01617(公開番号WO94/03615)に開示されている。
プラスミドpTECH2は、破傷風毒素Cフラグメントが連結したnirBプロモータ領域を含んでおり、そのCフラグメントの3’末端には、他のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入が可能ないくつかの制限部位に伴って、Gly-Pro-Gly-Proを繰り返す特徴をコードするヒンジ領域が、BamHI制限部位を介して連結している。ヒンジ領域と破傷風毒素Cフラグメント領域の一部とをコードしている1.7kbフラグメントは、SacII及びAlwNIを用いて消化してpTECH2から取り出したあと、精製した。生じたフラグメントのDNA塩基配列をSEQ.ID.NO.6に示す。
htrAプロモータ及び破傷風毒素CフラグメントをコードしているがヒンジはコードしていないプラスミドpHTRA1を、SacII及びAlwNIを用いて消化し、生じた2kbフラグメントをゲル精製した。
pTECH2由来の1.7kbフラグメント(SEQ.ID.NO.6)と、pHTRA1由来の2kbフラグメントとをつないで、3’末端にヒンジ領域を有する破傷風毒素Cフラグメントの遺伝子と、これに対して作動可能に連結されたhtrAプロモータとを一体的に内包するpHTRA2を形成した。
弱毒化ネズミチフス菌株をベクターpHTRA2を用いて形質転換し、そして標準的手法により選択したあと、プラスミドpHTRA2を内包しているサルモネラ株BRD1062を分離した。
プラスミドpHTRA2は、ヒンジ領域によって連結された融合タンパクをコードする構造を調製するための中間体として利用できる。そして、我々の先の国際出願PCT/GB93/01617に記載された手法に従えば、さらに別のタンパクをヒンジ領域上の制限エンドヌクレアーゼ部位内にクローニングすることができる。
材料及び方法
細菌株
大腸菌HB101及びBRD509(弱毒化ネズミチフス菌aroA、aroD株。認証番号NCTC12716で寄託)を使用して実験を行った。細菌はルリアブロス(LB)[Luria broth]培地、又は適切な抗生物質を補充し、1.6w/v%寒天で固化したLB培地中で生育させた。
DNAの操作
プラスミドDNAはアルカリ溶菌法により精製した[R. Maniatis, et al., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]。制限されたDNAフラグメントは、タウツ及びレンツ(Tautz and Rentz)の方法により寒天ゲルから精製した[1983, "An optimised freeze-squeeze method for the recovery of DNA Fragments from agarose gels". Analytical Biochem., 132, 14-19]。制限酵素は、ドイツのベーリンガー マンハイム[Boehringer Mannheim]と米国のニュー イングランド バイオラブス[New England Biolabs]により提供されたものであり、製造者の指示に従って使用した。
DNA塩基配列決定
二重鎖塩基配列を決定するためのDNAを、ステファンら[Stephen et al.]の方法により分離した[1990, A Rapid Method for Isolating High Quality Plasmid DNA Suitable for DNA Sequencing, Nucleic Acid Research, 18, No. 24, p 7463]。配列決定は、シークエンス バージョン 2 キット(USB)[Sequense Version 2 kit]を用いて実行した。このキットは、製造者の指示に従って使用した。
オリゴヌクレオチド
SAM 1 オリゴヌクレオチド シンセサイザー(Biolabs社、イギリス)を用いて合成した。
実験例 2
htrA−lacZ構造の調製
htrAプロモータの諸特性を、別の2つの誘導可能なプロモータ、すなわちnirB及びgroEと比較した。
nirB、htrA及びgroEプロモータの下流へのlacZの補助的クローニング
プラスミドpMAC1878(ファーマシア[Pharmacia])を制限酵素SalI及びBamHI[14]で開裂した後、そのプラスミドから、プロモータの無いlacZ遺伝子をコードするDNAフラグメントを低融点アガロース法により精製した。プラスミドpTETnir−15[S.N. Chatfield et al, Bio/Technology 10, 888-892]及びpTEThtrA−1は、それぞれnirBプロモータ、htrAプロモータを内包する。これらのプラスミドをSalI及びBamHIエンドヌクレアーゼを用いて消化し、lacZをコードする精製済みフラグメントをプロモータの下流にはめ込んでクローニングした。プラスミドpRZ−PESは、groEプロモータ由来のβ−ガラクトシダーゼ(β−gal)の形質発現を測定するために使用された。pRZ−PESは、groES及びlacZ遺伝子の上流に大腸菌groE−オペロンのプロモータを含んでいる。それは、プラスミドpOF39[O. Fayet et al., J. Bacteriol. 171, 1379-1385(1989)]由来のオペロンを担持している2.1kbのEcoRI−HindIIIフラグメントを、pUC19に補助的クローニングすることによって構成された。それから、新規のBalII部位を、突然変位誘発を起こす部位を利用して、groES遺伝子とgroEL遺伝子の間に導入した。groEプロモータとgroES遺伝子とを担持しているそのEcoRI−BglIIフラグメントを、EcoRI−BamHI切除プロモータ−プローブ プラスミドpRF5255[P.F. Lambert et al., J. Bacteriol. 162, 441-444(1985)]の中にクローニングし、プラスミドpRZ−PESを得た。そのプラスミドを、ネズミチフス菌LB5010(r-m+)[L.R. Bullas et al., J. Bacteriol. 256, 471-474(1983)]の中で調製し、エレクトロポレーションを利用してネズミチフス菌株BRD915(ネズミチフス菌SL1344 htrA)[S.N. Chatfield et al, Microbial Pathog. 12, 145-151(1992)]の中に導入した。正のlac活性を有する組み替え体は、アンピシリンとX−galを含有するL寒天平板培地上でスクリーニングした。
lacZ形質発現に対する環境条件変化の影響
組み替えプラスミドを内包する細菌株を、L−ブロス培地中で30℃に保持[skaing]して一晩中生育させた。培地は1:50に希釈され、生育は、OD600が2.8〜3.4に到達するまで、さらに30℃で3時間続けられた。各培地0.2mlずつを4℃に保管し、β−ガラクトシダーゼ活性のベースラインを測定するために使用した。そして各培地の残部を、後述するような異なる生育条件に移し、特別のことがない限り、0、2、4、6、及び24時間目にサンプルを採取した。各時点でOD600を測定し、細菌はβ−ガラクトシダーゼ分析を行うのに先立ち4℃で保管した。
感染したHEp−2、Caco−2及びTHP 1−マクロファージ細胞系における形質発現の測定
細胞は、24穴プレートに1穴当たり約105個を撒き、ドルベッコ[Dolbecco]の修正イーグル培地、これにはフェノールフタレインが含有されておらず(ICNフロー)、10%(容量/容量)ウシ胎児血清と2mMグルタミンが補充されている、中で37℃、5%CO2雰囲気下、一晩中生育した。一晩中培養して希釈された培地の細菌108のCFUを組織培養細胞に添加し、30℃でインキュベートした。いろいろな時点で組織培養の培地を採取し、細胞外細菌についてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。各サンプル中の細菌数は生存数を数えることにより測定し、対応するOD600は標準曲線を用いて測定した。感染した細胞は、燐酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄し、200mg/mlゲンタマイシンの存在下でさらに一時間インキュベートし、細胞外細菌を死滅させた。その後、細胞を、無菌蒸留水とピペットによる強い撹拌で溶菌した。おのおのの溶菌物について、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。各溶菌物中の細菌数は、生存数を数えることにより測定し、対応するOD600の値は標準曲線を用いて測定した。
結 果
本研究のために選ばれた各プロモータからの形質発現は、環境条件の変化に対して感受性を有している。nirBが嫌気的条件の変化に反応することは、すでに知られていた。最初の実験は、同様の多数複製プラスミド(multicopy plasmid)上に存在しサルモネラワクチン株BRD915に内包される各プロモータに由来する、lacZの形質発現レベルを評価するために行われた。異なるプロモータに対する温度変化の影響を、図7に示す。温度を30℃から37℃に変化させると(図7A)、lacZをnirB及びhtrAプロモータから形質発現させた場合には、β−ガラクトシダーゼ酵素単位が増加した。groEプロモータからは、β−ガラクトシダーゼ単位の顕著な増加は認められなかった。温度を30℃から42℃に変化させると、3つ全てのプロモータからβ−ガラクトシダーゼ単位数が増加した。β−ガラクトシダーゼレベルの増加速度は、groEからの場合と比べて、htrA及びnirBからの場合のほうが速かった(図7B)。温度を37℃から42℃に変化させることによって、nirB及びhtrAプロモータの誘導と、それよりも緩和ではあるがgroEプロモータからのβ−ガラクトシダーゼ単位の増加が起きた(図7C)。
またさらに、異なるプロモータからのβ−ガラクトシダーゼ形質発現は、真核生物細胞に入れた細菌のための選択を通じて試験されもした。HEp−2、Caco−2及びTHP−1マクロファージ細胞系を、108個の細菌に感染させ、30℃でインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ単位数をHEp−2の感染後3時間測定したところ、htrA及びnirBプロモータからのlacZの形質発現が著しく向上することがわかった(図2)。しかしながら、groEプロモータからのlacZ形質発現の増加は検出されなかった。同様の結果が、Caco−2細胞の感染において得られた(図示せず)。これに対して、マクロファージの細胞内環境においては、3つ全てのプロモータが誘導された(図8)。nirBプロモータが最も大きく影響を受け、groEの受けた影響が最も少なかった(図8)。各細胞系の細胞外培地中のβ−ガラクトシダーゼ単位数を測定したが、酵素活性の増加は見られなかった(図示せず)。
マクロファージ内での生育が、3つ全てのプロモータからの形質発現に影響を与えることがわかったので、マクロファージのファゴソーム内で普通に見られる過酸化水素に対する、それらの感受性を監視した。細菌を100μMの過酸化水素中に30℃でインキュベートしたが、groE及びnirBプロモータへの顕著な作用は起こらなかった。これに対して、htrAプロモータからは、β−ガラクトシダーゼのレベルが増加し、4時間経過までにベースラインのレベルから10Uまで達した。その後、6時間経過までにベースラインのレベルまで急激に減少した(図示せず)。プラスミドpLK[M. Szabo et al, J. Bacteriol. 174, 7245-7252]からのlacZの構造発現に対しては、いかなる環境条件も顕著な影響を及ぼさなかった(図示せず)。
本研究においては、異なる生育条件下でlacZ遺伝子を形質発現させるために、3つの環境調節性プロモータを使用した。プロモータは、3種類の誘導可能な細菌プロモータを代表しており、すなわち、嫌気的誘導性の大腸菌nirB、σE依存性htrA、及びσ32依存性groEである。nirBプロモータからの形質発現は、転写開始点の上流にある−52位と−30位の間に結合する転写因子FNRに依存する。FNR依存性転写は、第2転写因子NarLと一緒になって調節を受ける場合がある。しかしながら、ここで使用されたプラスミドpTETnir−15は、FNR依存性結合部位だけしか含んでいない。
細菌は、環境的ストレスが加えられた条件に対して、多種のタンパク質の合成速度を迅速に変化させて対応する。多くの場合、トランジット インダクション(transit induction)は、タンパク質レベルを迅速に調節して、新しい安定状態に適合させる。我々は、本研究において、β−ガラクトシダーゼのレベルに対する環境条件の影響を試験した。我々は、温度変化による作用が、groEに対する場合と比べて、htrAプロモータに対する場合のほうが強いことを発見した。この結果は、htrAプロモータがインビボ試験において、RNAポリメラーゼ[11,12]を含有するσEによって、groE(σ32依存性である)よりも先に誘導され、また、σ32と一緒になって誘導される事実と整合する。意外にも、nirBも同様に、温度の上昇によって高められた。高温時に生育培地中の酸素濃度が低い可能性もあるが、温度を30℃から37℃に変化させると、nirBプロモータから形質発現させたβ−ガラクトシダーゼ単位の急速な増加をもたらすと言う事実は、FNRが、他のストレスタンパク調節因子のように、数々の環境刺激に反応するであろうことを示唆している。同様に、htrAも嫌気的生育条件の下で誘導されたことから、このプロモータがσE以外の因子により調節されているか、または低い酸素分圧の下でもσEが活性化されていると考えられる。
ネズミチフス菌が発病力を保持するためには、その菌がマクロファージ内で生き延びることが可能でなければならない。この生き残りは、過酸化水素の生産を包含する毒性の殺菌メカニズムが及ぶ範囲に耐える細菌の耐久力に依存する。大腸菌htrA突然変異体とは異なり、ネズミチフス菌htrA突然変異体は温度上昇によっては死滅しないが、顕著なレベルの過酸化水素から生き延びる能力がどちらかと言うと損なわれていることが、すでに知られている。興味深いことに、試験したプロモータのうち過酸化水素の存在下で形質発現したものは、htraAプロモータただ一つだけであった。
細胞内環境の影響を測定するために、試験に供したプラスミドを内包するサルモネラ菌をいくつかの異なる培養真核生物細胞系に入れた後で、3つの異なるプロモータからの形質発現のレベルを監視した。細菌をインビトロで生育させ、30℃で真核生物細胞を感染させるのに使用した。というのは、温度が30℃から37℃に変化すると、htrA及びnirBプロモータが、双方とも劇的に誘導されるからである。我々は、nirB及びhtrAプロモータ双方からのβ−ガラクトシダーゼ形質発現のレベルが、試験に供した全ての細胞系で増加したのに対して、groEプロモータは、感染させたマクロファージ内でのみ誘導されたことを発見した。
配 列 表
(1)概括的情報
(i)出願人
(A)名称:メデヴァ ホールディングス ビーヴィ
(B)ストリート:チャーチル−ラーン 223
(C)都市名:アムステルダム
(E)国名:オランダ国
(F)郵便番号:1078ED
(ii)発明の名称:ワクチン
(iii)配列の数:7
(iv)コンピュータ読取フォーム
(A)記録媒体のタイプ:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM PC compatible
(C)オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエアー:PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO)
(vi)優先権出願データ
(A)出願番号:GB 9401795.1
(B)提出日:1994年1月31日
(2)SEQ ID NO:1についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:55塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(vi)起源:
(A)生物名:Salmonella typhimurium
(ix)配列の特徴
(A)ネーム/キー:promoter
(B)存在位置:1..55
(xi)配列:SEQ ID NO:1:
(2)SEQ ID NO:2についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:55塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:SEQ ID NO:2:
(2)SEQ ID NO:3についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:55塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:YES
(xi)配列:SEQ ID NO:3:
(2)SEQ ID NO:4についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:3712塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴
(A)ネーム/キー:htrA promoter
(B)存在位置:1..55
(ix)配列の特徴
(A)ネーム/キー:SacII restriction site
(B)存在位置:513
(ix)配列の特徴
(A)ネーム/キー:AlwN 1 restriction site
(B)存在位置:2235
(xi)配列:SEQ ID NO:4:
(2)SEQ ID NO:5についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:3769塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:SEQ ID NO:5:
(2)SEQ ID NO:6についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:1766塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部(internal)
(ix)配列の特徴
(A)ネーム/キー:hinge region
(B)存在位置:923..934
(xi)配列:SEQ ID NO:6:
(2)SEQ ID NO:7についての情報:
(i)配列の特性
(A)長さ:1736塩基対
(B)型:核酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(v)フラグメント型:中間部(internal)
(xi)配列:SEQ ID NO:7:
Claims (14)
- 1又はそれ以上の異種タンパク質をコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されたhtrAプロモータ塩基配列を含んでなるDNA構造を有する弱毒化細菌、及び薬学的に許容し得る担体を含有することを特徴とするワクチン組成物。
- 前記細菌がグラム陰性細菌であることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
- 前記細菌が、サルモネラ、ボルデテラ、ビブリオ、ヘモフィルス、ナイセリア及びエルジニアの各属から選ばれることを特徴とする請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記細菌が、エンテロトキシン原性大腸菌、チフス菌、ネズミチフス菌、腸炎菌、豚コレラ菌、百日咳菌、インフルエンザ菌、淋菌及びエルジニアの各属から選ばれることを特徴とする請求項2に記載のワクチン組成物。
- htrAプロモータ塩基配列が、2以上のタンパク質からなる融合タンパクをコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されていることを特徴とする請求項1から4の何れか1つに記載のワクチン組成物。
- 融合しあっているタンパク質が可撓性のヒンジ領域によって連結されていることを特徴とする請求項5に記載のワクチン組成物。
- ヒンジ領域が、4個以上のアミノ酸からなり、次の配列で規定されるアミノ酸鎖であることを特徴とする請求項6に記載のワクチン組成物
−[X]p−Pro−[Y]q−Pro−[Z]r−
ここで、Proはプロリン、XとYはおのおの独立してグリシン又はかさばらない側鎖を有するアミノ酸、Zは何らかのアミノ酸、pは正の整数、qは1から10までの正の整数、そしてrは0又は0より大きな正の整数である。 - htrAプロモータが、第1及び第2の異種タンパク質をコードするDNA塩基配列に対して作動可能に連結されており、第1の異種タンパク質は、破傷風毒素フラグメントC又は1つ或いはそれ以上のそのエピトープを含む抗原性配列であることを特徴とするクレーム5、6又は7のいずれか1つに記載のワクチン組成物。
- 経口投与用、又は経鼻腔内投与用に適合されたものであることを特徴とする請求項1から8の何れか1つに記載のワクチン組成物。
- 弱毒化細菌が、細菌の芳香族アミノ酸生合成経路に関する遺伝子中に非復帰突然変異を有することによって弱毒化されていることを特徴とする請求項1から9の何れか1つに記載のワクチン組成物。
- 弱毒化細菌が、htrA遺伝子中に非復帰突然変異を付加的に有していることを特徴とする請求項10に記載のワクチン組成物。
- 弱毒化細菌が、芳香族アミノ酸生合成経路に関する2つの異なった遺伝子のそれぞれに非復帰突然変異を内包していることを特徴とする請求項10又は11に記載のワクチン組成物。
- 前記芳香族アミノ酸生合成経路における前記遺伝子が、aro−A、aro−C、aro−D、及び、aro−Eから選択されることを特徴とする請求項10から12の何れか1つに記載のワクチン組成物。
- 前記2つの異なった遺伝子は、aro−A及びaro−Dであることを特徴とする請求項12に記載のワクチン組成物。
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