CN109777821B - 质粒pRC12及其在微生物降解卤代烃污染物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种质粒pRC12及其在微生物降解卤代烃污染物中的应用，质粒pRC12核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述应用是将含质粒pRC12的基因工程菌接种至含卤代烃污染物的无机盐培养基中，在28～32℃、pH6.8～7.2下进行降解，实现对卤代烃污染物的降解；本发明质粒pRC12可大幅度提高氯酚类有机污染物的处理能力，卤代氯酚类有机污染物的生物降解效率提高分别为：一氯酚(MCP)56.12％、二氯酚(DCP)55.09％、三氯酚(TCP)54.88％、五氯酚(PCP)47.35％。

Description

质粒pRC12及其在微生物降解卤代烃污染物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种氯酚降解性质粒pRC12及其在微生物分解处理卤代烃污染物中的应用。

(二)背景技术

细菌降解性质粒在有机污染物微生物降解过程中起重要作用，它们编码了一些降解过程中的关键酶类，赋予细菌分解代谢各种复杂有机化合物的能力。迄今已报道的卤代降解性质粒主要以氯代芳香族化合物降解性质粒为多，如氯代苯甲酸降解质粒Pac25、Pac27和Pwr1，以及2,4-二氯苯氧基乙酸降解质粒pJP4,pEML159和pRC10等。国内关于有机污染物降解性质粒的研究工作开展得比较晚，在80年代末才陆续有一些报道。

本发明涉及到一种氯酚降解性质粒pRC12，并建立了质粒的物理图谱，对今后利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，消除有关物质的环境污染创造了条件。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种卤代烃污染物(特别是氯酚)降解性质粒pRC12及其在微生物降解卤代烃污染物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种源自环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)CCTCC NO:M207006的质粒pRC12，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还涉及含有所述质粒pRC12的基因工程菌，所述基因工程菌以感受态大肠杆菌DH5α为受体，经电转化质粒pRC12，获得含质粒pRC12的基因工程菌。

本发明还提供一种所述质粒pRC12在微生物降解卤代烃污染物中的应用，所述卤代烃污染物为氯酚污染物，优选为下列之一：一氯酚(MCP)、二氯酚(DCP)、三氯酚(TCP)或五氯酚(PCP)。

本发明所述质粒pRC12降解卤代烃污染物的应用是将含质粒pRC12的基因工程菌接种至含卤代烃污染物的无机盐培养基中，在28～32℃、pH6.8～7.2下进行降解，实现对卤代烃污染物的降解；所述含质粒pRC12的基因工程菌接种量以卤代烃污染物体积计为1×10⁶个/mL，所述卤代烃污染物在无机盐培养基中终浓度为10-50mmol/L，优选32mmol/L。

本发明所述无机盐培养基组成：硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L(最后放)，溶剂为去离子水，调pH 7.0。

本发明所述含质粒pRC12的基因工程菌以菌悬液的形式接种，所述菌悬液按如下方法制备：将含质粒pRC12的基因工程菌接种在无碳查氏固体培养基斜面上，斜面的对侧试管壁上放置滴有一氯酚的棉花，30℃培养48h，获得斜面菌种；无碳查氏固体培养基组成：硝酸钠2.0g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.02g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.31g，水1000ml；将斜面菌种接种在含32mM五氯酚的种子培养基中，30℃培养48h，获得种子液，将种子液以体积浓度5％的接种量接种到装有1000mL含32mM五氯酚的种子培养基的5L三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30℃震荡培养48h终止培养，获得菌悬液；种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃ 2g/L、K₂HPO₄ 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、Fe₂SO₄ 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟。

所述无机盐培养基组成：硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L，溶剂为去离子水，调pH 7.0。

本发明提供了建立了质粒pRC12的物理图谱，对今后利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，消除有关物质的环境污染创造了条件。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种氯酚降解性质粒pRC12，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，可大幅度提高氯酚类有机污染物的处理能力。卤代氯酚类有机污染物的生物降解效率提高分别为：一氯酚(MCP)56.12％、二氯酚(DCP)55.09％、三氯酚(TCP)54.88％、五氯酚(PCP)47.35％。

(四)附图说明

图1为质粒pRC12电泳检测图谱；泳道1为质粒pRC12，泳道2为阴性转化子质粒提取，泳道3为阳性转化子质粒提取，泳道M为核酸分子量标准样品。

图2为步骤2获得的质粒pRC12利用Bam HI、Eco RI、Hind III限制性酶切图谱；泳道1为Bam HI酶切，泳道2为Eco RI酶切，泳道3为Hind III酶切，泳道M为核酸分子量标准样品。

图3为pRC12物理图谱；

图4阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)对不同卤代芳香烃的降解特性。

图5降解菌的分离和纯化示意图。在无碳平板上涂布菌悬液，倒置平板，在皿盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴适量的氯酚，置30℃培养，定时补加氯酚，结果2～3d后，平板上长出了丰厚的菌苔，对照平板的棉花中加蒸馏水，无菌苔出现。获得的单菌落转入20×200mm大试管斜面，在斜面的对面试管壁上放置含待降解物的棉花，便可获得斜面菌种。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：质粒pRC12的获得及鉴定

1、质粒检测：

(1)将出发菌株环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)CCTCC NO:M207006(已在专利申请2007100675100中公开)接种至3mL LB培养液，30℃培养过夜，7000转/分4℃离心10分钟，收集沉淀；

(2)沉淀重悬于l mL TE缓冲液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸调整pH值为7.9)；

(3)加入2mL裂解液(3％SDS,50mM Tris，加1.6mL2N NaOH调整pH为12.6)裂解，轻摇混匀；

(4)在50～65℃的水浴中加热20min，然后加入2倍体积的氯仿；

(5)轻轻振荡乳化，离心破乳(6000转/分，15分钟，40℃)；

(6)上清液直接用琼脂糖凝胶电泳分析质粒带，条件如下：

琼脂糖浓度0.7％，电泳电压80V，电泳缓冲液TBE，marker为λDNA/HindIII，采用凝胶成像仪分析电泳结果(如图1中泳道1)。

2、质粒的提取：采用碱法提取质粒。

(1)取步骤1在30℃过夜培养的环状芽胞杆菌(CCTCC NO:M207006)LB菌液5mL于微量离心管中，16000r/min离心3～4s，弃上清，沉淀用吸水纸吸干，即为菌体。

(2)菌体中加入碱裂解液Ⅰ100μL，剧烈振荡充分悬浮菌体。

(3)不离心加入200μL新鲜配置的碱裂解液Ⅱ，快速柔和颠倒数次，以混合内容物。

(4)直接加入经4℃冰预冷的碱裂解液Ⅲ150μL，置于冰上5min。

(5)16000r/min离心5min，取上清，转移至另一新的离心管中，重复该步骤一次。

(6)加入等体积的酚：氯仿(1：1，v/v)，剧烈振荡。

(7)16000r/min离心2min，用移液枪吸出上清，注意中间层蛋白不要吸出来。

(8)加入2倍体积无水乙醇(约1mL)，室温放置2min，16000r/min离心5min，弃上清。

(9)加入1mL 75％乙醇，将微量离心管颠倒数次，16000r/min离心2min，弃上清，用吸水纸洗干，不够干可以离心后用移液枪吸去余液，室温放置2～3min，直至试管内没有可见的液体存在。

(10)加入30μL含有去DNA酶的RNA酶A(20μg/mL)的超纯水或TE溶液重新溶解核酸，获得质粒pRC12(核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)溶液，贮存于-20℃。

碱裂解液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，l0mM EDTA(pH8.0)。

碱裂解液Ⅱ：10M NaOH 60μL，10％SDS 300μL，dd H₂O 2640μL总体积3000μL；或10M NaOH20μL，10％SDS 100μL，dd H₂O 880uL总体积1000μL。

碱裂解液Ⅲ(3M NaAc(pH4.8))：无水NaAc 26.4g用70mL ddH₂O溶解，用约20mL冰乙酸调pH至4.8，定容至100mL。

3、质粒的消除：采用丫啶橙消除法。

出发菌株环状芽胞杆菌CCTCC NO:M207006接种至3mL LB培养液，30℃培养过夜，在无碳查氏固体培养基平板上涂布菌悬液，倒置平板，在皿盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴适量的一氯酚，置30℃培养2～3d后，平板上长出菌落，挑单菌落接种于3mL含氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基中，30℃摇床过夜培养，然后取200μL菌液，接入5mL含丫啶橙75mg/L的LB培养基，30℃摇床培养24小时，然后无菌生理盐水稀释后，分别涂布至以下四个平板：①LB平板；②LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL)；③LB平板(含硝基苯100mg/L)；④LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL和硝基苯100mg/L)，30℃培养2-3天，检查菌落在平板上的生长情况，结果：①LB平板有菌落生长；②LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL)无菌落生长；③LB平板(含硝基苯100mg/L)有菌落生长；④LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL和硝基苯100mg/L)无菌落生长。

4、质粒的转化：

感受态细胞的制备：用接种环挑取甘油保存的E.coli DH5α菌种在LB琼脂平板上划线培养。取琼脂平板上一个单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养，至OD₆₀₀＝0.3～0.4时，将培养管冷却至0～4℃，获得菌液。取若干灭菌的1.5mL离心管，各加入200μL菌液，再各加入过滤除菌的4mol/L CaCl₂水溶液5μL，加上盖，轻弹管底使混匀，即制得E.coliDH5α感受态细胞。

质粒转化：在E.coli DH5α感受态细胞中加入步骤2制备的5μL质粒pRC12溶液(采用碱法提取质粒，DNA≤10ng)，轻弹离心管底部，使质粒与细菌混匀。0～4℃冰浴中静置30min。在42℃水浴中，安静放置90～120s。0～4℃冰浴1～2min。37℃振荡培养45min。将离心管中全部菌液铺到步骤3含相应抗生素的四个LB琼脂平板上，LB平板(含氨苄青霉素50μg/mL)长出的菌落为阳性转化子。在37℃温箱中，倒置培养过夜。菌落计数、扩增、鉴定，方法同步骤2，采用碱法提取质粒上清液直接用琼脂糖凝胶电泳分析质粒带，条件如下：琼脂糖浓度0.7％，电泳电压80V，电泳缓冲液TBE，marker为λDNA/HindIII。结果见图1中的泳道3。

5、质粒的应用

将出发菌株环状芽胞杆菌CCTCC NO:M207006、大肠杆菌E.coli DH5α、阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)和阴性转化子E.coli DH5(mcp^－)分别接种至含16mmol/L一氯酚(MCP)为唯一碳源的无机盐培养基中，在37℃下培养72h，取培养液制样后用气相色谱分别测定MCP残留浓度，初始浓度减去残留浓度除以初始浓度的百分比即转换成降解率，结果见表1所示。

无机盐培养基组成：硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L(最后放)，溶剂为去离子水，调pH 7.0。

气相色谱参考条件：色谱柱，DB-5MS毛细管色谱柱或相当者(30m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱升温程序，初温80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，290℃后运行4min；进样口温度230℃；进样模式，不分流进样；进样体积lμL；载气，高纯氦气，纯度≥99.999％，恒流模式，流速为1.0mL/min。

阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)能在16mmol/L一氯酚(MCP)为唯一碳源的无机盐MM培养基中生长良好，而质粒消除后的阴性转化子E.coli DH5(mcp^－)则不能以MCP为唯一碳源生长。E.coliDH5阳性转化子培养72h的MCP生物降解效率见表1。

表1大肠杆菌E.coli DH5阳性转化子培养72h的MCP生物降解效率

6、质粒的限制性酶切分析与物理图谱

对步骤2获得的质粒pRC12和pJP4(购自“辉骏生物”)进行限制性酶切分析实验，首先要应用紫外分光光度计测定核酸浓度，然后按照每一种酶的反应条件和方法(参看各种酶附带的说明书)，将质粒和酶(Bam HI、Eco RI、Hind III)加入反应体系中，然后进行酶切反应，结果见图2和表2(表2为质粒pRC12和pJP4同样采样三种限制性酶切片段的比较，用于证明pRC12分子量的准确性)。采用UP全自动凝胶成像仪对酶切实验结果进行分析。采用vector NTI软件绘制物理图谱，结果见图3，说明质粒酶切结果验证正确。

表2：质粒pRC12和pJP4限制性酶切片段比较

实施例2：质粒转化E.coli DH5

(1)质粒的转化与扩增：

质粒转化：在实施例1方法制备的E.coli DH5α感受态细胞5μL中加入实施例1制备的5μL质粒pRC12溶液(DNA≤10ng)，轻弹离心管底部，使质粒与细菌混匀。0～4℃冰浴中静置30min。在42℃水浴中，安静放置90～120s。0～4℃冰浴1～2min。37℃振荡培养45min。将离心管中全部菌液，铺到含AMP100μgml的LB琼脂平板上。在37℃温箱中，倒置培养过夜，获得阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)。同样条件下以pBR322(购自“辉骏生物”)做为对照转化E.coli DH5α感受态细胞。

经检测阳性转化子的转化频率为2.17×10⁵/μg质粒DNA，而对照组pBR32阳性转化子的转化频率为3.81×10⁷/μg质粒DNA。

将质粒pRC12的阳性转化子分别接种至含16mmol/L一氯酚(MCP)为唯一碳源的无机盐培养基中，在37℃下培养72h，取培养液制样后用气相色谱分别测定MCP残留浓度，初始浓度减去残留浓度除以初始浓度的百分比即转换成降解率，结果56.12％。

质粒pRC12阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)能在16mmol/L一氯酚(MCP)为唯一碳源的无机盐培养基中生长良好，而质粒消除后的E.coli DH5(mcp^－)不能以PCP为唯一碳源生长(用于证明质粒消除的效果)。以上试验结果证实了MCP代谢相关基因定位在菌株所含质粒上，该质粒为MCP的降解性质粒，并可在不同种属菌株之间转移。

实施例3：质粒pRC12阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)在生物降解处理五氯酚中的应用(1)菌株培养：采用无碳查氏固体培养基如图5方法培养，首先在无碳查氏固体培养基表面涂布质粒pRC12阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)菌悬液，然后在皿盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴0.2ml(2滴)五氯酚，置30℃下培养，24小时后滴加五氯酚0.3ml(3滴)。对照平板的棉花中加等量无菌生理盐水，30℃培养2～3天后，获得的单菌落转入大试管无碳査氏培养基斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有一氯酚的棉花，便可获得斜面菌种。无碳查氏固体培养基组成：硝酸钠2.0g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.02g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.31g，水1000ml，pH自然。

(2)菌种扩大培养：步骤(1)斜面菌种接种在种子培养基中，30℃培养48h，获得种子液。再将50mL种子液(细胞浓度1×10⁶个/mL)接种到装有1000mL种子培养基的5L三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30℃震荡培养48h终止培养，获得菌悬液。种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃ 2g/L、K₂HPO₄ 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、Fe₂SO₄ 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，五氯酚终浓度为32mM，培养时分4次加入；

(3)五氯酚的降解：将步骤(2)获得的菌悬液(浓度1×10⁶个/mL)，在

的有机玻璃生物滴滤池内(MHEP-233型生物滴滤池，上海华育科教设备制造有限公司)，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种液(组成：硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L，溶剂为去离子水，调pH 7.0。48L，接种菌悬液约9.6L，接种和挂膜约需30天。终浓度32mM五氯酚加入接种液中，作为混合循环液在滴滤池内逆流操作，循环液pH值为7.0±0.5，温度维持在28.5±2℃的条件下，循环液在滴滤池空床停留时间为15.7s、五氯酚进口浓度为0.8～4.56g/m³的范围内，去除效率为33.52％～54.18％。

实施例4：质粒pRC12阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)对不同氯酚的降解效果

(1)菌株培养：同实施例3。

(2)菌种扩大培养：同实施例3。

(3)阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)对不同氯酚的降解特性。

在初始pH为7.0的无机盐培养基中，分别加32mmol/L的一氯酚(MCP)、二氯酚(DCP)，三氯酚(TCP)和五氯酚(PCP)为唯一碳源和能源，再分别接入阳性转化子E.coli DH5(mcp⁺)200μL(1×10⁶个/mL)，置30℃、180rpm摇床中黑暗培养3d，每隔12h取样，制样后用气相色谱分别测定DCP，MCP、PCP和TCP残留浓度，初始浓度减去残留浓度除以初始浓度的百分比即转换成降解率。结果：在初始pH为7.0的无机盐MM培养基中调节NaCl初始浓度为10g L^-1时，36h基本达到最大降解效率，对MCP、DCP、TCP和PCP、分别为56％、54％、51％和42％(图4)。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 质粒pRC12及其在微生物降解卤代烃污染物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49168

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

tcgaccgcgc cggcggcatc gccaggttcg gcgatgctgg ccagctcccg gcatcgtcgc 60

ttgtgacgat gctgcaggat gattccacca ggccctcggc gggcctccct cgccagaaat 120

ggcgatgctc gagaaaaaag cccggcgacc gccgggcttc gtttttatgc gggcctggct 180

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atggcggggc gatgggtggg ggtcggtggt cggcgatgcc cggcgctggg cgtgtcagcc 2880

ctccagcagc gcgacaagct gcacggtgcc aaggtcggcc tcgaactcct ggccgtcatc 2940

ctcgtatttg agccaggccc agccctcggc cgggggccgg cggttgagga tcagccgtgc 3000

cggccggtcg tcgtgcttga cctggatgat ggccttcttg agcttgtcgg ggtcggcctc 3060

cttcggctcc ttcttcccct tggcgtcatc atcctgcggc ccctgctcgc cgtcgccggc 3120

ctcggcgtcg gtcttgccgg tcagcgcatc gacggtgttg ggatcacggt cgccgtcctc 3180

gtgactgcgc ttgtcctcca ggaactcgcg cagcagcttc accgagccgc gcgtcagctc 3240

ctggctgtcg tcggccagcc aggcggccac ctcgtcgggg ttcttcttgt aggccgtcac 3300

cagctcgttg atgacagtca cgtccttgcc ccggccgcta ttgaacgcct cggcaatggg 3360

ttcgggcaag tccagcagcg tgacgtgctg cgtgacgaag gccggcgact tgccgatctc 3420

cttggcgatc tcgcccttct tcttgccctt cgccagctcg cggccgatga agtcggcgat 3480

ctcacgcgcc gtcagctcgt tgcgttgcag gttctcgata acctggtcgg cctcgttgta 3540

gtcgttgtcg atgaaggccg ggatcgtggt cttgtgcgcc cacttcgagc cgcgatagcg 3600

ccgcgcgccg tggttgatga ggtagcgccc cggtgcgtcc gggttctcgc gcacgctgat 3660

gggcgacttc acgccgcgcg ctttgatcgt ctcgccgatc tccgcgatgc tctccggcga 3720

gaagccgggg ttgtcggccg tgcgcggctg gtgcgggtct tcgtcgatca ggtcaagcgg 3780

cagctcctgc gggcctgcgc cgccggcgtt ggccgccggc tgctcgttca gcaggccggc 3840

caggtcgccc agcccgtcca ggcccagccc ggacgattgc ggcttgtcct gctccttctt 3900

cttggcgttg gtcttggcgc tcattgcgcg atctccatct tcgtgaacac gtaatccgcc 3960

agcgcacgca cctcctgggt ggccttccgc gcggcggtct tcttgatctt ccacaccggc 4020

atctgctcgc ccagcgcctc ggcgatgctg tcacgcgcgc cgatgctgaa cggcaagatg 4080

agctgcgggt atgcctgctg caacgtcgcc aggttgttga cgtggcgcgg cttccgcgcg 4140

tccaccttgt tcggcaccat gccgaggaag cgcagcttgg ggttctgctt gcgcaggttg 4200

ctgatgaccg cgaccatctt cttcatgccc tgcaagctgt acgcctccat ttcgatgggc 4260

gacagcatgt agtcggccgt cagcacggcc gccgtcatgg cgacgccaag ggagggggcc 4320

gtgtcgatca ggcacacgtc gaagaactcg cccagcgcgg ccacactggc ccgcagcgcg 4380

gcggccgcct gggaaagctc catcttgtcc aggttcgcca ggttggcgtc tgccgcgatc 4440

agcgccaggc cgtcatcctc ccggtcagcg aaccaggcgc gcagctcgtc gccgccggcg 4500

gtgaacatgc gactggcggg atagcccgag tcgtggccgg ccagcgtcca gctcgcattg 4560

ccctgggtgt ccaggtcgat cactgcaacc cgaaggccgc gctcctggaa gtcgaacgcc 4620

aggtggcagg ttgcgaacgt cttgccttga ccgcctttct gaattgccgt gaccagtgtt 4680

ttcatgagtt gggttcctgt ttcctctttc ccttggcgtc ggcttcccaa cgcttgacga 4740

tgaacgcttg atgctccggc agtaccgccg tcacccgctc gaagccctgc gggagcactt 4800

cccccgccac tgcccacacg cggctgaccg cttgcgatac cgcccccttg gtcagcccca 4860

gcgaggccac aaactcggcc tggggccttc catcgaccag cacgccgcgc gctatgtcga 4920

tggtctgttg cccgatctcc aggcccttga tcgccgcctg gaattgggct tcggttagcc 4980

gtttcttcat ggagaacacc catataaact ccacacccgg ttgttgaaca aaaggcggtg 5040

ccagccgccg accatgtgca gaagtttagc taaactcgcc gcccgcgtca agcgttttag 5100

cggctaaaaa tgggcgcgtg atcttctttc ttggcgttca acctggccgc gtcagcggca 5160

ctcatgaaga acgtcatcag cgggccgacc gtgcggctcg aaccgttggc aaagcacacg 5220

tcgaactgac cgccggcggt gtgcggatcg acgccttcca ccagtcgcca ggggtcaagg 5280

ccccattcct cggattgcgc gctgtaccaa taggccggcg catcgccgtt caagtcgctg 5340

gccgcgtact cgcgcaccag gacggccacc cggccggtgt tcggctccac gaatcccggc 5400

gggtagggta gggtctgttt tttcatgtca aagccccttc ggcttgtaga tcgaaacgaa 5460

gtaggtgatc gcggtcagca ccgcgaagta cgccaggaac gaccaaccgg catacacgcc 5520

aggcgtgttc cagtggtaga gcatccgcac gaactggaag aaggtggcaa tcgacagcac 5580

ccacttgagg atcggccaga ccagcacggt cgccacccat acgaacttga ccaggccggc 5640

cagcaggcca gcaccggggg ccttgttggg ggcagcagac gcggcggcag gctccaccgg 5700

cgcgggcgcg gcgggctgct cgatctcctt ggggaacttg atgatgttgg acatagcttg 5760

accctccacg cgcttacgtg ttgaatgctg ggtgctccca ctcggaagca tggttacggt 5820

gtgccagcac caggccaagc gccccggatc actccggggc gttcctccac ctggggccgc 5880

ccttgatctt gcctcggctc acgcaatact ccttcttggc gtcctcgata ggcccggccg 5940

ttgccgaccg ggccatgtgc tcttaccagc cggcccggcg cttggcctgc tcgacggctt 6000

ccatcgacca atggcccttg gcctgcccct ccagggagca tccggcgaag tacgccttgc 6060

cgcgcagttc ctcggctttg cacaccagct cggccgcctc ggccatcatg gccgcgatct 6120

cgtcacggcg ggccgggaag tcggtcgctg ccgcgccctc cagctcgtca atccagggca 6180

taatcttgtt gtcgctcatc ggactttctc cggtagttga cctgggcaat gtgcccggcc 6240

ttcaagtgct atattagggc aaaatgccct aacctgtcaa gcactttagc taaacttttt 6300

tcgctttacc ggaatccgaa ggctaaactt tagccgctaa aacctttccc ttggcgtcaa 6360

tcctctttcc agatcacgcc cagcccggcc tggtcgcaca ggatcgccca tgccgcatag 6420

ggaatcgggg tgtcctcgcc gatccagcgg cggatcgtgc ggtcgccctt cgcgcccagc 6480

cccagcgcct tcgcggcctt gctgccgctg aacccggcca ggcgcagcac ctctcggact 6540

tcctcgccgg tcggttgcgc ccagcgttcg gccggcttca agcactccag ccggatattg 6600

gcgtcgttcg tcattcgttc gttctcctgg tcaagtgata agccgcaact ggtcgaagcc 6660

gtagatcgac tggatgcagc tcgggtctga atcgaccacg cgccggcctg cgcgattggt 6720

cttgtacgtt accggcctgt cgtcgtgcgc ccacacctgg cgggtgtcgg gatgcacctt 6780

cacgatgatg atgcgcttgc cgatgtagcg gtcgaaaacc gggtgatgga cgctcacgat 6840

ctcgcaccgc tggccgggct tgaactccac caggtcggcc gggcctccat cgccattcct 6900

ggcgatgctg caggttgccg cgctcgctcg cggcatcgtt gtttccggcg atacaggccc 6960

gccctcgccc ggctcggcat cgtcggcttt gacgatgctg caggtcatcg tcgtttctgg 7020

cgatgcggga tctcgctccg ggcctgcgcc ggtgattttt cccttggcgt ccaacccggc 7080

ggccctggcc gccttgatcc tggtcgcggc ctcggccgcc cagcgcctgg cgatgaaggc 7140

ccgatgcgag ggcagcacca catcgaccag gacgaacccc ggcggcacca ggacggtcgc 7200

cggtgcgcgc cgcgccggcg gctccaagcc ggccagccaa gcgggcaggg gagcatcggc 7260

caggcggtcg cggtagctgg cctcgaccat caccgggcgc ttcttctcgg ctcgctgcgc 7320

agccaggatg ccgcgcgcaa cctcgtccac cgtcatgcag ccctgcgccg tgtcgaagtg 7380

cgagcggtag cccgtttcgg agataaacgg cctgtccagg tcgatgacgt ggaactggaa 7440

gtgggcaccc agcggcccgc cgtagccggc ctcgtactcc accagggcgc gcatgtcgcc 7500

atccgcgacc aggaactggc cgcgctggcc ccacaagggc acgtcgccag gcaccgccgc 7560

gcaatggcgc tcgatgacct ggccgggcgc gtcgtggtcg gccatgctgc ccacgtgcgt 7620

tccgccgttc atcttccaga tgacggcctc gtatcggtcg ctggccgcct cggcggccgc 7680

accgtcaccg cgcatgatcg ccgcgtcgat ctccaccacg gccgccacgg cggcggccag 7740

cagctcgtcg cggtcggtgg gcagctcggc cagcagctcg gccgccggcg cgttccagtc 7800

ctggcccggc tgggccggcg tcttgcgttt cttcgccatc ggccggcccc tcaagtgtca 7860

gcacgccgcc acgcgatcac gtcgcgggct tcgtagccgt ggcgcttgca gtcgtcgcag 7920

aatcccgagc tgaacccctt gtggttcgtg ccgatccatg cggccggctt gccgcattcg 7980

tggccgtagg tgcccggctc ggcgttgtgg cacttgccgt ccgtcgcgta gctgttcgtc 8040

ggtgcctggg gagcgttgtt cctggtcatg gtcgcctcct ggaagccccg gccgaagccg 8100

gggccgcccc tcatcagtca atagcccggt agatcgcggc cgcctcggcg tggctggctg 8160

cgaagccgcg caggaagtga tagcggtcga tcagggcatc gccggcgtcc gtgtcggcgg 8220

cctcggccgc gagctgaccc agcgcgaaca gggttgcgac aatgccggcg gcgtcggccg 8280

acaactcgcc tcggaagccg ttgccgtcca cctcgatctc caggcggtcg gccaggtcgg 8340

gggccatgta aaaaccgccg tccgacaagg tgtagtagtg ccaatacgcg ccgctgtagc 8400

gttcgcagag ccggcgaagc caggcataca ccagggcctc gccgcgcatc atcagacgcg 8460

ggccgaagta ggcgggcagg aagtcgaggc gctgggcctc ggcgaccagg gaagcggtaa 8520

cgggttgctc ttgggtgttc atcggacttt ctccggtagt tgacctgggc gaaatgcccg 8580

gccttcaagt gctatattag ggcaaaatgt cctaatcgtc aagcacttta gctaaacgtt 8640

ttagccgcta aaccttgccc tttcccttgg cgtgcattac aatgtaattc acgaacccaa 8700

ccggagaacc aatcatggct gcaaaccagc tcgtacaaac gcgcatcgac ggcgcgatca 8760

aggaagaagc ggcggccgtc ctggccgcga tgggccttac cgtgtccgac gcggtgcggc 8820

tgctgctcac gaaggtggcc caggacaagg cgctgccctt cgagccgctg attccgaacg 8880

ccaccaccat cgaggcgatg aaggaagccc gcaagggcaa gctgccgcgc ttcgccaccg 8940

tcaacgatct gatggccgat ctgcatgcgg cagattgagc gcaccggcca gttcaagcgc 9000

gactacaagc gcgaggcgaa agggcagcac cgggccacgc tcgacgccga cctggtgccc 9060

gtcctggtcg cgctcgccga cgaccagccg ctggaacctc ggcaccgcga ccacgcgctg 9120

accggggact ggaaggatca ccgggattgc cacgtcaagc ccgacctggt gctgatctac 9180

cagaagcccg acgccgacac gctgcgcctg gtgcgcctcg gctctcactc cgaactcggc 9240

ttgtgatcgg cgcgggcctg gccccgcgtc tcacgtttca ttgacacttg aggggcgctt 9300

tccgcgccac cggccgagct ggccgacccc cttccttggc gtaaaacctg cggcggtgga 9360

gctgctgcga tgcttgagga tcgcgcggcc ggtcgaaccg cggcgacctg gttggggagt 9420

gtgagggggc tttgccccct cgcaagctct cgaacttact gccttccgcc aggcgcttgc 9480

gcctggctct cctaagccgt agcgccgaag gcgctccatt gtggggtgag gccgcaaggc 9540

ggccgagggg cgtagcccct ggggggatgg gaggccgctt gcggccgggt gggatcgaga 9600

aggggggttt ccccccttcg gcggccggtc atgctgcgcg gtagcttggg ccgtgttgcc 9660

gtttttttcg ccagcctctg gttaaaacta cctggttata taaaaaggtt ataaagacgg 9720

ttaaaaacct ggttagcatg accgaaaaac gcgcgtaaac cgttgtcacg ccaaggaaaa 9780

gcgcgaagag gccgcccctc aagtgtcaat ggataagccc cccatgtgtc aatacgctgc 9840

ccctcaagtg tcaagaaccg cgcccctcaa gtgtcagtag ggccgcccct caagtgtcaa 9900

taccggggca gggttcctaa cagggttatc cacaacttcg gtggataact ccatgccgat 9960

caggcactta ggccgcctcg gcggccgcct ggacggctcg accaggccga aatcggccgc 10020

tgccccccaa gtgtcaacat cgcgccggcc ccgctgcccc tcaagtgtca acgtcagggc 10080

tgcgccggcc ggcctcggcc gacttgtccc gaaactgtcc acaacggccg cgccggtggg 10140

gcagggcagg gaaggccccg gaaacggggt ctcctcgttt tcagtgcaat aagtgacggt 10200

acgaaaagct agcactggcg cggaggtggt gttggtagat cgttgatttc attgactttc 10260

ctgttcactt tcaaatctgc gattcgtggc gtcaaaccgt ggtcggtttc atccattggt 10320

gccagttatc gatgcatttg gccgcgaagg caggatttgg tcagcatagc ggtcaaccgg 10380

gaagcgaaac acaccccgca agttgatgct ctccagcctg gtgggcgcaa tcttcccgat 10440

cagttccggt ggaatgacct ggcggcggtt cgaccagcga tccaggaccg cctgcatctg 10500

tgaggtattc cacgccatca cgatgttggc catcaggctc aacgcatcgg ccacagcctg 10560

catttcatcg acacgtttgg cctgcgccgg gctgatccgg ccggtataaa tggcgcgctt 10620

gagggcgtta acagcctcgc cccgattgag cacccggcgc aactcgttcc tgaaaggggt 10680

tctacgccgg aaccccagaa aattccgtca ttccacattg tgaacgtcaa tcggtttgtt 10740

gcctgacgtg ccgagcgagt aactcagtcg gtaaatgcct gcccgaactg ccgtgcccgc 10800

tttacatcgt cggtatgcaa gtaaatcgac gtggtcgaaa tcgacgcgtg acgcaggtta 10860

tctcgtacgg cgctcagctc aacccctctg gcgatcgcgt gggtcgcatg ggtgtgccgc 10920

atccagtgcg gagaggcccg atgcagcttt tcagccagca ccggatggtc gttcttgata 10980

atctgcgcga cgagccgaaa aaaccggcgc atgacttccc acagccgcaa gggcttgatg 11040

ccggcatcgg cgtcgtcaag gctgccaatc agggacgtgg tcggattcca gtgagcacgg 11100

ctgacaggaa gcccccgctc ctgcagatat cggtccagcg ctgtgcgcgc taggggtgtc 11160

agggtaacgc gggctggctt gccgcccttg ccgaccacgt gcagccagtg atcaccggct 11220

gcgtcgactt cgatgctgcg cagtgtggcg tcagccagtt cgctgatccg cagtcccgtt 11280

gcgtagccga aatccagcat gaaccgcaac cgttgcgcag cgggcgcctg ccagccgtac 11340

gaccactcga gcccgttggc gatggtgcgc gtcagcatcc attctccttc ggtgaaagcg 11400

tgcgaggttt caagagccat ggcgcgcttg ctgccgcgta ccttgatgcc ggagaatggg 11460

ttggccacga cgtagcgctg ctcgaccagc cagcggaaca tggcgctgag cacggcaagc 11520

gcatgcgcaa tcgaacgggc cgagaggttg tcgacaaacg ggcgccagtc cgttgatgtg 11580

cgcggccgcg gtggcccgac ccagcgttct cgcggtgtag gtctgcgcag aaacgccctg 11640

tagtcggtgg catcccgggt ggtcagcgaa gacagcgcct tgccgcgagc aacgatgccc 11700

cagagaatca gccgttcggc ttccttgcgg taggcccgct gcgtggccgg ggattcgtgc 11760

aacgcgagcc atgcctggat agcgtcgtaa tcgttgtcga cgccgaggat gcaggccgac 11820

accggtgcgc ggaaggcgcc ggcggatccg tcgatctcgt gcggtagccg tagttgctcc 11880

caaggcgtca cgactgactg ccgatccgcg atgatcagtg cgcgggcccg ctccgtgagc 11940

gccgggtacg cggcaaagaa ggcctcgatc cttcttgcac tggccggccc gagacccgga 12000

atgacggtcc accactgccg gcgacgcgga atccgtaccg tgagatcggc cagggtccgg 12060

atgccggccg cgtgcagggt gcgggcagcg cgattcggca gccagtgcgc aatgtcgtcg 12120

ccgatctgcg gagctggcgc aggcatgatg cgcagtagct cgacagcctg cgtggtggcg 12180

cgcgcatgat gcatacgctt ttgggccggg cattcgaaca gcgtggccag atctgcccgc 12240

tgtcggttac gggcataaag tgccagttgc cggcggatct ggccgatgac gccgcgggct 12300

gactggctgt ggctgagccg atcttgcatg taccggtgtg ccgcctcacg cgaggatgcg 12360

ccctcgtacc aggcacgcag cgctgccagt gcatcagcat caggaaagtc ggtcgggatg 12420

tcggcggcgg acgggctcgt ggggcgcgtt ttcatgtcat cgagtttaat atggaaacaa 12480

tgccacagag ataataaagc ttatctctgt agaatgcggg agttcaatat ttctgtcgta 12540

ccccatgtcg tgatatcaca aaattgaagg atctgacgtt gcgtggagag gatggtcgat 12600

gatcaacaag aataagctgc tcagcgtctt ttccgacgcc gaacaggaag ccctgtatgg 12660

cctgcctgat ttcgacgatg cgcagcggct ggaatacctg gcattgaccg aatccgaact 12720

ggcgctcgcc agtagccggc cctccatacc cgcgcaggtc tattgcatct tgcagattgg 12780

ctacttcaag tccaagcacg ccttcttccg cttcgattgg gacgaggttg aggacgatta 12840

cgatttcgtg ttgagccgct atttccacgg cgagccgttc gaacgcaagc cgatcacccg 12900

gcacgagtac tacgcccagc gcgaacagat cgctgaactg tacggctatc gaccgtgggt 12960

ggccgccttc ctgccgcaac tcatgcagca ggccgcgcag atcgtacgtc gcgacgtgac 13020

accgggattc gtcgccgccg agctcatcgt gtggctcaat gagcacaaga tgatccggcc 13080

cggctacacg accttgcaag agctagtcag cgaagccctg tccgtcgaac gtcggcggct 13140

gggcgacctg ctcaccggcg tattggacga attgacccaa accgcgctag accaacttct 13200

ggtgcgcgat gatactctgt cgaaactggc ggcgctgaaa caggatgcca agaatttcgg 13260

ctggcgtcag atggtccgcg aacgcgaaaa gcgcggcacg ctgcagccgt tgcacgaaat 13320

cgccaggacg ctgctgcccc ggctggatat ctcgcagcag aacgtgctgt actacgcaag 13380

cctggcgaac ttctataccg tccacgacct gcgcaacctg aaggcggatc aggcgcagct 13440

ctacctgctg tgttacgcct gggtgcgctt ccgacagctc accgacaacc tggtcgatgc 13500

gatggccttc cacatgaagc agctcgagga agaaagcagc gcgggcgcga aacagtcact 13560

catcgccgag caagtaaaac gccatcggga aacgccgcag atcggccgcc tgttgtcgct 13620

ctatgtggac gacagcgtag ccgatccgac gccgttcggc gaggtgcgtc agcgcgccta 13680

taaaatcatg gccaaagatg tgctacaaaa cacggcgcaa cgcatgacgg tcaagccgct 13740

gagtcaactg gcactacact ggttggcggt ggacggccta gccaaacgta ttcgccgtca 13800

cctgcgcccc ttgtacgtcg agctcgactt cgtcggcacc tccccagaca acccgtggct 13860

cgcggcgctg gcttgggtca agggggcctt cgccaaacag cagcgcctgt cacaacgacc 13920

gctcgccgaa tgtcccgcgg ccacgctgcc gaagcgcctg cgaccgtacc tgctgatctt 13980

cggcgctgat ggtcagccga ccggtttgca cgccgatcgc tacgaattct ggttgtaccg 14040

ccagatccgg aagcgcttcc agtcgggaga gatctatctc gacgacagtc tgcaacatcg 14100

tcacttctcc gacgagcttg tttcgatgaa cgagaaggcc gacgcgctgg cgcagatgga 14160

gatcccgttc ctgcagcagc caatcgatgc ccaactcgat gcgttagcgg ccgagttgca 14220

tgcacaatgg ctggccttca accgagagct gaaacagggc aagcttacgc acctggaata 14280

cgacaaggat acgcagaagc tgatttggcg caaaccgaaa accgagaacc agaaggtgcg 14340

tgagcaggca ttctacgagc aactgccatt ctgcgatgtt gccgacgtgt tccgcttcgt 14400

caacggccag tgccagttcc tgtcggcgct gacgccattg cagccgcgct acgcgaagaa 14460

ggtagcggac gccgatagcc tgatggcggt tatcatcgct caggcaatga accatggcaa 14520

ccatgtcatg gcgcgcacca gcgacattcc gtaccacgtt ctggatagca cctaccagca 14580

gtatctgcgt caggcgacgc tgcatgcggc caacgactgc atcagcaacg ccatcgccgc 14640

gctgccgatc ttcccgtact actcgttcga tctcgatgcg ctgtacagcg ccgtcgatgg 14700

gcagaaattc ggcgtcgagc gaccgaccgt gaaggcgcgt tactcgcgca aatacttcgg 14760

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cgctatcctg tattggttcg ggttgcgctt cgagcctcgc ttcacaaacc tcgatgacca 15000

gttgcaggaa ttgtattgta tcgacgaccc ggcgctgtac gagaaatgcc tgattcagcc 15060

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ctcgcaggaa aacccgacac gtcgcgcgat ttttgagttc gataagctca ttcgtaccat 15240

ctacacgttg cgttacctgc gcgacccgca gctcgagcga aacgtgcatc gctcccaaaa 15300

ccgcctcgag tcttaccatc agcttcgttc gaccatcgcc caggtcggcg gcaagaagga 15360

attgaccggc cgcaccgaca tcgaaatcga gatcagcaac cagtgcgccc ggctgatcgc 15420

caacgtcatc attttttaca actcggcgat tctgtcgcat ctactgacga aatgggaggc 15480

cagtggcaac gccaaggcgc tggcgcggct tacgcagata tcaccggcag cctggcggca 15540

tatccttttg aacgggcact acacttttca aagcgacaac aaaatcgacc tggacgcgct 15600

cattgcaggg ctcgaattgg agtgatcgaa ttttcggcgg ttctggcttg gaatccctta 15660

ttcctgttac ggtggaatac gatgccacaa ccaggtaatc ctttaccccc agccgtggtc 15720

aacacctggc gactgagcgt cggcacgtcg ctgttcgtga tcgatatcct ggccgacggc 15780

agctggcgac cggcgtatat tgcgccaaag cggctgggtg gctggacgat ggatgtgttg 15840

ccgaacatgc cgccgacgtt agtcgatatc gctccctcgg tacgcacctg ggcgcgacag 15900

tacggcgcga atgtaacgaa ccggcgcacg ccggcgcgcc ggtttcccgc gcaaaccgct 15960

tcttcgaaca ggacgccaga atgaacatgc tgaaacgtcg tctcgatgcg acagacgaaa 16020

agctgcagga gctgaaaaca gcccgcaaag cggcagctaa ggcgcagcgc cagcaggtca 16080

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atgctgccaa cgctccgcat gaaccggaat tttgtcgagg ccttgctggc cgagcgcgcg 16380

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atacgcggca ccgacgactt cgaggtcgta cacttcggct tagagtttta cggctaccgc 16560

atcttcaatg cgctgatcaa tccgagcaac ttcatcgcca ggacaatcct gtcgcacatg 16620

gtcgacacga aggcgttttt cttcttcgcg gtcaacccgt caggcggtgt gacggtgttc 16680

aagtccggca tcggtgaatg cagcctggac agcatcgagt ctaatctcga gcggatactg 16740

cgctcgagca cgtccgatgc tcagtacgac gcggcgctga caacgttcag cgaccatcca 16800

gatccggtcg ggccgatgct gcactgggtt tgccgggact gcgaagattg tctcgacctg 16860

tcccacaatg taatcgaact gggccccgcg taacggtcct gatggtccgt gtgaccgaga 16920

ccgtcatgtc actcaccgga cgtcgctcca acattcttcg gctggaataa gccgattaat 16980

gttcacaatg tggaacgacg gaattttctg gggttccggc gtagatcccc atccttttga 17040

tgcggaatct ggcgctttca tcccgccgcg tccgtgaggc ccagacgcat ccgatagtcc 17100

ccgagcaact gctgctcgtc gaactgcgct gtgagcttcg tcagatcggc ggtcagcgat 17160

tcacgtgctt cgcgcagccg cgtcagttca gtcgcctcag tcctcgcggt gttagcagcg 17220

catcgtgctc ggccttggtg cgtgcgtggt cggcgagcga ctggttcaac gtattctgta 17280

actacttgct gtgcgcttgc agctcgcgta gatgccttgt cgcgacgccg gcttcggcga 17340

cgagccgcgc gctttctctg ttcaactggg ttatttcatt ttgcttgacg atcagcgttt 17400

ggttcacctg gcgcagttca gcctgcagtt actgaacccc cagcatcctt ggcagcgcgg 17460

gtcgaatgaa aatgcgaacg ggctatcgag acatccccaa cggcacctac atttcggtgt 17520

accaattggc tactcaatac cgtggcgagg cggctggatg ggcgaccgag gaaaaccctg 17580

aaccacggaa cgcccgccga acgatttcag caaactgttg catccaccgg ttgaatccgc 17640

acgagcaagc ggtcattcaa atgacagtaa tgtagatcgt gtcgtcgaca ttgcaatcaa 17700

gcgctctttt ttcaacgttg gctgcaccgg cccgtcgtct gctcacgtgc ttaatagcat 17760

catcagcaag gcggtcgaca ccggtacgaa cttcccaaat tagatgatct gcagttacgt 17820

ccggtccaga aaacacgtca cgtcgttgcg caccgccttg ccttaatcgc gcgacaacct 17880

tcccgcgtcg ccacacgcca tctcacgctg cgcaagatca cgcttcccct cccgcaaccc 17940

gaggtgagcg cttccgtctc acctcgaata gatcgcgacg ccactcctta tatagctcga 18000

gacgtaacgc gcagcgcgct cgacctctct gactggcgtc cgaggatccg cctcatggcg 18060

gacacgaggt cgcctgccgc atcggccggc aaggacgtcg cccgataggc gacgtggaaa 18120

tccggccgca ccaggatggc gccggtgtcg atgatctcgg aaattctcgc gaagtcgccg 18180

taatgatcct cgtaggcctg gccaggccca atgatgcgca ccgtcactgc caccccgagt 18240

tgccggctca cggccgccgc ggcatcctgc caggctgcgc cgccaatccc ggtaaagaga 18300

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tagacccaga catgcggcat gggcgctcca ggccgcgtcg acgcctggtg atagagctcg 18420

acgtcgcgga agacttcgtc cggcgaattg tctgccacga tcgcgggact gtcgtaacgc 18480

tgattcattt cgacgccgtg ggcgttgtaa acgtaattgg tcccggcgat ggcctcgcgt 18540

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gtgtaggtgt ccagcaggct ctcgtcggcc gtgccgttca gcaccatggc gatcttccag 18780

gcgagattga agctgtcctg gatggaggtg tttgagccga gtccgttggt cggcggatgc 18840

cggtggaccg cgtcgccggc gcagaagacc cgtccttgct gcaaccgggt cgcgtacatg 18900

tcgttgaccg tccaggtcga gatgccctca attttcagcg gcacgctgtc atcgccgatc 18960

agattgtgga cgatgcggcg ggcgaaggat tccgagatct ccggcgggcc ctgctcgacg 19020

tcgtaccccc agatcgccag ccatttgttc cacggccgga ccatgcgcac cacgccgatg 19080

ccgagaccgc cgatatcgga gccgggctgg atgacccagt aaaggaccga tggacgatgc 19140

gcgacgtagc ggtcgagatc agcctcgaac agcaagttga tggaaccgga cttgcccatg 19200

gtaccttcga gcggcaggtc caggtctgac acgacgcggc tgttggcgcc gtcggcgccg 19260

atcagatatt tcgaccggac ggtaaactct tcgccattca gacgatcgcg caagcgcgac 19320

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ccgtcgagtg cggccgactt gacgagaatc ggctcgagat agttctgtgg caggtcgcac 19440

atggaggtcg gcgaacattc gtcgtaatcg gcgcgccggc gaacatccgt cccccaggtg 19500

cgaatccgac cgaactcctc gccggccaac gaggcgcaga tggtgttctc gcccattagg 19560

tcattcggcg cggcgtagag gcgggcttca gcttcgagac cgagatcacg caggatctcc 19620

attgtgcgtt ggttggtgat gtgggcacgc ggcgtcggag ccgtccagtt gtacttgtta 19680

atgagcatcg tcctgacacc gtatcgcgca agcagtgccc ccgccgaagc gcccgccggc 19740

ccggtgccaa cgaccagcac gtcggtttcg atcgtcaatg ccatgtcttc ctccgtcaat 19800

tgttatgtct ctctctttgt gagaagaaac agggattgtt catctcgcgt tcggccaagt 19860

cgatttttta aacttcaccg tctttaacgc gcgatgaata gtaaggctga agagcctttg 19920

ttgcgcgcaa agtaaaaatg agccacttcg cgcaaagaaa atccgagcca cctccagtac 19980

agtcggcctt tttcgcgcga aggctggcga tgctccacaa ggaacagtgg atgcaaattc 20040

atgtgcttcg ctttagcttg aagacccgat gtcgactttg gaacgggctc ttcaccgcta 20100

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cccttagcgc gaggtcgcgt accctcggaa tatcttcagg ccgcataccg atttcggcga 20280

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ccgagatagc aagcggcaaa tcgaccgtga gcaatggatc ataaatcacg gtcttcggta 20760

gcaccttggg gtcgcggccg gtcctcttca ttccgccttc cgtgacaccc caaatggtag 20820

tcatttcact accggcatag gtcgttggta taaccagact tgggacgtca aggttcatcg 20880

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cgccatcgaa atatccagct accctgtcac ctatcggacg gacgatatcc ttcgctaact 21060

cgcgttgttc cgggctgctt aataccaagg gccggcgtgc gccaaggcgt cctatttcat 21120

ctggcaatgc agaagcagtg cccgccccga agacgaccct cgggctcagg tagtcaagcg 21180

tgaacttctt catgaagggt ccttcaacat tgcaagcagt tcgagcgtcc gagcattggc 21240

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tggataccag tgcagactca gatttttgtt tcgaccgaaa tgctcttcga gaatgctacg 21360

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ggccaatgat cgcgccgcca catcaaacgc cagcgcacct cccaggcagt acccgactac 21540

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attgactcct gcctccatgt caaagtcgcg aaacaacgca agcgcctgtt cccgttccga 21660

tggtacgttt gcatcaagct cgatattcgg cgcctgtctc cagtacagat ccggacacac 21720

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gaaaatctcc tgcgcgatca cgacgatggg tgcggagtcc gtcgtcggct ttccgaggta 21840

ggcaccaaag cgaccacccg agcgcgacgt gatctcaacg ccgtctgata acatatttag 21900

tctccagtta cacatgcgca gttgcattcg aggcgatcca cagccgcggc ctgcgctgcg 21960

cgttttgcct agctgacgcg tgcgtattgg cgcaccttgt cctcgtcaag cgtcatgccg 22020

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tcaacgcgaa ggtaggcctt cgatccgaga ctatttgaca aagcctccat atggatgaga 22560

tcgtcttggg gcgaccggaa gccaagcttg actttgaagc gattgtgtcg tcgtctttca 22620

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acgataacgt agctctgctg gtgcacggta gtgatcgaca tctggatcgg ccgcttggtc 23040

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cttcgaagta gtactgcgtg gtcaacgttt catatcccgg cgccttcacc ttgaaatgta 23280

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aagactggca tacgctggtg cgacctgtcg accaagttgg gattcgggtc ggggccgacc 24960

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ctgagccgtc tttttgaaac agtctctaac tgacaagggg atcggcaaca tgccctgcgg 25620

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gggcgttcgc ctgcgcggaa gggtcgatgg cattgacgat ccgcgcgatc gtgtcgccgc 26340

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gcagcaccag cggcgccaat ccaccgatgt agaacaggac ctgccagccg aagacaggca 26460

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acggcgacgg gcagtccctg cgccatcgcg cgaatgcttt cttcggccag cagcatggtg 29400

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gccagatcgc gctggtccgg cgtgcagagc accagtgcgc gtcgtgcacc caggcgcttg 29880

tccagaccat caacatgaag ctgatgcagg acagcgcatc ggcccagcag gaaatcttgg 29940

tgcgcaacga attcattcag atcgccggtc acttcagccc cccaacaagg tcgtcgtacc 30000

gatgcgcagt ccgcgcttcg ccacggccgc gcgcgccgtg tccggcgatt cgagatctgc 30060

caggaagccg tggccggcac cgttcatgat gtgcaggtcg atcgcatcgt tggcgcgggc 30120

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ctcatggacg cggggatttg tcatggtgct ttctcttcaa aaaagatgaa tcgggtggat 31500

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ttgaaggccc cggccttgcc tgcctccagc atgcggaacg cctcgtcgac ctcctggttc 32220

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cgtcctgcgt ccagtctgca ggtcggcggc cggcaaggtc ttgctggcga acgaacgcga 42900

cgaggacatc gaacggatcg cctctgccgc gaacgcggag gcggctgacg gtgttcaagt 42960

caatattccg gcgctgattc gcgaagcgcg cgagtgccgc caacgcggat gggctcagag 43020

tctggactac ccgaggcccg gctgggcgaa ccttgcgatg gggctgcccc ggatggaagg 43080

acagccggag atggcggtca cgctgggcgt tcgaaaggaa tcggtcgagc tgcggcgcga 43140

cgatctgatc gccgaactca ggcgcgcgat ggaacgcttg aaacgctagg ccgccccgag 43200

gatgcgtggc ggaccctctc actcgcccct atcgacagcg cgccgccccc gccttatatt 43260

caattcaatg aggcacgatt caaacaattc atccgccgcc gggccccgcg ccgacgcctc 43320

cccgctcgtc ctgccacgca agcgcgggcg caagaaagtc gacggcctgg tcgaggcgcg 43380

gcggcagcag atcctcacgg ccgcgctcga gctgttcggc accaagggat tccaccgcac 43440

gacgacgcag gacctggccg acagcgccga cgtgagcgtc ggcctcatct accagtactt 43500

caaggacaag gaagacctgc tcgcggcggc catcggccag atcttcgatg cctacctgag 43560

cgagatcccg ctcgccgtcg aggccgccgc cgatccgctg tcgcgctttc gggccgcggt 43620

gcatgcctac tgccgcgtca tcgacgaaca ccgcgaggcc gccctgctcg gctatcgcga 43680

gacacgttcg ctgtccaagg cggcaaccaa gggcctgatg gcgaaggaaa cgcagtcgac 43740

ggcgctgatc gccgagcgcg tgaccgaatg catcgaggcg cgcgtcttcc gctcggtcga 43800

cgtcgcgatg ctgacctacc acatcgtcgt cttcgtccat tcctgggcgc tcaattcgtg 43860

gcgcctgaag ggccagttca agcgcgagga ctacgtggac gtgggcgtcg acatgctgct 43920

gggcccgatc gtgcagaccc cggcgcctgc gcgcaaaccc gccaaggccg ccaagacaac 43980

caagaccgcg aaacccgcac cccgaaggaa tccccatgcc ggccgccgca ctgtctgaca 44040

aggtcgcgat catcaccggc gccgcgtcgg gcatcggcgc cgccacggcc gagcgcttca 44100

tcgccgaagg cgcgcaggtg atgctggccg acatcgacgg cgccgcggcc gaagcggtgg 44160

ccgcgcgcct cggcccgcgc gccgccgccg cgcacggcaa ccattgcctg cccgcggaca 44220

acgcgcgcgt ggtcgccgag acgctggcgc gcttcggcca cgtcgacatc ctctacaaca 44280

acgccggcgt gctgtcgcgc ggcgcgctcg acacgatcga gggcgacgag ctgcgcgccg 44340

tgctcgatgc caacctggtc ggcccggcct tgatgagccg cgcctgcctg gccgcgctgc 44400

gcgagtcggc acggctgggg cgcgcgccgt gcatcctttt cacgggctcg atccagtcgc 44460

tgatggtgcg cccgggcttc gccgcctacg ggtcgtccaa gcacggcgtc gccggactcg 44520

cttcgacgct ggcgctggaa ctcgcgcccg agggcatccg cgtcaacgcg ctctgcccgg 44580

gcccggtcga tacgccgctg ttccgcaaga gcgcggcgcc ggccggcgcg gtcgggccgt 44640

cgatcgagca actggctgcc ggcatcccga tcggccgcct gatccgcgtc gaggaagtcg 44700

ccagcgccgc cctcttcctg tgcagcgatc aggccagcgc gatcagcggc gtgctgctgc 44760

cggtggacgg cgccatcacg gcccgctgag cgtccggccg gccagcgggt ccctaccctt 44820

gacagggcca tgccggtgcg caagaataaa tttgagtgaa gcttcactca aataagagaa 44880

tcgagatcga gcaccgccgc cggctgcaca tggcaagggc gcgggcaacc accagaacag 44940

gagacaacgc cgtgaaaatt caacgtttcg ctcgcgcctt ccggtcccgc ctcgccgccc 45000

tggcgatcgg ggtcgcgacc gcttccctat cgctgctggc tgccggcccc gcggccgcgc 45060

aggacaagcc catcaagatc ggcctgacca ccgacctcac cggcatcgcg gccgcctacg 45120

cgcgctcgca ggtcaacggc gtgcagctcg cggtcgacca gatcaacgcc agcggcggcc 45180

tgctgggccg caagctcgag gtgctggtgc gcgactcgca gctcaagccc gacctcggca 45240

cttcgcacac gcgcgacctc atcacgcgcg agaacgtcga cttcctgatc ggccccgacg 45300

gcagcgcggt cggcatgacg gtctcggcgg tcgccaagca atacaagaag gtggtcatga 45360

tgaccatccc gaactcgccg cgcatcacga ccgagacctt ccatccctac gtcttcacgg 45420

tcgtgccctc cggcgtcatg gaagcgcgcg ccatggccgc cgccatcggt cccggcaaca 45480

agcgcatcgc cttcatcggc ggcgactacg aggccgcgca ccaggggctg aagtacttca 45540

aggactggct ggcgaaggtc aatccctcgg ccgagatcgt ctccgaggcc tggccgaagc 45600

tcggcgagcc cgactacagc agctacatca cgagcctgat gtcgtccaag cccgacgtca 45660

tcttctcgta cctctggggc gccgacctga tcggcttcgt caagcagggc aagccctacg 45720

gcgtgttcac caagaccaag gtcgccagcc tggtgttcct cgacgacctg aaagcgctcg 45780

gcgacgagat gcccgatggc gtgatcgccc agatgcgcgc gcccttcttc gcgcttacgg 45840

gtgaccgcat gaccaagttc accgagcagt tccgcgccaa gtacaacgac tacccggccg 45900

actgggcgat catgggctac gagggcatgc agatcctcgc gcaggcgatc aagagcgcca 45960

actcgctcga atcggacgcc atcgtcaaag cggtcgagca ggtcaagtac gacggtctgc 46020

gcggtccgat cagcttccgg gcgctcgatc accagggcac ggtcggctcc tacatcggca 46080

ccgtcgccaa gagcgacaag tacccgttca agatcctgac caacgtcaag accatcagcg 46140

ccgaatcgat ctggcccagc gaggccgaga tcacggccgc gcgcgcggcc gtcaagtagg 46200

agccgcggcg cgcatgttcc agagcatcct ggtccaggcc ctgagcggcg tcagcagcgg 46260

catggtgctg ttcctggtcg cttcgggcat gacgctgatc ttcggcacgc tgcgcgtcgc 46320

caatttcgcg cacggctcct tctacatgat cgcggcctac ctgagcttca cgctcacgcg 46380

ctgggtcggc cacggaacct ggggcttcgt cgtctcgctg gtcgtggcgc cgctcatcgt 46440

cgcactgctc gggctggtgg tcgagcgctt cctgctgcgc cgcatcgcca cgcgcgccca 46500

ccagtaccag ctgatcctga cctatgcgct gacgctgatc ctggcggatg ccgtgaagat 46560

gatctggggc cgcgacaact tcacggtgcc gcgccccggc gcgctcgacg gcgccttcga 46620

catcttcggc acgcccttcc cgagctacta cgcgctcttg atcgtggtcg gcgccgtcat 46680

cgccgtcgcg ctgcacctgc tgctgacgcg cacgcgcttc ggcaaggtgc tgcgcgcctc 46740

ggtcgccgac ggccagatgg tgggcgcgct cggcatcgac gtgccgcgcc tgtacaccgg 46800

cgtgttcgcg ctcggcgcct ggctggccgg cctgggcggt gccctggcgg cgccggtggg 46860

ctcgatctcg ctgggcatcg acagctcgat catcatcgaa tgcttcgcgg tcgtgatcat 46920

cggcggcgtc ggcagcgtcg gcggcgccct gctcggcgcg ctgatcatcg gcgtgaccaa 46980

gtcggtcggc atcctgttcg cgcccaagct ggcgatcgcc ttcatcttca ttgcgctgtg 47040

cgcggtgctg gtgctgcggc cgcagggcct gctgggccgc agcacggcct gatgggacga 47100

gcacgcgcat gagaaccgcc ctgcccgccg ccatcgaccg gcccgaacgc atgtcgcgca 47160

gcacgatcgg ctggtgcgtg gccgcgctcg tgttcgcgct gctgccgctc gcgatcggcg 47220

agagctacgc cttcctgacg gtcgacttct tcatcatgtc gctgttcgcg atgagctaca 47280

acctgctgct cgggcaggcc ggcatgctgt ccttcggcca cgcgacctac tacggcctgg 47340

gcgcctatgc ggtcgccatc ctgcagaaca agtacggcgt accgccctgg ctcgggctgg 47400

tggccgcgcc catcgtggcg gcgctcggcg ctttcgcgat cggctggctt tcggtgcgcg 47460

tcaccggcat gtacttcgcg atgctcacgc tggccttcgg ccaactggtg ttcaccctgg 47520

tgctcggctg gtacaccttc accggcggcg acgacggcct gccggtggcg ctgccggact 47580

ggatgctgtc ggcgcgcaac tactactact tcagcctcgt gatcgtcgcg ctgtgcatct 47640

ggctgatcta ccgggtcacg aagtcgccct tcggcgtcgc tctcggcgcg atccgcgaca 47700

accgccagcg tgcggcctac atcgggctct cggtgcgccg gctggaactg caggccttcg 47760

tcgtcgcggc ggccttcgcc ggtgtcgcgg gcgggctgcg cgcaccgctg cagcagatgg 47820

cctttcccgg cctgctcaac tggagccagt cggccgaccc ggtgctgatg gccctggccg 47880

gcggcatcaa cagcttcgtc gggccgatcg tcggcgccgc gttgttcgtg ttcaccaatt 47940

tcgcggtcac cagccgcttt gagtacccgc tgctggtctt cggcacgctg gtgctgctga 48000

tcgtgctgtt cctgccggac gggatcgtcg gcacgttgcg gcggcggcgc aatgtggggg 48060

cgcagaaatg agcgcagcgc ccgtcatcct ttcgatcgaa ggcatcggca agaacttcgg 48120

cggcttccac gcgctgagcc aggtcgacct gcaggtggcc gaccgcagcg tgcacgcgct 48180

gatcggcccg aacggtgccg gcaagagcac gctgctgaac gtggtctcgg gccatctcgc 48240

gccgagcgcc ggccaggtgc tgttccgcgg ccgaccgatc tgcggccggc cgccgcacga 48300

aaccgcgcgc cgcggcgtcg cgcgctcgtt ccagatcacc agcatcttca gcggcttcac 48360

ggtgttcgag aacgtgcaga tggcgctgct cgcgcagcac ggcctgtgca cgcgcatgtt 48420

ccgcagcgcc gcgccgatga agcgcgacga ggccttcgcg ctgctgcagc tggtgcggct 48480

cgacggcgcg gccgaccgca tcgccggcca gctcgccgcg ggtgaccgca agcggctgga 48540

attcgcgatc gcgatggccg gcacgccggc cgtgatgctg ctcgacgaac cgaccgccgg 48600

catgagcccc gacgagcgcg ccatcgtcat cggcctgatc cgcaagatca accaggagcg 48660

cggcgtggcg gtgctgttca ccgagcacga catcgagatg gtgttcgcca ttgccgaccg 48720

catcaccgtg ctgcaccagg gcagctgcat tgccgacggt gcgcccgagg cggggtctcc 48780

tcgttttcag tgcaataagt gacggtacgc aaagctagca ctggcgcggg ggtggtctgg 48840

gtagaccgtt gatttcattg actttcctgt tcgctttgta aacgggtatg gtggcctccc 48900

acttttgagg ttcacgatgc agggttggca cacaacgttt ttggggatgc gtgggctccc 48960

tgcaggaggg cgcgaaggcg gccgccgagg ccgtgcggcg tgaggttgag gcggtgacgg 49020

cgcagctcgt cgcgccgatc cgcgaggcgc ggcgcgtcgc catgatgaac atggtcgcgg 49080

ccggcatggc ggtcgtggcc gccggcctgg ccctgtgggc ctcgctgtag atggcgatgc 49140

gggatctcat cgtcagaact ggcgatgg 49168

Claims (9)

1.一种质粒pRC12，其特征在于所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述质粒按如下方法制备：

（1）将环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）CCTCC NO:M207006接种至3 mL LB培养液，30℃培养过夜，取菌液5 mL于微量离心管中，16000 r/min离心3~4 s，弃上清，沉淀用吸水纸吸干，即为菌体；

（2）菌体中加入碱裂解液Ⅰ100 μL，剧烈振荡充分悬浮菌体；

（3）不离心加入200 μL新鲜配置的碱裂解液Ⅱ，快速柔和颠倒数次，以混合内容物；

（4）直接加入经4℃冰预冷的碱裂解液Ⅲ 150 μL，置于冰上5 min；

（5）16000 r/min离心5 min，取上清，转移至另一新的离心管中，重复该步骤一次；

（6）加入等体积的体积比1:1的酚：氯仿，剧烈振荡；

（7）16000 r/min离心2 min，用移液枪吸出上清，注意中间层蛋白不要吸出来；

（8）加入2倍体积无水乙醇，室温放置2 min，16000 r/min离心5 min，弃上清；

（9）加入1mL 75％乙醇，将微量离心管颠倒数次，16000 r/min离心2 min，弃上清，用吸水纸洗干，不够干可以离心后用移液枪吸去余液，室温放置2~3 min，直至试管内没有可见的液体存在；

（10）加入30 μL含有20 μg/mL去DNA酶的RNA酶A的超纯水或TE溶液重新溶解核酸，获得质粒pRC12溶液；

碱裂解液Ⅰ：50 mM葡萄糖，25 mMTris-HCl，10 mM EDTA ，pH8.0；

碱裂解液Ⅱ：10 M NaOH 60 μL，10%SDS 300 μL，dd H₂O 2640 μL，总体积3000 μL；或10 M NaOH 20 μL，10 %SDS 100 μL，dd H₂O 880 uL，总体积1000 μL；

碱裂解液Ⅲ：无水NaAc 26.4 g用70 mL ddH₂O溶解，用20 mL冰乙酸调pH至4.8，定容至100 mL。

2.一种含权利要求1所述质粒pRC12的基因工程菌。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌以感受态大肠杆菌DH5α为受体，经电转化质粒pRC12，获得含质粒pRC12的基因工程菌。

4.一种权利要求1所述质粒pRC12在微生物降解卤代烃污染物中的应用，其特征在于所述卤代烃污染物为氯酚污染物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述氯酚污染物中氯酚为下列之一：一氯酚、二氯酚、三氯酚或五氯酚。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用是将含质粒pRC12的基因工程菌接种至含氯酚污染物的无机盐培养基中，在28~32℃、pH6.8~7.2下进行降解，实现对氯酚污染物的降解。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含质粒pRC12的基因工程菌接种量以氯酚污染物体积计为1×10⁶ 个/mL，所述氯酚污染物中氯酚终浓度为10~50mM。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含质粒pRC12的基因工程菌以菌悬液的形式接种，所述菌悬液按如下方法制备：将含质粒pRC12的基因工程菌接种在含32mM五氯酚的种子培养基中，30℃培养48h，获得种子液；再将种子液以体积浓度5%的接种量接种至新的含32mM五氯酚的种子培养基中，30℃震荡培养48 h，获得菌悬液；所述种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃ 2g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO₄ • 7H₂O 0.5 g/L、FeSO₄ 0.01 g/L，溶剂为去离子水，pH7.0~7.2，在121℃下灭菌20分钟。

9.如权利要求6所示的应用，其特征在于所述无机盐培养基组成：硝酸铵 1.0 g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、磷酸氢二钠 1.5g/L、氯化钠 1.0g/L、七水硫酸镁 0.2g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。

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