CN102321659A - 氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明质粒从实验室自行建成的工业废气生物净化微生物资源菌种库中筛选获得。本发明的有益效果主要体现在：提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，提高以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解效果，大幅度提高有机废气的处理能力。

Description

氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、含有该质粒的基因工程菌，以及该工程菌在微生物降解卤代烃类污染物中的应用。

(二)背景技术

细菌降解性质粒在有机污染物微生物降解过程中起重要作用，它们编码了一些降解过程中的关键酶类，赋予细菌分解代谢各种复杂有机化合物的能力。迄今已报道的卤代烃降解性质粒主要以氯代芳香族化合物降解性质粒为多，如氯代苯甲酸降解质粒Pac25、Pac27和Pwr1，以及2，4-二氯苯氧基乙酸降解质粒pJP4，pEML159和pRC10等。国内关于有机污染物降解性质粒的研究工作开展得比较晚，在80年代末才陆续有一些报道。

迄今尚没有氯代脂肪烃降解性质粒的报道。

(三)发明内容

本发明目的是为了提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11、含有该质粒的基因工程菌及其在微生物分解处理氯代有机污染物中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明质粒从实验室自行建成的工业废气生物净化微生物资源菌种库中筛选获得，命名为pRC11。

本发明还涉及含有所述质粒pRC11的基因工程菌。

本发明还涉及所述基因工程菌在微生物降解卤代烃污染物中的应用。

具体的，所述卤代烃污染物优选为下列之一：CH₂Cl₂、CH₂BrCl、C₂H₄Cl₂或C₂H₂Cl₂。

优选的，所述降解在28～32℃、pH6.8～7.2下进行。

本发明提供了一种卤代脂肪烃降解性质粒pRC11，并建立了质粒的物理图谱，对今后利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，消除有关物质的环境污染创造了条件。

本发明的有益效果主要体现在：提供一种氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11，建立了质粒的物理图谱，该质粒遗传背景非常清晰，可利用该质粒进行分子育种，培育高效多功能质粒菌，提高以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解效果，大幅度提高有机废气的处理能力。

(四)附图说明

图1为氯代脂肪烃降解性质粒——pRC11电泳检测图谱；

图2为质粒pRC11利用Bam HI、Eco RI、HindIII限制性酶切图谱；

图3为pRC11和pJP4物理图谱比较；

图4阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)对不同卤代烷烃的降解特性。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：质粒pRC11的获得及鉴定

1)质粒检测：

(1)3mL LB菌液培养过夜，7000转/分4℃离心10分钟；

(2)重悬于l mLTE缓冲液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸调整pH值为7.9)；

(3)加入2mL裂解液(3％SDS，50mM Tris，加1.6mL2N NaOH调整pH为12.6)裂解，轻摇混匀：

(4)在50～65℃的水浴中加热20分钟，然后加入2倍体积的氯仿；

(5)轻轻振荡乳化，离心破乳(6000转/分，15分钟，40℃)；

(6)上清液直接进行电泳分析。

用琼脂糖凝胶电泳分析质粒带，条件如下：

琼脂糖浓度0.7％，电泳电压80V，电泳缓冲液TBE，marker为λDNA/HindIII，采用凝胶成像仪分析电泳结果(结果见图1)。

2)质粒的提取：采用碱法提取质粒。

(1)取过夜培养的菌液1.5mL于微量离心管中，用微量离心以最大转速Vmax离心3～4s，弃上清，用吸水纸吸干。

(2)菌体中加入碱裂解液I 100μL，剧烈振荡充分悬浮菌体。

(3)加入200μL新鲜配置的碱裂解液II，快速柔和颠倒数次，以混合内容物。

(4)加入经冰预冷的碱裂解液III 150μL，置于冰上5min。

(5)Vmax离心5min，取上清，转移至另一新的离心管中，重复该步骤一次。

(6)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，剧烈振荡。

(7)Vmax离心2min，用移液枪吸出上清，注意中间层蛋白不要吸出来。

(8)加入2倍体积无水乙醇(约1mL)，室温放置2min，Vmax离心5min，弃上清。

(9)加入1mL 75％乙醇，将微量离心管颠倒数次，Vmax离心2min，弃上清，用吸水纸洗干，不够干可以离心后用移液枪吸去余液，室温放置2～3min，直至试管内没有可见的液体存在。

(10)加入30μL含有去DNA酶的RNA酶A(20μg/mL)的超纯水或TE溶液重新溶解核酸，贮存于-20℃。

溶液I：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；

溶液II：10M NaOH 60μL，10％SDS 300μL，dd H₂O 2640μL总体积3000μL或10M NaOH 20μL，10％S DS 100μL，dd H₂O 880uL总体积1000μL；

溶液III：3M NaAc(pH4.8)：无水NaAc 26.4g用70mL ddH₂O溶解，用约20mL冰乙酸调pH至4.8，定容至100mL。

3)质粒的消除：采用丫啶橙消除法。

挑单菌落于3mL LB培养基(含氨苄50μg/mL)中，30℃摇床过夜培养，然后取200μL菌液，接入5mL LB培养基(含丫啶橙75mg/L)，30℃摇床培养24小时，然后稀释后，涂布至以下四个平板：①LB平板；②LB平板(含氨苄50μg/mL)；③LB平板(含硝基苯100mg/L)；④LB平板(含氨苄50μg/mL和硝基苯100mg/L)，培养2-3天，检查菌落在平板上的生长情况。

4)质粒的转化：

感受态细胞的制备：用接种环挑取甘油保存的DH5α菌种在LB琼脂平板上划线培养。取琼脂平板上一个单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养，至OD₆₀₀＝0.3～0.4时，将培养管冷却至0～4℃。取若干灭菌的1.5mL离心管，各加入200μL菌液。再各加入过滤除菌的4mol/L CaCl₂5μL，加上盖，轻弹管底使混匀。即制得感受态菌。

质粒转化：在感受态细胞中加入5μL质粒溶液(DNA≤10ng)，轻弹离心管底部，使质粒与细菌混匀。0～4℃冰浴中静置30min。在42℃水浴中，安静放置90～120s。冰浴1～2min。37℃，振荡培养45min。将离心管中全部菌液，铺到含相应抗生素的LB琼脂平板上。在37℃温箱中，倒置培养过夜。菌落计数、扩增、鉴定。

阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)能在16mmol/L的无机盐MM培养基中生长良好，而质粒消除后的E.coli DH5(dcm^-)又不能以DCM为碳源生长。E.coli DH5阳性转化子培养72h的二氯甲烷生物降解效率见表1。

表1：大肠杆菌E.coli DH5阳性转化子培养72h的二氯甲烷生物降解效率

4)质粒的限制性酶切分析与物理图谱

对质粒进行限制性酶切分析实验，首先要应用紫外分光光度计测定核酸浓度，然后按照每一种酶的反应条件和方法(参看各种酶附带的说明书)，将质粒和酶加入反应体系中，然后进行酶切反应，结果见图2和表2。采用UP全自动凝胶成像仪对酶切实验结果进行分析。采用vector NTI软件绘制物理图谱，结果见图3。

表2：质粒pRC11和pJP4限制性酶切片段比较

实施例2：质粒的转化E.coli DH5

(1)质粒的转化与扩增：

感受态细胞的制备：用接种环挑取甘油保存的DH5α菌种在LB琼脂平板上划线培养。取琼脂平板上一个单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养，至OD₆₀₀＝0.3～0.4时，将培养管冷却至0～4℃。取若干灭菌的1.5mL离心管，各加入200μL菌液。再各加入过滤除菌的4mol/L CaCl₂5μL，加上盖，轻弹管底使混匀。即制得感受态菌。

质粒转化：在感受态细胞中加入5μL质粒溶液(DNA≤10ng)，轻弹离心管底部，使质粒与细菌混匀。0～4℃冰浴中静置30min。在42℃水浴中，安静放置90～120s。冰浴1～2min。37℃，振荡培养45min。将离心管中全部菌液，铺到含相应抗生素的LB琼脂平板上。在37℃温箱中，倒置培养过夜。菌落计数、扩增、鉴定。

(2)质粒的提取：采用碱法提取质粒(同实施例1)。

(3)效果检测：以E.coli DH5(dcm^-)作为受体菌，做了质粒的接合转移试验，以pBR322做为阳性对照。经检测阳性转化子的转化频率为1.65×10⁵/μg of plasmid DNA，而对照组pBR32阳性转化子的转化频率为3.87×10⁷/μg of plasmid DNA。阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)能在16mmol/L的无机盐MM培养基中生长良好，而质粒消除后的E.coli DH5(dcm^-)又不能以DCM为碳源生长。以上试验结果证实了DCM代谢相关基因定位在菌株wh22所含质粒上，上述结果表明，该质粒为DCM的降解性质粒，并可在不同属菌株之间转移。

实施例3：质粒pRC11阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)在生物过滤处理二氯甲烷中的应用

(1)菌株培养：采用无碳查氏固体培养基培养，首先在固体培养基表面涂布菌种，然后在皿盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴适量的二氯甲烷，置30℃下培养，定时补加二氯甲烷。对照平板的棉花中加无菌生理盐水，培养2～3天后，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯甲烷的棉花，便可获得斜面菌种。

(2)菌种扩大培养：斜面菌种在种子培养基中培养获得菌悬液，50ml菌悬液(细胞浓度1×10⁶个/mL)接种到装有1000ml种子培养基的5L三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30℃震荡培养，48h终止培养。种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃，2g/L；K₂HPO₄，1g/L；KCl，0.5g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；Fe SO₄，0.01g/L；pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入；

(3)以上方法获得的菌悬液(浓度1×10⁶个/ml)，在

50mm的有机玻璃生物滴滤池内，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种液(组成：NaNO₃，2.5g/L；K₂HPO₄，1.5g/L；KCl，0.6g/L；MgSO₄·7H₂O，0.8g/L；Fe SO₄，0.015g/L；pH7.2)48L，接种菌悬液约9.6L，接种和挂膜约需30天。二氯甲烷模拟气体和循环液在滴滤池内逆流操作，循环液pH值为7.0±0.5，温度维持在28.5±2℃的条件下，在气体空床停留时间为15.7s、二氯甲烷进口浓度为0.7～3.12g/m³的范围内，去除效率为72.0％～89.1％。

实施例4：质粒pRC11阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)对不同卤代烷烃的降解效果

(1)菌株培养：同实施例3

(2)菌种扩大培养：同实施例3

(3)阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)对不同卤代烷烃的降解特性。

在初始pH为7.0的无机盐MM培养基中调节NaCl初始浓度为10gL^-1，分别加32mmol/L的CH₂BrCl，C₂H₄Cl₂和C₂H₂Cl₂为唯一碳源和能源，再分别接入降解菌阳性转化子E.coli DH5(dcm⁺)，置30℃、180rpm摇床中黑暗培养3d，每隔12h取样，制样后用气相色谱分别测定CH₂BrCl，C₂H₄Cl₂和C₂H₂Cl₂残留浓度，转换成降解率。

结果：在初始pH为7.0的无机盐MM培养基中调节NaCl初始浓度为10gL^-1时，36h基本达到最大降解效率，对CH₂Cl₂、CH₂BrCl、C₂H₄Cl₂和C₂H₂Cl₂分别为81％、61％、55％和48％(见图4)。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江工业大学

 <120>  氯代脂肪烃降解性质粒pRC11、工程菌及其应用

 <130> 

 <160>  1    

 <170>  PatentIn version 3.4

 <210>  1

<211>  48868

<212>  DNA

<213>  Unknown

 <220>

<223>  人工序列

 <400>  1

tcgaccgcgc cggcggcatc gccaggttcg gcgatgctgg ccagctcccg gcatcgtcgc     60

 ttgtgacgat gctgcaggat gattccacca ggccctcggc gggcctccct cgccagaaat    120

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 ccttgatctt gcctcggctc acgcaatact ccttcttggc gtcctcgata ggcccggccg   5640

 ttgccgaccg ggccatgtgc tcttaccagc cggcccggcg cttggcctgc tcgacggctt   5700

 ccatcgacca atggcccttg gcctgcccct ccagggagca tccggcgaag tacgccttgc   5760

 cgcgcagttc ctcggctttg cacaccagct cggccgcctc ggccatcatg gccgcgatct   5820

 cgtcacggcg ggccgggaag tcggtcgctg ccgcgccctc cagctcgtca atccagggca   5880

 taatcttgtt gtcgctcatc ggactttctc cggtagttga cctgggcaat gtgcccggcc   5940

 ttcaagtgct atattagggc aaaatgccct aacctgtcaa gcactttagc taaacttttt   6000

 tcgctttacc ggaatccgaa ggctaaactt tagccgctaa aacctttccc ttggcgtcaa   6060

 tcctctttcc agatcacgcc cagcccggcc tggtcgcaca ggatcgccca tgccgcatag   6120

 ggaatcgggg tgtcctcgcc gatccagcgg cggatcgtgc ggtcgccctt cgcgcccagc   6180

 cccagcgcct tcgcggcctt gctgccgctg aacccggcca ggcgcagcac ctctcggact   6240

 tcctcgccgg tcggttgcgc ccagcgttcg gccggcttca agcactccag ccggatattg   6300

 gcgtcgttcg tcattcgttc gttctcctgg tcaagtgata agccgcaact ggtcgaagcc   6360

 gtagatcgac tggatgcagc tcgggtctga atcgaccacg cgccggcctg cgcgattggt   6420

 cttgtacgtt accggcctgt cgtcgtgcgc ccacacctgg cgggtgtcgg gatgcacctt   6480

 cacgatgatg atgcgcttgc cgatgtagcg gtcgaaaacc gggtgatgga cgctcacgat   6540

 ctcgcaccgc tggccgggct tgaactccac caggtcggcc gggcctccat cgccattcct   6600

 ggcgatgctg caggttgccg cgctcgctcg cggcatcgtt gtttccggcg atacaggccc   6660

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 cgatgcggga tctcgctccg ggcctgcgcc ggtgattttt cccttggcgt ccaacccggc   6780

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 ccgatgcgag ggcagcacca catcgaccag gacgaacccc ggcggcacca ggacggtcgc   6900

 cggtgcgcgc cgcgccggcg gctccaagcc ggccagccaa gcgggcaggg gagcatcggc   6960

 caggcggtcg cggtagctgg cctcgaccat caccgggcgc ttcttctcgg ctcgctgcgc   7020

 agccaggatg ccgcgcgcaa cctcgtccac cgtcatgcag ccctgcgccg tgtcgaagtg   7080

 cgagcggtag cccgtttcgg agataaacgg cctgtccagg tcgatgacgt ggaactggaa   7140

 gtgggcaccc agcggcccgc cgtagccggc ctcgtactcc accagggcgc gcatgtcgcc   7200

 atccgcgacc aggaactggc cgcgctggcc ccacaagggc acgtcgccag gcaccgccgc   7260

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 tccgccgttc atcttccaga tgacggcctc gtatcggtcg ctggccgcct cggcggccgc   7380

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 cagctcgtcg cggtcggtgg gcagctcggc cagcagctcg gccgccggcg cgttccagtc   7500

 ctggcccggc tgggccggcg tcttgcgttt cttcgccatc ggccggcccc tcaagtgtca   7560

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 aatcccgagc tgaacccctt gtggttcgtg ccgatccatg cggccggctt gccgcattcg   7680

 tggccgtagg tgcccggctc ggcgttgtgg cacttgccgt ccgtcgcgta gctgttcgtc   7740 

ggtgcctggg gagcgttgtt cctggtcatg gtcgcctcct ggaagccccg gccgaagccg   7800 

gggccgcccc tcatcagtca atagcccggt agatcgcggc cgcctcggcg tggctggctg   7860 

cgaagccgcg caggaagtga tagcggtcga tcagggcatc gccggcgtcc gtgtcggcgg   7920 

cctcggccgc gagctgaccc agcgcgaaca gggttgcgac aatgccggcg gcgtcggccg   7980 

acaactcgcc tcggaagccg ttgccgtcca cctcgatctc caggcggtcg gccaggtcgg   8040 

gggccatgta aaaaccgccg tccgacaagg tgtagtagtg ccaatacgcg ccgctgtagc   8100 

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ggccgaagta ggcgggcagg aagtcgaggc gctgggcctc ggcgaccagg gaagcggtaa   8220 

cgggttgctc ttgggtgttc atcggacttt ctccggtagt tgacctgggc gaaatgcccg   8280 

gccttcaagt gctatattag ggcaaaatgt cctaatcgtc aagcacttta gctaaacgtt   8340 

ttagccgcta aaccttgccc tttcccttgg cgtgcattac aatgtaattc acgaacccaa   8400 

ccggagaacc aatcatggct gcaaaccagc tcgtacaaac gcgcatcgac ggcgcgatca   8460 

aggaagaagc ggcggccgtc ctggccgcga tgggccttac cgtgtccgac gcggtgcggc   8520 

tgctgctcac gaaggtggcc caggacaagg cgctgccctt cgagccgctg attccgaacg   8580 

ccaccaccat cgaggcgatg aaggaagccc gcaagggcaa gctgccgcgc ttcgccaccg   8640 

tcaacgatct gatggccgat ctgcatgcgg cagattgagc gcaccggcca gttcaagcgc   8700 

gactacaagc gcgaggcgaa agggcagcac cgggccacgc tcgacgccga cctggtgccc   8760 

gtcctggtcg cgctcgccga cgaccagccg ctggaacctc ggcaccgcga ccacgcgctg   8820 

accggggact ggaaggatca ccgggattgc cacgtcaagc ccgacctggt gctgatctac   8880 

cagaagcccg acgccgacac gctgcgcctg gtgcgcctcg gctctcactc cgaactcggc   8940 

ttgtgatcgg cgcgggcctg gccccgcgtc tcacgtttca ttgacacttg aggggcgctt   9000 

tccgcgccac cggccgagct ggccgacccc cttccttggc gtaaaacctg cggcggtgga   9060 

gctgctgcga tgcttgagga tcgcgcggcc ggtcgaaccg cggcgacctg gttggggagt   9120 

gtgagggggc tttgccccct cgcaagctct cgaacttact gccttccgcc aggcgcttgc   9180 

gcctggctct cctaagccgt agcgccgaag gcgctccatt gtggggtgag gccgcaaggc   9240 

ggccgagggg cgtagcccct ggggggatgg gaggccgctt gcggccgggt gggatcgaga   9300 

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gtttttttcg ccagcctctg gttaaaacta cctggttata taaaaaggtt ataaagacgg   9420 

ttaaaaacct ggttagcatg accgaaaaac gcgcgtaaac cgttgtcacg ccaaggaaaa   9480 

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ccctcaagtg tcaagaaccg cgcccctcaa gtgtcagtag ggccgcccct caagtgtcaa   9600 

taccggggca gggttcctaa cagggttatc cacaacttcg gtggataact ccatgccgat   9660 

caggcactta ggccgcctcg gcggccgcct ggacggctcg accaggccga aatcggccgc   9720 

tgccccccaa gtgtcaacat cgcgccggcc ccgctgcccc tcaagtgtca acgtcagggc   9780 

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gcagggcagg gaaggccccg gaaacggggt ctcctcgttt tcagtgcaat aagtgacggt   9900 

acgaaaagct agcactggcg cggaggtggt gttggtagat cgttgatttc attgactttc   9960 

ctgttcactt tcaaatctgc gattcgtggc gtcaaaccgt ggtcggtttc atccattggt  10020 

gccagttatc gatgcatttg gccgcgaagg caggatttgg tcagcatagc ggtcaaccgg  10080 

gaagcgaaac acaccccgca agttgatgct ctccagcctg gtgggcgcaa tcttcccgat  10140 

cagttccggt ggaatgacct ggcggcggtt cgaccagcga tccaggaccg cctgcatctg  10200 

tgaggtattc cacgccatca cgatgttggc catcaggctc aacgcatcgg ccacagcctg  10260 

catttcatcg acacgtttgg cctgcgccgg gctgatccgg ccggtataaa tggcgcgctt  10320 

gagggcgtta acagcctcgc cccgattgag cacccggcgc aactcgttcc tgaaaggggt  10380 

tctacgccgg aaccccagaa aattccgtca ttccacattg tgaacgtcaa tcggtttgtt  10440 

gcctgacgtg ccgagcgagt aactcagtcg gtaaatgcct gcccgaactg ccgtgcccgc  10500 

tttacatcgt cggtatgcaa gtaaatcgac gtggtcgaaa tcgacgcgtg acgcaggtta  10560 

tctcgtacgg cgctcagctc aacccctctg gcgatcgcgt gggtcgcatg ggtgtgccgc  10620 

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ccggcatcgg cgtcgtcaag gctgccaatc agggacgtgg tcggattcca gtgagcacgg  10800 

ctgacaggaa gcccccgctc ctgcagatat cggtccagcg ctgtgcgcgc taggggtgtc  10860 

agggtaacgc gggctggctt gccgcccttg ccgaccacgt gcagccagtg atcaccggct  10920 

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gcgtagccga aatccagcat gaaccgcaac cgttgcgcag cgggcgcctg ccagccgtac  11040 

gaccactcga gcccgttggc gatggtgcgc gtcagcatcc attctccttc ggtgaaagcg  11100 

tgcgaggttt caagagccat ggcgcgcttg ctgccgcgta ccttgatgcc ggagaatggg  11160 

ttggccacga cgtagcgctg ctcgaccagc cagcggaaca tggcgctgag cacggcaagc  11220 

gcatgcgcaa tcgaacgggc cgagaggttg tcgacaaacg ggcgccagtc cgttgatgtg  11280 

cgcggccgcg gtggcccgac ccagcgttct cgcggtgtag gtctgcgcag aaacgccctg  11340 

tagtcggtgg catcccgggt ggtcagcgaa gacagcgcct tgccgcgagc aacgatgccc  11400 

cagagaatca gccgttcggc ttccttgcgg taggcccgct gcgtggccgg ggattcgtgc  11460 

aacgcgagcc atgcctggat agcgtcgtaa tcgttgtcga cgccgaggat gcaggccgac  11520 

accggtgcgc ggaaggcgcc ggcggatccg tcgatctcgt gcggtagccg tagttgctcc  11580 

caaggcgtca cgactgactg ccgatccgcg atgatcagtg cgcgggcccg ctccgtgagc  11640 

gccgggtacg cggcaaagaa ggcctcgatc cttcttgcac tggccggccc gagacccgga  11700 

atgacggtcc accactgccg gcgacgcgga atccgtaccg tgagatcggc cagggtccgg  11760 

atgccggccg cgtgcagggt gcgggcagcg cgattcggca gccagtgcgc aatgtcgtcg  11820 

ccgatctgcg gagctggcgc aggcatgatg cgcagtagct cgacagcctg cgtggtggcg  11880 

cgcgcatgat gcatacgctt ttgggccggg cattcgaaca gcgtggccag atctgcccgc  11940 

tgtcggttac gggcataaag tgccagttgc cggcggatct ggccgatgac gccgcgggct  12000 

gactggctgt ggctgagccg atcttgcatg taccggtgtg ccgcctcacg cgaggatgcg  12060 

ccctcgtacc aggcacgcag cgctgccagt gcatcagcat caggaaagtc ggtcgggatg  12120 

tcggcggcgg acgggctcgt ggggcgcgtt ttcatgtcat cgagtttaat atggaaacaa  12180 

tgccacagag ataataaagc ttatctctgt agaatgcggg agttcaatat ttctgtcgta  12240 

ccccatgtcg tgatatcaca aaattgaagg atctgacgtt gcgtggagag gatggtcgat  12300 

gatcaacaag aataagctgc tcagcgtctt ttccgacgcc gaacaggaag ccctgtatgg  12360 

cctgcctgat ttcgacgatg cgcagcggct ggaatacctg gcattgaccg aatccgaact  12420 

ggcgctcgcc agtagccggc cctccatacc cgcgcaggtc tattgcatct tgcagattgg  12480 

ctacttcaag tccaagcacg ccttcttccg cttcgattgg gacgaggttg aggacgatta  12540 

cgatttcgtg ttgagccgct atttccacgg cgagccgttc gaacgcaagc cgatcacccg  12600 

gcacgagtac tacgcccagc gcgaacagat cgctgaactg tacggctatc gaccgtgggt  12660 

ggccgccttc ctgccgcaac tcatgcagca ggccgcgcag atcgtacgtc gcgacgtgac  12720 

accgggattc gtcgccgccg agctcatcgt gtggctcaat gagcacaaga tgatccggcc  12780 

cggctacacg accttgcaag agctagtcag cgaagccctg tccgtcgaac gtcggcggct  12840 

gggcgacctg ctcaccggcg tattggacga attgacccaa accgcgctag accaacttct  12900 

ggtgcgcgat gatactctgt cgaaactggc ggcgctgaaa caggatgcca agaatttcgg  12960 

ctggcgtcag atggtccgcg aacgcgaaaa gcgcggcacg ctgcagccgt tgcacgaaat  13020 

cgccaggacg ctgctgcccc ggctggatat ctcgcagcag aacgtgctgt actacgcaag  13080 

cctggcgaac ttctataccg tccacgacct gcgcaacctg aaggcggatc aggcgcagct  13140 

ctacctgctg tgttacgcct gggtgcgctt ccgacagctc accgacaacc tggtcgatgc  13200 

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catcgccgag caagtaaaac gccatcggga aacgccgcag atcggccgcc tgttgtcgct  13320 

ctatgtggac gacagcgtag ccgatccgac gccgttcggc gaggtgcgtc agcgcgccta  13380 

taaaatcatg gccaaagatg tgctacaaaa cacggcgcaa cgcatgacgg tcaagccgct  13440 

gagtcaactg gcactacact ggttggcggt ggacggccta gccaaacgta ttcgccgtca  13500 

cctgcgcccc ttgtacgtcg agctcgactt cgtcggcacc tccccagaca acccgtggct  13560 

cgcggcgctg gcttgggtca agggggcctt cgccaaacag cagcgcctgt cacaacgacc  13620 

gctcgccgaa tgtcccgcgg ccacgctgcc gaagcgcctg cgaccgtacc tgctgatctt  13680 

cggcgctgat ggtcagccga ccggtttgca cgccgatcgc tacgaattct ggttgtaccg  13740 

ccagatccgg aagcgcttcc agtcgggaga gatctatctc gacgacagtc tgcaacatcg  13800 

tcacttctcc gacgagcttg tttcgatgaa cgagaaggcc gacgcgctgg cgcagatgga  13860 

gatcccgttc ctgcagcagc caatcgatgc ccaactcgat gcgttagcgg ccgagttgca  13920 

tgcacaatgg ctggccttca accgagagct gaaacagggc aagcttacgc acctggaata  13980 

cgacaaggat acgcagaagc tgatttggcg caaaccgaaa accgagaacc agaaggtgcg  14040 

tgagcaggca ttctacgagc aactgccatt ctgcgatgtt gccgacgtgt tccgcttcgt  14100 

caacggccag tgccagttcc tgtcggcgct gacgccattg cagccgcgct acgcgaagaa  14160 

ggtagcggac gccgatagcc tgatggcggt tatcatcgct caggcaatga accatggcaa  14220 

ccatgtcatg gcgcgcacca gcgacattcc gtaccacgtt ctggatagca cctaccagca  14280 

gtatctgcgt caggcgacgc tgcatgcggc caacgactgc atcagcaacg ccatcgccgc  14340 

gctgccgatc ttcccgtact actcgttcga tctcgatgcg ctgtacagcg ccgtcgatgg  14400 

gcagaaattc ggcgtcgagc gaccgaccgt gaaggcgcgt tactcgcgca aatacttcgg  14460 

acgaggcaaa ggcgtcgtcg cctacacgct gctgtgcaat catgtcccgt tgaacggcta  14520 

cctaatcggc gcgcacgagt acgaggcgca tcacgtgttc gacatctggt atcgcaacac  14580 

gtcggatata gtgccgactg cgatcaccgg cgacatgcac agcatcaaca aagccaactt  14640 

cgctatcctg tattggttcg ggttgcgctt cgagcctcgc ttcacaaacc tcgatgacca  14700 

gttgcaggaa ttgtattgta tcgacgaccc ggcgctgtac gagaaatgcc tgattcagcc  14760 

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ctcgcaggaa aacccgacac gtcgcgcgat ttttgagttc gataagctca ttcgtaccat  14940 

ctacacgttg cgttacctgc gcgacccgca gctcgagcga aacgtgcatc gctcccaaaa  15000 

ccgcctcgag tcttaccatc agcttcgttc gaccatcgcc caggtcggcg gcaagaagga  15060 

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caacgtcatc attttttaca actcggcgat tctgtcgcat ctactgacga aatgggaggc  15180 

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cattgcaggg ctcgaattgg agtgatcgaa ttttcggcgg ttctggcttg gaatccctta  15360 

ttcctgttac ggtggaatac gatgccacaa ccaggtaatc ctttaccccc agccgtggtc  15420

 aacacctggc gactgagcgt cggcacgtcg ctgttcgtga tcgatatcct ggccgacggc  15480 

agctggcgac cggcgtatat tgcgccaaag cggctgggtg gctggacgat ggatgtgttg  15540 

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tcttcgaaca ggacgccaga atgaacatgc tgaaacgtcg tctcgatgcg acagacgaaa  15720 

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ccctgctttg cgatgggact cgtggccgag ggccagacgc actatgcttg cctggcactg  16140 

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atacgcggca ccgacgactt cgaggtcgta cacttcggct tagagtttta cggctaccgc  16260 

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tgcggaatct ggcgctttca tcccgccgcg tccgtgaggc ccagacgcat ccgatagtcc  16800 

ccgagcaact gctgctcgtc gaactgcgct gtgagcttcg tcagatcggc ggtcagcgat  16860 

tcacgtgctt cgcgcagccg cgtcagttca gtcgcctcag tcctcgcggt gttagcagcg  16920 

catcgtgctc ggccttggtg cgtgcgtggt cggcgagcga ctggttcaac gtattctgta  16980 

actacttgct gtgcgcttgc agctcgcgta gatgccttgt cgcgacgccg gcttcggcga  17040 

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cgatccgctg cgcctgctcg acagcgtgat gttctgcgac ggcgcgaacg gcgtcctgat  40020 

gatgcgggcc gagacggcgt ccgcgatggg attgtccaaa tgcgcgcggc tggccggcta  40080 

cgccgaacgc acgaaccacg atgtgcagga acagccgccc gacctgctcg cgtcgggctt  40140 

cgtccaggcc ggtccgcgcg cgctgcgcca ggccggcctg accgtgcagg agatcgacat  40200 

gctgcagctg tacgacgact tcaccatcgc cgtcctgatg cagctggagc acatggggtt  40260 

ttgcggccgg ggcgagggcg ccgccttcat cgagaagacc gatctaagat tcagcggcgg  40320 

cttgccgctg aacacgggcg ggggccaact ctccgcgggt caaccaggct tggctgccgg  40380 

cggactgggc ctggtggagg cggtgcgcca gctcttcggc gaaggcggcg caacccaggt  40440 

cgaagatccg cgcaatgcgc tggtcacggg catcggcggc ctcgcctatg gccgggcctg  40500 

gatgatgagc agcgcgctcg tgctggaccg atgagcggtc ttcgaacttc gactgtggcc  40560 

atcggccact acatggacac cgcggcgttc tgggcggcca cgcgcgagcg ccggctgctg  40620 

gtccagttct gcacgcaaac aggacggtgg caggcctatc cgcggcctgg cagcgtctac  40680 

accgggcgcc gtcgtctggc gtggcgcgag gtcagcggcg acggggtgtt ggcaagctgg  40740 

accgtcgatc gcatgaacac ccctgcggcg gccgacgccc cccgcatgca cgcatggatc  40800 

gacctggtcg aaggcgcgcg aatcctcagc tggctggtcg actgcgatcc cgcgcgattg  40860 

cgcgtgggcc tggccgttcg ggtcgcctgg atctcgctcc ccgacggatg gcagtggccc  40920 

gccttcacca tcgccgcgca ttcaggcggg cccaacggaa aggcacccta gccttgcaac  40980 

acgcctgggg ccttgatttc tggcgcactc cgttccgcca tcgccagccg ctgaagccaa  41040 

cggcgtgcgg cgagcggcgc gtgatccacc gcgatatcca tcattccgcc gctgctggac  41100 

ggctcgatcc tgcgaatgac ttccacgccg tcgagtgccc agtttctctg ctggttctcc  41160 

atgagcacct tgtcttccat cacggtcttg cggaactgct cgaacatgcc gacggtcagc  41220 

gcctcgttgt ccggcaggaa gtcgcgatag agcgcggaga acttgaaatg cgtggtcgat  41280 

gtggaggggg tacagggccc cggcacccga agccgcttga tctgcgtcgg gtcgttgttg  41340 

ccgaccggtt cgacctcgat ctccagcagc atgttggcgc cgggccagaa gctgatgcgt  41400 

tggctgttct tgacgaagtc ccatccgaac aggttcttga acgagggtcc ggtggacgcc  41460 

ttgtcccagt tgcgtgtcac ctggaccttg gcttcgctga cgtcgacggt cgggcgcgtg  41520 

agcgccactt cgggcgtgcc gacggtctct ggatgggcgt aggtcacatg cgacaggtcc  41580 

agcacgttct cgatgttgaa caaaaagggc gcctcgacga gcagggcttc ggcgggccgc  41640 

ccgacgtagc gtccggagct gcagatctcc gcgtagtcgg gcaccagcgt ttcgtttgcg  41700 

agcgccggat cgcccggcca gatccagacg aatccgtcgc gctcgaccac cggataggag  41760 

cgcacgcagg cgctcggtgg gacgcgagac tgaccgggaa tgctcgtgca cgaaccgtcg  41820 

ccggcaaagg tcaacccgtg atagccgcac tggacttcgt cgccgatcag gcgccccagg  41880 

gaaagcgaga cgcgacggtg gctgcaacga tcggccagcg cggcgacact gccgtcattg  41940 

cgacggaaga agacgacggg ctgttccagc agggttctcg ccagcagctg ccgccccacc  42000 

tcgtgcttca tcgccccgac gtaccagaaa ttcttgggat acatggtcta gttctccttc  42060 

gtttgcggac cgtgcgctga gcgtagggcg agcaccttcc agtggcatca tgaatgtgat  42120 

gacgaagcgc gaagaaaccc ttgattcatc gcccaagccg gtcaagtcgg cattccgggc  42180 

gatcgagatc ctcgagtact tcgccgcgag gcagaagggc gccaccatca ccgagattgc  42240 

ggcggcgctg gactatcccc aatccagcac ctcgatgctg gttggcagcc tggagacgat  42300 

gggctacctc acgttctccg agaaagacca cctcttccgt cccacgctgc gcgtcatgct  42360 

cccggctcgc agcacgccct tccgtgacaa cacgccgagt caagggaagc aatacaaatg  42420 

ggccctcgcg atgcgcacga aggccggcgt catggtcgga ctgcgccaag gcattcacgt  42480 

gcgcttcatc ctgtcgctgt tgccgagctt gaagaccaac gcgctgtggt ttccgccagg  42540 

cgtcctgcgt ccagtctgca ggtcggcggc cggcaaggtc ttgctggcga acgaacgcga  42600 

cgaggacatc gaacggatcg cctctgccgc gaacgcggag gcggctgacg gtgttcaagt  42660 

caatattccg gcgctgattc gcgaagcgcg cgagtgccgc caacgcggat gggctcagag  42720 

tctggactac ccgaggcccg gctgggcgaa ccttgcgatg gggctgcccc ggatggaagg  42780 

acagccggag atggcggtca cgctgggcgt tcgaaaggaa tcggtcgagc tgcggcgcga  42840 

cgatctgatc gccgaactca ggcgcgcgat ggaacgcttg aaacgctagg ccgccccgag  42900 

gatgcgtggc ggaccctctc actcgcccct atcgacagcg cgccgccccc gccttatatt  42960 

caattcaatg aggcacgatt caaacaattc atccgccgcc gggccccgcg ccgacgcctc  43020 

cccgctcgtc ctgccacgca agcgcgggcg caagaaagtc gacggcctgg tcgaggcgcg  43080 

gcggcagcag atcctcacgg ccgcgctcga gctgttcggc accaagggat tccaccgcac  43140 

gacgacgcag gacctggccg acagcgccga cgtgagcgtc ggcctcatct accagtactt  43200 

caaggacaag gaagacctgc tcgcggcggc catcggccag atcttcgatg cctacctgag  43260 

cgagatcccg ctcgccgtcg aggccgccgc cgatccgctg tcgcgctttc gggccgcggt  43320 

gcatgcctac tgccgcgtca tcgacgaaca ccgcgaggcc gccctgctcg gctatcgcga  43380 

gacacgttcg ctgtccaagg cggcaaccaa gggcctgatg gcgaaggaaa cgcagtcgac  43440 

ggcgctgatc gccgagcgcg tgaccgaatg catcgaggcg cgcgtcttcc gctcggtcga  43500 

cgtcgcgatg ctgacctacc acatcgtcgt cttcgtccat tcctgggcgc tcaattcgtg  43560 

gcgcctgaag ggccagttca agcgcgagga ctacgtggac gtgggcgtcg acatgctgct  43620 

gggcccgatc gtgcagaccc cggcgcctgc gcgcaaaccc gccaaggccg ccaagacaac  43680 

caagaccgcg aaacccgcac cccgaaggaa tccccatgcc ggccgccgca ctgtctgaca  43740 

aggtcgcgat catcaccggc gccgcgtcgg gcatcggcgc cgccacggcc gagcgcttca  43800 

tcgccgaagg cgcgcaggtg atgctggccg acatcgacgg cgccgcggcc gaagcggtgg  43860 

ccgcgcgcct cggcccgcgc gccgccgccg cgcacggcaa ccattgcctg cccgcggaca  43920 

acgcgcgcgt ggtcgccgag acgctggcgc gcttcggcca cgtcgacatc ctctacaaca  43980

 acgccggcgt gctgtcgcgc ggcgcgctcg acacgatcga gggcgacgag ctgcgcgccg  44040 

tgctcgatgc caacctggtc ggcccggcct tgatgagccg cgcctgcctg gccgcgctgc  44100 

gcgagtcggc acggctgggg cgcgcgccgt gcatcctttt cacgggctcg atccagtcgc  44160 

tgatggtgcg cccgggcttc gccgcctacg ggtcgtccaa gcacggcgtc gccggactcg  44220 

cttcgacgct ggcgctggaa ctcgcgcccg agggcatccg cgtcaacgcg ctctgcccgg  44280 

gcccggtcga tacgccgctg ttccgcaaga gcgcggcgcc ggccggcgcg gtcgggccgt  44340 

cgatcgagca actggctgcc ggcatcccga tcggccgcct gatccgcgtc gaggaagtcg  44400 

ccagcgccgc cctcttcctg tgcagcgatc aggccagcgc gatcagcggc gtgctgctgc  44460 

cggtggacgg cgccatcacg gcccgctgag cgtccggccg gccagcgggt ccctaccctt  44520 

gacagggcca tgccggtgcg caagaataaa tttgagtgaa gcttcactca aataagagaa  44580 

tcgagatcga gcaccgccgc cggctgcaca tggcaagggc gcgggcaacc accagaacag  44640 

gagacaacgc cgtgaaaatt caacgtttcg ctcgcgcctt ccggtcccgc ctcgccgccc  44700 

tggcgatcgg ggtcgcgacc gcttccctat cgctgctggc tgccggcccc gcggccgcgc  44760 

aggacaagcc catcaagatc ggcctgacca ccgacctcac cggcatcgcg gccgcctacg  44820 

cgcgctcgca ggtcaacggc gtgcagctcg cggtcgacca gatcaacgcc agcggcggcc  44880 

tgctgggccg caagctcgag gtgctggtgc gcgactcgca gctcaagccc gacctcggca  44940 

cttcgcacac gcgcgacctc atcacgcgcg agaacgtcga cttcctgatc ggccccgacg  45000 

gcagcgcggt cggcatgacg gtctcggcgg tcgccaagca atacaagaag gtggtcatga  45060 

tgaccatccc gaactcgccg cgcatcacga ccgagacctt ccatccctac gtcttcacgg  45120 

tcgtgccctc cggcgtcatg gaagcgcgcg ccatggccgc cgccatcggt cccggcaaca  45180 

agcgcatcgc cttcatcggc ggcgactacg aggccgcgca ccaggggctg aagtacttca  45240 

aggactggct ggcgaaggtc aatccctcgg ccgagatcgt ctccgaggcc tggccgaagc  45300 

tcggcgagcc cgactacagc agctacatca cgagcctgat gtcgtccaag cccgacgtca  45360 

tcttctcgta cctctggggc gccgacctga tcggcttcgt caagcagggc aagccctacg  45420 

gcgtgttcac caagaccaag gtcgccagcc tggtgttcct cgacgacctg aaagcgctcg  45480 

gcgacgagat gcccgatggc gtgatcgccc agatgcgcgc gcccttcttc gcgcttacgg  45540 

gtgaccgcat gaccaagttc accgagcagt tccgcgccaa gtacaacgac tacccggccg  45600 

actgggcgat catgggctac gagggcatgc agatcctcgc gcaggcgatc aagagcgcca  45660 

actcgctcga atcggacgcc atcgtcaaag cggtcgagca ggtcaagtac gacggtctgc  45720 

gcggtccgat cagcttccgg gcgctcgatc accagggcac ggtcggctcc tacatcggca  45780 

ccgtcgccaa gagcgacaag tacccgttca agatcctgac caacgtcaag accatcagcg  45840 

ccgaatcgat ctggcccagc gaggccgaga tcacggccgc gcgcgcggcc gtcaagtagg  45900 

agccgcggcg cgcatgttcc agagcatcct ggtccaggcc ctgagcggcg tcagcagcgg  45960 

catggtgctg ttcctggtcg cttcgggcat gacgctgatc ttcggcacgc tgcgcgtcgc  46020 

caatttcgcg cacggctcct tctacatgat cgcggcctac ctgagcttca cgctcacgcg  46080 

ctgggtcggc cacggaacct ggggcttcgt cgtctcgctg gtcgtggcgc cgctcatcgt  46140 

cgcactgctc gggctggtgg tcgagcgctt cctgctgcgc cgcatcgcca cgcgcgccca  46200 

ccagtaccag ctgatcctga cctatgcgct gacgctgatc ctggcggatg ccgtgaagat  46260 

gatctggggc cgcgacaact tcacggtgcc gcgccccggc gcgctcgacg gcgccttcga  46320 

catcttcggc acgcccttcc cgagctacta cgcgctcttg atcgtggtcg gcgccgtcat  46380 

cgccgtcgcg ctgcacctgc tgctgacgcg cacgcgcttc ggcaaggtgc tgcgcgcctc  46440 

ggtcgccgac ggccagatgg tgggcgcgct cggcatcgac gtgccgcgcc tgtacaccgg  46500 

cgtgttcgcg ctcggcgcct ggctggccgg cctgggcggt gccctggcgg cgccggtggg  46560 

ctcgatctcg ctgggcatcg acagctcgat catcatcgaa tgcttcgcgg tcgtgatcat  46620 

cggcggcgtc ggcagcgtcg gcggcgccct gctcggcgcg ctgatcatcg gcgtgaccaa  46680 

gtcggtcggc atcctgttcg cgcccaagct ggcgatcgcc ttcatcttca ttgcgctgtg  46740 

cgcggtgctg gtgctgcggc cgcagggcct gctgggccgc agcacggcct gatgggacga  46800 

gcacgcgcat gagaaccgcc ctgcccgccg ccatcgaccg gcccgaacgc atgtcgcgca  46860 

gcacgatcgg ctggtgcgtg gccgcgctcg tgttcgcgct gctgccgctc gcgatcggcg  46920 

agagctacgc cttcctgacg gtcgacttct tcatcatgtc gctgttcgcg atgagctaca  46980 

acctgctgct cgggcaggcc ggcatgctgt ccttcggcca cgcgacctac tacggcctgg  47040 

gcgcctatgc ggtcgccatc ctgcagaaca agtacggcgt accgccctgg ctcgggctgg  47100 

tggccgcgcc catcgtggcg gcgctcggcg ctttcgcgat cggctggctt tcggtgcgcg  47160 

tcaccggcat gtacttcgcg atgctcacgc tggccttcgg ccaactggtg ttcaccctgg  47220 

tgctcggctg gtacaccttc accggcggcg acgacggcct gccggtggcg ctgccggact  47280 

ggatgctgtc ggcgcgcaac tactactact tcagcctcgt gatcgtcgcg ctgtgcatct  47340 

ggctgatcta ccgggtcacg aagtcgccct tcggcgtcgc tctcggcgcg atccgcgaca  47400 

accgccagcg tgcggcctac atcgggctct cggtgcgccg gctggaactg caggccttcg  47460 

tcgtcgcggc ggccttcgcc ggtgtcgcgg gcgggctgcg cgcaccgctg cagcagatgg  47520 

cctttcccgg cctgctcaac tggagccagt cggccgaccc ggtgctgatg gccctggccg  47580 

gcggcatcaa cagcttcgtc gggccgatcg tcggcgccgc gttgttcgtg ttcaccaatt  47640 

tcgcggtcac cagccgcttt gagtacccgc tgctggtctt cggcacgctg gtgctgctga  47700 

tcgtgctgtt cctgccggac gggatcgtcg gcacgttgcg gcggcggcgc aatgtggggg  47760 

cgcagaaatg agcgcagcgc ccgtcatcct ttcgatcgaa ggcatcggca agaacttcgg  47820 

cggcttccac gcgctgagcc aggtcgacct gcaggtggcc gaccgcagcg tgcacgcgct  47880 

gatcggcccg aacggtgccg gcaagagcac gctgctgaac gtggtctcgg gccatctcgc  47940 

gccgagcgcc ggccaggtgc tgttccgcgg ccgaccgatc tgcggccggc cgccgcacga  48000 

aaccgcgcgc cgcggcgtcg cgcgctcgtt ccagatcacc agcatcttca gcggcttcac  48060 

ggtgttcgag aacgtgcaga tggcgctgct cgcgcagcac ggcctgtgca cgcgcatgtt  48120 

ccgcagcgcc gcgccgatga agcgcgacga ggccttcgcg ctgctgcagc tggtgcggct  48180 

cgacggcgcg gccgaccgca tcgccggcca gctcgccgcg ggtgaccgca agcggctgga  48240 

attcgcgatc gcgatggccg gcacgccggc cgtgatgctg ctcgacgaac cgaccgccgg  48300 

catgagcccc gacgagcgcg ccatcgtcat cggcctgatc cgcaagatca accaggagcg  48360 

cggcgtggcg gtgctgttca ccgagcacga catcgagatg gtgttcgcca ttgccgaccg  48420 

catcaccgtg ctgcaccagg gcagctgcat tgccgacggt gcgcccgagg cggggtctcc  48480 

tcgttttcag tgcaataagt gacggtacgc aaagctagca ctggcgcggg ggtggtctgg  48540 

gtagaccgtt gatttcattg actttcctgt tcgctttgta aacgggtatg gtggcctccc  48600 

acttttgagg ttcacgatgc agggttggca cacaacgttt ttggggatgc gtgggctccc  48660 

tgcaggaggg cgcgaaggcg gccgccgagg ccgtgcggcg tgaggttgag gcggtgacgg  48720 

cgcagctcgt cgcgccgatc cgcgaggcgc ggcgcgtcgc catgatgaac atggtcgcgg  48780 

ccggcatggc ggtcgtggcc gccggcctgg ccctgtgggc ctcgctgtag atggcgatgc  48840 

gggatctcat cgtcagaact ggcgatgg                                     48868

 

Claims (5)

1.一种氯代脂肪烃降解性质粒pRC11，其物理图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述质粒pRC11的基因工程菌。

3.如权利要求2所述基因工程菌在微生物降解卤代烃污染物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述卤代烃污染物为下列之一：CH₂Cl₂、CH₂BrCl、C₂H₄Cl₂或C₂H₂Cl₂。

5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述降解在28～32℃、pH6.8～7.2下进行。

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