CN113980856B - 假单胞菌新菌种及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了假单胞菌新菌种及其应用。本发明提供了Pseudomonaspolyaromaticivorans，其菌株号为SL‑6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.23460。本发明菌株SL‑6为假单胞菌属新物种，该菌株具有比较广的多环芳烃底物谱，能够降解多种多环芳烃化合物。本发明对于芳香族污染物的生物降解具有重要意义。

Description

假单胞菌新菌种及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种假单胞菌新菌种及其应用。
背景技术
芳香族化合物(aromatic compounds)是一类具有苯环结构的化合物。它们不仅广泛存在于自然环境中，还广泛应用于人类社会工业、农业生产和日常生活中。由于苯环结构的稳定性，部分芳香族化合物能够长期残留在环境中(如水体和土壤等)，对生态环境和人体健康形成巨大威胁。例如，芳香族化合物对人体健康可能存在神经毒性、血液毒性、生殖毒性和致癌性等多方面的威胁，亟需高效的处理技术和工艺。
微生物降解是芳香族污染物脱毒的最佳途径，主要是依靠微生物的代谢产物——降解酶实现对芳香族污染物的降解。以微生物降解和转化为基础，对芳香族污染物进行完全或部分降解的生物整治技术是解决芳香族污染物污染问题的重要手段。
通过微生物降解法处理芳香族污染物重点依赖于分离、筛选高效降解菌株。目前被广为报道的芳香族污染物降解菌株主要包括假单胞菌属，芽孢杆菌属，红球菌属，鞘脂菌属等，其中假单胞菌属因其功能菌株种类多，降解效果显著，环境适应性广泛，成为相关领域的重点研究对象。然而考虑到芳香族污染物的多样性和难降解性，目前的生物处理过程仍需挖掘更为广谱高效的降解菌株，以及更多的新的菌种资源。
环境中多环芳烃污染最为严重的区域是油田、焦化厂、煤炭的加工冶炼等，而这些区域大多伴随着较高的盐环境。然而，在高盐环境中多环芳烃的溶解性极差，会更容易地富集于泥土、水体及生物体内，在环境中的半衰期会更长，对环境的危害更大。并且在高盐环境中由于盐胁迫的存在，会使普通微生物发生脱水、体内大分子结构发生改变、相关酶及蛋白质失活等现象，最终导致普通的降解微生物不能很好的发挥其降解的功能。因此，筛选出高效降解多环芳烃的嗜盐微生物是解决环境多环芳烃污染的关键。
目前筛选高效降解多环芳烃菌株主要针对中高浓度的多环芳烃。在自然界中多环芳烃的含量一般为低浓度，或突发多环芳烃污染事件生物修复到中后期时浓度降低，使生物修复效率大大降低。因此，挖掘低浓度条件下高效降解多环芳烃的微生物资源是促进多环芳烃生物修复应用必要环节。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够降解芳香族化合物的假单胞菌新菌种。
第一方面，本发明要求保护一种假单胞菌新菌种。
本发明要求保护的假单胞菌新菌种具体为Pseudomonas polyaromaticivorans，其菌株号为SL-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.23460。
Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6为假单胞菌属的一个新菌种，其16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示，gyrB基因序列如SEQ ID No.2所示，rpoD基因序列如SEQ IDNo.3所示。
第二方面，本发明要求保护Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6的培养物。
本发明要求保护的Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6的培养物是将Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6在细菌培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。
上述培养物中，所述物质包括Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6(菌体自身)和Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6的代谢物。
术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。
上述培养物中，所述细菌培养基可为假单胞菌培养基，可为固体培养基，也可为液体培养基。
术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。
在本发明的具体实施方式中，所述培养基具体为MSM培养基。
第三方面，本发明要求保护一种菌剂。
本发明要求保护的菌剂为含有前文第一方面所述的PseudomonaspolyaromaticivoransSL-6、Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6的代谢物和/或前文第二方面所述的培养物。
术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。
所述菌剂为用于降解芳香族化合物的菌剂。
上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为生物学上的惰性载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述的Pseudomonaspolyaromaticivorans SL-6或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述菌剂在降解芳香族化合物中的应用。
第五方面，本发明要求保护前文第一方面所述的Pseudomonaspolyaromaticivorans SL-6或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述菌剂在制备用于降解芳香族化合物的产品中的应用。
第六方面，本发明要求保护一种降解芳香族化合物的方法。
本发明要求保护的降解芳香族化合物的方法，可包括如下步骤：采用前文第一方面所述的Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6或Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6的代谢物或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述菌剂处理含有芳香族化合物的污染物。
在所述方法中，降解所述芳香族化合物时的温度可为15-50℃，如15-40℃，再如30-35℃。降解所述芳香族化合物时的pH可为6.5-9.5，如8-8.5。降解所述芳香族化合物时的NaCl浓度可为0-12％，如0-7％，再如2-4％，其中％表示g/100mL。降解所述芳香族化合物时可加以震荡条件，转速可为150-180rpm。
所述污染物可为含有所述芳香族化合物的水体和/或土壤等。
在上述各方面中，所述芳香族化合物可为多环芳烃，如稠环芳烃和/或非稠环芳烃。其中，所述稠环芳烃为相邻苯环至少有两个共用的碳原子的多环芳烃，所述非稠环芳烃为相邻苯环之间以一个碳原子方式相连的多环芳烃。
进一步地，所述多环芳烃可选自如下中的全部或部分：菲(PHE)、联苯(BIP)、萘(NAP)、芴(FLU)、苊(ANA)、苯并[a]芘(BaP)、芘(PYR)、二苯并[a,h]蒽(DBA)、蒽(ANT)、4-硝基苯酚(PNP)、苯并[k]荧蒽(BkF)、苯并[a]蒽(BaA)、苯并[b]荧蒽(BbF)。
由于Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6具有盐碱耐受性，因此前文所述降解芳香族化合物可为在盐碱环境下降解芳香族化合物。所述盐碱可为盐和/或碱。所述盐具体可为不大于140g/L的NaCl(如不大于120g/L，再如不大于50g/L，进一步如40g/L的NaCl)；所述碱具体可为pH6.5-9.5(如pH8.5)。Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6在偏碱性(pH8.5)、偏盐(NaCl 4％)环境下生长良好。
在本发明中，所述降解芳香族化合物为降解低浓度的芳香族化合物。所述低浓度具体可为5mg/L以下，如1mg/L以下，再如0.5mg/L。
实验证明，本发明菌株SL-6为假单胞菌属新物种，命名为Pseudomonaspolyaromaticivorans。该菌株具有比较广的多环芳烃底物谱，能够降解多种多环芳烃化合物，尤其能高效降解低浓度的多环芳烃。且该菌株还属于中度嗜盐微生物，环境适应性强，对盐碱具有广泛的耐受性。本发明对于芳香族污染物的生物降解具有重要意义。
保藏说明
分类命名：Pseudomonas polyaromaticivorans；
参椐的生物材料：SL-6；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏机构简称：CGMCC；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2021年9月22日；
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23460。
附图说明
图1为菌株SL-6的可生长pH范围。
图2为菌株SL-6的可生长温度范围。
图3为菌株SL-6的可生长NaCl范围。
图4为菌株SL-6的极性脂鉴定结果。DPG：双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol)；PE：磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)；PG：磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)；PL：一种未知磷脂。
图5为菌株SL-6的呼吸醌鉴定结果。
图6为基于Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6和假单胞菌属近缘种的完整16S rRNA基因序列的NJ系统发育树。
图7为基于Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6和假单胞菌属近缘种的完整16S rRNA基因序列的ME系统发育树。
图8为基于Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6和假单胞菌属近缘种的完整16S rRNA基因序列的ML系统发育树。
图9为基于管家基因16s rRNA、gyrB和rpoD的串联序列的NJ系统发育树。
图10为基于管家基因16s rRNA、gyrB和rpoD的串联序列的ME系统发育树。
图11为基于管家基因16s rRNA、gyrB和rpoD的串联序列的ML系统发育树。
图12为Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6在不同条件下的对菲的降解情况。A为SL-6在不同温度条件下的对菲的降解情况。B为SL-6在不同pH条件下的对菲的降解情况。C为SL-6在不同NaCl条件下的对菲的降解情况。
图13为Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6在最适降解条件下对低浓度菲的降解曲线(降解时间为6天)。
图14为Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6对不同多环芳烃底物的降解(降解时间为6天)。BbF：苯并[b]荧蒽；BkF：苯并[k]荧蒽；DBA：二苯并[a，h]蒽；BaP：苯并[a]芘；BaA：苯并[a]蒽；PYR：芘；PHE：菲；ANT：蒽；BIP：联苯；ANA：苊；FLU：芴；NAP：萘；PNP：4-硝基苯酚。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6的分离与鉴定
一、菌株分离及生长条件
土壤样本采集于山东省胜利油田(37°37'54”N,118°41'51”E)。将5g土壤样品浸入100mL含10mg萘和10mg菲的富集培养基(溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 20.0g/L；KCl1.0g/L；KH2PO4 0.3g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；酵母粉4.0g/L；酪蛋白氨基酸0.5g/L；蛋白胨0.5g/L；葡萄糖2.0g/L；蔗糖2.0g/L；)中培养6天(30℃，150rpm)。溶液以10％(体积比)的接种量转移至相同培养基中。经5次转以后，将菌液涂布在菲筛选固体培养基(菲100mg)；NaCl30.0g；KCl 1.0g；KH2PO4 0.3g；MgSO4·7H2O 0.1g；加水定容至1000mL，固体加入15g琼脂粉)上培养(30℃)，分离得到SL-6。将SL-6在改良LB培养基(胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl40g；加水定容至1000mL，调节pH至8.5)上培养(pH 8.5，35℃)，并在-80℃下保存在添加40％甘油的改良LB培养基中。
生长条件优化：
配制LB液体培养基(胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；加水定容至1000mL)分别设置不同的pH梯度：5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，11.5(不同pH的缓冲体系配置参照文献：Wang S,Dong L,Zhao B,Zhang X,Xu S,Wu K,WangH.Salipaludibacilluskeqinensis sp.nov.,a moderately halophilic bacteriumisolated from a saline-alkaline lake.Antonie Van Leeuwenhoek.2019,112(6):897-903.doi:10.1007/s10482-018-01224-w)，以10％(体积百分数)的接种量接种SL-6后，30℃，180rpm培养，每隔8h取样使用紫外分光光度计测量OD600，绘制菌株在不同pH条件下的生长曲线。
使用LB培养基(胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；加水定容至1000mL，pH8.5)分别设置不同的温度梯度：15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，以10％(体积百分数)的接种量接种SL-6，180rpm培养，每隔8h取样测定OD600，绘制菌株在不同温度条件下的生长曲线。
使用含有不同NaCl浓度的LB培养基(胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl梯度0％，1％，2％，3％，4％，5％，8％，10％，12％，14％，15％，％表示g/100mL；加水定容至1000mL，pH8.5)，以10％(体积百分数)的接种量接种SL-6，180rpm，35℃培养，每隔8h取样测定OD600，绘制菌株在不同NaCl梯度条件下的生长曲线。
二、化学分类特征
按照微生物鉴定系统(MIDI)的说明制备和鉴定脂肪酸。使用等人描述的方法(/>P,Kroppenstedt RM.Numerical analysis of fatty acid patterns ofcoryneform bacteria and related taxa.Can J Micobiol1996；42:989-1005.doi:10.1139/m96-128.)从100mg冻干菌体提取极性脂，并在硅胶板上使用氯仿/甲醇/水(体积比70:27:4)通过二维薄层色谱(TLC)在第一个方向进行分析，氯仿/乙酸/甲醇/水(体积比80:12:12:4)在第二个方向进行分析。
其中。极性脂组分提取及分析参照的方法参见“Collins,MD,Pirouz T,Goodfellow M,Minnikin,DE.Distribution of menaquinones in actinomycetes andcorynebacteria.J Gen Microbiol 1977；100:221-230.doi:10.1099/00221287-100-2-221.”和“Groth I,Schumann P,Rainey FA,Martin K,Schuetze B et al.Demetriaterragena gen.nov.,sp.nov.,a new genus of actinomycetes isolated from compostsoil.Int J Syst Bacteriol 1997；47:1129–1133.doi:10.1099/00207713-47-4-1129.”。呼吸醌类型分析参照方法参见“Minnikin DE,O'Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G,Athalye M et al.An integrated procedure for the extraction of bacterialisoprenoid quinones and polar lipids.JMicrobbiol Meth1984；2:233-241.doi:10.1016/0167-7012(84)90018-6.”。
三、基因组DNA提取，测序及拼装
SL-6在改良LB培养基上培养24小时，然后收集菌体。用试剂盒(北京金百特生物科技有限公司，D112-100)提取基因组DNA，并通过荧光染料(Quant-iTPicoGreen dsDNAAssay Kit)和琼脂糖电泳(1％)进行质量检测。采用全基因组鸟枪法策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术，基于MiSeq测序平台，对这些文库进行双末端测序。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)扩增SL-6的16SrRNA基因序列，并由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
四、基于16SrRNA基因和看家基因的系统发育分析
菌株SL-6的16SrRNA基因序列(1542bp)如SEQ ID No.1所示，gyrB基因序列如SEQID No.2所示，rpoD基因序列如SEQ ID No.3所示。
使用菌株SL-6的16SrRNA基因序列(SEQ ID No.1)在EzBioCloud服务器(https://www.ezbiocloud.net)中进行序列比对。在MEGA7.0软件中使用邻接法(NJ)，最小进化法(ME)和最大似然法(ML)构建系统发育树，选择Acinetobacter baumannii DSM 30007T(X81660)作为外群，基于bootstrap1000个重复进行系统发育分析。从NCBIGenBank数据库检索相关菌株的看家基因(gyrB和rpoD)，所有相关菌株的16srRNA基因序列来自于EzBioCloud。SL-6的序列从其基因组草图中检索得到。
五、基因组分析
选择Pseudomonas stutzer ATCC 17588作为基因组分析的参考菌株，其与SL-6的16SrRNA基因序列相似度高于99.79％。根据Yoon等人所述，在EzBioCloud中评估了同源基因百分比(Ortho-ANI)(Yoon SH,Ha SM,Lim J,Kwon S,Chun J.A large-scaleevaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity.Antonie vanLeeuwenhoek2017；110:1281–1286.doi:10.1007/s10482-017-0844-4.)。根据Meier-Kolthoff等人的描述，在GGDC(http://ggdc.dsmz.de/distcalc2.php)中进行数字DNA-DNA杂交(dDDH)(Meier-Kolthoff JP,Auch AF,Klenk HP,M.Genome sequence-basedspecies delimitation with confidence intervals and improved distancefunctions.BMC Bioinformatics 2013；14:60.doi:10.1186/1471-2105-14-60.)。SL-6基因组序列提交模式菌株基因组服务器(Type(Strain)Genome Server，https://tygs.dsmz.de/，参考文献：Meier-Kolthoff JP,/>M.TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy.NatCommun2019；10:2182.doi:10.1038/s41467-019-10210-3.)。
六、实验结果
从胜利油田石油污染土壤样品中分离到一株降解多环芳烃的新菌株SL-6。
改良LB固体培养基上的SL-6菌落呈黄白色，干燥扁平，不透明，在35℃下培养24小时后直径为2.0-3.0mm。细胞为革兰氏染色阴性，具有单极性鞭毛，无孢子形成，需氧，杆状，宽约1.0-1.4μm，长约2.0-2.6μm。
菌株SL-6的可生长pH范围为6.5-9.5，最适生长pH为8.5(图1)。可生长温度范围为15-50℃，最适生长温度为35℃(图2)。可生长NaCl范围为0-14％，最适生长NaCl浓度为4.0％(图3)。
菌株SL-6主要细胞脂肪酸(＞10％)为C16:0(25.63％)、C18:1ω7c(21.71％)和Summed feature 3(C16:1ω7c and/or C16:1ω6c,15.99％)(表1)，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺、二磷酸甘油和磷脂酰甘油(图4)；主要泛醌是Q-9(图5)。菌株SL-6的化学分类特征与假单胞菌属的化学分类特征一致(Zhong ZP,Liu Y,Hou TT,Liu HC,Zhou YG,Wang F,Liu ZP(2015)Pseudomonas salina sp.nov.,isolated from a salt lake.Int J Syst EvolMicrobiol 65(9):2846–2851.https://doi.org/10.1099/ijs.0.000341)，表明菌株可能属于假单胞菌属。
表1、菌株SL-6和假单胞菌属相关物种的脂肪酸谱(％)
注：菌株：1，Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6；2，PseudomonasstutzeriATCC17588；3，Pseudomonas nitrititolerans GL14；4，PseudomonasguariconensisLMG 27394；-，<1％或未检测出。*Summed feature 3包括C16:1ω6c和/或C16:1ω7。
基于16S rDNA序列的系统发育分析表明，菌株SL-6与Pseudomonasstutzer ATCC17588T(序列相似度为99.79％)形成一个集群，在此基础上，SL-6被归类为代表假单胞菌属的一员。SL-6与Pseudomonasstutzer ATCC 17588的rpoD和gyrB序列相似性分别为93.1％和95.19％，证实了两者的亲缘关系。SL-6和Pseudomonasstutzer ATCC 17588之间的ANI和dDDH值分别为90.5％和39.5％(平均值)。低水平的dDDH足以说明菌株SL-6代表了一个新物种，因此建议将其命名为Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6。
用SL-6的16S rRNA基因序列在EzBioCloud数据库中进行搜索，结果表明菌株SL-6与假单胞菌属相关，与Pseudomonas stutzer ATCC 17588(99.79％)，Pseudomonasnitrititolerans GL14(98.43％)，Pseudomonas guariconensis LMG 27394(98.28％)，Pseudomonas zhaodongensis NEAU-ST5-21(98.28％)和其他有效发表的假单胞菌属物种(<98.5％)具有高度相似性。基于SL-6基因组中16SrRNA的基因序列(1542bp进行了系统发育分析，根据NJ系统发育树(图6)，SL-6与Pseudomonas stutzerATCC 17588形成一个单独的分支，bootstrap值为100.0％，但进化距离明显不同。当使用ME(图7)和ML(图8)算法时，得到了类似的树拓扑，这支持NJ树的结果。此外，基于串联管家基因16S rRNA、gyrB和rpoD的NJ(图9)、ME(图10)和ML(图11)系统发育树表明SL-6与Pseudomonas stutzerATCC 17588形成了一个稳定的独立分支。结果表明，SL-6是假单胞菌属的一员。
菌株SL-6的DNA GC含量为63.7％，属于假单胞菌属(58％-70.0％)。为了进一步阐明SL-6分类学的地位，进行了基因组关联分析。SL-6和参考菌株Pseudomonas stutzerATCC17588T、Pseudomonas nitrititolerans GL14T、Pseudomonas guariconensisLMG 27394T之间的OrthoANI分别为90.5％、80.8％和75.9％，低于原核生物认定属于同一种的域阀值(>95.0％)(Richter M,Rosselló-Móra R.Shifting the genomic gold standard for theprokaryotic species definition.Proc Natl Acad Sci USA 2009；106:19126-19131.doi:10.1073/pnas.0906412106)。SL-6与参考菌株Pseudomonas stutzerATCC17588T、Pseudomonas nitrititolerans GL14T、Pseudomonas guariconensisLMG 27394T之间的的dDDH值分别为38.4％、23.7％、22.6％，远低于属于同一物种的域阀值(＞70％)(Wayne LG,Brenner DJ,Colwell RR,Grimont PAD,KandlerO,et al.InternationalCommittee on Systematic Bacteriology.Report of the ad hoc committee onreconciliation of approaches to bacterial systematics.Int J Syst Bacteriol1987；37:463–464.doi:10.1016/s0176-6724(88)80120-2.)。SL-6基因组序列经模式菌株基因组服务器(TYGS)分析，被鉴定为“潜在的新种”。菌株SL-6与参考菌株的16SrRNA基因序列相似性，ANI和dDDH值详见表2。
表2、菌株SL-6与参考菌株的16SrRNA基因序列相似性，ANI和dDDH值
综上所述，SL-6与假单胞菌属的模式菌株的化学分类特征一致，且具有较高的16SrRNA基因序列相似性，系统发育分析表明该菌株与假单胞菌属模式稳定聚类在一个分支，应归属于该属。此外，根据基因组相关性(ANI和dDDH)和生理特性，新分离物与假单胞菌属的其他公认物种明确区分。因此，很明显，SL-6应被视为假单胞菌属的一个新物种，将该新菌种命名为Pseudomonas polyaromaticivorans。Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6已于2021年9月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23460。
实施例2、Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6用于降解化合物
一、HPLC测定Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6对菲的降解
MSM培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl(40.0g/L)，KCl(1.0g/L)，KH2PO4(0.4g/L)，MgSO4·7H2O(0.1g/L)，NH4Cl(1.0g/L)；pH 8.0。
Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6在改良LB培养基培养至OD600＝0.6-0.8，离心(6000rpm，5分钟)收集菌体，用PBS缓冲液洗涤3次，然后用MSM培养基重新悬浮，以10％(v/v)的接种量将菌液接种在10mL含有菲的MSM培养基中，菲的浓度为100mg/L。摇床培养，180rpm，30℃。前两天每4小时取样，之后每天取样，每次取三个样品作为平行，测定培养基中菲的剩余量。以未接种Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6的含菲MSM培养基作为对照组。
使用等体积(10mL)的正己烷从上述样品中萃取菲。将1mL有机相吸入EP管中，EP管置于通风橱挥发正己烷，待正己烷完全挥发后，添加1mL甲醇复溶菲，将菲/甲醇溶液注射入HPLC样品瓶，使用0.22μm滤膜过滤。
使用HPLC(Agilent 1200)检测菲样品。柱材为Zorbax Eclipse Plus C18(4.6μm×150mm×5mm)，检测器为二极管阵列检测器(DAD)。紫外检测波长设置为254nm。流动相为甲醇：水＝90:10(v/v)(体积比)，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为3μL。结果由Chemstation(v2.3，Agilent)分析。
菲降解率计算公式如下：
降解率＝(初始量-剩余量)/初始量。
SL-6降解菲条件优化：
以无机盐培养基(MSM)为基础培养基(NaCl 20.0g；KCl 1.0g；KH2PO4 0.3g；MgSO4·7H2O 0.1g；加水定容至1000mL)，在条件为温度35℃，pH 8.5，底物(菲)浓度为100mg/L，转速150rpm的基础条件下进行单因素实验。实验时对照组按相应的单因素处理，不接菌，对照组和实验组各3个重复。不同条件梯度的单因素如表3所示。
表3、菌株SL-6单因素条件设置
因素 范围
温度(℃) 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃
pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5
NaCl浓度(％) 0、1、2、3、4、5、6、7
注：％表示g/100mL。
二、多环芳烃底物谱的测定
按照上述方法，将Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6接种在MSM培养基中培养，MSM含有以下一种多环芳烃(100mg/L)作为唯一碳源和能量：菲、芘、萘、芴、苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苊、对硝基苯酚、联苯、蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽。所有组设置三个平行，在摇床中培养6天(30℃，150rpm)，未接种SL-6的含底物培养基作为对照。
底物的测定方法：(1)芘、萘、芴、苯并[a]芘、苊、对硝基苯酚、联苯用甲醇溶解配制成1×104PPm的母液，实验后用高效液相色谱测定；苯并[a]蒽、蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽用正己烷溶解配制成的1×103PPm母液，用气相色谱进行测定。(2)菲的测定方法参见前文。
各多环芳烃降解率计算公式如下：
降解率＝(初始量-剩余量)/初始量。
三、实验结果
Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6能在6天内(生物降解菲(100mg/L)90.0％以上，对环境适应性强。Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6降解低浓度菲的能力非常突出(0.5mg/L菲，6天内降解率为68％)。此外，与以前的报道相比，菌株SL-6具有广泛的底物谱，降解多达9种多环芳烃(降解率大于20％)。
Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6降解菲最佳温度为30℃(图12中A)，最佳pH为8.0(图12中B)，最佳NaCl浓度为3％(即30g/L)(图12中C)。在优化条件下，SL-6能够在6天内降解96％的菲(100mg/L)(图13)。
确定Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6对低浓度菲的生物修复应用能力非常重要(图13)。当菲浓度较低时，SL-6的降解能力显著(6天)。例如，5mg/L的菲可以降解82％。
分析多种多环芳烃的降解情况是必要的，因为多环芳烃通常共存于受菲污染的环境中。Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6与不同的多环芳烃作为唯一碳源培养6天(100mg/L，30℃，pH 8.0，150rpm)。检测降解率以研究Pseudomonas polyaromaticivoransSL-6对多环芳烃的生物降解能力(图14)。Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6对双环芳烃具有很高的降解能力，完全降解了BIP(联苯)和NAP(萘)。对于三环芳烃(ANT和PHE)，Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6降解了大部分PHE(约96.0％)。Pseudomonaspolyaromaticivorans SL-6对三环以上芳烃也表现出一定的降解能力，尤其是对DBA和BaP。可见，Pseudomonas polyaromaticivorans SL-6对稠环芳烃和非稠环芳烃均具有降解能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业科学院研究生院
<120> 假单胞菌新菌种及其应用
<130> GNCLN212974
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> Pseudomonas polyaromaticivorans
<400> 1
attgaactga agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg 60
caagtcgagc ggatgagtgg agcttgctcc atgattcagc ggcggacggg tgagtaatgc 120
ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat accgcatacg 180
tcctacggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga 240
ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga 300
tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 360
atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg 420
gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac 480
gttaccgaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt 540
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat 600
gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcgagcta gagtatggca 660
gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt 720
ggcgaaggcg accacctggg ctaatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 780
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt 840
gagatcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 900
ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960
aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatgcagag aactttccag agatggattg 1020
gtgccttcgg gaactctgac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttaaggtg 1140
ggaactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1200
catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa 1260
gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc 1320
gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag 1440
tctaaccttc ggggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtagccgt aggggaacct gcggctggat cacctcctta at 1542
<210> 2
<211> 2415
<212> DNA
<213> Pseudomonas polyaromaticivorans
<400> 2
atgagtgaga accacacgta cgactcttcg agcatcaagg tactgaaagg tcttgatgcc 60
gtgcgtaagc gccctggcat gtatatcggc gacaccgatg acggcaccgg cctgcaccac 120
atggtcttcg aggtcgtcga taactcgatc gatgaagcgc tggccggcta ctgcagcgat 180
atttccatca ccatccatac cgacgaatcc attaccgtgc gcgacaacgg gcgcggcatt 240
ccggtggata ttcacgaaga aggtgtatcg gcagccgagg tcatcatgac cgtgctgcac 300
gctggcggta agttcgacga caactcctac aaggtatccg gtggtctgca cggcgtgggt 360
gtctcggtgg tgaacgcatt gtccgaggag ctgctgctga ccatccgccg cgaaggcaag 420
gtgtgggaac agctctatcg ccatggcgtc ccgcaagctc cgctcgcggc ggtgggcgaa 480
accgatacgt cgggcacgca gatccatttc aagccctccg ccgagacctt tcagaacatc 540
catttcagct gggacattct ggccaagcgt ctgcgcgagc tgtctttcct caactccggc 600
gtgggtatcg tcctgcgcga cgagcgcacg gccaaggaag aactgttcaa gtacgagggc 660
ggcctcagcg ccttcgtcgc ctacctgaac accaacaaga ccgcggtgaa ccaggtcttc 720
cacttcaacg tccagcgtga cgatggcgtc ggcgtcgaag tcgcgctgca gtggaacgac 780
agcttcaacg agaacatcct ctgctttacc aacaacattc cccagcgtga cggcggtacc 840
cacctggccg gcttccgttc cgcgctgacg cgcaacctga acaactacat cgagcaggaa 900
ggtctggcga agaagcacaa gatctccacc accggtgacg atgcgcgtga aggcctgacc 960
gcaatcatct cggtcaaggt gccggatccg aagttcagct cgcaaaccaa ggacaagctg 1020
gtttcttctg aggtgaagac ggcggtggaa caggaaatgg gcaagtactt cgccgacttc 1080
ctgctggaac atcccaacga agccaaggct gtggttggca agatgatcga cgccgcgcgt 1140
gcccgtgagg cggcgcgcaa ggcgcgggaa atgacccgcc gcaagggtgc gctggatatc 1200
gccggcctgc cgggcaagct tgccgactgt caggagaagg atcctgcgct gtccgaactg 1260
tacatcgtgg agggtgactc cgcgggtggc tcggcgaagc agggccgcaa ccgcaagacc 1320
caggcgatcc tcccgctcaa gggcaagatc ctcaacgtcg agaaggcacg cttcgacaag 1380
atgctctcgt cccaggaagt cggcacgctg atcaccgcgc tgggttgcgg catcggccgc 1440
gaggaataca acatcgacaa gctgcgctac cacaacatca tcatcatgac cgatgctgac 1500
gttgacggtt cgcacatccg caccctgctc ttgaccttct tcttccgcca gttgcccgag 1560
ctgatcgagc gtggctacgt gtatatcgcg cagccgcctc tgtacaaggt caagcgcggc 1620
aagcaggagc agtacatcaa ggacgacgag gcgatggagg agtacctcac tcaatcggcc 1680
ctggaagatg ccagcctgca cgtcaacgat gatgcgccag gcctggccgg cgaagcgctg 1740
gaaaggctgg tcaacgacta ccgtacggta atgaagaccc tgcagcgcct gtcgcggctg 1800
tacccgctgg agctgaccga gcacttcatc tatctgcctc gggttacgct cgagcagctg 1860
gctgaccact ccgcgatgca gtcctggctc gagcagtaca gcgcgcggct caagggtggc 1920
gagcgctcgg ggctggtcta caacctcagc ctgcgcgagg acaaggaacg ccacctgtgg 1980
ctcccggagg tggagatcag ctcccacggc ctggccagct acatcacctt caaccgtgat 2040
ttcttcggca gcaacgatta ccgcacggtg accgcgctgg gcgagaagct caacagtctg 2100
ctggaagaag gtgcctacgt gcagcgtggc gagcgcaaga agccggtcgc cagcttcaag 2160
gaagcgctgg actggctgat gaacgagggt acccgtcgac acagcgttca gcgctacaag 2220
ggtctcggcg agatgaaccc ggaccaactg tgggaaacca ccatggaccc gaacgtgcgg 2280
cgcatgctca aggtgacgat cgaggacgcc atcgcggcgg accagatctt caacacgctg 2340
atgggcgatg cagtggaacc ccgccgggag ttcatcgaaa ccaacgcact ggcggtctcg 2400
aatctggact tctga 2415
<210> 3
<211> 1854
<212> DNA
<213> Pseudomonas polyaromaticivorans
<400> 3
atgtccggaa aagcgcaaca gcagtcccgc ctcaaagagt tgatccagcg tggccgtgag 60
cagggttacc tgacttacgc cgaggtcaac gaccacctgc cggaggatat ttccgatccg 120
gaacaggtgg aagacatcat tcgcatgatc aacgacatgg gcatcaacgt attcgagacc 180
gctccggatg ccgatgccct gttgttggcc gaagccgata ccgatgaagc tgccgccgaa 240
gaggccgccg ctgcactcgc ggcggtcgag accgacatcg gccgcaccac cgacccggtg 300
cgcatgtaca tgcgcgaaat gggcaccgtc gaactgctga cccgcgaagg cgagatcgaa 360
atcgccaaac gcatcgagga aggcattcgc gaagtcatga gcgcgatcgc ccacttcccc 420
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ctgagccaga tccgcgccca ggagcgagcc atcatgcaac tgtgcgtgcg tgatgcccgc 900
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gagcaactgg ctgccggcaa gagcaagtac gccgaggcca tcggcaaccg caaggaagac 1020
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gacatcaagg acatcaaccg tcgcatgtcc attggcgagg ccaaggcccg ccgggcgaag 1140
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cgcggcctgc aattcctcga cctgatccag gaaggcaaca tcggcctgat gaaggcggtg 1260
gacaagttcg aataccgccg cggctacaag ttctcgacct acgcaacctg gtggattcgc 1320
caggcgatca ctcgctccat tgccgaccag gcgcggacca tccgcatccc ggtgcacatg 1380
atcgagacga tcaacaagct caaccgcatc tcccgccaga tgctgcagga aatgggccgc 1440
gagcccacgc ccgaagagct tggcgagcgc atggaaatgc ccgaggacaa gatccgcaag 1500
gtactgaaga tcgccaagga gccgatctcc atggaaacgc cgatcggtga cgacgaagac 1560
tcgcacctgg gcgatttcat cgaggactcg gccatgcagt cgccgatcga cgtcgccaca 1620
gtggaaagcc tcaaggaagc cacccgcgaa gtgctctccg gcctcaccgc ccgtgaagcc 1680
aaggtgctgc gcatgcgctt cggcatcgac atgaacaccg accacaccct cgaggaagtc 1740
ggcaagcagt tcgacgtcac tcgcgagcgg attcgtcaga tagaggccaa ggcgctacgc 1800
aagctgcgcc acccgacgcg aagcgagcac ctgcgctcct tcctcgacga gtaa 1854

Claims (14)

1. 一种假单胞菌（Pseudomonas polyaromaticivorans）SL-6，其特征在于：所述假单胞菌SL-6在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.23460。
2.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的假单胞菌SL-6。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为用于降解芳香族化合物的菌剂。
4.权利要求1所述的假单胞菌SL-6或权利要求2所述的菌剂在降解芳香族化合物中的应用。
5.权利要求1所述的假单胞菌SL-6或权利要求2所述的菌剂在制备用于降解芳香族化合物的产品中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述芳香族化合物为多环芳烃。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述多环芳烃为稠环芳烃和/或非稠环芳烃。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述多环芳烃选自如下中的全部或部分：菲、联苯、萘、芴、苊、苯并[a]芘、芘、二苯并[a, h]蒽、蒽、4-硝基苯酚、苯并[k]荧蒽（BkF）、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽。
9.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述降解芳香族化合物为降解低浓度的芳香族化合物；所述低浓度为5 mg/L以下。
10.一种降解芳香族化合物的方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述假单胞菌SL-6或权利要求2所述菌剂处理含有芳香族化合物的污染物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述芳香族化合物为多环芳烃。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述多环芳烃为稠环芳烃和/或非稠环芳烃。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述多环芳烃选自如下中的全部或部分：菲、联苯、萘、芴、苊、苯并[a]芘、芘、二苯并[a, h]蒽、蒽、4-硝基苯酚、苯并[k]荧蒽（BkF）、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述降解芳香族化合物为降解低浓度的芳香族化合物；所述低浓度为5 mg/L以下。
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