CN108504591A - 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用 - Google Patents

一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108504591A
CN108504591A CN201810247227.4A CN201810247227A CN108504591A CN 108504591 A CN108504591 A CN 108504591A CN 201810247227 A CN201810247227 A CN 201810247227A CN 108504591 A CN108504591 A CN 108504591A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aromatic hydrocarbon
polycyclic aromatic
freeze
degradation
mortierella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810247227.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108504591B (zh
Inventor
苏丹
巩春娟
普聿
王天杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dezhou Microp Bio Technology Co ltd
Original Assignee
Liaoning University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning University filed Critical Liaoning University
Priority to CN201810247227.4A priority Critical patent/CN108504591B/zh
Publication of CN108504591A publication Critical patent/CN108504591A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108504591B publication Critical patent/CN108504591B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/20—Organic substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Management (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用。低温条件下，假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7协同降解冻融土壤中的多环芳烃，本发明对冻融土壤中的Pyr和BaP的去除率分别为37.15％和27.41％，为寒冷地区冻融土壤中多环芳烃的降解提供了一种有效的方法。

Description

一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，特别涉及一种低温条件下采用复合菌剂对冻融土壤中多环芳烃污染物的降解方法。
本发明中所称假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4，已于2017年4月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.14048。
本发明中所称高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，已于2018年1月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15183。
背景技术
多环芳烃是(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)一类由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物，常见的18种PAHs中已被美国环保局(USEPA)列入优控污染物的有16种。PAHs具有长期残留性，容易出现生物富集、生物放大现象，在环境中难降解；具有“二半”特点，即较长半衰期，半挥发性；“三高”，即高稳定性、高蓄积性、高毒性。由于该类化合物辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤成为PAHs的主要载体，通过土壤-植物系统迁移，PAHs经食物链进入人体，进而影响到人类健康。由于苯环数越高，脂溶性越大，水溶性越低，生物可降解性越低，所以能降解高分子量PAHs的微生物较少。
微生物降解是环境中PAHs去除最主要的途径，具有环境友好的特点。目前国内外主要集中在常温微生物降解PAHs的研究，然而我国华北、东北和西北地区是冬季气候寒冷漫长，冰冻期长达3～6个月的寒冷地区，结冻会导致大部分微生物休眠，微生物活性会受到抑制，致使微生物对PAHs的降解能力下降，常温微生物很难清除冻融土壤中的PAHs。因此，研究低温微生物对PAHs的降解具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用细菌和真菌联合的方法来降解冻融土壤中的多环芳烃，以提高降解PAHs的效率。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，由假单胞菌和被孢霉混合制成。
优选的，上述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，所述的假单胞菌为保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4；所述的被孢霉为保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7。
优选的，上述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，假单胞菌和被孢霉按体积比1:1混合。
一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，利用上述的复合菌剂，包括如下步骤：
1)将假单胞菌和被孢霉分别置于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至假单胞菌细菌密度为5～6×108CFU·mL－1，被孢霉孢子悬浊液中孢子密度为5～6×108CFU·mL－1；
2)将假单胞菌和被孢霉接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，得复合菌剂；假单胞菌和被孢霉按体积比1:1混合；
3)于含有多环芳烃污染物的冻融土壤中，加入复合菌剂，补加或不补加水，使土壤含水量为20～30％。
优选的，上述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，所述的多环芳烃是由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物。
优选的，上述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，所述的多环芳烃是芘(Pyr)和苯并[a]芘(Bap)。
优选的，上述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，所述的完全培养基是：肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH为7.1～7.2，121℃，灭菌20min。
(一)本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4的筛选方法如下：
从沈抚灌渠采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于-20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓度法进行驯化，于15℃，120r·min－1摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始浓度为10、10与5mg·L－1，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L－1，第3次转接浓度增加至30、30与15mg·L－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10－2、10－3、10－4、10－5和10－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出4株细菌，记为SDR2-SDR5，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×108CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果SDR4效果显著。
菌株SDR4，在牛肉膏蛋白胨平板上呈淡黄色，不透明，呈革兰氏阴性，短杆状，边缘整齐，不形成芽孢，好氧。
菌株SDR4基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA 5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图1可见，SDR4菌与假单胞菌属的16S rDNA序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株SDR4归属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
无机盐液体培养基包括：K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 5g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，pH 7.0～7.2，蒸馏水1L定容，121℃灭菌25min，营养培养基(CM培养基)：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，pH 7.0～7.2，以蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌25min，固体培养基另加琼脂粉20g/L。
(二)本发明提供的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7的筛选
从鸡西污染地采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于-20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓度法进行驯化，于15℃，120r·min－1摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始浓度为10、10与5mg·L－1，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L－1，第3次转接浓度增加至30、30与15mg·L－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10－2、10－3、10－4、10－5和10－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出真菌3株，记为JDR6-JDR8，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×108CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果JDR7效果显著。
菌株JDR7，在牛肉膏蛋白胨平板上呈白色，生长初期成花瓣状，后期菌丝发达.生长繁密，在扫描电镜下观察呈管状，是一种具有良好的食品安全评估记录的工业产油好氧真菌。
菌株JDR7基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA 5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图2可见，JDR7菌与被孢霉的ITS序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株JDR7归属于被孢霉。
本发明的有益效果是：本发明克服了寒冷地区常温单一菌种降解PAHs的不完全性，本发明的复合菌剂能够提高多环芳烃的降解效率。
附图说明
假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2017年4月19日，保藏编号为CGMCC NO.14048。
高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2018年1月5日，保藏编号为CGMCC NO.15183。
图1是基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法构建SDR4的系统进化树。
图2是基于ITS序列和Neighbor-Joining法构建JDR7的系统进化树。
图3是三种降解方法降解芘(Pyr)的比较图。
图4是三种降解方法降解苯并[a]芘(Bap)的比较图。
具体实施方式
实施例一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法
(一)假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4的培养
完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
取保存于斜面培养基上的、保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonassp.)SDR4，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至细菌密度为6×108CFU·mL－1，得假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4细菌菌悬液。
(二)高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7的培养
完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
取保存于斜面培养基上的、保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至孢子悬浊液中孢子密度6×108CFU·mL－1，得高山被孢霉(Mortierellaalpine)JDR7真菌菌悬液。
(三)复合菌剂
完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
按体积比1:1，取假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4细菌菌悬液和高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7真菌菌悬液，分别按10％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，得复合菌剂。
(四)降解
降解实验用土壤：采自中国科学院沈阳生态试验站0～20cm表层清洁土，土壤为草甸棕壤，其基本理化性状：pH为6.72，有机碳为17.8g/kg，全氮为1.1g/kg，全磷为0.35g/kg，交换量(CEC)为45.04mg/kg。土壤过2mm筛后，分装培养瓶中，每瓶5g，121℃高温灭菌60min，冷却后每瓶定量加入Pyr和Bap的丙酮溶液，混合均匀，使Pyr和Bap的初始浓度分别为120mg/L和60mg/L，放置过夜，得含有Pyr和Bap污染物的土壤样品。
对比例1：按10％接种量，将被孢霉(Mortierella sp.)JDR7真菌菌悬液加入到上述含有Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45和60d取样。
对比例2：按10％接种量，将假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4细菌菌悬液加入到上述含有Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45和60d取样。
本发明：按10％接种量，将步骤(三)制备的复合菌剂加入到上述含有Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45和60d取样。
(五)结果
土壤中Pyr和Bap的含量采用超声提取，HPLC法测定。
称取5g处理后土样过筛60目，倒入50ml离心管中，用移液枪加15ml二氯甲烷，超声2次，每次超声2h，超声时保持超声仪内水温在30℃以下。将超声后的离心管放入离心机，以4000r/min的转速离心10min，离心完成后将上清液倒入相应编号的鸡心瓶中进行旋转蒸发。吸取2ml正己烷溶解样品，将其转移到净化柱(1g中性A12O3+1g硅胶+1g无水硫酸钠)中净化，用20mL正己烷、二氯甲烷(体积比为1:1)淋洗，收集滤出液，浓缩至约1mL，用柔和氮气吹干，1mL乙腈定容用液相色谱测定PAHs。
污染土壤的待检测样品均使用荧光及紫外检测器进行检测，色谱条件：色谱柱为多环芳烃分析专用柱ZORBAX EclipsePAH(4.6m*250mm*5um)；柱温25℃；流动相为色谱纯乙腈和水，乙腈:水＝60％:40％，流速1.000mL/min；进样量为10μL，各种PAHs以色谱峰保留时间定性，外标法定量，方法回收率79.56％～92.48％。
测定结果如图3和图4所示，本实施例说明耐低温菌可用于北方寒冷地区降解冻融土壤中的PAHs，其中混合菌SDR4+JDR7对高环PAHs降解效果好。由图3和图4可看出，各处理组在整个过程对Pyr的去除率增加趋势较明显。0～30d，随修复时间的增加，菌的生长迅速加快，微生物的浓度增大，各菌株组对Pyr的降解率也随之增加，60d后SDR4、JDR7和SDR4+JDR7可分别降解31.17％、38.11％与37.15％的Pyr。而对于高环的BaP，其脂溶性大，水溶性较低，生物可降解性较低。各菌株的降解率都不高，但30～45d，两种菌起到协同作用，SDR4+JDR7对BaP去除率快速增加。60d后混合菌SDR4+JDR7可降解27.41％的BaP，降解率较细菌SDR4和真菌JDR7提高了4.10％和9.15％。

Claims (8)

1.一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，其特征在于，由假单胞菌和被孢霉混合制成。
2.按照权利要求1所述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，其特征在于，所述的假单胞菌为保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4；所述的被孢霉为保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7。
3.按照权利要求1或2所述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂，其特征在于，假单胞菌和被孢霉按体积比1:1混合。
4.权利要求1或2所述的复合菌剂在降解冻融土壤中多环芳烃污染物中的应用。
5.一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的复合菌剂，包括如下步骤：
1)将假单胞菌和被孢霉分别置于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至假单胞菌细菌密度为5～6×108CFU·mL－1，被孢霉孢子悬浊液中孢子密度为5～6×108CFU·mL－1；
2)将假单胞菌和被孢霉接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，得复合菌剂；按体积比，假单胞菌:被孢霉＝1:1；
3)于含有多环芳烃污染物的冻融土壤中，加入复合菌剂，补加或不补加水，使土壤含水量为20～30％。
6.按照权利要求5所述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述的多环芳烃是由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物。
7.按照权利要求6所述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述的多环芳烃是芘和苯并[a]芘。
8.按照权利要求5所述的一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述的完全培养基是：肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH为7.1～7.2，121℃，灭菌20min。
CN201810247227.4A 2018-03-23 2018-03-23 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用 Active CN108504591B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810247227.4A CN108504591B (zh) 2018-03-23 2018-03-23 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810247227.4A CN108504591B (zh) 2018-03-23 2018-03-23 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108504591A true CN108504591A (zh) 2018-09-07
CN108504591B CN108504591B (zh) 2021-06-25

Family

ID=63378245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810247227.4A Active CN108504591B (zh) 2018-03-23 2018-03-23 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108504591B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467841A (zh) * 2018-03-23 2018-08-31 辽宁大学 蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒及其制备方法和应用
CN110241065A (zh) * 2019-05-18 2019-09-17 南京农业大学 一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法
CN111117993A (zh) * 2020-01-15 2020-05-08 辽宁大学 用于降解土壤中PAHs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒及其制备方法与应用
CN113980856A (zh) * 2021-11-17 2022-01-28 中国农业科学院研究生院 假单胞菌新菌种及其应用
CN114214312A (zh) * 2022-01-05 2022-03-22 辽宁大学 一种生物炭加载耐低温高效降解pahs混合菌颗粒及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006007174A (ja) * 2004-06-29 2006-01-12 Green Tec:Kk 塩素含有芳香族有機化合物汚染物の浄化方法及び浄化資材
JP2009197120A (ja) * 2008-02-21 2009-09-03 Nittetsu Kankyo Engineering Kk 微生物の成長促進剤及びそれを用いる土壌浄化方法
CN101724582A (zh) * 2008-10-29 2010-06-09 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法
CN105176888A (zh) * 2015-10-22 2015-12-23 中国石油大学(华东) 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用
KR20160150391A (ko) * 2015-06-22 2016-12-30 (주)신대양 유류 분해능을 가지는 신규 슈도모나스 속 sdy3 균주 및 이를 이용한 유류 분해 방법
CN107497850A (zh) * 2017-09-05 2017-12-22 杭州更蓝生物科技有限公司 一种用于修复污染土壤的复配生物制剂

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006007174A (ja) * 2004-06-29 2006-01-12 Green Tec:Kk 塩素含有芳香族有機化合物汚染物の浄化方法及び浄化資材
JP2009197120A (ja) * 2008-02-21 2009-09-03 Nittetsu Kankyo Engineering Kk 微生物の成長促進剤及びそれを用いる土壌浄化方法
CN101724582A (zh) * 2008-10-29 2010-06-09 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法
KR20160150391A (ko) * 2015-06-22 2016-12-30 (주)신대양 유류 분해능을 가지는 신규 슈도모나스 속 sdy3 균주 및 이를 이용한 유류 분해 방법
CN105176888A (zh) * 2015-10-22 2015-12-23 中国石油大学(华东) 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用
CN107497850A (zh) * 2017-09-05 2017-12-22 杭州更蓝生物科技有限公司 一种用于修复污染土壤的复配生物制剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STINEN . SCHMIDT ET AL.: "Fungal PAH-Metabolites Resist Mineralization by Soil Microorganisms", 《ENVIRON. SCI. TECHNOL.》 *
苏丹等: "混合菌固定化及其对土壤中芘和苯并芘的降解", 《辽宁工程技术大学学报》 *
苏丹等: "耐冷腐殖酸吸附态 PAHs 降解菌筛选及其降解特性", 《环境科学学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108467841A (zh) * 2018-03-23 2018-08-31 辽宁大学 蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒及其制备方法和应用
CN110241065A (zh) * 2019-05-18 2019-09-17 南京农业大学 一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法
CN110241065B (zh) * 2019-05-18 2020-07-21 南京农业大学 一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法
CN111117993A (zh) * 2020-01-15 2020-05-08 辽宁大学 用于降解土壤中PAHs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒及其制备方法与应用
CN111117993B (zh) * 2020-01-15 2023-04-07 辽宁大学 用于降解土壤中PAHs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒及其制备方法与应用
CN113980856A (zh) * 2021-11-17 2022-01-28 中国农业科学院研究生院 假单胞菌新菌种及其应用
CN113980856B (zh) * 2021-11-17 2023-08-29 中国农业科学院研究生院 假单胞菌新菌种及其应用
CN114214312A (zh) * 2022-01-05 2022-03-22 辽宁大学 一种生物炭加载耐低温高效降解pahs混合菌颗粒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108504591B (zh) 2021-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108504591A (zh) 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用
CN106754582B (zh) 恶臭假单胞菌rxx-01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用
CN106834269A (zh) 一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用
CN105820982B (zh) 一种赤红球菌xs-2、其生物菌剂及制备方法和应用
CN106635933A (zh) 一种降解土壤中抗生素的混合菌剂及其制备方法
CN108220277A (zh) 单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂及其制备方法和应用
CN106497810B (zh) 一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解柴油的方法
CN104805036B (zh) 微杆菌（Microbacterium sp．）J-1在降解多种邻苯二甲酸酯中的应用
CN108048351A (zh) 一株酰基高丝氨酸内酯降解菌及其在病害防治中的应用
CN107058156A (zh) 四环素类抗生素降解菌株、含有该菌株的菌剂及其应用
CN108410771A (zh) 红球菌yc915及其吸附菌剂在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用
CN108048366A (zh) 一株海洋放线菌及其应用
CN105316269B (zh) 一株耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌及其在降解石油中的应用
CN106754572A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其用途
CN102796671A (zh) 一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用
CN106434413B (zh) 一种植生拉乌尔菌以及利用该菌降解土壤中芘的方法
CN108467841A (zh) 蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒及其制备方法和应用
CN106906158A (zh) 一株含油污泥降解功能菌及其应用
CN110184225A (zh) 一株具有PAHs降解能力的根际促生细菌PHE-2及其应用
CN104745654B (zh) 一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株
US5739019A (en) Method of isolating and propagating microorganisms and viruses
CN109554308A (zh) 一种Rhizobium pusense F3-1及其应用
CN105462838A (zh) 一种筛选用于促进植物吸收重金属的根系共生菌的方法
CN108739860A (zh) 一种微生物群体感应信号淬灭菌及其作为生防菌的应用
CN105925265B (zh) 苜蓿和菌剂构成的降解多环芳烃的成套产品及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220527

Address after: 215128 no.1721, building 5, Caizhi business square, Changqiao street, Wuzhong District, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Suzhou Fangyun science and Technology Service Co.,Ltd.

Address before: 110000 58 Shenbei New Area Road South, Shenyang, Liaoning.

Patentee before: LIAONING University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220621

Address after: 251299 Room 301, floor 3, zone B, ideal space incubator innovation and entrepreneurship building, North Head of Yingbin Road, Shizhong sub district office, Yucheng City, De Zhou City, Shandong Province

Patentee after: DEZHOU MICROP BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 215128 no.1721, building 5, Caizhi business square, Changqiao street, Wuzhong District, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: Suzhou Fangyun science and Technology Service Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right