IT8319462A1 - Procedimento per la produzione di un tossoide difterico con rese elevate - Google Patents
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Description
"PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DI UN TOSSOIDE DIFTERICO CON RESE ELEVATE"
R i a s s u n t o
Procedimento per la produzione di un tossoide difterico naturale (CRM) 197 con rese nell'ambito di 60 Lf/ml mediante crescita di un ceppo batterico appartenente al genere Corynebacterium diphtheriae contenente due fagi P 197 integrati nel proprio cromosoma in modo non tandem. Descr izion e
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione di un tossoide difterico (CRM 197) con rese elevate, mediante crescita di un ceppo batterico C7 (^>-197) MI appartenente al genere Corynebacterium diphtheriae contenente due fagi 197 integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma.
Attualmente il tossoide difterico viene ottenuto dalla tossina difterica mediante detossificazione con formolo. Detta tossina ? una proteina estremamente tossica nei confronti delle cellule eucariotiche costituita da 2 subunit?: frammento B, capace di legarsi ai recettori presenti sulla membrana delle cellule eucariotiche e frammento A, tossico, che blocca la sintesi delle proteine una volta 2. entrato nella cellula. Questa proteina ? codificata da un
gene presente nel DNA di alcuni batteriofagi strettamente correlati { ^ , w) capaci di infettare il batterio Corynebacterium diphtheriae (4, 5, 3).
I suddetti fagi possono lisare la cellula infettata e
quindi ucciderla, oppure possono integrarsi nel suo cromosoma e rimanere quiescienti, replicandosi tutte le
volte che si replica il batterio, cosi che ogni cellula
figlia conterr? nel proprio cromosoma una copia del fago integrato, e fornire in tale modo al batterio il gene codificante per la tossina difterica.
Attualmente, questa tossina viene prodotta industrialmente, coltivando il ceppo PW8 appartenente al genere
C. diphtheriae, ed il vaccino antidifterico viene preparato dopo detossificazione con formolo di detta proteina.
Questo procedimento presenta l'inconveniente di dar luogo
ad un prodotto finale solo parzialmente purificato, contenente proteine denaturate e crosslincate ad inquinanti presenti in soluzione.
Alcuni anni f?, Uchida ed al. (14, 15) isolarono mutanti
del fago , ottenuti mediante trattamento con nitrosoguanidina, che una volta integrati nel cromosoma batterico
di C. diphtheriae, codificavano la sintesi di una proteina immunologicamente indistinguibile dalla tossina difterica attualmente prodotta e che presentava il vantaggio di non essere tossica.
Tra i vari mutanti isolati, quello maggiormente studiato, fu il fago in quanto dirigeva la sintesi di una proteina (cross reacting material 197, abbreviata CRM 197) che aveva lo stesso peso molecolare della tossina difterica, competeva con la stessa per i recettori sulle cellule HeLa ma straordinariamente era atossica, poich? nel frammento A, tossico, era sostituito un amminoacido. Si pens? quindi che il CRM 197, immunologicamente indistinguibile dalla tossina attualmente prodotta, potesse rappresentare una alternativa all?attuale tossoide difterico utilizzato per la produzione del vaccino antidifterico.
Infatti, era sufficiente un blando trattamento con formolo del CRM 197, per ottenere buoni livelli protettivi di anticorpi difterici nelle cavie (11).
Fino ad ora, lo sviluppo di prodotti derivati dal CRM 197 ? stato ostacolato dal fatto che la sintesi di detta proteina in coltura veniva ottenuta con rese molto basse (7-10 Lf/ml contro le 150-200 Lf/ml ottenute nel procedimento usuale). E<1 >stato trovato ora un procedimento per la produzione di un tossoide difterico CRM 197 con resa elevata mediante crescita in condizioni aerobiche e ad una temperatura da 27? a 37? e per un tempo variabile da 10 a 45 ore di un ceppo batterico C7 (^s-197) MI appartenente al genere Corynebacterium diphtheriae contenente due fagi mutati 197 codificanti per il tossoide difterico integrati in modo non tandem in entrambi i siti di attaccamento att. B1 e att. B2.
Questo ceppo, contenendo due fagi ? 197 integrati, possiede anche due geni codificanti per il CRM 197, per cui sar? in grado di sintetizzare una quantit? doppia di questa proteina.
11 ceppo C7 (^ 197) MI ? stato depositato presso ATCC e contrassegnato con il numero 39255
Processo di lisogenizzazione nel C. diphtheriae.
In figura 1A ? riportato lo schema del processo di lisogenizzazione di un fago secondo il modello di Campbell (2). Il DNA circolare del fago si apre in un punto specifico, att P, e si integra in un altro punto specifico del cromosoma batterico: att. B.
Il DNA del batterio lisogeno viene cos? a contenere la permutazione lineare del DNA fagico interrotto al sito att. P. In figura 1B viene riportato lo stesso modello adattato per i due siti di attaccamento presenti nel cromosoma del Corynebacterium diphtheriae. Il processo ? essenzialmente lo stesso, solo che il fago ha a disposizione due siti att B (att B1 e att B2), dove pu? integrarsi, producendo alla fine monolisogeni C7 (p 197) M5 (se il fago ? presente una sola volta in att B1 o in 5. att B2), lisogeni doppi non tandem C7 ( (?197) MI quando
due copie sono presenti contemporaneamente una in att B1 e l'altra in att B2, oppure doppi lisogeni tandem C7
( p 197) M8 quando due copie sono presenti contemporaneamente in un solo sito att B.
Isolamento del fago 197
Il lisogeno C7 ( 197) ottenuto da Pappenheimer, (Biological Labs. Cambridge, Mass.) veniva fatto crescere in terreno liquido CY a 35?C fino a densit? ottica di 0,3
O.D. e 5 mi di detta coltura venivano trasferiti in una capsula di Petri, successivamente esposta a raggi UV per 1
min. I batteri cos? trattati, venivano lasciati crescere ancora per 2 h in beute contenenti terreno CY e Tween 20 (soluzione allo 0,2%) (1) e quindi la soluzione veniva centrifugata.
Il supernatante conteneva circa 10 ? 10 fagi O 197/ml.
Isolamento di nuovi lisogeni
I fagi 197 cos? ottenuti, venivano usati per infettare
il ceppo C7- (ottenuto da Pappenheimer, Biological Labs., Cambridge, Mass) mediante piastramento su terreno CY. Dopo
48 h di crescita avvenuta a 35?C, le placche di lisi del
fago contenevano all'interno una zona opaca dovuta alla crescita di quei batteri nei quali il fago si ? integrato
nel cromosoma batterico (lisogeni).
Questi ceppi venivano prelevati sterilmente e piastrati su terreno CY agarizzato in modo da poter isolare le colonie singole. Queste venivano successivamente analizzate per evidenziare la presenza di fagi lisogeni, tramite il "phage release assay" (8).
Screening per i doppi lisogeni C7
Poich? il fago contiene il gene codificante per il CRM 197, quei lisogeni che contengono due copie del fago contengono anche due copie del gene e quindi sono capaci di sintetizzare una quantit? doppia di CRM 197.
Il metodo di screening per i doppi lisogeni ? stato basato quindi sulla produzizone di CRM 197.
Sono state preparate delle piastre TYE contenenti ciascuna 3, 4, 6, 8, 12 U/ml di siero antitossina difterica (ottenuto dal Reparto Controlli dell'ISVT Sciavo, Siena) ed ogni lisogeno ? stato saggiato per ogni singola concentrazione di siero mediante trasferimento su piastre contenenti le suddette concentrazioni.
Il CRM 197 prodotto dai vari lisogeni diffondendo nell'agar, veniva precipitato dall<1>anticorpo presente nel terreno, formando un alone le cui dimensioni erano direttamente proporzionali alla quantit? di CRM prodotto dalle colonie stesse.
Nelle piastre contenenti basse concentrazioni di anticorpo (3 U/ml), tutti i lisogeni formavano un alone, in quelle a concentrazione intermedia (4-6 U/ml), si osservano aloni di dimensioni diverse e pi? esattamente molto piccoli per i monolisogeni, pi? grandi per i doppi lisogeni, nelle piastre ad alta concentrazione di anticorpo (8-12 U/ml) solo i doppi lisogeni presentavano un alone di precipitazione. Con questo metodo ? stato possibile identificare facilmente e visivamente i doppi lisogeni.
In figura 2 ? riportata la foto di una piastra TYE contenente 6 U/ml di antisiero nella quale si possono distinguere i monolisogeni (alone piccolo), i doppi lisogeni tandem (A) e il doppio lisogeno non tandem (B). Dimostrazione che i batteri con alone pi? grande contengono due fagi integrati?nel proprio cromosoma L'organizzazione molecolare dei fagi ? stata messa in evidenza mediante purificazione del DNA cromosomiale (7) dai vari lisogeni.
Dopo digestione con l'enzima di restrizione Barn HI, i frammenti di DNA venivano separati su gel di agarosio (1,3%) e dopo trasferimento su fogli di nitrocellulosa venivano analizzati con la tecnica della ibridizzazione molecolare (Southern Blotting) (13).
Dalla fig. 1B si pu? osservare che, se abbiamo un enzima di restrizione che tagli il DNA fagico nei punti A e B, e lo usiamo per tagliare il DNA fagico otteniamo un frammento AB. Ma, se usiamo lo stesso enzima per tagliare il DNA del monolisogeno, otteniamo due frammenti: A e B contenenti entrambi un pezzo di cromosoma batterico. Il doppio lisogeno non tandem dar? invece quattro frammenti, mentre il doppio lisogeno tandem 3, di questi uno ? l'originale frammento AB.
In figura 3 ? riportato il risultato ottenuto con la tecnica del Southern Blotting usando come sonda il frammento la Barn 4 che contiene il sito att P (7) marcato con
Come si pu? osservare, il DNA del fago 197 d? una sola banda (A), quello del monolisogeno due bande (B), quello del doppio lisogeno non tandem quattro bande (C), mentre il doppio lisogeno tandem ne da tre delle quali una comigra con quella del fago ^ 197 (D).
Il numero e la posizione delle bande osservate, corrisponde esattamente a quanto ci si aspettava dalla analisi della fig. 1B e possiamo concludere quindi che questo metodo costituisce un ottimo mezzo per determinare in modo univoco l'organizzazione molecolare dei fagi.
Stabilit? dei doppi lisogeni
Per vedere se i doppi lisogeni restavano tali oppure tendevano a perdere i fagi durante le varie generazioni, colonie singole provenienti da colture molto vecchie di doppi lisogeni (5 giorni) venivano piastrate su agar CY e successivamente analizzate con il metodo dell'alone per evidenziare la presenza di 1 o 2 fagi .
Da questa analisi ? risultato che: i doppi lisogeni non tandem erano estremamente stabili (su 350 colonie esaminate non ? stato trovato nessun monolisogeno), mentre i doppi lisogeni tandem perdevano facilmente un fago divenendo cos? monolisogeni (su 200 colonie esaminate circa 160 erano diventate monolisogeni).
Produzione di CRM 197
I vari ceppi lisogeni contenenti il fago o fagi 197 nei diversi siti, venivano fatti crescere per una notte in terreno liquido di CY a 35?C e al mattino, 0,1 mi di brodocoltura venivano inoculati in beute da 125 mi contenenti 10 mi di terreno CY deferrato al quale erano stati aggiunti 0,1 ^*,g/ml di Fe<++>. ;Le beute, cos? inoculate, venivano incubate su agitatore rotante a 250 rpm e ad una temperatura di 35?C e, ad intervalli, si prelevavano dei campioni sui quali veniva determinata la densit? ottica e il CRM 197 rilasciato nel supernatante, tramite rochet immunoelettroforesi (9) e/o flocculazione (12). ;I risultati ottenuti con i diversi lisogeni, monolisogeni, doppi lisogeni tandem e doppi lisogeni non tandem, sono riportati in fig. 4. ;Come possiamo osservare da questa fig. 4, la produzione di CRM 197 non comincia prima che la densit? ottica della coltura abbia raggiunto valori di 4,5-5 D.O (densit? ottiche), corrispondenti alla fine della fase logaritmica. Con l'inizio della parte terminale di questa fase, ccmiii?ia ia pruuuz.j.une massiccia di CRM 197 che continua fino all'inizio della fase stazionaria (circa 20 ore), quando si riscontra la massima densit? ottica e la massima quantit? di CRM 197. ;Entrando la coltura nella parte finale della fase stazionaria (oltre 24 ore) si comincia ad osservare una lisi cellulare con rilascio di enzimi proteolitici che digeriscono rapidamente il CRM 197, la cui quantit? diminuisce del 25% a 30 ore e del 57% dopo 45 ore. ;L'andamento della curva di produzione del CRM 197 per i diversi lisogeni ? essenzialmente la stessa anche se, la quantit? di CRM 197 prodotto ? differente. ;Come possiamo osservare, dopo 24 ore, la coltura del monolisogeno contiene circa 20 Lf/ml di CRM 197, quella del doppio lisogeno tandem circa 30 Lf/ml, mentre quella del doppio lisogeno non tandem circa 60 Lf/ml. ;Da quanto sopra esposto notiamo che non vi ? molta differenza di produzione del CRM 197 fra monolisogeni e doppi lisogeni tandem e ci? si pu? giustificare perch? questi ultimi, come abbiamo osservato in precedenza, tendono a perdere un fago con l'andare del tempo e quindi il loro numero diminuisce mentre aumenta quello dei monolisogeni, per cui la quantit? di CRM 197 prodotto risulta essere una funzione del rapporto doppi lisogeni/-monolisogeni. ;Il ceppo C7 ({? 197) MI (doppio lisogeno non tandem) produce circa 60 Lf/ml di CRM 197, che ? circa 3 volte quello prodotto dal monolisogeno. Ci? non ? in perfetto accordo con quanto ci si attendeva, infatti il C7 ( p 197) MI contenendo 2 197 avrebbe dovuto produrre il doppio di CRM 197 e non il triplo. ;Poich? il CRM 197, a differenza della tossina difterica, ? sensibile agli enzimi proteolitici (16), possiamo concludere che la quantit? di CRM 197 trovata nel supernatante non ? quella effettivamente prodotta, ma quella prodotta meno quella degradata ed essendo quest<1>ultima costante, se radoppiamo la quantit? prodotta si pu? facilmente triplicare la resa effettiva di CRM 197. ;Terreni usati nel procedimento: ;Piastre TYE per la produzione dell?alone di precipitazione Il seguente terreno ? stato modificato dalla formula originale di Pappenheimer (10,6). Tryptose: 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 5 g, KH^PO^ 5 g, acqua a 1 litro. Portare a pH 7.4, aggiungere 2 mi di CaCl 50%, autoclavare. ;Lasciare sedimentare il precipitato o centrifugare. ;Aggiungere 2 ml/litro di soluzione II e 1 ml/litro di soluzione III. Aggiungere 12 ml/litro di agar noble. Aggiungere siero di cavallo antidifterico: 4, 6, 8 o 12 U/ml a seconda dell'alone desiderato, distribuire in piastre. ;Terreni CY per la produzione di CRM 197 (10) ;Yeast extract 20 g, casamino acids 10 g, 1% triptofano; 5 mi, KH^PO^ 5 g, 50% CaCl^ 2 mi. Portare a pH 7.4, bollire e filtrare su filtri Whatman ancora bollente. ;Aggiungere 2 mi di soluzione II, 1 mi di soluzione III, autoclavare. ;Prima dell'uso aggiungere 3 mi di soluzione maltosio? CaCl per 100 mi di terreno. ;2 ;- Soluzione II: ;MgSO^,7H^O 22,5 g; alanina 115 mg; Acido nicotinico 115 mg. (Aggiungere 1 mi di H^O, quindi HC1 conc. Quando disciolto, aggiungere agli altri componenti della soluzione). Acido pimelico 7,5 mg; 1% CuSO^.SH^O 5 mi; 1% ZnSU ,5n w <4 mi; 1% MnCl .4H 01,5 mi; HC1 conc. 3 mi. ;*4 4L 2 2
Acqua fino a 100 mi.
- Soluzione III:
L-cistina 20 g; HC1 conc. 20 mi. Acqua fino a 100 mi. - -Soluzione Maltosio CaCl2:
Maltosio 50 g; 50% CaCl22 mi; KH^O^ 1 g. Portare a 100 mi. Portare a pH 7,4. Filtrare su carta Whatman 40. Autoclave.
Descrizione delle figure
Fig. 1A : Processo di lisogenizzazione secondo il modello di Campbell: il DNA circolare del fago si apre in un punto specifico detto sito di attaccamento fagico (att P) e si integra in un punto altrettanto specifico del cromosoma batterico detto sito di attaccamento batterico (att B). In tutti i sistemi conosciuti att P ed att B sono unici, eccetto il Corynebacterium diphtheriae dove abbiamo dimostrato la presenza di due siti att B.
Fig. 1B : Modello di Campbell adattato per i due siti di attaccamento del Corynebacterium diphtheriae: il processo di integrazione ? lo stesso, ma il fago ha a disposizione due siti att B (att Bl e att B2) per cui pu? integrarsi: solo in att Bl o solo in att B2 e dare monolisogeni, in att Bl e in att B2 contemporaneamente e dare doppi lisogeni non tandem, oppure in tandem in att Bl o in att B2 e dare quindi doppi lisogeni tandem.
Fig. 2 : Piastra TYE contenente 6 U/ml di siero antidifterico. Si possono distinguere 3 tipi di aloni di precipitazione che circondano le colonie: alone molto piccolo {monolisogeni), alone intermedio (A) dovuto ai doppi lisogeni tandem e alone grande (B) dovuto al ceppo C7 (^ 197) MI, doppio lisogeno non tandem.
Fig, 3 : Analisi tramite Southern blot del DNA dei vari lisogeni. Il DNA ? stato digerito con Barn HI, i frammenti separati su gel di agarosio 1,3% e quindi trasferiti su nitrocellulosa dove sono stati ibridizzati con il frammento Barn 4 contenente il sito att P, marcato con P II frammento 4 corrisponde al frammento AB della figura 1B per cui si vede che: esiste un unico frammento AB nel DNA fagico (A). Il frammento AB viene diviso in due frammenti nel monolisogeno (B), in quattro frammenti nel doppio lisogeno non tandem (C) ed in 3 frammenti di cui uno ? l'originale AB nel doppio lisogeno tandem (D).
Fig. 4 : Produzione di CRM 197 da parte del ceppo monolisogeno C7 (^ 197) M5:0 5 del ceppo doppio lisogeno tandem C7 (|?> 197) M8:^ ; del ceppo doppio lisogeno non tandem C7 ( 197) .MI:Q . Con i quadratini scuri ? indicata la densit? ottica della coltura:
BIBLIOGRAFIA CITATA
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Claims (6)
1) Procedimento per la produzione di un tossoide difterico mediante crescita in condizioni aerobiche di un ceppo batterico C7 (^>-197) MI, appartenente al genere Corynebacterium diphtheriae e ottenuto per infezione di un ceppo C7 con fagi mutati ^5197 ed isolato su un terreno di coltura modificato e contenente due fagi mutati ^ 197 codificanti per il tossoide difterico integrati in modo non tandem nei siti attivi att. B1 e att. B2.
2) Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il ceppo batterico C7 (^197) MI ? ottenuto per infezione del ceppo C7, con fagi mutati ^-197 mediante pi'astramento su un terreno di coltura CY e ad una temperatura da 28 a 37?C e per un tempo da 24 a 72 ore.
3) Procedimento secondo le rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il ceppo C7 (^197) MI ? isolato su un terreno di coltura TYE modificato mediante aggiunta di siero antidifterico.
4) Procedimento secondo la rivendicazione precedenti caratterizzato dal fatto che il ceppo batterico C7 (^5-197) MI viene fatto crescere in un terreno di coltura CY deferrato ed integrato con ioni Fe++ in concentrazione da 0,05 a 0,2JUg./ml e ad una temperatura da 28? a 37?C e per un tempo da 10 a 45 ore.
5) Procedimento secondo le rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il ceppo C7 (^?l97) MI ? contrassegnato con la sigla ATCC 39255.
6) Tossoide difterico quando ottenuto secondo le precedenti rivendicazioni.
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