JP2645702B2 - アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法 - Google Patents
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法Info
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- JP2645702B2 JP2645702B2 JP20278096A JP20278096A JP2645702B2 JP 2645702 B2 JP2645702 B2 JP 2645702B2 JP 20278096 A JP20278096 A JP 20278096A JP 20278096 A JP20278096 A JP 20278096A JP 2645702 B2 JP2645702 B2 JP 2645702B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エシェリヒア属に属す
るアシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
（Ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅｃｙｔｉｄｙｌｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）生産菌由来のアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を含む染色
体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡと略称する）断片を組込
んでなる新しい組換え体プラスミド、該プラスミドを導
入して形質転換した微生物、及び該微生物を用いてアシ
ルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼを製造
する方法に関する。
るアシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
（Ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅｃｙｔｉｄｙｌｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）生産菌由来のアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を含む染色
体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡと略称する）断片を組込
んでなる新しい組換え体プラスミド、該プラスミドを導
入して形質転換した微生物、及び該微生物を用いてアシ
ルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼを製造
する方法に関する。
【０００２】アシルノイラミネートシチジリルトランス
フェラーゼ［ＥＣ２．７．７．４３］はシチジントリホ
スフェートとシアル酸からシチジンモノホスホシアル酸
を合成する酵素であり、シチジンモノホスホシアル酸、
なかんずくシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン
酸は、中枢神経及び末梢神経系における神経刺激の障
害、及び癌等の治療に有用である。
フェラーゼ［ＥＣ２．７．７．４３］はシチジントリホ
スフェートとシアル酸からシチジンモノホスホシアル酸
を合成する酵素であり、シチジンモノホスホシアル酸、
なかんずくシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン
酸は、中枢神経及び末梢神経系における神経刺激の障
害、及び癌等の治療に有用である。
【０００３】
【従来の技術】アシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼは、ウシ、ブタの顎下腺、その他の動物組
織、あるいは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）等の微生物の一部に存在することが知られ
ている。
スフェラーゼは、ウシ、ブタの顎下腺、その他の動物組
織、あるいは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）等の微生物の一部に存在することが知られ
ている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】アシルノイラミネート
シチジリルトランスフェラーゼを動物組織から調製する
にあたっては、該酵素の失活を免れるために、屠殺後速
やかに該組織を摘出し、酵素を抽出する必要があるこ
と、また、原料の動物組織を確保しなければならないと
いう規模的な難点があり、大量調製が難しい。
シチジリルトランスフェラーゼを動物組織から調製する
にあたっては、該酵素の失活を免れるために、屠殺後速
やかに該組織を摘出し、酵素を抽出する必要があるこ
と、また、原料の動物組織を確保しなければならないと
いう規模的な難点があり、大量調製が難しい。
【０００５】他方、前記の微生物から調製する場合は微
生物の大量培養は可能であるが、微生物菌体中のアシル
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ含量は極
めて低いものであり、該菌体中にシチジントリホスフェ
ート分解酵素が含まれているため、シチジンモノホスホ
シアル酸の合成に使用するに際しては、その収量を上げ
るためにはアシルノイラミネートシチジリルトランスフ
ェラーゼをイオン交換クロマトグラフィー等で高度に精
製して該分解酵素を除去した後、使用する必要がある等
の難点を有している。
生物の大量培養は可能であるが、微生物菌体中のアシル
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ含量は極
めて低いものであり、該菌体中にシチジントリホスフェ
ート分解酵素が含まれているため、シチジンモノホスホ
シアル酸の合成に使用するに際しては、その収量を上げ
るためにはアシルノイラミネートシチジリルトランスフ
ェラーゼをイオン交換クロマトグラフィー等で高度に精
製して該分解酵素を除去した後、使用する必要がある等
の難点を有している。
【０００６】このような煩雑な精製操作をしなくても、
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生
産能が高い微生物によるアシルノイラミネートシチジリ
ルトランスフェラーゼの製造法、即ちシチジンモノホス
ホシアル酸合成収率の高い該酵素の製造法の開発が望ま
れている。
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生
産能が高い微生物によるアシルノイラミネートシチジリ
ルトランスフェラーゼの製造法、即ちシチジンモノホス
ホシアル酸合成収率の高い該酵素の製造法の開発が望ま
れている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる欠
点を解決するために種々検討した結果、本発明を完成す
るに至った。即ち本発明は、エシェリヒア属に属するア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生産
菌由来のアシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んでなる組
換え体プラスミドを導入したエシェリヒア属に属する微
生物を、栄養培地に培養し、培養物中にアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼを蓄積させる、ア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製
造法を提供するものである。
点を解決するために種々検討した結果、本発明を完成す
るに至った。即ち本発明は、エシェリヒア属に属するア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生産
菌由来のアシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んでなる組
換え体プラスミドを導入したエシェリヒア属に属する微
生物を、栄養培地に培養し、培養物中にアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼを蓄積させる、ア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製
造法を提供するものである。
【０００８】以下、本発明を詳述する。エシェリヒア属
に属するアシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ生産菌、例えばアシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼ活性を有する大腸菌等から染色体Ｄ
ＮＡを単離する方法は常法に従って、例えばＢｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ
Ｖｏｌ．７２，ｐｐ６１９−６２９（１９６３）記載の
フェノール法により行うことができる。
に属するアシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ生産菌、例えばアシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼ活性を有する大腸菌等から染色体Ｄ
ＮＡを単離する方法は常法に従って、例えばＢｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ
Ｖｏｌ．７２，ｐｐ６１９−６２９（１９６３）記載の
フェノール法により行うことができる。
【０００９】染色体ＤＮＡのプラスミドへの組込みは常
法に従って、例えば染色体ＤＮＡ及びプラスミドを制限
酵素でそれぞれ切断してＤＮＡ断片を調製した後、両Ｄ
ＮＡ断片を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理することによ
って行うことができる。
法に従って、例えば染色体ＤＮＡ及びプラスミドを制限
酵素でそれぞれ切断してＤＮＡ断片を調製した後、両Ｄ
ＮＡ断片を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理することによ
って行うことができる。
【００１０】ここでベクターＤＮＡとして用いられるプ
ラスミドとしては、適当な選択マーカーを有し、多コピ
ーのものが好適で、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１
８，ラムダファージ等が挙げられる。
ラスミドとしては、適当な選択マーカーを有し、多コピ
ーのものが好適で、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１
８，ラムダファージ等が挙げられる。
【００１１】また、制限酵素としては、例えばＢａｍＨ
Ｉ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ
等が例示されるが、ＨｉｎｄＩＩＩが好適に用いられ
る。
Ｉ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ
等が例示されるが、ＨｉｎｄＩＩＩが好適に用いられ
る。
【００１２】また、ＤＮＡリガーゼとしては例えばＴ４
ファージ由来のＴ４−ＤＮＡリガーゼが好適に用いられ
る。
ファージ由来のＴ４−ＤＮＡリガーゼが好適に用いられ
る。
【００１３】次いで、上記方法で得られた組換え体プラ
スミドは常法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｐｐ２５０−２５３（１９８２）に記載の塩化カル
シウム処理法や塩化カルシウム−塩化ルビジウム処理法
等により、宿主菌細胞となるエシェリヒア属に属する微
生物菌体内、例えば大腸菌内に導入する。
スミドは常法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｐｐ２５０−２５３（１９８２）に記載の塩化カル
シウム処理法や塩化カルシウム−塩化ルビジウム処理法
等により、宿主菌細胞となるエシェリヒア属に属する微
生物菌体内、例えば大腸菌内に導入する。
【００１４】所望の組換え体プラスミド（即ち、アシル
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの遺伝情
報を担う染色体ＤＮＡ断片を組込んだプラスミド）を含
有する菌株は、菌体をトルエン処理し、その懸濁液を酵
素試料として常法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８，ｐｐ２０８−２１０
（１９６６）に記載の方法でアッセイすることにより、
選択し、取得することができる。
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの遺伝情
報を担う染色体ＤＮＡ断片を組込んだプラスミド）を含
有する菌株は、菌体をトルエン処理し、その懸濁液を酵
素試料として常法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８，ｐｐ２０８−２１０
（１９６６）に記載の方法でアッセイすることにより、
選択し、取得することができる。
【００１５】かくして得られた組換え体プラスミドを含
有する微生物としては、例えばエシェリヒア・コリＫＪ
５３７（微工研菌寄第９６８２号）が挙げられる。
有する微生物としては、例えばエシェリヒア・コリＫＪ
５３７（微工研菌寄第９６８２号）が挙げられる。
【００１６】上記の如くして取得した本発明の微生物
は、培養すれば培養物中に著量のアシルノイラミネート
シチジリルトランスフェラーゼを蓄積する。
は、培養すれば培養物中に著量のアシルノイラミネート
シチジリルトランスフェラーゼを蓄積する。
【００１７】本発明の微生物の培養に用いられる培地と
しては、炭素源、窒素源、無機塩等を含む天然培地また
は合成培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例
えばグルコース、フラクトース、シュークロース等、ま
た窒素源としては、例えば塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム等の無機態窒素の他、酵母
エキス、ペプトン、肉エキス等の有機態窒素を使用でき
る。また、無機塩としては、例えば塩化マグネシウム、
塩化マンガン等の添加が効果的である。用いる炭素源の
濃度は０．０５−５ＷＴ％、好適には０．５ＷＴ％、窒
素源の濃度は０．０５−５ＷＴ％、好適には０．５ＷＴ
％、また、無機塩は０．００５ＷＴ％程度添加するのが
好ましい。
しては、炭素源、窒素源、無機塩等を含む天然培地また
は合成培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例
えばグルコース、フラクトース、シュークロース等、ま
た窒素源としては、例えば塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム等の無機態窒素の他、酵母
エキス、ペプトン、肉エキス等の有機態窒素を使用でき
る。また、無機塩としては、例えば塩化マグネシウム、
塩化マンガン等の添加が効果的である。用いる炭素源の
濃度は０．０５−５ＷＴ％、好適には０．５ＷＴ％、窒
素源の濃度は０．０５−５ＷＴ％、好適には０．５ＷＴ
％、また、無機塩は０．００５ＷＴ％程度添加するのが
好ましい。
【００１８】培養は振とう培養、あるいは通気攪拌培養
等の好気的条件下に行われ、培養温度は２０−４２℃、
好適には３７℃、また、培養ｐＨは６−８、好適には７
が好ましく、培養時間は通常１２−４８時間で完了す
る。
等の好気的条件下に行われ、培養温度は２０−４２℃、
好適には３７℃、また、培養ｐＨは６−８、好適には７
が好ましく、培養時間は通常１２−４８時間で完了す
る。
【００１９】次に、上記培養液から遠心分離等での方法
で培養した菌体を集め、更に、この菌体からアシルノイ
ラミネートシチジリルトランスフェラーゼを抽出する場
合は、超音波処理、フレンチプレス処理、凍結融解処理
等よって細胞を破砕し、該酵素を抽出する。更に、この
菌体破砕抽出液から、アシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼを精製する場合は硫安塩析法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法等の常法によ
り、精製酵素を得ることができる。
で培養した菌体を集め、更に、この菌体からアシルノイ
ラミネートシチジリルトランスフェラーゼを抽出する場
合は、超音波処理、フレンチプレス処理、凍結融解処理
等よって細胞を破砕し、該酵素を抽出する。更に、この
菌体破砕抽出液から、アシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼを精製する場合は硫安塩析法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法等の常法によ
り、精製酵素を得ることができる。
【００２０】シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミ
ン酸等のシチジンモノホスホシアル酸の製造に際して
は、遠心分離等の方法で集めた上記の培養菌体を各種界
面活性剤等で処理し、その処理菌体を直接使用すること
によっても、また上記の菌体破砕抽出液を何ら処理する
ことなく使用することによっても、シチジントリホスフ
ェートとシアル酸から高効率で生産することができる。
ン酸等のシチジンモノホスホシアル酸の製造に際して
は、遠心分離等の方法で集めた上記の培養菌体を各種界
面活性剤等で処理し、その処理菌体を直接使用すること
によっても、また上記の菌体破砕抽出液を何ら処理する
ことなく使用することによっても、シチジントリホスフ
ェートとシアル酸から高効率で生産することができる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。
する。
【００２２】実施例１ （１）染色体ＤＮＡの調製 アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活
性を有する大腸菌、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１３０
２７をＬＢ−培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ，酵母エキス
５ｇ／Ｌ，塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ，ｐＨ７）２００
ｍｌ中、３７℃で１６時間振とう培養した後、遠心分離
により菌体を分離した。かくして得られた１．２ｇの菌
体（湿重量）より、フェノール法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａ ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．７
２，ｐｐ６１９−６２９（１９６３）］で染色体ＤＮＡ
を抽出し、約１．６ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
性を有する大腸菌、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１３０
２７をＬＢ−培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ，酵母エキス
５ｇ／Ｌ，塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ，ｐＨ７）２００
ｍｌ中、３７℃で１６時間振とう培養した後、遠心分離
により菌体を分離した。かくして得られた１．２ｇの菌
体（湿重量）より、フェノール法［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ
ａ ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．７
２，ｐｐ６１９−６２９（１９６３）］で染色体ＤＮＡ
を抽出し、約１．６ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
【００２３】（２）染色体ＤＮＡ断片を組込んだ組換え
体プラスミドの調製 （１）で得られた染色体ＤＮＡ２μｇに、制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩを３７℃で２時間反応させて断片化し、フェ
ノール処理、次いでエーテル処理し、染色体ＤＮＡ断片
溶液を得た。別にベクターとして使用するプラスミドｐ
ＵＣ１８ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間処
理し、更に、Ｕｌｌｒｉｃｈらの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｖｏｌ．１９６，ｐｐ１３１３−１３１９（１９７
７）］でアルカリホスファターゼ処理した後、フェノー
ル処理、次いでエーテル処理してＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐ
ＵＣ１８溶液を得た。かくして得たプラスミドｐＵＣ１
８断片溶液と前記の染色体ＤＮＡ断片溶液を混合し、Ｔ
４−ＤＮＡリガーゼで１０℃、１６時間処理し、組換え
体プラスミドを調製した。
体プラスミドの調製 （１）で得られた染色体ＤＮＡ２μｇに、制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩを３７℃で２時間反応させて断片化し、フェ
ノール処理、次いでエーテル処理し、染色体ＤＮＡ断片
溶液を得た。別にベクターとして使用するプラスミドｐ
ＵＣ１８ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間処
理し、更に、Ｕｌｌｒｉｃｈらの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｖｏｌ．１９６，ｐｐ１３１３−１３１９（１９７
７）］でアルカリホスファターゼ処理した後、フェノー
ル処理、次いでエーテル処理してＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐ
ＵＣ１８溶液を得た。かくして得たプラスミドｐＵＣ１
８断片溶液と前記の染色体ＤＮＡ断片溶液を混合し、Ｔ
４−ＤＮＡリガーゼで１０℃、１６時間処理し、組換え
体プラスミドを調製した。
【００２４】（３）組換え体プラスミドによる大腸菌の
形質転換 アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活
性を有しない大腸菌、エシェリヒア・コリＪＭ１０９を
ＬＢ−培地２０ｍｌで３７℃、３時間振とう培養して得
た菌体を３０ｍＭ塩化カルシウム溶液１０ｍｌに懸濁
し、０℃、１時間保持した。次いで、遠心分離により菌
体を分離し、２ｍｌの３０ｍＭ塩化カルシウム溶液に再
懸濁した。この菌体の懸濁液０．２ｍｌに（２）で調製
した組換え体プラスミド溶液を加え、０℃で１時間保持
した後、４２℃で９０秒間熱処理して該プラスミドを該
菌体の細胞内に取り込ませ形質転換させた。次に、この
形質転換させた菌体の懸濁液に１ｍｌのＬＢ−培地を加
えて３７℃、１時間放置した後、アンピシリン５０ｍｇ
／Ｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
チオガラクトピラノシド３０ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ−
培地の寒天平板に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
形質転換 アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活
性を有しない大腸菌、エシェリヒア・コリＪＭ１０９を
ＬＢ−培地２０ｍｌで３７℃、３時間振とう培養して得
た菌体を３０ｍＭ塩化カルシウム溶液１０ｍｌに懸濁
し、０℃、１時間保持した。次いで、遠心分離により菌
体を分離し、２ｍｌの３０ｍＭ塩化カルシウム溶液に再
懸濁した。この菌体の懸濁液０．２ｍｌに（２）で調製
した組換え体プラスミド溶液を加え、０℃で１時間保持
した後、４２℃で９０秒間熱処理して該プラスミドを該
菌体の細胞内に取り込ませ形質転換させた。次に、この
形質転換させた菌体の懸濁液に１ｍｌのＬＢ−培地を加
えて３７℃、１時間放置した後、アンピシリン５０ｍｇ
／Ｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
チオガラクトピラノシド３０ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ−
培地の寒天平板に塗布し、３７℃で１８時間培養した。
【００２５】（４）アシルノイラミネートシチジリルト
ランスフェラーゼ生産能を有する形質転換体の分離 （３）の寒天平板上に生じた白色コロニーを、２ｍｌの
ＬＢ−培地で３７℃、１６時間振とう培養した後、遠心
分離で菌体を分離した。この得られた菌体を０．５ｍｌ
の蒸留水と５μｌのトルエンを添加して懸濁し、この懸
濁液０．３５ｍｌを用いてＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８，ｐｐ２０８−２１０
（１９６６）に記載の方法により、アシルノイラミネー
トシチジリルトランスフェラーゼ活性の有無を判定し
た。かくして、アシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼ生産能を有する形質転換体エシェリヒア・
コリＫＪ５３７（微工研菌寄第９６８２号）を取得し
た。この形質転換体ＫＪ５３７が保有する組換え体プラ
スミドｐＫＪＣ７のアガロースゲル電気泳動法により作
製した制限酵素切断地図は図１に示すとおりであり、該
プラスミドには染色体ＤＮＡ断片が１個組込まれてい
た。
ランスフェラーゼ生産能を有する形質転換体の分離 （３）の寒天平板上に生じた白色コロニーを、２ｍｌの
ＬＢ−培地で３７℃、１６時間振とう培養した後、遠心
分離で菌体を分離した。この得られた菌体を０．５ｍｌ
の蒸留水と５μｌのトルエンを添加して懸濁し、この懸
濁液０．３５ｍｌを用いてＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８，ｐｐ２０８−２１０
（１９６６）に記載の方法により、アシルノイラミネー
トシチジリルトランスフェラーゼ活性の有無を判定し
た。かくして、アシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼ生産能を有する形質転換体エシェリヒア・
コリＫＪ５３７（微工研菌寄第９６８２号）を取得し
た。この形質転換体ＫＪ５３７が保有する組換え体プラ
スミドｐＫＪＣ７のアガロースゲル電気泳動法により作
製した制限酵素切断地図は図１に示すとおりであり、該
プラスミドには染色体ＤＮＡ断片が１個組込まれてい
た。
【００２６】実施例２ 実施例１で得られた形質転換体ＫＪ５３７から実施例１
と同様にしてフェノール法によって組換え体プラスミド
ｐＫＪＣ７を抽出し、更に実施例１と同様にしてＨｉｎ
ｄＩＩＩ処理、次いでＴ４−ＤＮＡリガーゼ処理し、新
たなる組換え体プラスミドを得た。この新たなる組換え
体プラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９を実施例
１と同様にして形質転換することによって形質転換体エ
シェリヒア・コリＫＪ４０４（微工研菌寄第９６８１
号）を取得した。この形質転換体ＫＪ４０４が保有する
組換え体プラスミドｐＫＪＣ７７Ｒの実施例１と同様な
方法により作製した制限酵素切断地図は図２に示すとお
りであり、該プラスミドには染色体ＤＮＡ断片が２個組
込まれていた。
と同様にしてフェノール法によって組換え体プラスミド
ｐＫＪＣ７を抽出し、更に実施例１と同様にしてＨｉｎ
ｄＩＩＩ処理、次いでＴ４−ＤＮＡリガーゼ処理し、新
たなる組換え体プラスミドを得た。この新たなる組換え
体プラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１０９を実施例
１と同様にして形質転換することによって形質転換体エ
シェリヒア・コリＫＪ４０４（微工研菌寄第９６８１
号）を取得した。この形質転換体ＫＪ４０４が保有する
組換え体プラスミドｐＫＪＣ７７Ｒの実施例１と同様な
方法により作製した制限酵素切断地図は図２に示すとお
りであり、該プラスミドには染色体ＤＮＡ断片が２個組
込まれていた。
【００２７】比較例１、２及び実施例３、４ 表１記載の菌株、即ちエシェリヒア・コリＡＴＣＣ１３
０２７（従来技術としてのアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ活性を有する菌株）を比較例
１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（アシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ活性を有さず、本発
明の組換え体プラスミドの宿主として用いた菌株）を比
較例２、エシェリヒア・コリＫＪ５３７（実施例１で得
られた本発明の形質転換体）を実施例３、エシェリヒア
・コリＫＪ４０４（実施例２で得られた本発明の形質転
換体）を実施例４とし、それぞれ１．６ＬのＬＢ−培地
に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。培養終了
後、それぞれ遠心分離にて菌体を分離し、４０ｍｌの５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に再懸濁し、フレ
ンチプレスにかけた。次いでこれをそれぞれ遠心分離に
かけて菌体抽出液を分離し、同緩衝液を加えて全量を５
０ｍｌに調製した。この調製した抽出液１０μｌを用い
てＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ．８，ｐｐ２０８−２１０（１９６６）に記載の方法
により、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ活性（１時間に１μｍｏｌｅのシチジンモノホス
ホＮ−アセチルノイラミン酸を生成する酵素活性を１単
位とする。以下、酵素活性単位と略す）をそれぞれ測定
した。前記１．６ＬのＬＢ−培地の単位培養液当たりに
換算した結果をまとめて表１に示す。これらの結果から
明らかなように、本発明の菌株は単位培養液当たりのア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性
が従来の菌株（ＡＴＣＣ１３０２７）の６．５倍（ＫＪ
５３７）から２０倍（ＫＪ４０４）に達し、酵素生産を
効率的なものとした。
０２７（従来技術としてのアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ活性を有する菌株）を比較例
１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（アシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ活性を有さず、本発
明の組換え体プラスミドの宿主として用いた菌株）を比
較例２、エシェリヒア・コリＫＪ５３７（実施例１で得
られた本発明の形質転換体）を実施例３、エシェリヒア
・コリＫＪ４０４（実施例２で得られた本発明の形質転
換体）を実施例４とし、それぞれ１．６ＬのＬＢ−培地
に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。培養終了
後、それぞれ遠心分離にて菌体を分離し、４０ｍｌの５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に再懸濁し、フレ
ンチプレスにかけた。次いでこれをそれぞれ遠心分離に
かけて菌体抽出液を分離し、同緩衝液を加えて全量を５
０ｍｌに調製した。この調製した抽出液１０μｌを用い
てＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ．８，ｐｐ２０８−２１０（１９６６）に記載の方法
により、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼ活性（１時間に１μｍｏｌｅのシチジンモノホス
ホＮ−アセチルノイラミン酸を生成する酵素活性を１単
位とする。以下、酵素活性単位と略す）をそれぞれ測定
した。前記１．６ＬのＬＢ−培地の単位培養液当たりに
換算した結果をまとめて表１に示す。これらの結果から
明らかなように、本発明の菌株は単位培養液当たりのア
シルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性
が従来の菌株（ＡＴＣＣ１３０２７）の６．５倍（ＫＪ
５３７）から２０倍（ＫＪ４０４）に達し、酵素生産を
効率的なものとした。
【００２８】
【表１】 ──────────────────────────────────── 菌株 アシルノイラミネートシチシ゛リルトランスフェラーセ゛活性 （単位／ｍｌ−培養液） ──────────────────────────────────── 比較例１ エシェリヒア・コリ ATCC13027 0.438 比較例２ エシェリヒア・コリ JM109 0.000 実施例３ エシェリヒア・コリ KJ537 2.843 実施例４ エシェリヒア・コリ KJ404 8.738 ────────────────────────────────────
【００２９】実施例５ 実施例２で得られたエシェリヒア・コリＫＪ４０４を
１．６ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃で１６時間振と
う培養した。この培養液より遠心分離にて菌体を分離
し、４０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）
に懸濁した後、フレンチプレス処理し、次いでこれを遠
心分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体抽出
液を同緩衝液を加えて５０ｍｌに調製した。次いで、こ
の調製した抽出液に硫安を加え、硫安５０％飽和で沈殿
する画分を採取した。この画分を１０ｍＭの塩化マグネ
シウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）５０ｍｌに溶解し、同緩衝液５Ｌで２４時間透析し
た。透析液を１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したヒドロキシルア
パタイト（４０ｍｌ，口径３ｃｍ）に通塔し、１０ｍＭ
塩化マグネシウムを含む１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
６）と１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．６）の濃度勾配液で溶出を行っ
た。この溶出液の活性画分（４０ｍｌ）を集め、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）５Ｌで２４時間透析した。次に、この透
析液を１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したイオン交換樹
脂カラム（５０ｍｌ，口径１．５ｃｍ、商品名ＤＥＡＥ
−トヨパール、東ソー（株）製）に通塔し、１０ｍＭ塩
化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）と０．５Ｍ塩化カリウムを含む同液の濃度勾
配液で溶出を行った。この溶出液の活性画分を集め、１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）５Ｌで２４時間透析した。透析液を
凍結乾燥し、比活性３６単位／ｍｇのアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ粉末標品６０ｍｇを
得た。
１．６ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃で１６時間振と
う培養した。この培養液より遠心分離にて菌体を分離
し、４０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）
に懸濁した後、フレンチプレス処理し、次いでこれを遠
心分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体抽出
液を同緩衝液を加えて５０ｍｌに調製した。次いで、こ
の調製した抽出液に硫安を加え、硫安５０％飽和で沈殿
する画分を採取した。この画分を１０ｍＭの塩化マグネ
シウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）５０ｍｌに溶解し、同緩衝液５Ｌで２４時間透析し
た。透析液を１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したヒドロキシルア
パタイト（４０ｍｌ，口径３ｃｍ）に通塔し、１０ｍＭ
塩化マグネシウムを含む１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
６）と１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．６）の濃度勾配液で溶出を行っ
た。この溶出液の活性画分（４０ｍｌ）を集め、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）５Ｌで２４時間透析した。次に、この透
析液を１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したイオン交換樹
脂カラム（５０ｍｌ，口径１．５ｃｍ、商品名ＤＥＡＥ
−トヨパール、東ソー（株）製）に通塔し、１０ｍＭ塩
化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）と０．５Ｍ塩化カリウムを含む同液の濃度勾
配液で溶出を行った。この溶出液の活性画分を集め、１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）５Ｌで２４時間透析した。透析液を
凍結乾燥し、比活性３６単位／ｍｇのアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ粉末標品６０ｍｇを
得た。
【００３０】参考例１ 以下に、本発明の形質転換微生物から調製したアシルノ
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼを使用した
シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸の製造例
を述べる。実施例２で得られたエシェリヒア・コリＫＪ
４０４を１．６ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃で１６
時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて菌体を
分離し、４０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８）に再懸濁し、フレンチプレスにかけた。これを遠心
分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体抽出液
に上記と同じ緩衝液を加えて５０ｍｌに調製した。この
調製した菌体抽出液を実施例３と同様にして、アシルノ
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性を測定
した結果、２８０単位／ｍｌであった。この５０ｍｌに
調製した菌体抽出液の内１８ｍｌ（約５０００単位）、
Ｎ−アセチルノイラミン酸１ｍｍｏｌｅ、シチジントリ
ホスフェート１ｍｍｏｌｅ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９）４００ｍｌ及び１Ｍ塩化マグネシウム４０ｍ
ｌを混合し、水を加えて全量を２０００ｍｌとした。３
７℃で４時間反応後、イオン交換樹脂（炭酸型，６００
ｍｌ，商品名ダウエックス１，ダウケミカル（株）製）
に通塔し、水洗後、０〜１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモ
ニウムで連続的濃度勾配溶出を行った。シチジンモノホ
スホＮ−アセチルノイラミン酸を含む画分を減圧濃縮
し、濃縮液に５倍量のエタノールを加えて沈殿を採取し
た。真空乾燥により、ＨＰＬＣ純度９３％のシチジンモ
ノホスホＮ−アセチルノイラミン酸アンモニウム塩の白
色粉末４．６７２ｇを得た。収率は７２％であった。
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼを使用した
シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸の製造例
を述べる。実施例２で得られたエシェリヒア・コリＫＪ
４０４を１．６ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃で１６
時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて菌体を
分離し、４０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８）に再懸濁し、フレンチプレスにかけた。これを遠心
分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体抽出液
に上記と同じ緩衝液を加えて５０ｍｌに調製した。この
調製した菌体抽出液を実施例３と同様にして、アシルノ
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性を測定
した結果、２８０単位／ｍｌであった。この５０ｍｌに
調製した菌体抽出液の内１８ｍｌ（約５０００単位）、
Ｎ−アセチルノイラミン酸１ｍｍｏｌｅ、シチジントリ
ホスフェート１ｍｍｏｌｅ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９）４００ｍｌ及び１Ｍ塩化マグネシウム４０ｍ
ｌを混合し、水を加えて全量を２０００ｍｌとした。３
７℃で４時間反応後、イオン交換樹脂（炭酸型，６００
ｍｌ，商品名ダウエックス１，ダウケミカル（株）製）
に通塔し、水洗後、０〜１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモ
ニウムで連続的濃度勾配溶出を行った。シチジンモノホ
スホＮ−アセチルノイラミン酸を含む画分を減圧濃縮
し、濃縮液に５倍量のエタノールを加えて沈殿を採取し
た。真空乾燥により、ＨＰＬＣ純度９３％のシチジンモ
ノホスホＮ−アセチルノイラミン酸アンモニウム塩の白
色粉末４．６７２ｇを得た。収率は７２％であった。
【００３１】比較参考例１ 以下に、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１３０２７から調
製したアシルノイラミネートシチジリルトランスフェラ
ーゼを使用したシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラ
ミン酸の製造例を述べる。エシェリヒア・コリＡＴＣＣ
１３０２７を１２．８ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃
で１６時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて
菌体を集め、３２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）に再懸濁し、フレンチプレスにかけた。これ
を遠心分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体
抽出液を同緩衝液を加えて４００ｍｌに調製した。この
調製した菌体抽出液のアシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼ活性は実施例３と同様にして測定し
た結果、１４単位／ｍｌであった。次に、この調製した
菌体抽出液３６０ｍｌ（約５０００単位）、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸１ｍｍｏｌｅ、シチジントリホスフェー
ト１ｍｍｏｌｅ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）４
００ｍｌ、１Ｍ塩化マグネシウム４０ｍｌを混合し、水
を加えて全量を２０００ｍｌとした。３７℃で４時間反
応させ、以下参考例１と同様に処理することにより、Ｈ
ＰＬＣ純度６８％のシチジンモノホスホＮ−アセチルノ
イラミン酸アンモニウム塩の白色粉末１．４３１ｇを得
た。収率は２２％であった。本白色粉末には原料のシチ
ジントリホスフェートの分解産物であるシチジンモノホ
スフェートがなお多量に混在するため、再精製のため
に、本粉末を１０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、再度ダウエックス１に通塔
し、炭酸水素トリエチルアンモニウムの濃度勾配液で溶
出した。シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸
画分をエタノール沈殿、次いで真空乾燥し、ＨＰＬＣ純
度８８％のシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン
酸アンモニウム塩０．６５５ｇを得た。最終的な収率は
１０％であった。
製したアシルノイラミネートシチジリルトランスフェラ
ーゼを使用したシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラ
ミン酸の製造例を述べる。エシェリヒア・コリＡＴＣＣ
１３０２７を１２．８ＬのＬＢ−培地に接種し、３７℃
で１６時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離にて
菌体を集め、３２０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）に再懸濁し、フレンチプレスにかけた。これ
を遠心分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体
抽出液を同緩衝液を加えて４００ｍｌに調製した。この
調製した菌体抽出液のアシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼ活性は実施例３と同様にして測定し
た結果、１４単位／ｍｌであった。次に、この調製した
菌体抽出液３６０ｍｌ（約５０００単位）、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸１ｍｍｏｌｅ、シチジントリホスフェー
ト１ｍｍｏｌｅ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）４
００ｍｌ、１Ｍ塩化マグネシウム４０ｍｌを混合し、水
を加えて全量を２０００ｍｌとした。３７℃で４時間反
応させ、以下参考例１と同様に処理することにより、Ｈ
ＰＬＣ純度６８％のシチジンモノホスホＮ−アセチルノ
イラミン酸アンモニウム塩の白色粉末１．４３１ｇを得
た。収率は２２％であった。本白色粉末には原料のシチ
ジントリホスフェートの分解産物であるシチジンモノホ
スフェートがなお多量に混在するため、再精製のため
に、本粉末を１０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、再度ダウエックス１に通塔
し、炭酸水素トリエチルアンモニウムの濃度勾配液で溶
出した。シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸
画分をエタノール沈殿、次いで真空乾燥し、ＨＰＬＣ純
度８８％のシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン
酸アンモニウム塩０．６５５ｇを得た。最終的な収率は
１０％であった。
【００３２】
【発明の効果】エシェリヒア属に属するアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシ
ルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んだ組換え体プラスミド
を作成し、この組換え体プラスミドでエシェリヒア属に
属する微生物を形質転換することにより、アシルノイラ
ミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性が従来の該
活性を有する微生物よりも強い新規な微生物が得られ
る。この形質転換した微生物を栄養培地に培養すること
によって培養物中に著量のアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼを蓄積させることができる。即
ち、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラー
ゼの生産性を向上せしめることができる。また、シチジ
ンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸等のシチジンモ
ノホスホシアル酸の製造に際し、該微生物中のアシルノ
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼ含量が多い
ため、即ちアシルノイラミネートシチジリルトランスフ
ェラーゼ活性が強いため従来のように微生物中の該酵素
を精製しなくても、本発明の微生物を界面活性剤処理等
をしただけで、若しくは該酵素を上記微生物より破砕抽
出しただけで、精製しないで使用してもシチジンモノホ
スホシアル酸を高収率に生産できる。
ネートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシ
ルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んだ組換え体プラスミド
を作成し、この組換え体プラスミドでエシェリヒア属に
属する微生物を形質転換することにより、アシルノイラ
ミネートシチジリルトランスフェラーゼ活性が従来の該
活性を有する微生物よりも強い新規な微生物が得られ
る。この形質転換した微生物を栄養培地に培養すること
によって培養物中に著量のアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼを蓄積させることができる。即
ち、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラー
ゼの生産性を向上せしめることができる。また、シチジ
ンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸等のシチジンモ
ノホスホシアル酸の製造に際し、該微生物中のアシルノ
イラミネートシチジリルトランスフェラーゼ含量が多い
ため、即ちアシルノイラミネートシチジリルトランスフ
ェラーゼ活性が強いため従来のように微生物中の該酵素
を精製しなくても、本発明の微生物を界面活性剤処理等
をしただけで、若しくは該酵素を上記微生物より破砕抽
出しただけで、精製しないで使用してもシチジンモノホ
スホシアル酸を高収率に生産できる。
【図１】本発明の組換え体プラスミドｐＫＪＣ７のアガ
ロースゲル電気泳動解析による制限酵素切断地図であ
る。
ロースゲル電気泳動解析による制限酵素切断地図であ
る。
【図２】本発明の組換え体プラスミドｐＫＪＣ７７Ｒの
アガロースゲル電気泳動解析による制限酵素切断地図で
ある。
アガロースゲル電気泳動解析による制限酵素切断地図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属するアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシ
ルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んでなる組換え体プラス
ミドを導入したエシェリヒア属に属する微生物を、栄養
培地に培養し、培養物中にアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼを蓄積させることを特徴とする
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20278096A JP2645702B2 (ja) | 1996-07-15 | 1996-07-15 | アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20278096A JP2645702B2 (ja) | 1996-07-15 | 1996-07-15 | アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31316387A Division JP2627755B2 (ja) | 1987-12-12 | 1987-12-12 | アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107965A JPH09107965A (ja) | 1997-04-28 |
| JP2645702B2 true JP2645702B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=16463074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20278096A Expired - Lifetime JP2645702B2 (ja) | 1996-07-15 | 1996-07-15 | アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2645702B2 (ja) |
-
1996
- 1996-07-15 JP JP20278096A patent/JP2645702B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09107965A (ja) | 1997-04-28 |
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