KR20060064629A - 미생물을 이용한 ｌ-아스코르브산의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 번호 1의 20개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 개시한다. 본 발명은 추가로 높은 수율로 L-아스코르브산의 생산 방법, 특히 제공된 탄소 원을 비타민 C로 전환시킬 수 있는 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 생산 방법에 관한 것이다. 따라서 수득된 비타민 C를 정제 및/또는 분리 단계에 의해 가공할 수 있다.

Description

미생물을 이용한 Ｌ-아스코르브산의 생산{MICROBIAL PRODUCTION OF L-ASCORBIC ACID}

본 발명은 L-솔보손을 L-아스코르브산으로 직접 전환시키는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 효소 L-솔보손 탈수소효소(이후에: SNDHai)는 L-솔보손으로부터 직접 L-아스코르브산(비타민 C)을 생산한다. L-솔보손 탈수소효소(SNDHai)는 글루코노박터(Gluconobacter) 및 아세토박터(Acetobacter) 속에 속하는 세균으로부터 유래한다. 본 발명은 추가로 높은 수율로 L-아스코르브산의 생산 방법에 관한 것이다. L-아스코르브산은 약학, 식품 및 화장품 산업에서 광범위하게 사용된다.

지난 70년 대에, L-아스코르브산(비타민 C)은 공지된 라이히슈타인(Reichstein) 방법에 의해 D-글루코스로부터 산업적으로 생산되었다. 이 방법에서 모든 단계는 미생물 형질전환에 의해 수행되는 한가지(D-솔비톨을 L-솔보스로의 전환)를 제외하고 화학적이다. L-아스코르브산의 산업적인 생산을 위한 초기 실행 때문에, 몇가지 화학적 및 기술적 개질을 사용하여 라이히슈타인 방법의 효율성을 개선시켰다. 비타민 C 생산의 최신 개발은 문헌[Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5^th Edition, Vol. A27(1996), pp. 547ff]에서 요약된다. 최근에 비타민 C 생산의 상이한 단계를 미생물 또는 이로부터 단리된 효소의 도움으로 수행하였다.

L-아스코르브산을 위한 최근 생산 방법은 높은-에너지 소비 및 유기 및 무기 용매의 대량 사용과 같은 약간의 바람직하지 못한 특성을 갖는다. 따라서, 지난 수십년 동안, 보다 경제적일 뿐만 아니라 생태적인 미생물 전환을 사용하여 L-아스코르브산을 생산하는 다른 접근이 연구되었다. 직접적인 L-아스코르브산 생산은 몇가지 미생물에서 보고되었다.

놀랍게도, L-솔보손을 L-아스코르브산으로 직접 전환은 글루코노박터 옥시단스(oxydans) N44-1로부터 단리된 L-솔보손 탈수소효소(이후에서 SNDHai로 지칭됨) 또는 글루코노박터 및 아세토박터 속에 속하는 아세트산 세균으로부터 유래하는 그의 정형유전자인 효소를 사용하여 수행될 수 있다. 이 반응의 원인 유전자를 단리하고 선열을 결정하였다. 이 유전자에 의해 코딩된 솔보손 탈수소효소는 L-솔보손을 L-아스코르브산으로 전환시킨다. 이 효소는 공지된 SNDH 효소와 상이하다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 L-아스코르브산 또는 비타민 C는 예를 들어 유리 산 형태에서 해리되지 않거나 음이온으로 해리된 수용액에서 관찰되는 L-아스코르브산의 임의의 화학적인 형태일 수 있다. L-아스코르브산의 용해된 염 형태는 발효 상청액에서 주로 관찰되는 일종의 양이온, 예를 들어 칼륨, 나트륨, 암모늄 또는 칼슘의 존재하에 음이온으로서 규정될 수 있다. 또한, L-아스코르브산의 유리 산의 단리된 결정을 포함할 수 있다. 다른 한편, L-아스코르브산의 염 형태의 단리된 결정은 이의 상응하는 염 명칭, 나트륨 아스코르베이트, 칼륨 아스코르베이트, 칼슘 아스코르베이트 등으로 지칭된다.

L-솔보손을 비타민 C로의 전환은 비타민 C를 생성하는 기질의 전환이 SNDHai에 의해 수행되고, 즉 기질이 직접 비타민 C로 전환될 수 있다.

예를 들어, 클로닝 벡터는 임의의 플라스미드 또는 파지 DNA 또는 기타 DNA 서열이고, 이는 숙주에서 자발적으로 복제할 수 있고, 이러한 DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 결정가능한 방식으로 절단될 수 있는 하나 또는 적은 수의 제한 엔도뉴클라제 인식 부위에 의해 특징지어지고 DNA 단편이 복제를 초래하기 위해 스플라이싱될 수 있다. 클로닝 벡터는 추가로 예를 들어 클로닝 벡터와 함께 형질전환된 세포의 확인에서 사용하기 적합한 표시자를 함유할 수 있다. 이러한 표시자는 예를 들어 테트라사이클린 또는 암피실린과 같은 항생제에 저항성을 제공할 수 있다.

발현 벡터는 예를 들어 숙주내로 형질전환된 후 벡터에 클로닝된 유전자의 발현을 증강시킬 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 클로닝된 유전자는 주로 예를 들어 프로모터 서열과 같은 특정한 조절 서열의 조절 하에 위치(즉, 조절가능하게 연결됨)한다. 프로모터 서열은 구성적 또는 유도적일 수 있다.

핵산 분자는 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다. 예를 들어 이중 나선, 단일-나선 핵산 및 그의 뉴클레오시드와 같은 임의의 형태는 핵산 분자로서 유용할 수 있다. 또한, 예를 들어 DNA-RNA 혼성체, DNA-RNA-단백질 혼성체, RNA-단백질 혼성체 및 DNA-단백질 혼성체와 같은 혼성체이다. 폴리뉴클레오타이드는 몇가지 염기, 주로 20개 이상의 뉴클레오타이드 염기로 구성될 수 있다.

용어 "상동성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열의 유사성을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 상동성을 측정하기 위해서, 유사한 구역과 비교할 수 있는 방식으로 수행한다. 필요한 경우, 유사성을 개선시키기 위해서 특정한 위치에서 뉴클레오타이드가 블랭크 위치에 의해 치환될 수 있다. 상동성 비교는 예를 들어 수작업으로 또는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게 프로그램은 최대 상동성을 수득하기 위해서 표준 조건 하에서 수행된다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 상동성 또는 유사성의 정도는 "% 상동성"으로 제시된다.

돌연변이는 예를 들어 대상의 뉴클레오타이드 서열에서 단일 염기 쌍 변화, 삽입 또는 결실 또는 예를 들어 트랜스포손과 같은 유전 인자의 삽입과 같은 유전적인 현상일 수 있다.

DNA에서 돌연변이의 발생, 즉 돌연변이유발은 예를 들어 무직위적으로, 즉 무작위 돌연변이유발과 같은 상이한 방식으로 수행되고, 이때 돌연변이의 정확한 위치를 예상할 수 없고, 미생물의 염색체내에 임의의 위치에서 또는 내인성 플라드미스 상에서 발생하한다. 또한, 돌연변이는 예를 들어 방사선, 화학적인 처리 또는 유전 요소의 삽입과 같은 제제에 의해 초래되는 물리적인 손상의 결과로서 발생될 수 있다.

프로모터로서 각각의 유전자의 시작 코돈에 인접하게 위치하고 하나 이상의 인접한 유전자의 전사를 개시하는 임의의 DNA 서열을 사용할 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 각각의 유전자의 5' 영역에서 위치할 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 구조적 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 경우에, 전사의 속도는 유도제에 대해서 증가한다. 구조적인 프로모터의 경우에, 전사 속도는 예를 들어 유도제에 의해 조절되지 않는다.

용어 "동일성" 및 "% 동일성"은 예를 들어 하기에 예시된 바와 같이 서열 분석 프로그램을 사용하는 2개의 아미노산 서열의 비교를 지칭한다. "% 동일성"은 비교된 아미노산 서열에서 동일한 아미노산에 일치하는 대상 아미노산 서열의 아미노산 %를 지칭한다. 비교되는 아미노산 서열 둘다가 이들 임의의 아미노산에서 상이하지 않는 경우, 이들은 동일하거나 100% 동일성이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 20개 이상의 연속성 뉴클레오타이드에서 서열 번호 1의 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 유도되는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 서열 번호 1의 20개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 서열 번호 1의 50개 이상의 부분적인 뉴클레오타이드 서열, 보다 바람직하게 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 가장 바람직하다. 추가로 가장 바람직한 실시태양은 서열 번호 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 26으로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대해서 코딩된 폴리뉴클레오타이드로부터 유래될 수 있다. 서열 번호 1은 미생물 글루코노박터 옥시단스 N44-1로부터 단리된 SNDHai의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 서열의 부분을 상이한 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 짧은 폴리뉴클레오타이드를 예를 들어 다른 유기체로부터 단리된 적합한 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 개시체로서 사용할 수 있다. 짧은 폴리뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 100염기 쌍(bp), 주로 약 14 내지 약 50, 바람직하게는 약 17 내지 약 30bp의 범위일 수 있다. 이러한 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열의 예는 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 23 또는 24로 표현된다. 보다 긴 폴리뉴클레오타이드는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 예를 들어 SNDHai는 효소 활성에 사용될 수 있는 막통과 도메인을 갖는다. 단백질의 효소적으로 활성 구역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 일부가 막통과 도메인 없이 발현되는 경우, 이러한 폴리펩타이드는 충분한 효소 활성을 갖는다.

단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 또한 코딩하는 보다 긴 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 예를 들어 세균으로부터 단리할 수 있다. 바람직하게, 이들은 글루코노박터 및 아세토박터 속에 속하는 세균으로부터 단리되지만, 글루코노박터 옥시단스, 글루코노박터 프라테우리(frateurii), 글루코노박터 세리누스(cerinus) 및 아세토박터 아세티(aceti)에 한정되지 않는다. 이러한 폴리펩타이드가 보다 긴 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래할 때 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열 및 서열 번호 1 사이에 상동성을 결정하는 것이 가능하다. 이러한 경우에, 바람직하게 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 구역이 선택되고 상응하는 스트레치(stretch)와 비교될 수 있다. 서열 번호 1로부터 유래하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 스트레치가 예를 들어 100개의 연속적인 뉴클레오타이드를 비교함에 의해 확인된 60개의 뉴클레오타이드를 가질 때, 상동성은 60%이다. 따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 본 발명에 따라서 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 이때 부분적인 뉴클레오타이드 서열은 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드와 비교함에 의해 서열 번호 1과 60% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래한다. 바람직하게 본 발명의 부분적인 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는다. 예를 들어 100개 이상의 상동성 스트레치의 결정을 위해서, 바람직하게는 300개 이상, 보다 바람직하게는 500개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 스트레치가 사용될 수 있다.

본 발명은 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하기 위해 글루코노박터 및 아세토박터 속을 포함하는 초산균에 속하는 미생물의 L-솔보손 탈수소효소를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열에서 예를 들어 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 함에 의해 상기 폴리펩타이드로부터 유도가능한 폴리펩타이드를 코딩하고, 이는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 유지하여 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산한다. L-솔보손 탈수소효소 활성을 유지하여 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하는 폴리텝타이드의 부분적인 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 27로 표현되는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 본 명세서에서 개시된 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 선택되는 25개 이상의 연속적인 아미노산의 부분적인 아미노산 서열을 포함한다. 당업자는 폴리펩타이드에서 특정한 스트레치가 생물학적 활성을 위해 필수적임을 인지한다. 그러나, 아미노산이 다른 아미노산에 의해, 바람직하게는 치환되는 아미노산과 유사한 이러한 아미노산에 의해 삽입, 결실 또는 치환되는 다른 구역이 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 DNA 분자 및/또는 발현 벡터, 특히 적합한 숙주 세포에서 기능하는 벡터에 관한 것이다.

외부 뉴클레오타이드 분자의 수용체로서 기능하는 임의의 세포는 숙주 세포, 예컨대 복제가능한 발현 벡터를 갖는 세포 또는 클로닝 벡터 또는 그의 염색체 또는 게놈 상에 목적하는 유전자를 함유하는 공지된 기법에 의해 유전공학적으로 조작되는 세포로서 사용될 수 있다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 기원, 예컨대 세균 세포, 인간 세포를 포함하는 동물 세포, 효모 세포를 포함하는 곰팡이 세포 및 식물 세포일 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 생체내에서, 보다 바람직하게는 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 푸티다(putida) 또는 에세리키아(Escherichia), 예컨대 에세리키아 콜라이(coli) 속의 세균에서 활성 형태로서 L-솔보손 탈수소효소를 발현할 수 있는 세균에 속한다.

따라서, 본 발명의 양태는 상술된 바와 같이 이러한 발현 벡터를 포함하거나 또는 염색체 DNA에 통합되는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 이러한 뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 이어서, 이러한 숙주 세포는 재조합 숙주 세포 또는 재조합 유기체로 지칭된다.

본 발명은 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 재조합 L-솔보손 탈수소효소 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 상기에서 구체적으로 기술된 바와 같이 예를 들어 본 발명의 재조합 유기체의 배양을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부는 이 방법에 의해 제조된 재조합 L-솔보손 탈수소효소 폴리펩타이드이다. 이러한 재조합 L-솔보손은 예를 들어 효소 반응에 사용되고 당업자에게 공지되고 막 모듈(module) 또는 막 반응기와 같은 장치의 사용에 의해 재순환되거나 고체상 효소 반응을 위한 고체 담체 상에 고정되는 임의의 표준 과정에서 가용성 효소로서 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 재조합 L-솔보손 탈수소효소 폴리펩타이드의 보조하에 기질을 L-아스코르브산으로 전환시키는 단계를 포함하는 L-아스코르브산의 생산 방법이다. 자연적으로, 즉 비-재조합적으로 이러한 효소를 생산하는 미생물로부터 단리된, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코딩하고 있는 L-솔보손 탈수소효소(SNDHai)의 사용은 본 발명에 또한 포함된다.

기질로서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 SNDHai에 의해 L-아스코르브산으로 전환시킬 수 있는 탄소 원을 사용할 수 있다. 바람직한 기질은 L-솔보스, D-솔비톨 및 L-솔보손으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, L-아스코르브산의 생산 방법은 L-아스코르브산의 생산 방법은 L-솔보스를 L-솔보손으로 전환시키기 위해서 또는 D-솔비톨을 L-솔보손으로 전환시키기 위한 능력을 갖는 숙주 세포에서 L-솔보스 또는 D-솔비톨을 L-아스코르브산으로 전환시키는 단계를 포함한다.

또다른 실시태양에서 L-아스코르브산의 생산 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 재조합 SNDHai의 보조하에 L-솔보손을 L-아스코르브산으로 전환시키는 단계를 포함한다. 자연적으로, 즉 비-조합적으로 이러한 효소를 생산하는 미생물로부터 단리된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 L-솔보손 탈수소효소(SNDHai)가 이러한 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명은 효소(L-솔보손 탈수소효소 SNDHai 또는 그의 부분)를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 단리된 핵산 분자의 중폭을 위해 고안된 방법 및 기법은 당분야에 공지되어 있다. 핵산 분자의 단리, 정제 및 클로닝 뿐만 아니라 진핵생물 및 원핵생물 숙주 및 그안에 핵산 및 단백질 발현의 사용을 기술하는 방법 및 기법은 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능성 유도체는 본 발명의 일부일 수 있고 이러한 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 본 발명의 아미노산 서열을 기준으로 정의되고, 이때 이러한 유도체는 바람직하게 당분야에 공지된 또는 본원에서 구체적으로 기술된 시험에 의해 측정된 L-솔보손 탈수소효소 활성을 여전히 갖는다. 이러한 기능성 유도체를 당분야에서 공지된 화학적인 펩타이드 합성에 의해 또는 당분야의 언급에서 공지된 방법에 의해 본원에서 개시된 바와 같이 DNA 서열을 기준으로 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 분자의 활성이 일반적으로 변화되지 않는 단백질 및 펩타이드에서 아미노산의 교환이 공지되어 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 대상의 보존적인 치환은 다음과 같이 발생한다: 예를 들어 치환, Ala에서 Val/Leu/Ile로, Arg에서 Lys/Gln/Asn로, Asn에서 Gln/His/Lys/Arg로, Asp에서 Glu로, Cys에서 Ser로, Gln에서 Asn로, Glu에서 Asp로, Gly에서 Pro/Ala로, His에서 Asn/Gln/Lys/Arg로, Ile에서 Leu/Val/Met/Ala/Phe/norLeu로, Lys에서 Arg/Gln/Asn으로, Met에서 Leu/Phe/Ile로, Phe에서 Leu/Val/Ile/Ala/Tyr로, Pro에서 Ala로, Ser에서 Thr로, Thr에서 Ser로, Trp에서 Tyr/Phe로, Tyr에서 Trp/Phe/Thr/Ser로 및 Val에서 Ile/Leu/Met/Phe/Ala/norLeu로 치환이 합당하다. 바람직한 예로서, Ala을 Val으로, Arg를 Lys로, Asn에서 Gln로, Asp에서 Glu로, Cys에서 Ser, Gln에서 Asn으로, Glu에서 Asp으로, Gly에서 Ala으로, His에서 Arg으로, Ile에서 Leu으로, Leu에서 Ile으로, Lys에서 Arg으로, Met에서 Leu로, Phe에서 Leu으로, Pro에서 Ala으로, Ser에서 Thr로, Thr에서 Ser로, Trp에서 Tyr로, Tyr에서 Phe로 및 Val에서 Leu로 치환이 합당하다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 변화를 초래하는 경우, 보다 많은 치환 변화 후, 상기 기술된 대표적인 치환이 도입되고 생성물을 스크리닝한다.

달리 언급되지 않는다면, 본원에서 DNA 분자를 서열화함에 의해 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열을 자동 DNA 서열분석기(예컨대, 모델 응용된 생물계 프리즘(PRISM) 310 유전 분석기)를 사용하여 결정하였다. 따라서, 이 자동화된 접근에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해 당분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오타이드 서열은 약간의 오차를 함유할 수 있다. 자동으로 결정된 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로 서열화된 DNA 분자의 실제 뉴클레오타이드 서열에 전형적으로 약 90% 상동성, 보다 전형적으로 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상의 상동성이다. 실제 서열은 당업자에게 공지된 수동의 DNA 서열화 방법을 포함하는 다른 접근에 의해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 실제 서열과 비교시 결정된 뉴클레오타이드 서열에서 단일의 삽입 또는 결실은, 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 예상되는 아미노산 서열이 이러한 삽입 또는 결실의 시작하는 지점에서, 서열화된 DNA 분자에 의해 실제로 코딩된 아미노산 서열과 완전하게 상이할 수 있는 뉴클레오타이드 서열의 전위에서 프레임 이동을 야기할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호 2로서 서열 목록에서 개시된 바와 같은 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 상보 가닥 또는 이들 서열, 그의 DNA 서열 또는 단편을 포함하는 것 및 정확하게 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 대해 코딩된 이러한 서열과 표준 조건 하에서 혼성화하는 DNA 서열에 관한 것이다.

폴리뉴클레오타이드 서열의 유사성을 기술하는 또다른 방식은 이러한 서열이 혼성화되거나 또는 혼성화되지 않는가에 따라서 결정된다. 이는 혼성화를 위해 선택되는 조건에 따른다.

혼성화를 위한 표준 조건은 본원에서 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 구구체적인 혼성화 신호를 검출하거나 바람직하게는 당업자에 의해 "엄중한 혼성화 조건"으로 지칭되는 이러한 조건을 의미한다. 따라서, 본원에서와 같이 용어 "엄중한 혼성화 조건"은 혼성화가 서열 사이에 약 95%, 바람직하게는 97% 이상 상동성이 있을 경우 발생하는 것을 의미한다. 엄중한 혼성화 조건은 예를 들어 딕이지하이브(DigEasyHyb) 용액(로슈 다이아그노스틱 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))과 같은 용액중 연어 정자 DNA 100㎍과 함께 또는 없이 딕옥시게닌(DIG)-표지된 DNA 탐침(바람직하게 DIG 표지 시스템을 사용하여 제조됨; 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 68298 만하임) 또는 50% 포르말린, 5 x SSC(150mM NaCl, 15mM 삼나트륨 시트레이트), 0.02% 나트륨 도데실 설페이트, 0.1% N-라우로일살코신 및 2% 블로킹 제제(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)를 사용하여 42℃에서2시간 내지 4일동안 배양한 후 여과기를 2 X SSC 및 0.1% SDS로 5 내지 15분 동안 실온에서 세척한 후 0.5 X SSC 및 0.1% SDS 또는 0.1% SSC 및 0.1% SDS에서 65 내지 68℃에서 15 내지 30분동안 2회 세척한다.

하나의 실시태양에서, L-솔보손 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자, 발현 벡터 및 본 발명에서 사용되는 재조합 유기체를 함유하는 핵산 분자를 다음 단계에 의해 수득할 수 있다:

(1) 사용되는 트랜스포손에 의해 코딩되는 항생제 저항성을 표현하는 집락을 수득하여 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하는 글루코노박터 또는 아세토박터 속에 속하는 균주에서 하기에서 기술된 바와 같이 트랜스포손 돌연변이유발;

(2) 기질로서 L-솔보손으로 스크리닝하는 L-아스코르브산 비-생산 돌연변이의 선별;

(3) 돌연변이로부터 염색체 DNA의 단리;

(4) 집락-, 플라크- 또는 서던-혼성화, PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 등에 의해 염색체 DNA로부터 트랜스포손을 함유하는 DNA 단편의 클로닝;

(5) 트랜스포손 삽입을 함유하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 결정;

(6) L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하는 모체 균주로부터 DNA 단편의 클로닝;

(7) L-솔보손 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 효과적인 발현될 수 있는 발현 벡터의 구축;

(8) 숙주 세포 내로 DNA를 도입하는 적합한 방법, 예를 들어 형질전환, 형질도입, 접합 전달 및/또는 전기천공에 의해 L-솔보손 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 갖는 재조합 유기체의 구축(숙주 세포가 이에의해 본 발명의 재조합 유기체가 됨).

트랜스포손 돌연변이유발은 유전 분석을 위한 잠재적인 도구로서 공지되어 있다(문헌[P. Gerhardt et al., "Methods for General and Molecular Bacteriology" Chapter 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology]).

다양한 트랜스포손은 당분야에 공지되어 있고, 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, TnlO, 파지 Mu 등이다. 이들중, Tn5는 거의 삽입 특이성을 갖지 않고 크기가 상대적으로 작은 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 실행에서 무작위 돌연변이유발에서 사용하는 목적을 위해서, Tn5가 바람직하다. 미니-Tn5로 지칭되고, 항생제 저항성 또는 다른 선택적인 표지자 유전자와 커플링되는 전위를 위해 요구되는 Rn5 역 반복으로 구성된, 다양한 Tn5 유도체가 본 발명에서 또한 유용하다. 이러한 미니-Tn5는 자살 벡터, 추가로 Tn5 트랜스포사제(tnp)에 삽입하여 효과적인 Tn5 돌연변이유발 시스템을 구축한다.

트랜스포손으로 무작위 돌연변이유발은 예를 들어 형질전환, 형질도입, 접합 교배 또는 전기천공에 의해 자살 플라스미드 또는 파지 벡서를 사용함에 의해 목적 세균 세포내로 트랜스포손의 도입을 포함한다. 생성된 돌연변이는 트랜스포손에 의해 전달되는 표시자의 도움으로 스크리닝될 수 있다. 수용체 세균의 게놈내로 트랜스포손의 전위는 사용되는 벡터가 분리에 의해 손실된 후 검출될 수 있다.

글루코노박터 또는 아세토박터 속의 미생물내로 트랜스포손의 도입을 위해서, 예를 들어 소위 파지 P1의 유도체 및 좁은-숙주-범위 플라스미드, 예컨대 ColE1 복제 기점을 갖는 pBR325의 유도체가 통상적으로 사용된다. 파지 P1 벡터 및 플라스미드 벡터를 감염에 의해 및 형질전환, 접합 교배 또는 전기천공, 각각에 의해 수용체 세포내로 전달할 수 있고, 이때 이들 벡터는 바람직하게 적합한 복제 기점이 부족하다. 사용되는 자살 벡터 및 트랜스포손의 선택은 예를 들어 파지 감수성, 수용체 세포의 내인성 항생제 저항성, 형질전환, 접합 전달, 전기천공, 또는 트랜스포손-갖는 벡터를 에세리키아 콜라이내로 도입하는 감염을 포함하는 유전자 전달 시스템의 이용성을 포함하는 기준에 따른다.

본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 벡터의 하나는 예를 들어 글루코노박터 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물내로 자신의 DNA를 주입하는 파지 P1(ATCC 25404)이지만 이 DNA는 복제가능하지 않고 분리에 의해 소실될 수 있다. Tn5(P1::Tn5)를 갖는 이러한 P1 파지는 공지된 과정에 따른 P::Tn5를 갖는 에세리키아 콜라이를 용균시켜 제조될 수 있는 파지 용해질의 형태로 사용될 수 있다(예를 들어 문헌["Methods for General and Molecular Bacteriology" Chapter 17, Transposon Mutagenesis; American Society for Microbiology, 1992] 또는 미국 특허 제 5082785 호를 참조하시오).

결손된 돌연변이가 진정으로 트랜스포손을 가짐을 확신하기 위해서, 예를 들어 집락- 또는 서던-혼성화와 같은 방법이 표준 방법(문헌[Molecularcloning, a laboratory manual second edition, Maniatis T., et al., 1989])에 의해서 탐침으로서 사용되는 트랜스포손을 함유하는 표지된-DNA 단편으로 수행될 수 있다.

이러한 돌연변이를 본 발명의 실시예 5에서 기술된 바와 같이 단리하였다. 트랜스포손 돌연변이는 L-솔보손 탈수소효소를 코딩하는 표적 유전자를 추가로 확인하고 트랜스포손으로 표지된 영역의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 유용할 수 있다.

트랜스포손 삽입물을 함유하는 DNA 단편을 임의의 에세리키아 콜라이 클로닝 벡터, 바람직하게는 pUC18, pUC19, pBluscript II KS+(유럽 스트레타진(Stratagene)) 및 이들의 상대물으로 벡터 및 트랜스포손의 선백 표지자의 표현형 둘다를 나타내는 형질전환체를 선별함에 의해 클로닝할 수 있다. 트랜스포손에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 공지된 서열 방법에 의해 결정할 수 있다.

다르게는, 상기 L-솔보손 탈수소효소 폴리펩타이드를 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하는 균주로부터 정제하고, 목적 유전자를 하기 예시적인 방법에 의해 총 염색체 DNA로부터 플라스미드 또는 파지 벡터내에 클로닝할 수 있다:

(i) 부분적인 아미노산 서열을 정제된 단백질 또는 그의 펩타이드 단편으로부터 예를 들어 기질 보조된 레이저 흡착/이온화(말디(MALDI))에 의해 결정할 수 있다. 이러한 전체적인 단백질 또는 펩타이드 단편을 이러한 전체적인 단백질의 단리에 의해 또는 SDS-폴리아클릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 후 겔로부터 펩티다제-처리에 의해 제조할 수 있다. 따라서 수득된 단백질 또는 그의 단편을 또한 응용된 생물계 자동 기체-상 서열분석기 470A와 같은 단백질 서열분석기에 적용할 수 있다. 아미노산 서열을 예를 들어 응용된 생물계 자동 DNA 서열분석기 381A와 같은 DNA 합성기로 올리고뉴클레오타이드 탐침 및/또는 시발체를 고안하고 제조하는데 이용할 수 있다. 예를 들어 서던-, 집락- 또는 플라크-혼성화에 의해 목적 유전자를 갖는 균주의 유전자 라이브러리로부터 목적 유전자를 갖는 클론을 단리하기 위해서 탐침을 사용할 수 있다.

(ii) 추가로 다르게는, 유전자 라이브러리로부터 표적 단백질을 발현하는 클론을 선별하는 목적을 위해서, 예를 들어 표적 단백질에 대해서 제조된 항체와 함께 면역학적 방법을 적용할 수 있다.

(iii) 표적 유전자의 DNA 단편을 시발체의 한 세트, 즉 상기에서 결정된 아미노산 서열에 따라서 합성된 2개의 올리고뉴클레오타이드로 PCR에 의해 총 염색체 DNA로부터 증폭할 수 있다. 이어서, 전체 유전자를 갖는 클론을 예를 들어 에세리키아 콜라이에서 예를 들어 서던-, 집락- 또는 플라크-혼성화에 의해 탐침으로서 상기에서 수득된 PCR 생성물을 사용하여 유전자 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

당분야에 공지된 방법에 의해 이에서 개시된 DNA 서열을 기준으로 고안된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제작될 수 있는 DNA 서열이 또한 본 발명의 목적이다.

상술된 항체를 정제된 L-솔보손 탈수소효소 단백질, 정제된 재조합 L-솔보손 탈수소효소 단백질, 예컨대 에세리키아 콜라이에서 표현된 히스티딘-표지된-L-솔보손 탈수소효소 또는 항원으로서 그의 펩타이드 단편과 함께 제조할 수 있다. L-솔보손 탈수소효소의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 폴리펩타이드 서열은 항체의 제조를 위해 항원으로 사용될 수 있다.

목적 유전자를 갖는 클론을 수득한 경우, 표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다.

목적 유전자/뉴클레오타이드 서열을 효과적으로 발현하기 위해서, 다양한 프로모터가 예를 들어 유전자의 원래 프로모터, 예를 들어 항생제 저항성 유전자, 예컨대 Tn5의 가나마이신 저항성 유전자, pBR322의 암피실린 저항성 유전자 및 에세리키아 콜라이의 베타-갈락토시다제의 프로모터(lac), trp-, trc-프로모터, 람다 파지의 프로모터 및 숙주 세포에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 이 목적을 위해서, 숙주 세포를 세균 세포, 인간 세포를 포함하는 동물 세포, 효모 세포를 포함하는 곰팡이 세포 및 식물 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 생체내에서 활성 형태로서 L-솔보손 탈수소효소를 발현할 수 있는 세균, 특히 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 및 에세리키아 속의 세균에 속한다.

발현을 위해서, 다른 조절 요소, 예컨대 숙주 세포(코딩 서열을 도입하여 본 발명의 재조합 세포를 제공함)에서 조작가능한 사인-달가노(SD) 서열(예를 들어, AGGAGG 및 숙주 세포에서 조작될 수 있는 천연 및 합성 서열을 포함함) 및 전사 종결자(임의의 천연 및 합성 서열을 포함하는 역 반복 구조)를 상기에서 기술된 프로모터와 사용할 수 있다.

광범위한 숙주/클로닝 벡터 조합을 이중 나선 DNA를 클로닝하는데 사용할 수 있다. 에세리키아 콜라이에서 본 발명의 유전자, 즉 SNDHai 유전자의 발현을 위한 바람직한 벡터는 에세리키아 콜라이에서 주로 사용되는 임의의 벡터, 예컨대 히스티딘-표지된 재조합 단백질(큐아젠 아게(QIAGEN), 스위스)을 발현할 수 있는 pQE 벡터, pBR322 또는 예를 들어 pUC18 및 pBluescript II(스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning), 미국 캘리포니아주), pACYC177 및 pACYC184 및 그의 유도체 및 광범위한 숙주 범위 플라스미드, 예컨대 RK2 및 RSF1010로부터 유도된 벡터로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 글루코노박터, 아세토박터 및 슈도모나스를 포함하는 세균에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 표현을 위한 바람직한 벡터는 글루코노박터, 아세토박터 또는 슈도모나스 뿐만 아니라 에세리키아 콜라이와 같은 바람직한 클로닝 유기체에서 복제할 수 있는 임의의 벡터로부터 선택된다. 바람직한 벡터는 넓은-숙주-범위 벡터, 예컨대 pVK100과 같은 코스미드 벡터 및 그의 유도체 및 RSF1010이다. 벡터의 복제수 및 안정성은 클로닝된 유전자의 안정성 및 효과적인 발현을 위해서 및 클로닝된 유전자를 갖는 숙주 세포에서 효과적인 배양을 위해서 주의깊게 고려되어야한다. 예를 들어 전위 유전 단위, 예컨대 Tn5를 함유하는 핵산 분자를 벡터로서 또한 사용하여 목적 유전자를 바람직한 숙주, 특히 염색체내로 도입할 수 있다. 본 발명의 SNDHai 유전자와 함께 바람직한 숙주로부터 단리된 임의의 DNA를 함유하는 핵산 분자는 또한 이 유전자를 바람직한 숙주 세포, 특히 염색체내로 도입하는데 유용할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 임의의 통상적인 방법, 예를 들어 형질전환, 형질도입, 접합 교배 또는 전자천공을 적용함에 의해 바람직한 숙주내로 전달 할 수 있고, 이는 숙주 세포 및 핵산 분자의 특성을 고려하여 당업자에게 공지된다.

본 발명에서 제공된 L-솔보손 탈수소효소 유전자/뉴클레오타이드 서열을 조절 영역, 예컨대 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 당분야에 공지된 방법에서 상기 기술된 숙주 세포에서 조작가능한 전사 종결자를 함유하는 적합한 벡터와 연결하여 발현 벡터를 제작할 수 있다.

발현 벡터를 갖는 재조합 미생물을 구축하기 위해서, 예를 들어 형질전환, 형질도입, 접합 교배, 다양한 유전자 전달 방법을 사용할 수 있다. 재조합 세포를 구축하는 방법은 분자 생물학의 분야에서 공지된 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 형질전환 시스템은 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 또는 에세리키아를 사용할 수 있다. 형질도입 시스템은 또한 에세리키아 콜라이를 사용할 수 있다. 접합 교배 시스템은 광범위하게 에세리키아 콜라이, 슈도모나스 푸티다 및 글루코노박터를 포함하는 그람-양성 및 그람-음성 세균을 광범위하게 사용할 수 있다. 접합 교배의 예는 제 WO 89/06,688 호에 개시되어 있다. 접합은 예를 들어 액체 배지 또는 고체 표면에서 발생할 수 있다. SNDHai를 생산하기 위한 수용체의 예는 예를 들어 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 또는 에세리키아의 미생물을 포함한다. 접합 교배를 위한 수용체에서, 선택적인 표시자를 첨가할 수 있고; 예를 들어 날리딕산 또는 리팜피신에 대한 저항성을 주로 선택한다. 자연적 저항성을 또한 사용하고, 예를 들어 폴리믹신 B에 대한 저항성은 많은 글루코노박터에 대해서 유용하다.

본 발명은 재조합 L-솔보손 탈수소효소(SNDHai)를 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 L-솔보손 탈수소효소 유전자를 상기에서 기술된 숙주 세포내에 도입함에 의해 L-솔보손 탈수소효소의 제조 수율을 증가시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 또는 에세리키아로 구성된 군에서 선택되는 숙주 세포에서 본 발명의 L-솔보손 탈수소효소 유전자를 사용하여 L-솔보손 탈수소효소 단백질을 생산한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 바와 같은 SNDHai를 발현할 수 있는 미생물을 호기 조건 하에서 적합한 영양분을 공급한 수성 배지에서 배양할 수 있다. 배양을 회분식, 공급-회분식, 반-연속식 또는 연속식 방식으로 구축할 수 있다. 배양 기간은 예를 들어 목적 폴리펩타이드의 발현을 위해 사용되는 숙주, pH, 온도 및 사용되는 영양 배지에 따라서 다양할 수 있고, 회분식 또는 공급-회분식 방식으로 가동할 때 바람직하게 약 1 내지 약 10일이다. 배양을 예를 들어 약 4.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 수행할 수 있다. 배양을 수행하기 위한 바람직한 온도 범위는 약 13℃ 내지 약 36℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 33℃이다. 주로, 배양액은 동화할 수 있는 탄소 원, 예를 들어 글리세롤, D-만니톨, D-솔비톨, L-솔보스, 에리트리톨, 리비톨, 자일리톨, 아라비톨, 이노시톨, 둘시톨, D-리보스, D-프락토스, D-글루코스 및 수크로스, 바람직하게는 D-솔비톨, D-만니톨 및 글리세롤; 및 소화가능한 질소 원, 예컨대 유기 물질, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 제빵용 효모, 유레아, 아미노산 및 옥수수 담금 액으로서 이러한 양분을 함유할 수 있다. 다양한 무기 물질을 질소 원으로서, 예를 들어 나이트레이트 및 암모늄 염을 또한 사용할 수 있다. 게다가, 배양액을 주로 무기 염, 예를 들어 황산 마그네슘, 황산 망간, 인산 칼륨 및 탄산 칼슘을 함유할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 SNDHai를 포함하는 숙주를 사용하는 기질로부터 비타민 C의 생산 방법은 성장하는 세포, 즉 예를 들어 0.02시간^-1 이상인 세포의 비성장 속도에서 수행된다.

본 발명의 하나의 실시태양은 비타민 C의 생산을 위한 본원에서 개시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단리된 SNDHai의 용도이다. 배양 후 미생물로부터 SNDHai의 단리 및 정제를 위해서, 미생물의 세포를 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 액체 배양액으로부터 수집할 수 있다. 수집된 세포를 예를 들어 물, 생리 식염수 또는 적합한 pH를 갖는 완충 용액으로 세척할 수 있다. 세척된 세포를 적합한 완충 용액중에 현탁시키고, 예를 들어 균질화기, 초음파기, 프렌치 프레스에 의해 또는 라이소좀 등으로 처리하여 파쇄시켜 파쇄된 세포의 용액을 수득할 수 있다. L-솔보손 탈수소효소를 세포가 없는 추출물 또는 파쇄된 세포로부터, 바람직하게는 막 분획으로부터, 바람직하게는 표준 방법에 의해, 예컨대 초원심분리, 적합한 세정제를 사용하는 분별 가용화, 염 또는 다른 적합한 제제에 의한 침전, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 또는 결정화에 의해서 단리 및 정제할 수 있다. 재조합 L-솔보손 탈수소효소가 표지된 폴리펩타이드, 예컨대 히스티딘-표지 폴리펩타이드로서 생산될 때, 친화성 수지, 예컨대 니켈 친화성 수지로 정제할 수 있다. L-솔보손 탈수소효소의 정제는 예를 들어 인공 전자 수용체, 예컨대 나이트로블루테트라졸륨 클로라이드(NBT) 및 페나진 메토설페이트, 2,6-다이클로로페놀 인도페놀(DCIP), 페리시아니드 또는 시토크롬 c를 사용하여 광도측정법으로 검사할 수 있다.

본원에서 기술된 SNDHai의 도움으로 L-아스코르브산의 생산은 본 발명에 의해 제공된다. SNDHai를 위한 원료는 중요하지 않다. 이 방법은 예를 들어 자연적으로 상기 미생물로부터, 본 발명의 SNDHai 유전자를 갖는 상기에서 기술된 바와 같이 재조합 유기체를 단리하는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 SNDHai로부터 활성 SNDHai 효소를 발현할 수 있는 미생물을 사용하여 또는 막 분획, 가용성 또는 생촉매로서 작용하는 고정된 효소의 형태로 천연 및/또는 재조합 SNDHai를 사용하여 L-솔보손을 L-아스코르브산으로 다음에서 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. SNDHai의 단리 및 정제를 위한 상기 기술된 방법을 천연 및 재조합 SNDHai 둘다에 대해 사용할 수 있다.

L-솔보손으로부터 L-아스코르브산의 생산을 위해 사용된 재조합 유기체는 상기에서 기술된 바와 같이 배양될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 유기체가 본 발명의 L-솔보손 탈수소효소 유전자를 갖는 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 및 에세리키아로 구성된 군에서 선택된다. 재조합 미생물을 상기에서 기술된 바와같은 동일한 조건 하에서 배양할 수 있다. L-아스코르브산의 생산을 위해 사용되는 재조합 유기체가 상기 기술된 임의의 탄소 원을 L-솔보손으로 전환시킬 수 없는 경우, 이후에 L-솔보손은 L-아스코르브산의 생산을 위해 전구체로서 사용되는 매질에 첨가되어야한다. 반응 기간은 pH, 온도 및 사용되는 반응 온도에 따라서 다양하고, 회분식 또는 공급-회분 방식으로 가동될 때 바람직하게 약 1 내지 약 10일이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 SNDHai, 재조합체 또는 천연으로서, 즉 단리된 비-재조합 효소를 상기 기술된 바와 같은 배양액으로부터 정제하고 당업자에게 공지된 임의의 공정 방식, 예컨대 회분식, 공급-회분식, 반-연속식 또는 연속식으로 L-솔보손을 L-아스코르브산으로 전환시키는 생촉매로서 가용성 또는 고정된 효소의 형태로 사용한다. 정제된 L-솔보손 탈수소효소는 예를 들어 막 장치에 의해 반응 용기에 유지되는 가용성 형태로서 또는 임의의 고체상, 예컨대 다공성 또는 중합체성 기질에서 고정된 효소로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소는 하나 이상의 작용기를 갖는 수지의 막, 과립 등에 직접 결합할 수 있거나 하나 이상의 작용기, 예를 들어 글루타르알데하이드를 갖는 가교 화합물을 통하여 수지에 결합할 수 있다. 가용성, 유지되거나 고정된 형태중에 정제된 효소를 사용하는 반응은 예를 들어 호기 조건 하에서 L-솔보손 및 다른 적합한 양분을 함유하는 수성 매질에서 발생할 수 있다. 반응 매질은 예를 들어 무기 염, 예를 들어 황산 마그네슘, 인산 칼륨 및 탄산 칼슘을 함유할 수 있다. 반응은 pH 약 4.0 내지 약 9.0에서, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.0에서 수행될 수 있다. 반응을 수행하기 위한 바람직한 온도는 약 13℃ 내지 약 36℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 33℃이다.

본 발명에 사용할 수 있는 미생물은 상이한 원료로부터, 예를 들어 독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 베크 1베 소재의 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ), 2003년 5월 12일에 미국 버지니아주 20108 마나사스 피오 박스 1549 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC) 또는 일본 292-0818 시바 키사라주시 카주사카마타리 2-5-8 나이트(NITE) 생물 자원 센터의 컬처 컬렉션 디비즌(Culture Collection Division)(공식적으로: 일본 오사가 532-8686 요도가와구 주소-혼마치 2-초메 17-85 소재의 인스티튜트 포 퍼멘테이션, 오사카(Institute for Fermentation, Osaka, IFO))으로부터 공개적으로 이용가능할 수 있다. IFO로 기탁된 바람직한 세균의 예는 예를 들어 글루코노박터 옥시단스(공식적으로 글루코노박터 멜라노게누스(melanogenus)로서 공지됨) IFO 3293, 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 멜라노게누스로서 공지됨) IFO 3292, 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 루비기노수스(rubiginosus)로서 공지됨) IFO 3244, 글루코노박터 프라테우리(공식적으로, 글루코노박터 인더스트리우스(industrius)로서 공지됨) IFO 3260, 글루코노박터 세리누스 IFO 3266, 글루코노박터 옥시단스 IFO 3287 및 1954년 4월 5일에 모두 기탁된 아세토박터 아세티 아종 올레아누스(orleanus) IFO 3259; 1975년 10월 22일에 기탁된 아세토박터 아세티 아종 자일리늄(xylinum) IFO 13693 및 1977년 12월 8일에 기탁된 아세토박터 아세티 아종 자일리늄 IFO 13773이다. 또한, 바람직한 세균의 예인 균주 아세토박터 종 ATCC 15164는 ATCC로 기탁되었다. 바람직한 세균의 또다른 예로서 균주 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 멜라노게누스로서 공지됨) N44-1은 균주 IFO 3293의 유도체이고 수기사와(Sugisawa) 등의 문헌[Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990]에서 기술되어 있다.

또한, 상술된 미생물은 원핵생물의 명명법의 국제 규칙에 의해 정의된 바와 같이 동일한 생리학적 특성을 갖는 이러한 종의 동의어 또는 기본명을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 제시된 탄소 원을 비타민 C로 전환시킬 수 있는 미생물의 휴지기 세포를 사용하여 높은 수율로 L-아스코르브산을 생산하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.

직접적인 L-아스코르브산 생산은 상이한 배양 방법을 사용하여 몇가지 미생물에서 보고되었다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 생성물의 불안정성 때문에 생산된 비타민 C의 낮은 수율이다. 예를 들어, 2-케토-L-굴론산(2-KGA) 및 비타민 C 둘다를 생산할 수 있는 것으로 공지된 미생물을 사용하여, 미생물에 의해 생산된 비타민 C의 수율은 상기 미생물에 의해 보다 용이하게 합성될 수 있는 2-KGA의 상대적으로 높은 생산에 의해 제한되고, 0.1 미만인 비타민 C 대 2-KGA 사이의 농도 비를 초래한다. 따라서, 종래에 기술된 방법과 같이 보다 높은 수율을 얻을 수 있는 비타민 C의 미생물 생산을 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다.

놀랍게도, 본원에서 기질을 비타민 C로 직접 전환을 수행할 수 있는 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 방법이 비타민 C의 보다 높은 수율을 초래하는 것을 관찰하였다.

특히, 본 발명은 미생물의 휴지기 세포를 포함하는 매질에서 기질을 비타민 C로 전환시키는 단계를 포함하는 비타민 C의 생산을 위한 방법을 제공한다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법을 위한 기질로서 L-아스코르브산으로 전환시킬 수 있고 D-글루코스 또는 D-솔비톨 대사 경로, 예컨대 D-글루코스, D-솔비톨, L-솔보스, L-솔보손, 2-케토-L-글루코네이트, 2-케토-D-글루코네이트 또는 2,5-다이케토-글루코네이트로부터 용이하게 수득할 수 있는 탄소 원을 사용할 수 있다. 추가로 가능한 기질을 갈락토스일 수 있다. 바람직하게, 기질은 예를 들어 D-글루코스, D-솔비톨, L-솔보스 또는 L-솔보손, 보다 바람직하게는, D-글루코스, D-솔비톨 또는 L-솔보스, 가장 바람직하게는 D-솔비톨 또는L-솔보스로부터 선택될 수 있다. 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서 용어 "기질" 및 "생산 기질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서 기질을 비타민 C로 전환은 비타민 C로부터 초래되는 기질의 전환이 미생물에 의해 수행되고, 즉 기질이 직접 비타민 C로 전환될 수 있다. 상기 미생물은 상기 정의된 바와 같은 기질로부터 이러한 전환을 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법을 위한 본원에서 사용되는 매질은 비타민 C의 생산을 위한 임의의 적합한 매질일 수 있다. 전형적으로, 매질은 예를 들어 염, 기질 및 특정한 pH를 포함하는 수성 매질이다. 기질이 비타민 C로 전환되는 매질은 또한 생산 매질로서 지칭된다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 기질을 비타민 C로 전환을 수행할 수 있는 임의의 미생물은 예컨대 야생형으로서 효모, 조류 또는 세균, 고전적인 돌연변이유발 및 선별 방법에 의해 유도되는 돌연변이 균주 또는 재조합 균주를 사용할 수 있다. 이러한 효모의 예는 칸디다, 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 시조사카로마이세스(Scyzosaccharomyces) 또는 클루이버로마이세스(Kluyveromyces)일 수 있다. 이러한 조류의 예는 클로렐라(Chlorella)일 수 있다. 이러한 세균의 예는 글루코노박터, 아세토박터, 케토글로니시게늄(Ketogulonicigenium), 판토에아(Pantoea), 크립토코커스(Cryptococcus), 슈도모나스, 예컨대 슈도모나스 푸티다 및 에세리키아, 예컨대 에세리키아 콜라이일 수 있다. 글루코노박터 또는 아세코박터 아세티, 예컨대 글루코노박터 옥시단스, 글루코노박터 프라테우리, 아세토박터 아세티 아종 자일리늄 또는 아세토박터 아세티 아종 올레아누스가 바람직하다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련하여, 본 발명에서 사용할 수 있는 미생물은 상이한 원료로부터, 예를 들어 본 발명에 사용할 수 있는 미생물은 상이한 원료, 예를 들어 독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 베크 1베 소재의 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ), 2003년 5월 12일에 미국 버지니아주 20108 마나사스 피오 박스 1549 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 또는 일본 292-0818 시바 키사라주시 카주사카마타리 2-5-8 나이트(NITE) 생물 자원 센터의 컬처 컬렉션 디비즌(공식적으로: 일본 오사가 532-8686 요도가와구 주소-혼마치 2-초메 17-85 소재의 인스티튜트 포 퍼멘테이션, 오사카(Institute for Fermentation, Osaka, IFO))으로부터 공개적으로 이용가능할 수 있다. IFO로 기탁된 바람직한 세균의 예는 예를 들어 글루코노박터 옥시단스(공식적으로 글루코노박터 멜라노게누스로서 공지됨) IFO 3293, 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 멜라노게누스로서 공지됨) IFO 3292, 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 루비기노수스로서 공지됨) IFO 3244, 글루코노박터 프라테우리(공식적으로, 글루코노박터 인더스트리우스로서 공지됨) IFO 3260, 글루코노박터 세리누스 IFO 3266, 글루코노박터 옥시단스 IFO 3287 및 1954년 4월 5일에 모두 기탁된 아세토박터 아세티 아종 올레아누스 IFO 3259; 1975년 10월 22일에 기탁된 아세토박터 아세티 아종 자일리늄 IFO 13693 및 1977년 12월 8일에 기탁된 아세토박터 아세티 아종 자일리늄 IFO 13773이다. 또한, 바람직한 세균의 예인 균주 아세토박터 종 ATCC 15164는 ATCC로 기탁되었다. 바람직한 세균의 또다른 예로서 균주 글루코노박터 옥시단스(공식적으로, 글루코노박터 멜라노게누스로서 공지됨) N44-1은 균주 IFO 3293의 유도체이고 수기사와 등의 문헌[Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990]에서 기술되어 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 상술된 미생물은 또한 원핵생물의 명명법의 국제 규칙에 의해 정의된 바와 같이 동일한 생리학적 특성을 갖는 이러한 종의 동의어 또는 기본명을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용된 바와 같은 미생물의 명명법은 원핵생물의 계통학에서 국제 위원회 및 미생물 학회의 국제 단체의 세균학 및 응용 미생물 분야에 의해 공식적으로 채택되고(우선권 출원의 출원일에) 및 계통학 및 환경 미생물학의 국제 저널(IJSEM)의 공식 출판 수단에 의해 출판된다. 특정 참조는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025를 케토글로니시메늄 불가레(Ketogulonicigenium vulgare)로 분류학적 재분류를 기술하는 문헌[IJSEM(2001) vol 51: 1231-1233]에 교정 공고하면서, 울반스(Urbance) 등의 문헌[IJSEM(2001) vol 51: 1059-1070]에서 시작한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 휴지기 세포는 예를 들어 생육가능하지만 활발한 성장이 없거나 낮은 비성장 속도[μ], 예를 들어 0.02시간^-1 미만, 바람직하게는 0.01시간^-1 미만인 성장 속도의 미생물의 세포를 지칭한다. 상기 성장 속도를 나타내는 세포는 "휴지기 세포 방식"으로 지칭한다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기와 같은 본 발명의 방법은 상이한 단계 또는 상에서 수행되고, 바람직하게 미생물을 성장할 수 있는 조건 하에서 제 1 단계(또한 단계 a 또는 성장 상으로 지칭됨)에서 배양한다. 이 상은 미생물의 성장 속도가 감소되는 조건으로 변화시킴에 의해 종결되고 휴지기 세포를 초래하고 또한 단계 b로서 치징되며, 이후에 단계 b의 휴지기 세포를 사용하여 기질로부터 비타민 C의 생산에 의해서 생산 상으로서 또한 지칭한다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법에서 수행된 바와 같은 성장 및 생산 상은 동일한 용기에서, 즉 단지 하나의 용기 또는 2개 이상의 상이한 용기에서, 2개의 상 사이에 선택적인 세포 분리 단계와 함께 수행될 수 있다. 생산된 비타민 C를 임의의 적합한 수단에 의해 세포로부터 회수할 수 있다. 예를 들어 비타민 C를 생산하는 회수 수단은 생산 매질로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 따라서 생산된 비타민 C를 추가로 가공할 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법에 관련해서 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "성장 상", "성장하는 단계", "성장 단계" 및 "성장 기간"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "생산 상", "생산 단계" 및 "생산 기간"에 대해서 동일하게 적용된다.

본 발명의 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법을 수행하는 하나의 방법은 미생물이 제 1 용기, 소위 성장 용기에서 휴지기 세포를 위한 원료로서 성장하고, 세포의 적어도 일부가 제 2 용기, 소위 생산 용기로 옮겨지는 방법일 수 있다. 생산 용기에서 조건은 성장 용기로부터 옮겨진 세포가 상기 정의된 바와 같은 휴지기 세포가 되는 이러한 조건일 수 있다. 비타민 C를 제 2 용기에서 생산하고 이로부터 회수한다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 하나의 양태에서 성장 단계는 수성 배지, 즉 호기적인 조건 하에서 성장을 위한 적합한 양분을 공급하는 성장 배지에서 수행된다. 배양을 예를 들어 회분식, 공급-회분식, 반-연속식 또는 연속식 방식으로 수행할 수 있다. 배양 기간은 세포의 종류, pH, 온도 및 사용되는 양분 배지에 따라서 다양할 수 있고, 미생물에 따라서 회분식 또는 공급-회분식 방식으로 가동할 때 예를 들어 약 10시간 내지 약 10일, 바람직하게는 약 1 내지 약 10일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 5일일 수 있다. 세포가 연속식 방식으로 성장될 때, 잔류 시간은 예를 들어 미생물에 따라서 약 2 내지 약 100시간, 바람직하게는 약 2 내지 약 50시간일 수 있다. 미생물이 세균으로부터 선택되는 경우, 배양은 예를 들어 pH 약 3.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 4.0 내지 약 9.0, 보다 바람직하게는 약 4.0 내지 약 8.0, 보다 훨씬 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.0에서 실행할 수 있다. 조류 또는 효모를 사용하는 경우, 배양은 예를 들어 pH 약 7.0 미만, 바람직하게는 약 6.0 미만, 보다 바람직하게는 약 5.5 미만, 가장 바람직하게는 약 5.0 미만에서 실행할 수 있다. 세균을 사용하는 배양을 수행하는데 적합한 온도 범위는 예를 들어 약 13℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 37℃, 보다 바람직하게는 약 13℃ 내지 약 36℃, 가장 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 33℃일 수 있다. 조류 또는 효모를 사용하는 경우, 배양을 수행하는 적합한 온도 범위는 예를 들어 약 15℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 20℃, 내지 약 45℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃, 보다 훨씬 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 38℃, 가장 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 38℃이다. 성장을 위한 배양액은 주로 동화할 수 있는 탄소 원, 예를 들어 글리세롤, D-만니톨, D-솔비톨, L-솔보스, 에리트리톨, 리비톨, 자일리톨, 아라비톨, 이노시톨, 듈시톨, D-리보스, D-프락토스, D-글루코스 및 수크로스, 바람직하게는 L-솔보스, D-글루코스, D-솔비톨, D-만니톨 및 글리세롤; 소화가능한 질소 원, 예컨대 유기 물질, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물 및 아미노산과 같은 이러한 양분을 함유한다. 배지는 유레아 및/또는 옥수수 담금 액 및/또는 제빵용 효모를 첨가하거 첨가하지 않을 수 있다. 다양한 무기 물질은또한 질소 원, 예를 들어 나이트레이트 및 암모늄 염으로서 사용될 수 있다. 게다가, 성장 배지는 주로 무기 염, 예를 들어 황산 마그네슘, 황산 망간, 인산 칼륨 및 탄산 칼슘을 함유할 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 성장 상에서 비성장 속도는 예를 들어 0.02시간^-1 이상이다. 회분식, 공급-회분식 또는 반-연속식 방식으로 성장하는 세포에 대해서, 성장 속도는 예를 들어 성장 배지의 조성물, pH, 온도 등에 따른다. 일반적으로, 성장 속도는 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.2시간^-1, 바람직하게는 약 0.06 내지 약 0.15시간^-1, 가장 바람직하게는 약 0.07 내지 약 0.13시간^-1의 범위일 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법의 또다른 양태에서, 휴지기 세포는 따라서 성장 용기로서 제공되고, 필수적으로 동일한 조건, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 배양 기간, pH, 온도, 양분 배지를 추가의 한천 한천과 사용하는 한천 플레이트 상에 각각의 미생물의 배양에 의해서 제공될 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 성장 및 생산 상이 1개의 분리된 용기에서 수행되는 경우, 이어서 성장 상으로부터의 세포가 수집되거나 농축되고 제 2 용기인 소위 생산 용기로 옮겨질 수 있다. 이 용기는 세포에 의해 L-아스코르브산으로 전환시킬 수 있는 임의의 적용가능한 생산 기질을 공급하는 수성 매질을 함유할 수 있다. 성장 용기로부터 세포를 임의의 적합한 조작, 예컨대 원심분리, 막 통과 초여과 또는 미세여과, 여과, 붓기, 응집에 의해 수집하거나 농축할 수 있다. 따라서 수득된 세포를 또한 수집, 농축 또는 세척 없이, 즉 세포 현탁액의 형태로 성장 용기로부터 본래 배양액의 형태로 생산 용기에 옮길 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포를 과정-사이에 임의의 세척 또는 단리 단계 없이 세포 현탁액의 형태로 성장 용기로부터 생산 용기로 옮긴다.

따라서, 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 방법의 단계 a 및 c는 임의의 세척 및/또는 분리 단계에 의해서 분리되지 않는다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 성장 및 생산 상이 동일한 용기에서 수행되는 경우, 세포는 목적 세포 밀도로 적합한 조건 하에서 성장한 후 성장 배지를 생산 물질을 함유하는 생산 배지로 교환함에 의해 성장할 수있다. 이러한 교환은 예를 들어 용기로부터 상청액의 회수 또는 수집과 같은 동일한 시간 및 속도에서 생산 배지를 용기에 공급할 수 있다. 용기에서 휴지기 세포를 유지하기 위해서, 세포 순환 또는 지연을 위한 조작, 예컨대 세포 재순환 단계를 사용할 수 있다. 이러한 재순환 단계는 예를 들어 원심분리, 여과, 초여과의 막 통과 미세여과, 막 반응기, 응집 또는 적합한 다공성, 비 다공성 또는 중합체성 메스릭스에 세포 고정을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전이 상 후, 세포가 상기에서 정의된 바와 같은 휴지기 세포 방식 조건 하에서 용기를 처리하고, 생산 기질을 효과적으로 비타민 C로 전환시킨다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서 생산 단계에서 사용되고, 이후에서 생산 매질로 불리는 생산 용기에서 수성 매질은 L-아스코르브산으로 전환될 수 있는 생산 기질만을 함유하거나, 예를 들어 추가의 무기 염, 예를 들어 염화 나트륨, 염화 칼슘, 황산 마그네슘, 황산 망간, 인산 칼륨, 인산 칼슘 및 탄산 칼슘을 함유할 수 있다. 생산 배지는 또한 소화가능한 질소 원, 예컨대 유기 물질, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 유레아, 아미노산 및 옥수수 담금 액 및 무기 물질, 예를 들어 암모니아, 황산 암모늄 및 질산 나트륨을 세포가 상기 정의된 바와 같은 휴지기 세포를 유지하는 농도로 함유할 수 있다. 배지는 유레아 및/또는 옥수수 담금 액 및/또는 제빵 효모를 가지거나 가지지 않을 수 있다. 생산 단계는 예를 들어 회분식, 공급-회분식, 반-연속식 또는 연속식 방식으로 수행할 수 있다. 공급-회분식, 반-연속식 또는 연속식 방식의 경우에, 성장 용기 및 생산 배지로부터 둘다의 세포를 적합한 공급 속도에서 생산 용기에 연속적으로 또는 즉시 공급할 수 있다. 다르게는 생산 배지만을 생산 용기에 연속적으로 또는 즉시 공급할 수 있고, 이때 성장 용기로부터 도달하는 세포를 동시에 생산 용기로 옮길 수 있다. 성장 용기로부터 도달하는 세포를 생산 용기내에 세포 현택액으로서 사용하거나 예를 들어 임의의 고체 상, 예컨대 다공성 또는 중합체성 메트릭스에 응집되거나 고정된 세포로서 사용할 수 있다. 생산에 용기내로 기질의 도입과 비타민 C를 함유하는 상청액, 소위 수집 스트림의 수집 사이에 경과된 기간으로 정의된 생산 기간은 예를 들어 세포의 종류 및 농도, pH, 온도 및 사용되는 양분 배지에 따라서 다양할 수 있고, 바람직하게 약 2 내지 약 100시간이다. pH 및 온도는 성장 단계의 pH 및 온도와 상이하지만, 본질적으로 성장 단계와 동일하다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 생산 단계는 성장 용기로부터 세포를 함유하는 제 1 공급 스트림 및 기질을 함유하는 제 2 공급 스트림을 생산 용기에 연속적으로 또는 즉시 공급함을 의미하는 연속적인 방식으로 실행된다. 제 1 스트림은 성장 배지로부터 단리/분리된 세포 또는 세포 단계로부터 직접 도달한 세포 현탁액, 즉 세포 분리의 임의의 중간 단계, 세척 및/또는 단리 없이 성장 배지중에 현탁된 세포를 함유할 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같은 제 2 공급 스트림은 생산 단계의 조작을 위해 필요한 다른 공급 스트림 모두, 예를 들어 하나 이상의 상이한 스트림, 희석용 물 및 pH 조절용 염기의 형태로 기질을 포함하는 생산 배지를 포함할 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 둘다의 스트림이 연속적으로 공급될 때, 제 1 스트림의 공급 속도 대 제 2 스트림의 공급 속도의 비는 약 0.01 내지 약 10, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 5, 가장 바람직하게는 약 0.02 내지 약 2로 다양할 수 있다. 이 비는 제 1 및 제 2 스트림 각각에서 세포 및 기질의 농도에 따른다.

본 발명의 미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기와 같은 방법을 수행하는 또다른 방식은 생산 용기에서 휴지기 세포의 특정한 세포 밀도를 사용하는 방법일 수 있다. 세포 밀도는 당업자에게 공지된 방법에 의해 600nm에서 흡수 단위(광학 밀도)로서 측정된다. 바람직한 실시태양에서, 생산 단계중 세포 밀도는 약 10 이상, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 200, 보다 훨씬 바람직하게는 약 15 내지 약 200, 보다 훨씬 바람직하게는 약 15 내지 약 120, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 120이다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법과 관련해서, 예를 들어 연속식 또는 반-연속식 방식으로 수행되는 생산 상 동안 목적 세포 밀도에서 생상 용기중 세포를 유지하기 위해서 당분야에 공지된 임의의 수단이 예컨대 원심 분리, 여과, 미세여과의 막 통과 초여과, 붓기, 응집, 막 장치 또는 세포 고정에 의해 용기내에서 세포 지연에 의해서 세포 재순환에 사용할 수 있다. 게다가, 생산 단계의 경우에 연속식 또는 반-연속식 방식으로 수행되고, 세포는 성장 용기로부터 연속적으로 또는 즉시 공급되고, 생산 용기에서 세포 밀도는 예를 들어 성장 용기로부터 공급되는 세포의 양에 상응하는 생산 용기로부터 세포의 양을 수직함에 의해 일정한 수준을 유지할 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법에 관련해서, 소위 수집 스트림에서 함유되는 생산된 비타민 C를 생산 용기로부터 회수/수집한다. 수집 스트림은 예를 들어 생산 용기로부터 도달하는 세포가 없는 또는 세포 함유 수용액을 함유할 수 있고, 생산 용기에서 휴지기 세포에 의해 생산 기질의 전환의 결과로서 비타민 c를 함유한다. 수집 스트림에 여전히 존재하는 세포는 당분야에 공지된 임의의 조작, 예컨대 여과, 원심분리, 붓기, 막 통과 초여과 또는 미세여과, 접하는 흐름 초여과 또는 미세여과 또는 죽은 말단 여과에 의해 비타민 c로부터 분리될 수 있다. 이 세포 분리 조작 후, 수집 스트림은 본질적으로 세포가 없다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법에 관련해서, 하나의 양태로 본 발명의 방법은 약 1.8g/ℓ 이상, 바람직하게는 약 2.5g/ℓ 이상, 보다 바람직하게는 약 4.0g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 약 5.7g/ℓ 이상인 비타민 C의 수율을 초래한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 비타민 C의 수율은 약 1.8 내지 약 600g/ℓ의 범위이다. 비타민 C의 수율은 생산 용기에서 직접 도달하는 수집 스트림에서, 즉 비타민 C를 포함하는 세포가 없는 상청액에서 비타민 C의 농도를 지칭한다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 세포와 관련해서, 본 발명의 하나의 실시태양에서 비타민 C를 재조합 미생물의 휴지기 세포, 예컨대 재조합 세균을 사용하여 상기에서 기술된 바와 같은 방법으로 생산한다. 바람직하게, 재조합 세균은 생체내에서 활성 형태로서 L-솔보손 탈수소효소를 발현할 수 있는 세균, 특히 글루코노박터, 아세토박터, 슈도모나스 및 에세리키아 속의 세균, 가장 바람직하게는 글르쿠노박터, 아세토박터 또는 에세리키아 콜라이로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들어 글루코노박터 옥시단스 및 에세리키아 콜라이가 보다 훨씬 바람직하고, 글루코노박터 옥시단스 N44-1, 글루코노박터 옥시단스 IFO 3293 및 글루코노박터 옥시단스 IFO 3244로 구성된 군에서 선택하는 것이 가장 바람직하다. 재조합 미생물은 공지된 기술에 의해 유전공학적으로 조작되는 임의의 미생물 일 수 있고, 하나 이상의 목적 유전자를 그의 염색체 또는 상기 미생물내로 도입되는 플라스미드를 함유하고, 예를 들어 상기 유전자의 과발현을 초래할 수 있다. 상기 미생물에 도입되는 목적 유전자는 예를 들어 기질을 비타민 C로 전환을 포함하는 효소를 코딩할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 목적 유전자는 L-솔보손 탈수소효소를 코딩하고, L-솔보손을 비타민 C로 전환을 촉매시킨다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 바람직한 L-솔보손 탈수소효소는 예를 들어 서열 번호 2로 표현되는 글루코노박터 옥시단스 N44-1(수기사와 등의 문헌[Agric. Biol. Chem. 54: 1201-1209, 1990]) L-솔보손 탈수소효소(SNDHai)이고, SNDHai를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1로 표현된다. 상기 SNDHai의 기능적 유도체는 또한 본 발며으이 목적을 위해 사용될 수 있다. 서열 번호 1과 비교시 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖고 L-솔보손을 비타민C로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 또한 본 발명의 일부로 이해된다.

재조합 미생물, 예컨대 글루코노박터 옥시단스 N44-1은 적합한 플라스미드에 클로닝되거나 그의 염색체 상에 통합되는 SNDHai의 몇 개의 복제수를 포함할 수 있다. 본 바렴에 적합한 플라스미드 복제수는 예를 들어 형질전환된 미생물 당 약 2 내지 15의 범위, 바람직하게는 약 5 내지 약 10의 범위이다. 플라스미드 복제수의 값은 예를 들어 SDS-PAGE 상에 시각적인 각각의 밴드의 강도를 비교하여 결정할 수 있다.

미생물의 휴지기 세포를 사용하는 상기 방법에 관련해서, 본 발명의 방법에 대해서 재조합 미생물을 사용할 때, 성장 및 생산 단계는 본질적으로 상기에서 기술된 바와 동일할 수 있다. SNDHai를 포함하는 재조합 미생물, 예컨대 증가된 SNDHai 투여량을 갖는 글루코노박터 옥시단스 N44-1을 사용하는 경우, 성장 배지는 예를 들어 L-솔보스, 글리세롤 또는 D-글루코스를 단독으로 또는 그의 혼합물로, 하나 이상의 적합한 질소 원 및 염을 함유할 수 있다. 생산 배지는 예를 들어 D-솔비톨 및/또는 L-솔보스 및 염을 함유할 수 있다. 비타민 C의 수집은 본질적으로 본원에서 기술된 바와같이 수행될 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명의 방법을 수집 스트림에 함유될 수 있는 기타 성분으로부터 생산된 비타민 C의 분리 및/또는 정제의 추가의 단계, 즉 소위 하류 가공 단계와 합할 수 있다. 이들 단계는 다업자에게 공지된 임의의 수단, 예컨대 농축, 결정화, 침전, 흡착, 이온 교환, 전기투석, 양극성 막 전기투석 및/또는 역 삼투압을 포함할 수 있다. 비타민 C는 예컨대 활성 탄소로 처리, 이온 교환, 흡착 및 용리, 농축 결정화, 여과 및 건조에 의해 유리 산 형태 또는 그의 공지된 염 형태중 하나로 추가로 정제될 수 있다. 구체적으로, 수집 스트림에서 기타 성분으로부터 비타민 C의 제 1 분리는 임의의 적합한 조합 또는 반복에 의해, 예를 들어 다음 방법: 2- 또는 3-구획 전기투석, 양극성 막 전기투석, 역 삼투압 또는 예를 들어 이온 교환 수지 또는 비-이온성 수지 상에 흡착에 의해 수행될 수 있다. 비타민 C의 생성된 형태는 L-아스코르브산의 염이고, 염 형태를 유리 산 형태로 전환은 예를 들어 양극성 막 전기투석, 이온 교환, 촉진된 이동 상 크로마토그래피 기법 등에 의해 수행될 수 있다. 언급된 단계, 예를 들어 전기투석 및 양극성 막 전기투석에서 하나의 단계의 조합은 또한 언급된 단계의 조합 뿐만 아니라 예를 들어 촉진된 이동 상 크로마토그래피 방법을 하용하는 이온 교환의 몇가지 단계에서 사용될 수 있다. 이들 과정 단독으로 또는 조합중 하나는 생성물, 즉 비타민 C를 단리 및 정제하는 용이한 수단을 구성한다. 따라서 수득된 생성물을 추가로 예컨대 농축, 결정화, 침전, 세척 및 결정의 건조에 의한 방법으로 추가로 단리할 수 있고/있거나 예를 들어 활성 탄소로 처리, 이온 교환 및/또는 재-결정화에 의해 추가로 정제할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 비타민 C를 상기 기술된 바와 같은 일련의 하류 가공 단계에 의해 이 가공의 임의의 시간에 비-수용액으로 옮겨짐 없이, 즉 모든 단계가 수성 환경에서 수행되도록 수집 스트림으로부터 정제할 수 있다. 이러한 바람직한 하류 가공 과정은 예를 들어 2- 또는 3-구획 전기투석에 의해 생산 용기로부터 도달하는 수집 스트림의 농축, 양극성 막 전기투석 및/또는 이온 교환에 의해 농축된 용액중에 존재하는 염 형태중 비타민 C의 전환, 활성 탄소로 처리, 이온 교환 또는 비-이온성 수지와 같은 방법에 의한 정제 후 추가의 농축 단계 및 결정화를 포함할 수 있다. 이들 결정을 분리하고, 세척하고 건조할 수 있다. 필요한 경우, 결정을 물에 재-용해시키고, 활성 탄소로 처리 및/또는 이온 교환 수지 및 재결정화할 수 있다. 이어서, 이들 결정을 분리하고 세척하고 건조한다.

다음 실시예는 추가로 본 발명을 예시하고 임의의 방식으로 본 발명을 제한하고자 함이 아니다.

실시예 1

정제된 SNDHai로 L-아스코르브산 생산

공급-회분식 발효(배양에 대해서는 실시예 3을 참조하시오)에 의해 배양된 SNDHai 생산할 수 있는 미생물 세포를 2mM MgCl₂, 1mM 다이티오트레이톨(DTT) 및 2-3 EDTA가 없는 프로테아제 저해제 정제(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)를 함유하는 인산 완충액(20mM, pH 7.0) 25㎖중에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 프렌치 프레스 세로로 3회 처리하였다. 이어서, 2mM MgCl₂, 1M NaCl을 함유하는 인산 완충액(20mM, pH 7.0)을 첨가하고 현탁액을 초원심분리하였다(30,000rpm, 60분, 4℃). 막 분획을 함유하는 펠렛을 2mM MgCl₂, 500mM NaCl을 함유하는 인산 완충액(20mM, pH 7.0)으로 세척한 후 2mM MgCl₂을 함유하는 인산 완충액(20mM, pH 7.0) 적합한 양에 현탁시켰다. N-옥시글루코시드(플루카(Fluka))를 2%(w/v)의 최종 농도에 첨가한 후 현탁액을 얼음상에서 가볍게 교반하면서 90분동안 배양하였다. 원심분리(20,000rpm, 60분, 4℃)한 후 투명한 적색을 띄는 상청액을 수직하보 최종 농도 15%(w/v)에서 폴리에틸렌 글라이콜 6000(플루카)를 첨가하였다. 60분동안 4℃에서 가볍게 진탕한 후 원심분리(10,000rpm, 30분, 4℃) 후, 펠렛을 1M NaCl을 함유하는 2mM MgCl₂ 및 0.5%(w/v) 라우릴 설포베타인(플루카)를 함유하는 트리스-HCl 완충액(20mM, pH 7.0)에 용해시켰다. 4℃에서 밤새도록 가볍게 진탕한 후, 용액을 원심분리하였다(20,000rpm, 30분, 4℃). 상청액을 수집하고 추가로 다음과 같이 정제하였다.

다음 정제 단계는 액크타 익스플로러 10 S-시스템(AKTA Explorer 10 S-system, 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)) 상에서 소프트웨어 유니콘(UNICORN) 3.1로 4℃에서 실시하였다. 이온 교환 크로마토그래피의 전형적인 유속은 1 내지 2㎖/분의 범위였다. 단백질 용리를 280nm에서 검사하고 SNDHai-활성 기능을 정제의 모든 단계에서 표준 광도계 분석 또는 정제 분획과 생성물 분석을 사용하여 측정하였다.

투명한 상청액 IV를 세파덱스(sephadex) G 25-겔 여과 칼럼(공간 체적: 2.5㎖) 상에서 2mM MgCl₂ 및 0.5%(w/v) 라우릴 설포베타인(플루카)를 함유하는 20mM 트리스-HCl 완충액(pH .76)을 사용하여 탈염하였다.

SNDHai-양성 분획을 채우고, 액체(약 10㎖)를 완충액 A1(10mM 트리스, 10mM 비스트리스, 10mM MES, 2mM MgCl₂, 0.5% 라우릴 설포베타인, pH 7.6)을 사용하기 이전에 평형화시키는 강한 음이온 교환 칼럼(예를 들어, 모노-Q HR, 아머샴 바이오사이언스, 체적: 8㎖)을 주입하였다. 비-결합 단백질을 100% 완충액 A1을 4 칼럼 체 적로 용리한 후, 100% 완충액 B1(10mM 트리스, 10mM 비스트리스, 10mM MES, 2mM MgCl₂, 0.5% 라우릴 설포베타인, pH 4.7)에 6 칼럼 체적으로 선형 pH-구배를 적용한 후 100% 완충액 B1을 8 칼럼 체적으로 적용하였다. SNDHai를 아미노산 서열로부터 계산된 6.52 pI-값에 매우 가까운 약 6.5 pH-값에서 용리하였다. 활성 분획을 채우고, 2mM MgCl₂, 0.5% 라우릴 설포베타인(최종 체적: 15 내지 20㎖)을 함유하는 HEPES-완충액(50mM, pH 8.0)의 동량으로 희석하고, 완충액 A2(15mM HEPES, 2mM MgCl₂, 0.5% 라우릴 설포베타인, pH 7.6)로 평형화된 또다른 강한 음이온 교환 칼럼(예를 들어, 모노-Q HR, 아머샴 바이오사이언스, 칼럼 체적: 1㎖)을 적용하였다. 비-결합 단백질을 4 칼럼 체적의 100% 완충액 A2로 용리한 후 40% 완충액 B2(HEPES, 15 mM; 2 mM MgCl₂, 1M LiCl 및 0.5% 라우릴 설포베타인, pH 7.6)에 20 칼럼 체적에서 선형 구배를 적용한 후 100% 완충액 B2로 단계 구배를 적용하였다. SNDHai를 약 150mM LiCl로 용리하였다. 활성 분획은 SDS 겔 전기영동에서 약 85kDa에서 하나의 단일 밴드를 나타냈다.

2. SNDHai에 대한 광도계 분석

광도계 SNDHai-활성 측정을 위한 반응 혼합물은 0.196mM 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT), 0.137mM 페나진 메토설페이트(PMS), 20.4mM L-솔보손 및 0.1M 인산 나트륨 완충액, pH 7.5 1.0㎖의 최종 체적에서 효소 용액으로 구성되었다. 반응은 효소를 첨가하여 개시하고, 효소 활성을 570nm(T = 25℃)에서 NBT의 초기 환원 속도로서 1-cm 광 경로를 갖는 큐벳에서 측정하였다. 효소 활성의 하나 의 단위는 분당 1μM NBT의 환원을 촉매하는 효소의 양으로서 정의하였다. pH 7.5에서 NBT의 흡광 계수는 100mM^-1cm^-1로서 채택되었다. 2개의 종류의 대조군 큐벳을 활성 측정을 위해서 사용하고: 하나는 L-솔보손을 제외하고 상술된 성분을 함유하고 나머지는 효소 용액을 제외하고 모든 성분을 함유한다.

3. SNDHai에 대한 생성물 분석

순수한 SNDHai-함유 분획(상기를 참조하시오)을 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산 생산에 대해 다음 조성물(총 체적 0.5㎖): 정제된 탈염된 SNDHai 0.14mg/㎖, 50mM 인산 완충액(pH 6.5), 소 혈청 알부민(BSA) 8mg/㎖, 100mM L-솔보손, 1mM PMS, 5mM CaCl₂, 50μM PQQ-K2에서 직접 분석하였다. 분석은 광 배제하에서 충분한 진탕(벤치용 진탕기에서 900rpm)하면서 25℃에서 적당한 반응 관에서 수행하였다.

시료를 아미넥스(Aminex)-HPX-78H(300 x 7.8mm) 칼럼(바이오라드(Biorad), 스위스 레이나츠)에 부착된 리크로스페르(LiChrospher)-100-RP18(125 x 4.6mm) 칼럼(메르크(Merck), 독일 다름스타트)을 갖춘 어길런트 1100 HPLC 시스템(어길런트 테트놀로지스(Agilent Technologies), 미국 윌밍톤)을 사용하여 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하였다. 이동 상을 황산 0.004M이고, 유속 0.6㎖/분이었다. 2개의 신호를 반사 지수 검출기와 조합으로 자외선 검출기(파장 254nm)를 사용하여 기록하였다. 또한, L-아스코르브산의 확인은 254nm에서 자외선 검출하면서 아미노-칼럼(YMC-팩 폴리아민-II, YMC 인코포레이티드, 일본 교토)을 사용하여 수행하였다. 이동 상은 50mM NH₄H₂PO₄ 및 아세토나이트릴(40:60)이었다. 이들 조 건 하에서 전형적인 초기 체적 L-아스코르브산-생산성은 0.5 내지 1.0g/ℓ/시간이었다. 따라서, 1시간 반응 시간 후, 상청액중 L-아스코르브산의 농도는 300 내지 930mg/ℓ였다.

실시예 2

시험관 및 플라스크 발효에서 L-솔보스 및 D-솔비톨로부터 L-아스코르브산 생산

글루코노박터 옥시단스 N-44의 세포를 사용하여 제 3BD 액체 배지 4㎖를 접종하고 시험관에서(18mm 직경)에서 30℃에서 3일동안 220rpm에서 진탕하면서 배양하였다. L-아스코르브산 20mg/ℓ를 접종 기간 마지막에 축적하였다.

균주 N44-1의 세포를 500㎖들이 조절된 진탕 플라스크에서 30℃에서 200rpm으로 진탕하면서 D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(디프코(Difco)) 15g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 2.5g/ℓ 및 CaCO₃ 15g/ℓ를 함유하는 제 5 배지 50㎖에서 배양하였다(3개). 배양 72시간 후, 3개의 플라스크에서 HPLC에 의해 측정된 L-아스코르브산의 양은 400, 500 및 680mg/ℓ였다.

실시예 3

공급-회분식 발효에서 D-솔비톨로부터 L-아스코르브산의 생산

균주 N44-1의 세포를 2ℓ들이 조절된 진탕 플라스크에서 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카(Fluka BioChemika), 스위스 부츠) 15g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 2.5g/ℓ 및 CaCO₃ 15g/ℓ를 함유하는 제 5 배지 200㎖에서 배양하였다. 48시간 후, 이 배양액 150㎖를 사용하여 D-솔비톨 20g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카, 스위스 부츠) 15g/ℓ 및 MgSO₄·7H₂O 2.5g/ℓ를 함유하는 5.3ℓ 배지로 이미 생산되고, 온도, pH 및 용해된 산소 감지기 및 조절 루프를 갖춘 10ℓ들이 생물반응기(비. 브라운(B. Braun) ED10, 독일 멜순겐)에 접종하였다. 온도를 30℃에서 조절하고, pH를 28% 암모니아 용액을 첨가하여 6.0으로 조절하고 기류는 4.5ℓ/분이고 용해된 산소를 교반 속도(최소 300rpm)로 연쇄반응에 의해 30%에서 조절하였다. 처리 시간 6시간 후, 솔비톨 용액 500g/ℓ를 44시간동안 25g/시간의 속도로 공급하였다. 처리 시간 96시간후, 약 1% 기질이 성청액에 남았고, L-아스코르브산 950mg/ℓ를 생산하였다.

실시예 4

세포 막 분획에서 L-솔보손 또는 L-솔보스로부터 L-아스코르브산 생산

글루코노박터 옥시단스의 세포를 500㎖들이 조절된 진탕 플라스크중에 제 3BD 액체 배지 100㎖를 30℃에서 220rpm에서 진탕하면서 3일동안 배양하였다. 생성된 배양액을 500rpm으로 원심분리하여 CaCO₃를 제거하였다. 이 단계로부터 상청액을 5,000rpm에서 원심분리한 후 세포를 펠렛화하였다. 수집된 세포를 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 3㎖에 현탁시키고 세포를 프렌치 프레스 세포(심-아민코 스페트로닉 인스트루먼츠(SIM-AMINCO Spetronic Instruments), 미국)를 통하여 900psi에서 2회 통과시켜 파쇄하였다. 생성된 분쇄물을 먼저 5,000rpm에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 이어서, 상청액을 단백질 3mg/㎖의 최종 단백질 농도로 희석하였다. 이 희석된 시료를 세포가 없는 추출물(CFE)로 지명하였다. CFE를 100,000 x g에서 60분동안 원심 분리하였다. 상청액을 버리고 펠렛을 막 분획으로서 수집하였다.

막 분획(100㎕)과 함께 반응물(200㎕)을 30℃에서 220rpm에서 15시간동안 진탕하면서 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에서 수행하였다. 시험된 기질은 L-솔보손(1% 최종 농도) 및 L-솔보스(2% 최종 농도)였다. 반응물에서 사용되는 최종 단백질 농도는 1.5mg/㎖였다. 배양 기간의 마지막에, L-아스코르브산 680mg/ℓ 및 10mg/ℓ을 1% L-솔보손 및 2% L-솔보스 각각으로부터 생산하였다.

실시예 5

글루코노박터 옥시단스 N44-1로부터 SNDHai 유전자의 단리

Tn5(사이몬 알.(Simon R.) 등의 문헌[1983. BIO/TECHNOLOGY 1: 784-791])를 함유하는 "자살 벡터"인 플라스미스 pSUP2021을 에세리키아 콜라이 HB101로부터 글루코노박터 옥시단스 N44-1로 다음과 같은 접합 교배 방법에 의해 전달하였다. 글루코노박터 옥시단스 N44-1을 MB 액체 배지 5㎖를 함유하는 시험관에서 30℃에서 밤새도록 배양하였다. 보조 플라스미드 pRK2013을 갖는 에세리키아 콜라이 HB101(디. 에이치. 피구르스키(D. H. Figurski)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1648-1652, 1979]) 및 플라스미드 pSUP2021을 갖는 에세리키아 콜라이 HB101을 가나마이신 50㎍/㎖를 갖는 LB 배지 5㎖를 함유하는 시험관에서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 밤새도록 배양으로부터, 글루코노박터 옥시단스 N44-1, 에세리키아 콜라이 HB101(pRK2013) 및 에세리키아 콜라이 HB101(pSUP2021)의 세포를 원심분리 에 의해서 개별적으로 수집하고 MB 배지에 본래 체적으로 현탁시켰다. 이어서, 이들 세포 현탁액을 동일한 체적으로 혼합하고 혼합물을 MB 한천 플레이트의 상단에 놓인 0.45㎛ 니트로셀룰로스 막에 퍼트렸다. 1일 동안 27℃에서 배양한 후, 세포를 막으로부터 벗겨내고 희석액을 MB 배양액에서 제조하였다. 이어서, 희석된 세포를 폴리믹신 B 10㎍/㎖ 및 가나마이신(MPK 배지) 50㎍/㎖를 함유하는 MB 한천 배지에 퍼트렸다. 폴리믹신 B가 에세리키아 콜라이 공여체 및 보조 균주에 대해서 선별하고, 반면에 가나마이신이 플라스미드 pSUP2021으로 형질전환된 글루코노박터 옥시단스 세포(즉, 교차접합체)를 선별하였다. 약 30,000 교차접합체를 수득하였다.

2. L-아스코르브산 비-생산 균주 선별

모두 3,760 교차접합체를 MPK 격자 플레이트 상에 멸균된 이쑤시개로 옮기고 27℃에서 3일동안 성장시켰다. L-솔보손으로부터 L-아스코르브산 생산에 대한 시험을 위해서, 각각의 교차접합체의 세포를 멸균된 이쑤시개로 격자 플레이트로부터 찍어서 96-웰 미세역가 플레이트에서 L-솔보손 0.5%, NaCl 0.3% 및 CaCO3 1%를 함유하는 휴지기 세포 반응 혼합물 50㎕중에 현탁하였다. 미세역가 플레이트를 30℃에서 1일 동안 진탕 없이 배양하였다. 각각의 생성된 반응 혼합물을 아스코르브산 시험 스트립 및 RQFlex2 장치(메르크 카게아아, 독일 64271 다름스타트)를 사용하여 L-아스코르브산 형성에 대해서 분석하였다. 양성 대조 균주는 동일한 조건 하에서 성장하는 글루코노박터 옥시단스 N44-1이었다. 이 방법에 의해, L-아스코르브산-비-생산 돌연변이 N44-1-6A9를 확인하였다. 서던 블롯 혼성화 분석을 수행한 후 돌연변이 N44-1 6A9의 염색체 DNA에서 Tn5의 존재를 확인하였다. 돌연변이로부터 단리된 염색체 DNA 2㎍을 ApaI, ClaI, EcoRI, EcoRV, KpnI, StuI, BamHI, SalI 또는 HindIII로 절단하고 아가로즈 겔 전기영동(0.8% 아가로즈)을 수행하였다. 이어서, 겔을 0.25N HCl로 15분동안 처리한 후, 0.5N NaOH로 30분동안 처리하였다. DNA를 나일론 막으로 급속 하향 전달 시스템 터보블롯터(TurboBlotter, 슬레이쳐 앤 슈엘 게엠베하(Schleicher & Schuell GmbH), 독일)로 전달하였다. 탐침을 주형으로서 플라스미드 pSUO2021로 시발체 Tn2419(서열 번호 3) 및 Tn3125(서열 번호 4)를 사용하여 PCR-DIG(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 68298 만하임)로 제조하였다. 707bp의 PCR 생성물을 수득하였다.

사용되는 혼성화 조건은 다음과 같다: 혼성화는 엄격한 혼성화 조건 하에서, 예를 들어 42℃에서 딕옥시게닌(DIG)-표지된 DNA 탐침(DIG 표지 시스템을 사용하여 제조됨; 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 68298 만하임)을 사용하여 딕이지하이브 용액(DigEasyHyb, 로슈 다이아그노스틱스)에서 연어 정자 DNA 100㎍/㎖와 2시간 내지 4일의 배양 수행한 후 15분 동안(2회) 2 x SSC 및 0.1% SDS중에 실온에서 여과기를 세척한 후 15분 동안(2회) 0.1% SDS 및 0.1 x SSC 및 0.1% SDS중에 65℃에서 세척하였다.

혼성화 단계 후, 혼성화의 검출은 항-DIG-AP 접합체(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 68298 만하임) 및 ECF 기질(아머샴 바이오사이언시스, 스웨덴 웁살라)로 스톰(STORM) 장치(아머샴 바이오사이언시스)를 사용하여 실행하였다. 모든 조작은 공급자의 지시에 따라서 실행하였다.

상기 기술된 방법을 사용하여, 돌연변이 N44-1의 염색체중 Tn5의 부재를 확인하였다.

3. Tn5에 의해 방해된 DNA 단변의 클로닝 및 인접한 구역의 서열화

상기 단락 2에서 기술된 제한 효소 소화의 결과를 기준으로, ApaI, ClaI, EcoRI 및 EcoRV를 Tn5의 양쪽 측면에서 염색체 DNA의 플랭킹의 1kb 이상을 갖는 DNA 단편을 생성하는 효소로서 선택하였다. SalI(약 Tn5의 중간) 및 ApaI으로 돌연변이 N44-1-6A9 DNA의 이중 절단은 상기 기술된 707bp 탐침에 혼성화되는 2개의단편(6.2 및 3.8kb)을 제공하였다.

Tn5 돌연변이 글루코노박터 옥시단스 N44-1-6A9의 염색체 DNA를 제조하고, ApaI으로 절단하였다. 9 내지 12kb의 크기인 DNA 단편을 아가로즈 겔로부터 단리하고 이미 ApaI으로 절단한 클로닝 벡터 pBluscriptII KS+(스트라타진, 스위스)과 연결하였다. 이어서, 연결된 혼합물을 사용하여 수용능 에세리키아 콜라이에 형질전환하고, 가나마이신 50㎍/㎖ 및 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 L-한천 플레이트에서 선별하였다. 하나의 형질전환체로부터, 플라스미드를 추출하고, Tn5 삽입의 측면의 클로닝 구역을 서열화하였다. 단일의 개방 해독 틀(Tn5 삽입에 의해 중단됨)의 뉴클레오타이드 서열을 Tn5 전위 사건 동안 발생하는 것으로 공지된 9bp 이배체를 제거한 후 조립하였다. 이후에서 SNDHai 유전자로서 지칭되는 총 개방 해독 틀의 뉴클레오타이드 서열은 2367bp로 구성되고 서열 번호 1로서 제공된다. 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 연역된 상응하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 번호 2로서 제공된다.

SNDHai 유전자서의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 1)을 데이터베이스 프로 SW-스위스프로트(PRO SW-SwissProt)(전체적인 발행 및 증가 업데이트) 상에 블라스트(Blast) 2 조사(알츠슐(Altschul) 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)]에서 기술된 생물공학 정보를 위한 국가 센터[NCBI]로부터 블라스트 버전 2)를 수행하였다. 사용되는 조건은 낮은 복잡성 구역에 대한 의문 서열의 그래프화된 정렬 및 여과이다.

프로그램 MOTIFS를 사용하여, 세균 퀴노프로테인 탈수소효소 신호 서열을 용이하게 확인하고 SNDHai가 PQQ-의존성 효소의 특성을 가짐을 나타낸다.

실시예 6

L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하는 세균의 서던 블롯 분석

염색체 DNA를 글루코노박터 옥시단스 글루코노박터 옥시단스 IFO 3293, IFO 3292, IFO 3244, IFO 3287, 글루코노박터프라테우리 IFO 3260 및 IFO 3265, 글루코노박터 세리누스 IFO 3266 및 IFO 3269, 아세토박터 아세티 아종 올레아누스 IFO 3259, 아세토박터 아세티 아종 자일리늄 IFO 13693 및 IFO 13773, 아세토박터 종 ATCC 15164, 및 에세리키아 콜라이 K-12의 세포로부터 제조할 수 있다. 균주 IFO 13693 및 IFO 13773은 27℃에서 3일동안 박토펩톤(디프코) 5g/ℓ, 효모 추출물(디프코) 5g/ℓ, 글루코스 5g/ℓ, 만니톨 5g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 1g/ℓ, 에탄올 5㎖/ℓ 및 한천 15g/ℓ을 함유하는 제 350배지에서 성장시켰다. 모든 다른 아세토박터 균주 및 모든 글루코노박터 균주는 27℃에서 3일동안 만니톨 25g/ℓ, 효모 추출물(디프 코래보레토리스, 미국 디트로이트 미츠) 5g/ℓ, 박토펩톤(디프코) 3g/ℓ 및 한천(디프코) 18g/ℓ를 함유하는 만니톨 배양액(MB) 한천 배지에서 성장시켰다. 에세리키아 콜라이 K-12는 라우리아 배양액 한천 배지에서 성장시켰다. 염색체 DNA 제조는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 엄중한 조건 하에서 서던 블롯 혼성화를 사용하였다. 염색체 DNA 제조는 ClaI(N-도메인 구역을 분석할 때) 또는 EcoRI(C-도메인 구역을 분석할 때) 및 DNA 단편 1㎍을 아가로즈 겔 전기영동(1% 아가로즈)에 의해 분리하였다. 겔을 0.25N HCl로 15분 동안 및 0.5N NaOH로 30분 동안 처리한 후 공급자의 지시에 따라서 진공 블롯터 모델 785(바이오-라드 래보레토리즈 아게(BIO-RAD Laboratories AG), 스위스)로 나일론 막 사이에서 브롯팅하였다. 탐침을 PCR-DIG 라벨링 키트(로슈 다이아그노틱스)로 표 1에서 기술된 탐침 세트를 사용하여 제조하였다. PCR 생성물 P1은 N-도메인(가능한 막통과 구역)을 나타내는 SNDHai의 구역에 상응하고, 반면에 PCR 생성물 P2는 C-도메인(가능한 1차 탈수소효소 구역)을 나타내는 SNDHai 구역에 상응하였다.

표 1은 서던 블롯 혼성화 실험의 결과는 제시한다. P1(N-도메인) 탐침으로 혼성화에서, 투명한 양성 밴드를 글루코노박터 옥시단스 IFO 3293, IFO 3292, IFO 3244, IFO 3287 및 아세토박터 종 ATCC 15164에서 관찰하였다. P2(C-도메인) 탐침과 혼성화에서, 투명한 양성 밴드를 균주 IFO 3293, IFO 3292, IFO 3244, IFO3287 및 아세토박터 종 ATCC 15164에서 관찰한 반면 희미한 밴드를 IFO 3260, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3269 및 IFO 13773에서 관찰하였다. 대조 균주, 에세리키아 콜라이 K-12는 도메인에 대한 어떤 검출가능한 신호도 제시하지 않았다.

실시예 7

글루코노박터 옥시단스 N44-1 SNDHai 유전자의 정형유전자의 PCR 증폭 및 서열화

염색체 DNA 제조(실시예 6에서 기술된 바와 같이 제조됨)는 표 1에서 제시된 4개의 탐침 세트를 PCR용 주형으로서 사용하였다. 염색체 5 내지 100ng을 반응(총 부피 50㎕) 당 사용하였다. 달리 구체화되지 않는다면, 확장된 고성능 PCR 시스템을 사용하였다(로슈 다이아그노스틱스). PCR 조건은 다음과 같다

94℃에서 2분동안 배양하고; (i) 94℃에서 15초 동안 변성 단계, (ii) 60℃에서 30초 동안 결합단계, (iii) 72℃에서 45 내지 120초 동안 합성 단계(탐침 세트 P1, P2, P3 및 P4에 대한 합성 시간은 각각 45초, 120초, 90초 및 90초이다)의 30주기 반복하고; 72℃에서 7분동안 연장하였다.

PCR 반응의 시료를 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하고 밴드를 에티듐 브로마이드로 염색하여 빛을 투과시켜 시각화하였다. PCR 반응의 결과는 표 3에 요약하였다.

투명한 PCR 밴드가 아가로즈 겔(표 3) 상에 관찰되고, PCR 생성물을 표준 방법을 사용하여 뉴클레오타이드 서열화에 직접 사용하였다. 뉴클레오타이드 서열을 상이한 PCR 생성물로부터 수득하고, 코딩된 펩타이드에 상응하는 아미노산 서열을 글루코노박터 옥시단스 N44-1로부터 SNDHai 유전자 및 단백질의 총 길이 서열과 비교하였다.

글루코노박터 옥시단스 IFO 3292 SNDHai 정형유전자

탐침 SNDH1391F(서열 번호 10) 및 SNDH2364R(서열 번호 8) 및 주형으로서 글루코노박터 옥시단스 IFO3292로부터 염색체 DNA로 증폭하여 수득된 PCR 생성물(약 1kb)을 탐침 SNDH1391F(서열 번호 10)로 서열화하는데 사용하였다. 771bp의 결정된 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 11)은 글루코노박터 옥시단스 N44-1로부터 SNDHai의 서열 뉴클레오타이드 1431 내지 2201(서열 번호 12)과 98.7%(761/771) 상동성을 나타냈다. 256개의 아미노산의 연역된 아미노산 서열(서열 번호 12)은 글루코노박터 옥시단스 N44-1로부터 SNDH의 아미노사의 아미노산 478 내지 733(서열 번호 2)에 100% 동일성을 나타냈다.

글루코노박터 옥시단스 IFO 3287 SNDHai 정형유전자

탐침 SNDH1F(서열 번호 5) 및 SNDH420R(서열 번호 6) 및 주형으로서 글루코노박터 옥시단스 IFO 3287로부터 염색체 DNA로 증폭에서 수득된 PCR 생성물(약 0.4kb)을 탐침 SNDH420R(서열 번호 6)로 서열화하는데 사용하였다. 350bp(서열 번호 13)의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 31 내지 380과 97.4%(341/350)의 상동성을 나타냈다. 116개의 잔기(서열 번호 14)의 연역된 아미노산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 11 내지 126과 100% 동일성을 나타냈다.

탐침 SNDH501F(서열 번호 7) 및 SNDH2364R(서열 번호 8)로 증폭에서 수득된 PCR 생성물(약 1.9kb)을 탐침 SNDH501F(서열 번호 7)로 서열화하는데 사용하였다. 808bp(서열 번호 15)의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 578 내지 1358과 98.0%(745/808)의 상동성을 나타냈다. 268개의 잔기(서열 번호 16)의 연역된 아미노산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 194 내지 461과 100% 동일성을 나타냈다.

탐침 SNDH1391F(서열 번호 10) 및 SNDH2364R(서열 번호 8)로 증폭에서 수득된 PCR 생성물(약 1kb)을 탐침 SNDH1391F(서열 번호 10)로 서열화하는데 사용하였다. 800bp(서열 번호 17)의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1469 내지 2268과 98.8%(790/800)의 상동성을 나타냈다. 266개의 잔기(서열 번호 18)의 연역된 아미노산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 491 내지 756과 100% 동일성을 나타냈다.

아세토박터 종 ATCC 15164 SNDHai 정형유전자

탐침 SNDH1F(서열 번호 5) 및 SNDH420R(서열 번호 6) 및 주형으로서 아세토박터 종 ATCC 15164로부터 염색체 DNA로 증폭에서 수득된 PCR 생성물(약 0.4kb)을 탐침 SNDH420R(서열 번호 6)로 서열화하는데 사용하였다. 360bp(서열 번호 19)의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 31 내지 390과 97.8%(352/360)의 상동성을 나타냈다. 120개의 잔기(서열 번호 20)의 연역된 아미노산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 11 내지 130과 100% 동일성을 나타냈다.

탐침 SNDH501F(서열 번호 7) 및 SNDH2364R(서열 번호 8)로 증폭에서 수득된 PCR 생성물(약 1.9kb)을 탐침 SNDH501F(서열 번호 7)로 서열화하는데 사용하였다. 760bp(서열 번호 21)의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 563 내지 1322와 98.0%(745/760)의 상동성을 나타냈다. 252개의 잔기(서열 번호 22)의 연역된 아미노산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 189 내지 440과 100% 동일성을 나타냈다.

글루코노박터 옥시단스 IFO 3244 SNDHai 정형유전자

글루코노박터 옥시단스 IFO 3244의 SNDHai 정형유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 주형으로서 글루코노박터 옥시안스 IFO 3244의 염색체DNA 및 다음 탐침 세트로 수득된 PCR 생성물을 사용하여 결정하였다: SNDH1F(서열 번호 5) 및 SNDH420R(서열 번호 6); SNDH501F(서열 번호 7) 및 SNDH1530R(서열 번호 9); SNDH1391F(서열 번호 10) 및 SNDH2364R(서열 번호8); SNDH382(서열 번호 23) 및 SNDH1530R(서열 번호 9); SNDH1F(서열 번호 5) 및 SNDH689R(서열 번호 24). BglII 및 BamHI로 절단되고 연결된 염색체 DNA를 다음 탐침 세트를 2회 이상의 PCR용으로 사용하였다: SNDH420R(서열 번호 6) 및 SNDH501F(서열 번호 7) andSNDH1530R(서열 번호 9) 및 IS-50.3(서열 번호 25). 완전한 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 26)은 글루코노박터 옥시단스 N44-1(서열 번호 1)의 SNDHai의 뉴클레오타이드에 98.4% 상동성을 나타냈다. 연역된 아미노산 서열(서열 번호 27)은 서열 번호 2의 아미노산 서열에 100% 동일성을 나타냈다.

실시예 8

증가된 SNDHai 투여량에 의해 L-솔보손으로부터 L-아미노산 생산의 증가

상류 및 하류 측면 구역과 함께 SNDHai 유전자를 주형으로서 균주 N44-1의 염색체 DNA와 탐침 세트 N1(서열 번호 28) 및 N2(서열 번호 29)로 PCR에 의해 증폭하였다.

PCR을 공급자의 지시에 따라서 GC-풍부한 PCR 시트템(로슈 다이아그노스틱스)로 실행하였다. 증폭된 DNA 단편을 벡터 pCR2.1-TOPO(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)내로 삽입하였다. 이어서, 생성된 플라스미드를 HindIII 및 XhoI으로 절단하였다. SNDHai 유전자를 포함하는 HindIII-XhoI 단편을 이미 HindIII 및 XhoI로 처리된 벡터 pVK(미국 균주 보관 은행에 이용가능한 목록 제 ATCC 37156)과 연결하였다. 연결체 혼합물을 사용하여 에세리키아 콜라이 TG1에 형질전환하였다. pVK-P-SNDHai-T로 지칭하는 목적 플라스미드를 에세리키아 콜라이로부터 단리하고 표준 방법(일렉트로셀(Electrocell) 증폭기 ECM600, 비티엑스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 산 디에고)을 사용하는 전기천공에 의해 글루코노박터 옥시단스 균주 N44-1에 도입하였다.

글루코노박터 옥시단스 균주 N44-1 및 플라스미드 pVK-P-SNDHai-T를 갖는 N44-1의 세포를 D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(디프코) 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ 및 CaC0₃ 15g/ℓ를 포함하는 제 5 배지에서 500㎖들이 조절된 진탕 플라스크에서 30℃에서 200rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 배양 48시간 후, 2개의 플라스크에서 HPLC에의 해 상청액중 측정되는 L-아스코르브산의 양은 각각 110mg/ℓ 및 200mg/ℓ였다.

실시예 9

만니톨 배양액 한천 배지 상에서 성장한 휴지기 세포를 사용하는 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산의 생산

IFO 균주 3293, 3292, 3244, 3260, 3266, 3287, 3259,13693 및 13773 뿐만 아니라 아세토박터 종 ATCC 15164 및 글루코노박터 옥시단스 N44-1, 균주 IFO 3293의 유도체를 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산의 생산을 위해 사용하였다.

균주 IFO 13693 및 IFO 13773를 27℃에서 3일 동안 박토펩톤(디프코) 5g/ℓ, 효모 추출물(디프코) 5g/ℓ, 글루코스 5g/ℓ, 만니톨 5g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 1g/ℓ, 에탄올 5㎖ 및 한천 15g/ℓ을 함유하는 제 350 배지 상에서 성장시켰다. 모든 다른 아세토박터 균주 및 모든 글루코노박터 균주를 27℃에서 3일 동안 만니톨 25g/ℓ, 효모 추출물(디프코 래보레토리즈, 미국 디트로이트 미츠) 5g/ℓ, 박토펩톤(디프코) 3g/ℓ 및 한천(디프코) 18g/ℓ를 함유하는 만니톨 배양액(MB) 한천 배지 상에서 성장시켰다.

세포를 한천 플레이트로부터 긁어내고, 증류수에 현탁시키고 30℃에서 20시간동안 5㎖ 시험관에서 230rpm으로 진탕하면서 수행된 휴지기 세포 반응용으로 사용하였다. 반응 혼합물(0.5㎖)은 1% L-솔보손, 0.3% NaCl, 1% CaCO₃ 및 600nm에서(OD₆₀₀)에서 10 흡광 단위의 최종 농도에 세포를 함유하였다. 배양 기간의 결정에서, 반응 혼합물을 아미넥스-HPX-78H(200 x 7.8mm) 칼럼(바이오라드, 스위스 레이나츠)에 부착된 리크로스퍼-1010-RP18(125 x 4.6mm) 칼럼(메르크, 독일 바름스타트)을 갖춘 어길런트 1100 HPLC 시스템(어길런트 테크놀로지스, 미국 윌밍톤)을 사용하여 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하였다. 이동 상을 황산 0.004M이고, 유속 0.6㎖/분이었다. 2개의 신호를 반사 지수 검출기와 조합으로 자외선 검출기(파장 254nm)를 사용하여 기록하였다. 또한, L-아스코르브산의 확인은 254nm에서 자외선 검출하면서 아미노-칼럼(YMC-팩 폴리아민-II, YMC 인코포레이티드, 일본 교토)을 사용하여 수행하였다. 이동 상은 50mM NH₄H₂PO₄ 및 아세토나이트릴(40:60)이었다.

어길런트 시리즈 1100 HPLC-질량 분광계(MS) 시스템을 사용하여 L-아스코르브산을 확인하였다. MS는 전자분사 경계면을 사용하여 양이온 방식으로 조작하였다. 분리를 루나(LUNA)-C8(2) 칼럼(100 x 4.6mm)(페노메넥스(Phenomenex), 미국 토란스)을 사용하여 수행하였다. 이동 상은 0.1% 포름산 및 메탄올(96:4)의 혼합물이었다. L-아스코르브산을 2.1분의 지연 시간으로 용리하였다. L-아스코르브산의 확인은 지연 시간 및 화합물의 분자 질량으로 확인하였다.

D-아이소아스코르브산의 존재를 배제하기 위해서, L-아스코르브산의 확인은 추가로 254nm에서 자외선 검출하여 아미노-칼럼(YMC-팩 폴리아민-II, YMC 인코포레이티드, 일본 교토)을 사용하여 지연 시간에 의해 수행하였다. 이동 상은 50mM NH₄H₂PO₄ 및 아세토나이트릴(40:60)이었다.

글루코노박터 및 아세토박터 균주는 표 4에서 제시된 바와 같이 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산을 생산하였다.

실시예 10

3BD 한천 배지에서 성장한 휴지기 세포를 사용하여 D-솔비톨, L-솔보스 또는 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산의 생산

글루코노박터 옥시단스 N44-1의 세포를 27℃에서 3일 동안 L-수크로스 70g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(디프코) 7.5g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ, CaCO₃ 10g/ℓ 및 한천(디프코) 18g/ℓ를 함유하는 제 3BD 한천 배지에서 성장시켰다. 균주 N44-1은 D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산 280, 400 및 1780mg/ℓ를 생산하였다.

다른 반응(10㎖ 시험관에서 0.5㎖ 반응 혼합물)을 실시예 9에서 기술된 바와 같이 2% D-솔비톨, 2% L-솔보스 또는 2% L-솔보손을 함유하는 반응 혼합물중 제 3BD 한천 배지 상에서 성장시킨 N44-1 세포로 수행하였다. 균주 N44-1은 D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산 1.8, 2.0 및 5.1g/ℓ를 생산하였다.

글루코노박터 옥시단스 IFO 3293의 세포를 사용하는 반응을 상기 기술된 바와 같이 2% L-솔보손으로 수행하였다. 균주 IFO 3293은 2일 동안 L-아스코르브산 5.7g/ℓ를 생산하였다.

실시예 11

액체 배지에서 성장한 휴지기 세포를 사용하는 D-솔비톨로부터 L-아스코르브산의 생산

글루코노박터 옥시단스 N44-1의 세포를 D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카, 스위스 부츠) 15g/ℓ,MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ 및 CaCO₃ 15g/ℓ를 함유하는 제 5 배지 200㎖중에 2ℓ 들이 조절된 진탕 플라스크에서 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 성장시켰다. 24시간 후, 배양물을 3220g에서 원심분리하고(에펜도르프(Eppendorf) 5810R, 독일 햄버그) 세포를 0.9% NaCl 용액에 재현탁하고 다시 3220g에서 원심분리하고 세포 펠렛을 사용하여 총 성장 배지(D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ, CaCO₃ 15g/ℓ) 50㎖를 함유하는 하나의 조절된 500㎖ 들이 진탕 플라스크 및 생산 배지(D-솔비톨 100g/ℓ, NaCl 3g/ℓ, CaC0₃ 10g/ℓ) 50㎖를 함유하는 또다른 조절된 500㎖ 들이 진탕 플라스크에 접종하였다. 초기 세포 밀도를 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도로서 측정하고 2개의 플라스크에서 10이었다. 2개의 플라스크를 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 48시간 후, 성장 배지 및 생산 배지중 세포 현탁액은 각각 L-아스코르브산 1.06 및 1.18g/ℓ를 축척하였다. 추가의 성장이 접종 기간동안 총 배지에서 관찰되지 안항T다.

실시예 12

증가된 SNDHai 유전자 투여량으로 재조합 미생물의 휴지기 세포에 의해 L-솔보손 또는 D-솔비톨로부터 L-아스코르브산의 생산

상류 및 하류 측면 구역과 함께 글루코노박터 옥시단스 N44-1(서열 번호1)의 SNDHai 유전자를 주형으로서 균주 N44-1의 염색체 DNA 및 탐침 세트 N1(서열 번호 28) 및 N2(서열 번호 29)로 PCR에 의해 증폭하였다.

PCR을 공급자의 지시에 따라서 GC-풍부한 PCR 시스템(로슈 다이아크로스틱스 게엠베하)로 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 벡터 pCR2.1-TOPO(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내로 삽입하였다. 이어서, 생성된 플라스미드를 HindIII 및 XhoI으로 절단하였다. SNDHai 유전자를 포함하는 HindIII-XhoI 단편을 이미 HindIII 및 XhoI로 처리된 벡터 pVK(미국 균주 보관 은행에 이용가능한 목록 제 ATCC 37156)과 연결하였다. 연결체 혼합물을 사용하여 에세리키아 콜라이 TG1에 형질전환하였다. pVK-P-SNDHai-T로 지칭하는 목적 플라스미드를 에세리키아 콜라이로부터 단리하고 표준 방법(일렉트로셀(Electrocell) 증폭기 ECM600, 비티엑스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아 산 디에고)을 사용하는 전기천공에 의해 글루코노박터 옥시단스 균주 N44-1에 도입하였다.

N44-1(pVK-P-SNDHai-T) 3개의 독립적인 형질전환체와 함께 부계 균주 글루코노박터 옥시단스 N44-1을 각각 제 3BD 한천 배지 및 MD 한천 배지 상에서 성장시켰다. 세포를 플레이트로부터 긁어내어 실시예 9에서 기술된 바와 같이 휴지기 세포 반응(기질로서 1% L-솔보손)을 위해 사용하였다. 제 3BD 한천 상에서 성장시킨 후, 휴지기 세포에서 분석 균주 N44-1은 L-아스코르브산 2.5g/ℓ를 생산하고 반면에 균주 N44-1(pVK-P-SNDHai-T) 클론 1, 2 및 3은 각각 L-아스코르브산 4.2, 4.1 및 4.2g/ℓ를 생산하였다. MB 한천 상에 성장 시킨 후, 휴지기 세포에서 분석 균주 N44-1은 L-아스코르브산 0.12g/ℓ를 생산하고 반면에 균주 N44-1(pVK-P-SNDHai-T) 클론 1, 2 및 3은 각각 L-아스코르브산 1.8, 2.5 및 0.94g/ℓ를 생산하였다.

또다른 반응은 제 5 배지(D-솔비톨 100g/ℓ, 글리세롤 0.5g/ℓ, 효모 추출물 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ, CaCO₃ 15g/ℓ) 50㎖에서 한쌍의 500㎖ 들이 조절된 진탕 플라스크에서 30℃에서 220rpm으로 진탕하면서 3일 동안 배양된 글루코노박터 옥시단스 N44-1 및 클론 2(상기를 참조하시오)를 사용하여 수행하였다. 각각의 균주에 대한 하나의 플라스크로부터, 생성된 배양액을 500rpm에서 원심분리하여 CaCO₃를 제거하였다. 이 단계로부터 상청액을 5,000rpm에서 원심분리한 후 세포를 펠렛화하였다. 수집된 세포를 0.9% NaCl 용액 10㎖내에 재현탁하고 다시 5,000rpm으로 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 수집된 세포를 물에 재현탁하고 이를 사용하여 10㎖ 반응 관에서 600nm에서 5OD에 상응하는 최종 휴지기 세포 밀도로 생산 배지(D-솔비톨 20g/ℓ, NaCl 3g/ℓ, CaCO₃ 10g/ℓ) 1㎖에 접종하였다. 30℃에서 220rpm으로 반응 시간 20시간 후, 상청액을 균주 N44-1 및 SNDHai를 과발현하는 N44-1에 대해서 각각 L-아스코르브산 360 및 760mg/ℓ를 함유하는 생산 플라스크로부터 수집하였다. 반대로, 72시간 후 상청액을 각각 L-아스코르브산 0 및 440mg/ℓ를 함유하는 잔류하는 성장 배지로부터 수집하였다.

실시예 13

에세리키아 콜라이의 휴지기 세포에서 L-솔보손으로부터 L-아스코르브산의 생산

서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 2364에 상응하는 SNDHai-1로 명명되는 종결 코돈 없는 SNDHai 유전자를 탐침 쌍 SNDHai-Nde(서열 번호 30) 및 SNDHaiHis-X(서열 번호 31)를 사용하는 PCR(로슈 하이 피델리티 키트)에 의해 균주 N44-1 염색체 DNA로부터 증폭하였다.

증폭된 DNA는 pCR2.1-TOPO(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스버그)내로 클로닝하여 SNDHai 서열이 뉴클레오타이드 서열화에 의해 정확하게 확인된 pCR2.1-TOPO-SNDHai-1을 수득하였다. 이어서, SNDHai-1 유전자를 NdeI 및 XhoI으로 절단하고 pET-21b(+)(노바젠(Novagen), 미국 위스콘신주 메디슨)의 NdeI 및 XhoI 부위 사이에 연결하여 pET21b-SNDHaiHis를 생산하고; 6xHis를 SNDHai의 C-말단에 첨가하였다. pET21b-SNDHaiHis를 에세리키아 콜라이 BL21(DE3)내로 도입하였다.

카르베니실린와 함께 LB에서 에세리키아 콜라이 BL21(DE3)/pET21b-SNDHaiHis의 밤새도록 배양한 5㎖를 동일한 배지 200㎖에 접종하였다. 세포를 230rpm에서 37℃로 2시간 동안 배양한 후 1mM IPTG로 유도하고 230rpm에서 25℃로 3시간 동안 배양을 지속하였다. 생성된 배양물을 원심분리하고 식염수로 2회 세척하고 세포펠렛을 물 2㎖에 재현탁하였다. 세포를 30℃에서 15시간동안 실행된 OD₆₀₀이 10인 세포, 1% 솔보손 일수화물, 5μM PQQ, 5mM MgCl₂, 0.3% NaCl, 및 1% CaCO₃를 함유하는 반응 혼합물(5㎖ 시험관중 500㎕)와 휴지기 세포용으로 사용하였다. 15시간 배양한 후 L-아스코르브산 0.14g/ℓ를 생산하였다. 휴지기 세포 반응을 1μM PQQ(다른 조건이 상기 기술된 바와 동일함)로 수행하고, L-아스코르브산 0.05g/ℓ를 3시간 배양 후 생산하였다.

실시예 14

증가된 SNDHai 유전자 투여량으로 재조합 미생물의 휴지기 세포에 의해 D-솔비톨로부터 L-아스코르브산의 생산

SNDHai를 과발현하는 글루코노박터 옥시단스 N44-1의 세포를 D-솔비톨 100g/ℓ 글리세롤, 0.5g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카, 스위스 부츠) 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ 및 CaCO₃ 15g/ℓ를 함유하는 제 5 배지 50㎖에서 500㎖ 들이 조절된 진탕 플라스크내에 30℃에서 180rpm로 진탕하면서 48시간 동안 성장시켰다. 생성된 세포 현탁액을 사용하여 D-솔비톨 100g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카, 스위스 부츠) 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ, KH₂PO₄ 0.3g/ℓ 및 CaS0₄ 0.12g/ℓ로 구성된 배지 1.25ℓ를 함유하는 성장 용기(바이오스타트-MD, 비. 브라운 멜순겐, 독일 멜순겐)로 불리는 2ℓ 들이 생물반응기에 접종하였다. 세포를 30℃에서, 통기 속도 1ℓ/분에서 배양하고, pH를 Na₂CO₃의 25% 용액으로 5.7로 조절하고, 용해된 산소를 교반 속도를 다양하게 함으로써 10% 포화되도록 조절하였다. 24시간 후, 600nm에서 흡광 단위로서 측정된 세포 밀도가 20이었다. 이 시점에서, D-솔비톨 100g/ℓ, 효모 추출물(플루카 바이오케미카, 스위스 부츠) 15g/ℓ, MgS0₄·7H₂0 2.5g/ℓ, KH₂PO₄ 0.3g/ℓ 및 CaS0₄ 0.12g/ℓ을 함유하는 공급 용액을 성장 용기에 125㎖/시간의 속도로 공급하고 수집 속도 125㎖/시간에서 연속적으로 수집하였다. 이 수단에 의해서, 성장 용기중 체적을 1.35ℓ에서 지속적으로 유지하였다. 다른 방법 매개변수는 상술된 바와 같이 조절을 지속하였다.

이 배양액을 생산 용기로 불리는 제 2 반응기내로 125㎖/시간의 속도로 연속적으로 공급하고, D-솔비톨 100g/ℓ, NaCl 0.3g/ℓ 및 CaS0₄ 0.12g/ℓ를 함유하는 생산 배지 5ℓ로 채우고 온도를 30℃로 pH를 7.0으로 NaOH 20% 용액에 의해 조절하였다. 통기 속도는 10리/분에서 일정하게 유지하고, 용해된 산소는 교반 속도를 다양하게 함으로써 20%로 조절하였다. 동일한 조성물을 갖는 생산 배지를 또한 공급 속도 375㎖/시간으로 생산 용기에 연속적으로 공급하였다. 용기 체적을 500㎖/시간으로 상청액을 연속적으로 수집함에 의해 5ℓ로 일정하게 유지하고, 생산 용기로부터 수집된 세포 현탁액을 마스터플렉스 펌프를 사용하여 50ℓ/시간으로 펌프질하여 500KDa 공극 크기(UFP-500-E-9A, 아머샴 바이오사이언시스)를 갖는 통과 초여과 모듈로부터 여과 스트림으로서 생성하였다. 지연 흐름이 용기로 역 펌프질되었다. 생산 용기중 세포 밀도가 600mn에서 100흡광 단위에 도달할 때, 생산 용기중 세포 밀도를 일정하게 유지하기 위해서 세포를 25㎖/시간의 속도로 생산 용기내로 역으로 흐르는 농축된 세포 스트림으로부터 수집하기 시작하였다.

세포가 없는 상청액의 수집 스트림은 아스코르브산 4g/ℓ를 함유하고 연속적으로 500㎖/시간의 속도로 30℃에서 이중 재킷(에코라인(Ecoline) RE112, 라우다(Lauda), 독일 라우다-코에니그쇼펜)을 갖춘 수집 용기내로 공급하였다. 이 용기는 연속적으로 상청액을 희석된 2-성분 전기투석 단위(양이온 교환 막 CMX-S 및 음이온교환 막 ASM 과 10개의 셀 쌍을 함유하는 스택, 총 막 구역 0.2m², 에우로디아 인더스트리스(Eurodia), 프랑스 위쏘우스)로 180ℓ/시간의 속도로 공급하고, 일정한 스트림을 용기 외로 펌프질하여 이 체적 상수를 2ℓ로 유지하였다. 30℃에서 초기 탈이온수를 함유하는 이중 재킷을 갖춘 또다른 용기는 신선한 물을 6.25㎖/시간의 속도로 연속적으로 공급하고 일정한 수용액을 전기투석 단위의 농축된 구획내로 200ℓ/시간의 속도에서 펌프질하고, 일정한 수집 스트림을 용기 외로 펌프질하였다. 공급 용액을 연동식 펌프(7518-00, 미국 마스터플렉스)를 사용하여 전기투석 스택으로 펌프질하고, 각각의 전기투석 구획을 통해서 용액의 재순환은 회전식 펌프(MD-20, IWAK, 일본 도쿄)의 도움으로 수행하였다. 전체 과정 동안, 14V를 전기투석 스택(전원 푸마테크(FuMATech) TS001/5, 독일 세인트 인베르트)에 적용하였다. 수집된 스트림중 L-아스코르브산의 농도는 16g/ℓ였다.

실시예 15

하류 가공 단계에 의해 휴지기 세포 반응에 의해 생산된 L-아스코르브산의 정제

아스코르브산 16g/ℓ를 함유하는 실시예 14의 수집 스트림을 킬레이팅 수지(암버리트(Amberlite) IRC 748, 롬 앤 하쓰(Rohm and Haas), 미국 펜실베니아주 필라델피아)에 공급하여 스트림으로부터 이가 양이온을 제거하였다. 이어서, 냉각된 용기(공급 용기)에 수집하고, 10ℓ가 수집될 때, 이들을 양극성 막 전기투석 단위(7 네오셉타 BP1/CMB 막을 함유하는 스택, 총 막 구역 0.14m², 에우리디아 인더스트리스, 프랑스 위쏘우스)를 통하여 회분식 방식으로 가공하였다. 이 용액을 전기투석 단위의 공급 구획을 통하여 200ℓ/시간으로 펌프질하고, 공급 용기로 재순환시켰다. 초기에 2g/ℓ NaOH 용액 5ℓ를 함유하는 또다른 냉각된 용기(농축 용기)는 양극성 막 전기투석 단위의 농축 구획을 통하여 100ℓ/시간으로 펌프질되었다. 최대 전압 25V 및 최대 전류 20A를 적용함에 의해서, 공급 구획으로부터 나트륨 양이온을 농축 구획으로 전달하고, 따라서 공급 스트림중 존재하는 L-아스코르브산의 나트륨 형태를 상응하는 유리 산 형태로 전환시켰다. 90% 전환 수율에 도달한 후, 반응을 중단하였다. 농축 용기에서, NaOH 7.5g/ℓ를 함유하는 용액 6ℓ를 희석 용기중에 수집하고, 유기 산 그의 유리 산의 형태로 약 L-아스코르브산 16g/ℓ를 함유하고 그의 나트륨 염 형태로 L-아스코르브산 1.6g/ℓ를 함유하는 9ℓ 용액을, 나트륨 염을 유리 산으로 약 99%로 전환 수율을 증가시키기 위해서, 추가로 양이온 교환 수지(암버리트 FPC 21, 롬 앤 하쓰, 미국 펜실베니아주 필라델피아)를 통하여 가공하였다. 다르게는, 전기투석 단계로부터 도달되는 그의 나트륨 염 형태인 L-아스코르브산 16g/ℓ를 함유하는 10ℓ 용액을 99% 수율로 유리 산 형태로 전환되는 직접 양이온 교환 수지에 처리하였다. 이어서, 상술된 방법에 의해 수득되는 유리 산의 형태로 L-아스코르브산의 스트림을 다음 단계의 순서에 의해 추가로 가공하였다: 음이온교환, 활성화된 탄소 처리, 농축, 결정화, 결정의 여과 및 건조. 수득된 결정의 최종 순도는 98%이고, 합해진 하류 가공에서 수득된 수율은 80%이다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Microbial production of L-ascorbic acid <130> 21864 WO <150> EP 03017677.0 <151> 2003-08-14 <160> 31 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2367 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans N44-1 <400> 1 atgaacagcg gcccccgcac gctctccatg atcatcggga ttctgggcgc cctcatggcc 60 gccttcctga tcatcgaagg cctccacctc atcatcctcg gcggctcgtg gttctacacc 120 ctcgccggca tcgcgctggc ggccagcagc gtctacatga tccgtcgcaa catcctctcg 180 acatggatcg ccctgggcct gcttgtggca acagccctgt ggtcgctcgc cgaagtcggc 240 accagcttct ggcccagctt ctcccgcctg atcgtgttcc tgtgcgtcgc cctgatcgcg 300 actctcatgg cgccctggct cagcggcccc ggccggcgct acttcacccg ccccgtcaca 360 ggcgccacat ccggcgccct cggcgcgatc atcgtggctt tcctcgccgg catgttccgg 420 gtccacccga ccatcgcccc gcaggacacc acccacccgc aggaaaccgc gtccaccgcc 480 gactccgacc agccaggcca tgactggccc gcctatggcc gcacggcttc cggcacgcgc 540 tacgccagct tcacgcagat caaccgcgac aatgtcagca agctccgcgt cgcctggacc 600 taccgcaccg gcgacatggc gctgaacggc gccgagttcc agggcacccc catcaagatc 660 ggcgacacgg tctatatctg ctcaccgcac aacatcgtct cggcccttga cccggacacc 720 ggcacggaaa agtggaagtt cgacccccac gcccagacga aagtctggca gcgctgccgc 780 ggcgtcggct actggcatga cagcacggcc acggacgcca acgcgccctg cgcctcgcgc 840 atcgtcctca ccacgatcga cgcccgcctc atcaccatcg acgcccgtac cggccaggcc 900 tgcacggatt tcggaacgaa cggcaacgtc aatctcctga ccggcctcgg cccgacagct 960 cccggctcgt actacccgac cgccgccccc ctcgtggcgg gtgacatcgt ggtcgtcggc 1020 ggccgcatcg ccgataacga gcgcaccggc gagccctccg gcgtcgtccg cggctatgat 1080 gtccgcaccg gcgcacaggt ctgggcctgg gacgccacca acccgcatcg cggcaccaca 1140 cctctggccg aaggcgagat ctaccccgcc gaaaccccca acatgtgggg caccgccagc 1200 tacgacccga aactcaacct cgtcttcttc ccgctcggca accagacccc cgatttctgg 1260 ggcggcgacc gcagcaaggc ctcagacgaa tacaacgacg ccttcgtcgc cgtggacgcc 1320 aagaccggcg acgaacgctg gcacttccgc accgccaacc acgacctcgt ggactacgat 1380 gccacggccc agcccatcct ctatgacatt ccggacggcc atggcggcac ccgcccggcg 1440 atcatcgcca tgaccaagcg cggccagatc ttcgtgctcg accgccgcga cggcaccccg 1500 atcgtccctg tggaaatgcg caaagtcccg caggacggcg caccggaaca ccagtacctc 1560 gcccccgaac agccctattc cgccctctcc atcggaacag agcgcctgaa acccagcgac 1620 atgtggggtg gtacgatctt cgaccagctc ctgtgccgca tccagttcgc ctcctaccgc 1680 tatgaaggcg agttcacccc cgtcaacgag aaacaggcca ccatcatcta tccgggctat 1740 tacggcggca tcaactgggg cggcggcgcc gtggatgaaa gcaccggaac gctgctggtc 1800 aacgacatcc gcatggccca gtggggcaag ttcatgaagc aggaagaagc ccgtcgcagc 1860 ggcttcaaac ccagctcgga aggcgaatat tccgaacaga aaggcacccc ctggggcgtc 1920 gtccgctcga tgttcttctc ccccgccggt ctcccctgcg tgaaaccgcc ctatggcacg 1980 atgaacgcca tcgacctgcg cagcggcaag gtcaaatgga gcatgccgct tggcacgatc 2040 caggacatgc cggtccacgg catggtccca ggcctcgcca tcccgctcgg aatgccgacc 2100 atgagcggcc cgctggccac ccataccggc ctggtgttct tctccggcac gctcgacaac 2160 tatgtccgcg cgctcaacac cgacaccggc gaagtcgtct ggaaagcccg tctccccgtc 2220 gcctcacagg ccgctccgat gagctacatg tccgacaaga ccggcaaaca gtacatcgtc 2280 gtcaccgcag gcggcctgac ccgctccggc gtcgacaaaa accgcggcga ctacgtcatc 2340 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Leu Ser Ile Gly Thr Glu Arg Leu Lys Pro Ser Asp Met 50 55 60 Trp Gly Gly Thr Ile Phe Asp Gln Leu Leu Cys Arg Ile Gln Phe Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Arg Tyr Glu Gly Glu Phe Thr Pro Val Asn Glu Lys Gln Ala 85 90 95 Thr Ile Ile Tyr Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Ile Asn Trp Gly Gly Gly 100 105 110 Ala Val Asp Glu Ser Thr Gly Thr Leu Leu Val Asn Asp Ile Arg Met 115 120 125 Ala Gln Trp Gly Lys Phe Met Lys Gln Glu Glu Ala Arg Arg Ser Gly 130 135 140 Phe Lys Pro Ser Ser Glu Gly Glu Tyr Ser Glu Gln Lys Gly Thr Pro 145 150 155 160 Trp Gly Val Val Arg Ser Met Phe Phe Ser Pro Ala Gly Leu Pro Cys 165 170 175 Val Lys Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asn Ala Ile Asp Leu Arg Ser Gly 180 185 190 Lys Val Lys Trp Ser Met Pro Leu Gly Thr Ile Gln Asp Met Pro Val 195 200 205 His Gly Met Val Pro Gly Leu Ala Ile Pro Leu Gly Met Pro Thr Met 210 215 220 Ser Gly Pro Leu Ala Thr His Thr Gly Leu Val Phe Phe Ser Gly Thr 225 230 235 240 Leu Asp Asn Tyr Val Arg Ala Leu Asn Thr Asp Thr Gly Glu Val Val 245 250 255 <210> 13 <211> 350 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a or c or g or t <400> 13 atcatcggga ttctgggcgc cctcatggcc gccttcctga tcatcgaagg cctccacctc 60 atcatcctcg gcggctcatg gttttacacc ctcgccggca tcgcgctggc agccagcagc 120 gtntacatga tccgtcgcaa catcctctcg acatggatcg ccctcggcct gcttgtggca 180 acagccctgt ggtcgctcgc cgaagtcggc accagcttct ggcccagctt ctcccgcctg 240 atcgtatttc tgtgcgtcgc cctgatcgcg accctcatgg cgccctggct cagcggcccc 300 ggccggcgct acttcacccg ccccgtcaca ggcgccacct ccggcgccct 350 <210> 14 <211> 116 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <400> 14 Ile Ile Gly Ile Leu Gly Ala Leu Met Ala Ala Phe Leu Ile Ile Glu 1 5 10 15 Gly Leu His Leu Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Phe Tyr Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Ile Ala Leu Ala Ala Ser Ser Val Tyr Met Ile Arg Arg Asn Ile 35 40 45 Leu Ser Thr Trp Ile Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Thr Ala Leu Trp 50 55 60 Ser Leu Ala Glu Val Gly Thr Ser Phe Trp Pro Ser Phe Ser Arg Leu 65 70 75 80 Ile Val Phe Leu Cys Val Ala Leu Ile Ala Thr Leu Met Ala Pro Trp 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Phe Thr Arg Pro Val Thr Gly Ala 100 105 110 Thr Ser Gly Ala 115 <210> 15 <211> 808 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <400> 15 gcaagctccg cgtcgcctgg acctaccgca ctggcgacat ggcgctgaac ggggccgagt 60 tccagggcac ccccatcaag atcggcgaca cggtctatat ctgctcgccg cacaacatcg 120 tctcggccct cgaccccgat accggcacgg aaaagtggaa gttcgacccc cacgcccaga 180 cgaaagtctg gcagcgctgc cgcggcgtcg gctactggca tgacagcacg gccacggacg 240 ccaacgcgcc ctgcgcctcg cgcatcgtcc tcaccacgat cgacgcccgc ctcatcacca 300 tcgacgcccg caccggccag gcctgcacgg atttcggaac gaacggcaac gtcaatctcc 360 tgaccggcct cggcccgaca gcccccggtt cctactaccc gaccgccgcc cccctcgtgg 420 ccggtgacat cgtggtcgtc ggcggccgca tcgccgataa cgagcgcacc ggcgaaccct 480 ccggcgtcgt ccgcggctat gacgtccgca ccggcgcgca ggtctgggcc tgggacgcca 540 ccaacccgca tcgcggcacc acaccgctgg ccgaaggcga gatctatccc gccgaaaccc 600 ccaacatgtg gggcaccgcc agctacgacc cgaagctcaa cctcgtcttc ttcccgctcg 660 gcaaccagac ccccgatttc tggggcggcg accgcagcaa ggcttctgat gaatacaacg 720 acgccttcgt cgccgtggac gccaagaccg gcgacgaacg ctggcacttc cgcaccgcca 780 accacgacct cgtggactac gatgccac 808 <210> 16 <211> 268 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <400> 16 Lys Leu Arg Val Ala Trp Thr Tyr Arg Thr Gly Asp Met Ala Leu Asn 1 5 10 15 Gly Ala Glu Phe Gln Gly Thr Pro Ile Lys Ile Gly Asp Thr Val Tyr 20 25 30 Ile Cys Ser Pro His Asn Ile Val Ser Ala Leu Asp Pro Asp Thr Gly 35 40 45 Thr Glu Lys Trp Lys Phe Asp Pro His Ala Gln Thr Lys Val Trp Gln 50 55 60 Arg Cys Arg Gly Val Gly Tyr Trp His Asp Ser Thr Ala Thr Asp Ala 65 70 75 80 Asn Ala Pro Cys Ala Ser Arg Ile Val Leu Thr Thr Ile Asp Ala Arg 85 90 95 Leu Ile Thr Ile Asp Ala Arg Thr Gly Gln Ala Cys Thr Asp Phe Gly 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly Leu Gly Pro Thr Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Tyr Tyr Pro Thr Ala Ala Pro Leu Val Ala Gly Asp Ile Val 130 135 140 Val Val Gly Gly Arg Ile Ala Asp Asn Glu Arg Thr Gly Glu Pro Ser 145 150 155 160 Gly Val Val Arg Gly Tyr Asp Val Arg Thr Gly Ala Gln Val Trp Ala 165 170 175 Trp Asp Ala Thr Asn Pro His Arg Gly Thr Thr Pro Leu Ala Glu Gly 180 185 190 Glu Ile Tyr Pro Ala Glu Thr Pro Asn Met Trp Gly Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Asp Pro Lys Leu Asn Leu Val Phe Phe Pro Leu Gly Asn Gln Thr Pro 210 215 220 Asp Phe Trp Gly Gly Asp Arg Ser Lys Ala Ser Asp Glu Tyr Asn Asp 225 230 235 240 Ala Phe Val Ala Val Asp Ala Lys Thr Gly Asp Glu Arg Trp His Phe 245 250 255 Arg Thr Ala Asn His Asp Leu Val Asp Tyr Asp Ala 260 265 <210> 17 <211> 800 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <400> 17 tcttcgtgct cgaccgccgc gacggcaccc cgatcgtccc cgtggaaatg cgcaaagtcc 60 cgcaggacgg cgcaccggaa caccagtacc tcgcccccga acagccctat tccgccctct 120 ccatcggaac agagcgcctg aaacccagcg atatgtgggg tggtacgatt ttcgaccagc 180 tcctgtgccg catccagttc gcctcctacc gctatgaagg cgagttcacc cccgtcaacg 240 agaaacaggc caccatcatc tatccgggct attacggcgg catcaactgg ggcggcggcg 300 ccgtggatga aagcaccgga acgctgctgg tcaacgacat ccgcatggcc cagtggggca 360 agttcatgaa gcaggaagaa gcccgtcgca gcggcttcaa acccagctcg gaaggcgaat 420 attccgaaca gaaaggcacc ccctggggcg tcgtccgctc gatgttcttc tcccccgccg 480 gtctcccctg cgtaaaaccg ccctatggca cgatgaacgc catcgacctg cgcagcggca 540 aggtgaaatg gagcatgccg cttggcacga tccaggacat gccggtccac ggcatggtcc 600 caggcctcgc catcccgctc ggaatgccaa ccatgagcgg cccgctggcc acccataccg 660 gcttggtctt cttctccggc acgctcgaca actacgtccg cgcgctcaac accgacaccg 720 gcgaggtcgt ctggaaagcc cgtctccccg tcgcctcaca ggccgctccg atgagctaca 780 tgtccgacaa gaccggcaaa 800 <210> 18 <211> 266 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans IFO 3287 <400> 18 Phe Val Leu Asp Arg Arg Asp Gly Thr Pro Ile Val Pro Val Glu Met 1 5 10 15 Arg Lys Val Pro Gln Asp Gly Ala Pro Glu His Gln Tyr Leu Ala Pro 20 25 30 Glu Gln Pro Tyr Ser Ala Leu Ser Ile Gly Thr Glu Arg Leu Lys Pro 35 40 45 Ser Asp Met Trp Gly Gly Thr Ile Phe Asp Gln Leu Leu Cys Arg Ile 50 55 60 Gln Phe Ala Ser Tyr Arg Tyr Glu Gly Glu Phe Thr Pro Val Asn Glu 65 70 75 80 Lys Gln Ala Thr Ile Ile Tyr Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Ile Asn Trp 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Val Asp Glu Ser Thr Gly Thr Leu Leu Val Asn Asp 100 105 110 Ile Arg Met Ala Gln Trp Gly Lys Phe Met Lys Gln Glu Glu Ala Arg 115 120 125 Arg Ser Gly Phe Lys Pro Ser Ser Glu Gly Glu Tyr Ser Glu Gln Lys 130 135 140 Gly Thr Pro Trp Gly Val Val Arg Ser Met Phe Phe Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Leu Pro Cys Val Lys Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asn Ala Ile Asp Leu 165 170 175 Arg Ser Gly Lys Val Lys Trp Ser Met Pro Leu Gly Thr Ile Gln Asp 180 185 190 Met Pro Val His Gly Met Val Pro Gly Leu Ala Ile Pro Leu Gly Met 195 200 205 Pro Thr Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr His Thr Gly Leu Val Phe Phe 210 215 220 Ser Gly Thr Leu Asp Asn Tyr Val Arg Ala Leu Asn Thr Asp Thr Gly 225 230 235 240 Glu Val Val Trp Lys Ala Arg Leu Pro Val Ala Ser Gln Ala Ala Pro 245 250 255 Met Ser Tyr Met Ser Asp Lys Thr Gly Lys 260 265 <210> 19 <211> 360 <212> DNA <213> Acetobacter sp. ATCC 15164 <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a or c or g or t <400> 19 atcatcggga ttctgggcgc cctcatggcc gccttcctga tcatcgaagg cctccacctc 60 atcatcctcg gcggctcgtg gttttacacc ctcgccggca tcgcgctggc ggccagcagc 120 gtntacatga tccgtcgcaa catcctctcg acatggatcg ccctcggcct gcttgtagca 180 acagccctgt ggtcgctcgc cgaagtcggc accagcttct ggcccagctt ctcccgcctg 240 atcgtgttcc tgtgcgtcgc cctgatcgcg actctcatgg cgccctggct cagcggcccc 300 ggccggcgct acttcacccg ccccgtcaca ggggccacct ccggcgcact cggcgccatc 360 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Acetobacter sp. ATCC 15164 <400> 20 Ile Ile Gly Ile Leu Gly Ala Leu Met Ala Ala Phe Leu Ile Ile Glu 1 5 10 15 Gly Leu His Leu Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Phe Tyr Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Ile Ala Leu Ala Ala Ser Ser Val Tyr Met Ile Arg Arg Asn Ile 35 40 45 Leu Ser Thr Trp Ile Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Thr Ala Leu Trp 50 55 60 Ser Leu Ala Glu Val Gly Thr Ser Phe Trp Pro Ser Phe Ser Arg Leu 65 70 75 80 Ile Val Phe Leu Cys Val Ala Leu Ile Ala Thr Leu Met Ala Pro Trp 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Phe Thr Arg Pro Val Thr Gly Ala 100 105 110 Thr Ser Gly Ala Leu Gly Ala Ile 115 120 <210> 21 <211> 760 <212> DNA <213> Acetobacter sp. ATCC 15164 <400> 21 accgcgacaa tgtcagcaag ctccgcgtcg cctggaccta ccgcaccggc gacatggcgc 60 tgaacggcgc cgaattccag ggcaccccca tcaagatcgg cgatacggtc tatatctgct 120 caccccacaa catcgtctcg gccctcgacc ccgacaccgg cacggaaaag tggaagttcg 180 acccccacgc ccagacgaaa gtctggcagc gctgccgcgg cgtcggctac tggcatgaca 240 gcacagccac ggacgccaac gcgccctgcg cctcgcgcat cgtcctcacc acgatcgacg 300 cccgcctcat caccatcgac gcccgcaccg gccaggcctg cacggatttc ggaacgaacg 360 gcaacgtcaa tctcctgacc ggcctcggcc cgacagcccc cggctcctac tacccgaccg 420 ccgcccccct cgtggcgggt gacatcgtgg tcgtcggcgg ccgcatcgcc gataacgagc 480 gcacaggcga gccttccggc gtcgtccgcg gctacgacgt ccgcaccggc gcacaggtct 540 gggcctggga cgccaccaac ccgcatcgcg gcaccacacc actggccgaa ggcgagatct 600 accccgccga aacccccaac atgtggggca ccgccagcta cgacccgaaa ctcaacctcg 660 tcttcttccc gctcggcaac cagacccccg atttctgggg cggcgaccgc agcaaggcct 720 cggatgaata caacgacgcc ttcgtcgccg tggacgccaa 760 <210> 22 <211> 252 <212> PRT <213> Acetobacter sp. ATCC 15164 <400> 22 Arg Asp Asn Val Ser Lys Leu Arg Val Ala Trp Thr Tyr Arg Thr Gly 1 5 10 15 Asp Met Ala Leu Asn Gly Ala Glu Phe Gln Gly Thr Pro Ile Lys Ile 20 25 30 Gly Asp Thr Val Tyr Ile Cys Ser Pro His Asn Ile Val Ser Ala Leu 35 40 45 Asp Pro Asp Thr Gly Thr Glu Lys Trp Lys Phe Asp Pro His Ala Gln 50 55 60 Thr Lys Val Trp Gln Arg Cys Arg Gly Val Gly Tyr Trp His Asp Ser 65 70 75 80 Thr Ala Thr Asp Ala Asn Ala Pro Cys Ala Ser Arg Ile Val Leu Thr 85 90 95 Thr Ile Asp Ala Arg Leu Ile Thr Ile Asp Ala Arg Thr Gly Gln Ala 100 105 110 Cys Thr Asp Phe Gly Thr Asn Gly Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly Leu 115 120 125 Gly Pro Thr Ala Pro Gly Ser Tyr Tyr Pro Thr Ala Ala Pro Leu Val 130 135 140 Ala Gly Asp Ile Val Val Val Gly Gly Arg Ile Ala Asp Asn Glu Arg 145 150 155 160 Thr Gly Glu Pro Ser Gly Val Val Arg Gly Tyr Asp Val Arg Thr Gly 165 170 175 Ala Gln Val Trp Ala Trp Asp Ala Thr Asn Pro His Arg Gly Thr Thr 180 185 190 Pro Leu Ala Glu Gly Glu Ile Tyr Pro Ala Glu Thr Pro Asn Met Trp 195 200 205 Gly Thr Ala Ser Tyr Asp Pro Lys Leu Asn Leu Val Phe Phe Pro Leu 210 215 220 Gly Asn Gln Thr Pro Asp Phe Trp Gly Gly Asp Arg Ser Lys Ala Ser 225 230 235 240 Asp Glu Tyr Asn Asp Ala Phe Val Ala Val Asp Ala 245 250 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 23 ggcgcgatca tcgtggcttt 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 24 gggtcaaggg ccgagacgat gtt 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 25 gcacgctcga caactatgtc 20 <210> 26 <211> 2367 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans IFO 3244 <400> 26 atgaacagcg gcccccgcac gctctccatg atcatcggga ttctgggcgc cctcatggcc 60 gccttcctga tcatcgaagg cctccacctc atcatcctcg gcggctcgtg gttctacacc 120 ctcgccggca tcgcgctggc ggccagcagc gtctacatga tccgtcgcaa catcctctcg 180 acatggatcg ccctcggcct gcttgtagca acagccctgt ggtcgctcgc cgaagtcggc 240 accagcttct ggcccagctt ctcccgcctg atcgtgttcc tgtgcgtcgc cctgatcgcg 300 actctcatgg cgccctggct cagcggcccc ggccggcgct acttcacccg ccccgtcaca 360 ggggccacct ccggcgcact cggcgccatc atcgtggctt tcctcgccgg catgttccgg 420 gtccacccga ccatcgcccc gcaggacacc acccacccgc aggaaaccgc gtccaccgcc 480 gactccgacc agcccggcca tgactggccc gcctatggcc gcacagcttc cggcacgcgc 540 tacgccagct tcacacagat caaccgcgac aatgtcagca agctccgcgt cgcctggacc 600 taccgcaccg gcgacatggc gctgaacggc gccgaattcc agggcacccc catcaagatc 660 ggcgatacgg tctatatctg ctcaccccac aacatcgtct cggccctcga ccccgacacc 720 ggcacggaaa agtggaagtt cgacccccac gcccagacga aagtctggca gcgctgccgc 780 ggcgtcggct actggcatga cagcacagcc acggacgcca acgcgccctg cgcctcgcgc 840 atcgtcctca ccacgatcga cgcccgcctc atcaccatcg acgcccgcac cggccaggcc 900 tgcacggatt tcggaacgaa cggcaacgtc aatctcctga ccggcctcgg cccgacagcc 960 cccggctcct actacccgac cgccgccccc ctcgtggcgg gtgacatcgt ggtcgtcggc 1020 ggccgcatcg ccgataacga gcgcacaggc gagccttccg gcgtcgtccg cggctacgac 1080 gtccgcaccg gcgcacaggt ctgggcctgg gacgccacca acccgcatcg cggcaccaca 1140 ccactggccg aaggcgagat ctaccccgcc gaaaccccca acatgtgggg caccgccagc 1200 tacgacccga aactcaacct cgtcttcttc ccgctcggca accagacccc cgatttctgg 1260 ggcggcgacc gcagcaaggc ctcggatgaa tacaacgacg ccttcgtcgc cgtggacgcc 1320 aaaaccggcg acgaacgctg gcacttccgc accgccaacc acgatctcgt ggactacgat 1380 gccacggccc agcccatcct ctacgacatt ccggacggcc atggcggcac ccgcccggcg 1440 atcatcgcca tgaccaagcg cggccagatc ttcgtgctcg accgccgcga cggcaccccg 1500 atcgtccccg tggaaatgcg caaagtcccc caggacggcg caccggaaca ccagtacctc 1560 gcccccgaac agccctattc cgccctctcc atcggaacag agcgcctgaa acccagcgat 1620 atgtggggcg gcacgatctt cgaccagctc ctgtgccgca tccagttcgc ctcctaccgc 1680 tatgaaggcg agttcacccc cgtcaacgag aagcaggcca ccatcatcta tccgggctat 1740 tacggcggca tcaactgggg cggcggcgcc gtggatgaaa gcaccggaac gctgctggtc 1800 aacgacatcc gcatggccca gtggggcaag ttcatgaagc aagaagaagc ccgccgcagc 1860 ggcttcaaac ccagctcgga aggcgaatat tccgaacaga aaggcacccc ctggggcgtc 1920 gtccgctcga tgttcttctc ccccgccggt ctcccctgcg tgaaaccgcc ctatggcacg 1980 atgaacgcca tcgacctgcg cagcggcaag gtcaaatgga gcatgccgct tggcacgatc 2040 caggacatgc cggtccacgg catggtcccc ggcctcgcca tcccgctcgg aatgccgacc 2100 atgagcggcc cgctggccac ccataccggc ctggtcttct tctccggcac gctcgacaac 2160 tatgtccgcg cgctcaacac cgacaccggc gaagtcgtct ggaaagcccg tctccccgtc 2220 gcctcacagg ccgctccgat gagctacatg tccgacaaga ccggcaaaca gtacatcgtc 2280 gtcaccgcag gcggcctgac ccgctccggc gtcgacaaaa accgcggcga ctacgtcatc 2340 gcctacgccc tgccctccga agaataa 2367 <210> 27 <211> 788 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans IFO 3244 <400> 27 Met Asn Ser Gly Pro Arg Thr Leu Ser Met Ile Ile Gly Ile Leu Gly 1 5 10 15 Ala Leu Met Ala Ala Phe Leu Ile Ile Glu Gly Leu His Leu Ile Ile 20 25 30 Leu Gly Gly Ser Trp Phe Tyr Thr Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Val Tyr Met Ile Arg Arg Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Ala 50 55 60 Leu Gly Leu Leu Val Ala Thr Ala Leu Trp Ser Leu Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Trp Pro Ser Phe Ser Arg Leu Ile Val Phe Leu Cys Val 85 90 95 Ala Leu Ile Ala Thr Leu Met Ala Pro Trp Leu Ser Gly Pro Gly Arg 100 105 110 Arg Tyr Phe Thr Arg Pro Val Thr Gly Ala Thr Ser Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Ala Ile Ile Val Ala Phe Leu Ala Gly Met Phe Arg Val His Pro Thr 130 135 140 Ile Ala Pro Gln Asp Thr Thr His Pro Gln Glu Thr Ala Ser Thr Ala 145 150 155 160 Asp Ser Asp Gln Pro Gly His Asp Trp Pro Ala Tyr Gly Arg Thr Ala 165 170 175 Ser Gly Thr Arg Tyr Ala Ser Phe Thr Gln Ile Asn Arg Asp Asn Val 180 185 190 Ser Lys Leu Arg Val Ala Trp Thr Tyr Arg Thr Gly Asp Met Ala Leu 195 200 205 Asn Gly Ala Glu Phe Gln Gly Thr Pro Ile Lys Ile Gly Asp Thr Val 210 215 220 Tyr Ile Cys Ser Pro His Asn Ile Val Ser Ala Leu Asp Pro Asp Thr 225 230 235 240 Gly Thr Glu Lys Trp Lys Phe Asp Pro His Ala Gln Thr Lys Val Trp 245 250 255 Gln Arg Cys Arg Gly Val Gly Tyr Trp His Asp Ser Thr Ala Thr Asp 260 265 270 Ala Asn Ala Pro Cys Ala Ser Arg Ile Val Leu Thr Thr Ile Asp Ala 275 280 285 Arg Leu Ile Thr Ile Asp Ala Arg Thr Gly Gln Ala Cys Thr Asp Phe 290 295 300 Gly Thr Asn Gly Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly Leu Gly Pro Thr Ala 305 310 315 320 Pro Gly Ser Tyr Tyr Pro Thr Ala Ala Pro Leu Val Ala Gly Asp Ile 325 330 335 Val Val Val Gly Gly Arg Ile Ala Asp Asn Glu Arg Thr Gly Glu Pro 340 345 350 Ser Gly Val Val Arg Gly Tyr Asp Val Arg Thr Gly Ala Gln Val Trp 355 360 365 Ala Trp Asp Ala Thr Asn Pro His Arg Gly Thr Thr Pro Leu Ala Glu 370 375 380 Gly Glu Ile Tyr Pro Ala Glu Thr Pro Asn Met Trp Gly Thr Ala Ser 385 390 395 400 Tyr Asp Pro Lys Leu Asn Leu Val Phe Phe Pro Leu Gly Asn Gln Thr 405 410 415 Pro Asp Phe Trp Gly Gly Asp Arg Ser Lys Ala Ser Asp Glu Tyr Asn 420 425 430 Asp Ala Phe Val Ala Val Asp Ala Lys Thr Gly Asp Glu Arg Trp His 435 440 445 Phe Arg Thr Ala Asn His Asp Leu Val Asp Tyr Asp Ala Thr Ala Gln 450 455 460 Pro Ile Leu Tyr Asp Ile Pro Asp Gly His Gly Gly Thr Arg Pro Ala 465 470 475 480 Ile Ile Ala Met Thr Lys Arg Gly Gln Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg 485 490 495 Asp Gly Thr Pro Ile Val Pro Val Glu Met Arg Lys Val Pro Gln Asp 500 505 510 Gly Ala Pro Glu His Gln Tyr Leu Ala Pro Glu Gln Pro Tyr Ser Ala 515 520 525 Leu Ser Ile Gly Thr Glu Arg Leu Lys Pro Ser Asp Met Trp Gly Gly 530 535 540 Thr Ile Phe Asp Gln Leu Leu Cys Arg Ile Gln Phe Ala Ser Tyr Arg 545 550 555 560 Tyr Glu Gly Glu Phe Thr Pro Val Asn Glu Lys Gln Ala Thr Ile Ile 565 570 575 Tyr Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Ile Asn Trp Gly Gly Gly Ala Val Asp 580 585 590 Glu Ser Thr Gly Thr Leu Leu Val Asn Asp Ile Arg Met Ala Gln Trp 595 600 605 Gly Lys Phe Met Lys Gln Glu Glu Ala Arg Arg Ser Gly Phe Lys Pro 610 615 620 Ser Ser Glu Gly Glu Tyr Ser Glu Gln Lys Gly Thr Pro Trp Gly Val 625 630 635 640 Val Arg Ser Met Phe Phe Ser Pro Ala Gly Leu Pro Cys Val Lys Pro 645 650 655 Pro Tyr Gly Thr Met Asn Ala Ile Asp Leu Arg Ser Gly Lys Val Lys 660 665 670 Trp Ser Met Pro Leu Gly Thr Ile Gln Asp Met Pro Val His Gly Met 675 680 685 Val Pro Gly Leu Ala Ile Pro Leu Gly Met Pro Thr Met Ser Gly Pro 690 695 700 Leu Ala Thr His Thr Gly Leu Val Phe Phe Ser Gly Thr Leu Asp Asn 705 710 715 720 Tyr Val Arg Ala Leu Asn Thr Asp Thr Gly Glu Val Val Trp Lys Ala 725 730 735 Arg Leu Pro Val Ala Ser Gln Ala Ala Pro Met Ser Tyr Met Ser Asp 740 745 750 Lys Thr Gly Lys Gln Tyr Ile Val Val Thr Ala Gly Gly Leu Thr Arg 755 760 765 Ser Gly Val Asp Lys Asn Arg Gly Asp Tyr Val Ile Ala Tyr Ala Leu 770 775 780 Pro Ser Glu Glu 785 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 ccgaattcag gccgaacagc agcaggtcac 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 29 gtgcctgggt acctcggtgg aggtcatgaa 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 30 aagtcatatg aacagcggcc cccgcacgct 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 31 atctcgagtt cttcggaggg cagggcgtag 30

Claims (37)

1. 서열 번호 1의 20개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
2. 제 1 항에 있어서,

   서열 번호 1의 부분적인 뉴클레오타이드 서열이 50개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
3. 제 1 항에 있어서,

   서열 번호 1의 부분적인 뉴클레오타이드 서열이 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
4. 제 3 항에 있어서,

   부분적인 뉴클레오타이드 서열이, 100개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드와 비교시 서열 번호 1과 60% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

   부분적인 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 1과 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   부분적인 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 유래하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

   서열 번호 1, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 26으로 구성된 군에서 선택되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
8. 제 1 항에 있어서,

   부분적인 뉴클레오타이드 서열이 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 23 및 24로 구성된 군에서 선택되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
10. 제 9 항에 있어서,

    서열 번호 2, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 27로 구성된 군에서 선택된 25개 이상의 연속적인 아미노산의 부분적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,

    부분적인 아미노산 서열이 35개 이상의 연속적인 아미노산을 갖는 폴리펩타이드.
12. L-솔보손 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현을 위한 재조합 DNA 분자로서 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 DNA 분자.
13. 제 12 항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
14. 제 12 항에 따른 재조합 DNA 및/또는 제 13 항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 재조합 유기체.
15. 제 14 항에 있어서,

    재조합 DNA가 염색체 내로 적어도 부분적으로 통합되는 재조합 유기체.
16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,

    곰팡이, 식물, 동물 및 세균 세포로 구성된 군에서 선택되는 재조합 유기체.
17. 제 16 항에 있어서,

    유기체가 글루코노박터(Gluconobacter), 아세토박터(Acetobacter), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 에세리키아(Escherichia)로 구성된 군에서 선택된 속의 세균인 재조합 유기체.
18. (a) 적합한 배지에서 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항의 재조합 유기체를 증식시키는 단계 및

    (b) 상기 배지로부터 L-아스코르브산을 회수 및 분리하는 단계

    를 포함하는, D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로 구성된 군에서 선택된 기질로부터 L-아스코르브산의 제조방법.
19. (a) 적합한 배지에서 제 9 항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 비-재조합 미생물을 증식시키는 단계 및

    (b) 상기 배지로부터 L-아스코르브산을 회수 및 분리하는 단계

    를 포함하는, D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로 구성된 군에서 선택된 기질로부터 L-아스코르브산의 제조방법.
20. D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로 구성된 군에서 선택된 기질을 제 9 항에 따른 단리된 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는 L-아스코르브산의 제조방법.
21. (a) 적합한 배지에서 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 따른 유기체의 재조합체 또는 제 9 항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 비-재조합 미생물을 증식시키는 단계,

    (b) L-솔보손 탈수소효소를 단리 및 정제하는 단계,

    (c) 단계 (b)의 L-솔보손 탈수소효소의 존재하에 기질을 배양하는 단계 및

    (d) 반응 혼합물로부터 L-아스코르브산을 회수 및 분리하는 단계

    를 포함하는, D-솔비톨, L-솔보스 및 L-솔보손으로 구성된 군에서 선택된 기질로부터 L-아스코르브산의 제조방법.
22. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 유기체를 적합한 배지에서 증식시키고, 세포를 파쇄하고, L-솔보손 탈수소효소를 단리하는 L-솔보손 탈수소효소의 제조방법.
23. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 비-재조합 미생물을 적합한 배지에서 증식시키고, 세포를 파쇄하고, L-솔보손 탈수소효소를 단리하는 L-솔보손 탈수소효소의 제조방법.
24. 미생물의 휴지기 세포를 포함하는 배지에서 기질을 비타민 C로 전환시키는 단계를 포함하는 비타민 C의 제조방법.
25. 제 25 항에 있어서,

    (a) 성장할 수 있는 조건 하에서 미생물을 배양하는 단계,

    (b) 미생물의 성장 속도가 감소되도록 조건을 변화시켜 휴지기 세포를 초래하는 단계 및

    (c) 단계 (b)의 휴지기 세포를 사용하여 기질로부터 비타민 C를 제조하는 단계

    를 포함하는 제조방법.
26. 제 25 항에 있어서,

    단계 (a) 및 (c)가 2개 이상의 분리 용기에서 수행되는 제조방법.
27. 제 25 항에 있어서,

    단계 (a) 및 (c)가 임의의 세척 및/또는 단리 단계에 의해 분리되지 않는 제조방법.
28. 제 24 항 내지 제 27 항중 어느 한 항에 있어서,

    미생물이 회분식, 공급-회분식, 연속식 또는 반-연속식 방식으로 성장하는 제조방법.
29. 제 25 항에 있어서,

    단계 (c)가 회분식, 공급-회분식, 연속식 또는 반-연속식 방식으로 수행되는 제조방법.
30. 제 24 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 있어서,

    OD 600nm에서 측정된 배지에서 휴지기 세포의 밀도가 10 이상인 제조방법.
31. 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,

    생산된 비타민 C의 수율이 1.8g/ℓ 이상인 제조방법.
32. 제 24 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,

    미생물이 효모, 조류 및 세균으로 구성된 군에서 선택되는 제조방법.
33. 제 24 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 있어서,

    미생물이 칸디다(Candida), 사카로마이세스(Saccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 시조사카로마이세스(Scyzosaccharomyces), 클루이버로마이세스(Kluyveromyces), 클로렐라(Chlorella), 글루코노박터, 아세토박터 아세티(aceti), 판토에아(Pantoea), 크립토코커스(Cryptococcus), 슈도모나스 및 에세리키아로 구성된 군에서 선택되는 제조방법.
34. 제 24 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 있어서,

    기질이 D-글루코스, D-솔비톨, L-솔보스, L-솔보손, 2-케토-L-굴로네이트, D-글루코네이트, 2-케토-D-글루코네이트 및 2,5-다이케토-글루코네이트로 구성된 군에서 선택되는 제조방법.
35. 제 24 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서,

    기질로부터 비타민 C 및 2-케토-L-굴론산 둘다를 생산할 수 있는 미생물을 사용하고 이때 비타민 C 대 2-KGA의 농도 비가 0.1 초과인 제조방법.
36. 제 18 항 내지 제 21 항 및 제 24 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서,

    배지로부터 비타민 C를 단리하는 단계 및 선택적으로 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
37. 제 36 항에 있어서,

    모든 정제 단계가 수성 환경에서 수행되는 제조방법.