SU1754779A1 - Способ получени мутантов чумного микроба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к бактериальной генетике. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода мутантов чумного микроба со строго определенными делеци ми Способ заключаетс  в использовании гибридной плазмиды pFs 23, которую ввод т в клетки чумного микроба с последующим отбором бескапсульных вариантов по KmRAps фенотипу

Description

Изобретение относитс  к бактериальной генетике, а именно к области направленного делеционного мутагенеза плазмид

Известен способ получени  мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I, путем посева взвеси на питательную среду, содержащую 15-25 мМ оксалата натри , и инкубировани  при 37°С, что приводит к получению в попул ции Tox+Fra мутантов Y. pestis. Отсутствие капсульного антигена у них обусловлено потерей генов, детерминирующих образование капсулы в результате делеции фрагмента плазмиды pFra/Tox.

К недостаткам прототипа следует отнести то, что причина, обусловливающа  такие делеции, не вы влена Делеци  составл ет 25-33% от размера плаэмидного реплико- на. Это приводит к значительному нарушению структуры всей плазмиды pFra/Tox. Выращивание культур Y pestis на кальций- дефицитных средах при 37°С вызывает повреждени  не только плазмиды pFra/Tox, но и инсерции, делеции плазмиды pCad различной прот женности и мутации в хромосоме Y. pestis. Это в свою очередь приводит

к изменению биологических свойств микроба .

Цель изобретени  - повышение выхода мутантов со строго определенными делеци ми

Цель достигаетс  за счет осуществлени  целенаправленной мутации, привод щей к делеции структурной части fra-оперона. Это происходит в результате гомологичной рекомбинации в клетках Y. pestis гибридной конструкции pFK23 с интактной плазмидой. Затем отбирают бескапсульные варианты по КтгАр8-феиотипу.

Сущность изобретени  заключаетс  в конструировании гибридной плазмиды на основе вектора рНС79. Данный вектор содержит геи /J -лактамазы и не способен стабильно наследоватьс  в клетках чумного микроба без селективного давлени  Гибридна  плазмида несет в своем составе фрагмент ДНК плазмиды pFra/Tox, где центральна  область этого фрагмента, несуща  структурную часть fra-оперона, замещена на ген устойчивости к канамицину. Наличие в рекомбинантной плазмиде областей гомологии с плазмидой pFra/Tox, фланкируюсл

с

XI ел VJ XI о

щих ген антибиотикоустойчивости, при трансформации клеток Y. pestis гибридной плазмидой обеспечивает гомологичную рекомбинацию с плазмидой pFra/Гох, в результате чего у части микробной попул ции на интактной плазмиде pFra/Tcx происходит замещение структурной части fra-one- рона на ген устойчивости к канзмицину, а структурна  часть fra-оперона люминирует из микробной клетки. Инкубируют трансформанты при 28°С в течение 2-3 сут на питательном агаре, содержащем 5 мкг/мл канаиицина. Выросшие клоны пересевают на агар со 100 v.sr/м  ампициллина и отбирают клоны с фенотипом KmrAps.

Клоны с KmrAps фенотипом составл ют 0,1-15% от числа всех грансформантов, причем 100% клонов с КтгАр8-фенотипом несут делецию структурной части fra-onepo- па. Содержание в попул ции рекомбинант- ных клонов с КгпгАрч-фенотипом можно увеличить до 50-80% путем заражени  смесью трансформантов белых мышей, предварительно иммунизированных фракцией 1. Наличие фракции 1 вклегкьх провер ют в реакци х РПГЛ и РНАт

Синтез мышиного токсина, V-антиге- нз определ ют в реакции диффузионной преципитации в геле, Са зависимость, способность к пигментсорбции, фибриноло- гическую, плазмокоагулазную активность и способность к синтезу пестицина I тестируют согласно руководству.

Существенное отличие заключаетс  в трансформации микробных клеток плазмидой pFj-23, обеспечивающей в результате гомологичной рекомбинации с собственной плазмидой pFra/Tox элиминацию структурной части fra-оперона из микробной клетки; получение мутантов проеодитг  на полноценных питательных средах при температуре 2&°С - в наиболее физиологичных дл  культивировани  Y, pestis In vttro услочи х,

Пример 1, Получение рекомбинант- ных плазмид.

Плазмида рЦС4К сконструирована Vieira J., Messing J. Плазмида pFsl получена нами путем клонировани  5,6-мегадаль- тонного Есо Ri-фрагменат плазмиды pFra/Tox из вакционного штамма Y. pebtls ЕВ линии НИИЭГ в составе известного кос- мидного вектора рНС7Э. На ее основе, за счет делецнк 0,8-мегадальтонного SalGl- фрагмента ДНК сконструирована плаими- да pFs2. Данные плазмиды несут в соагаьв клонированных фрагментов ДНК плазмиды pFra/Tox fra-оперон и обеспечивают при температуре 37°С образование белкозой капсулы (R антигена) в несуа их эти .

рукции клетках кишечной палочки и чумного микроба. Векторна  часть плазмиды включает гены Арг, Тсг, а плазмида pFs2 несет лишь ген Арг, т.к. проведенна  в процессе

ее получени  делеци  Sal Fi-фрагмептэ привела к инактивации гена Тсг,

Дл  получени  плазмиды pFsSX ДНК pFsl гидролизовали рестриктазами Sal (ограниченный гидполиэ)и (полный гидро0 лиз), смешивали с Salll-фрагментом плазмиды pUC4K несущий ген устойчивости к камамицину, обрабатывали ДНК-лигазой фага 14, Полу ченным лигатом трансфорг.и- ровали клетки E.collH В 101, отбирали KmrTcr

5 клоны, выдел ли плазмидную ДНК клонов. При получении плазмиды pFs 23 примен ли сходные приемы, за исключением того, что делецию получали обработкой плэзмиды pFc2 рестриктазой Cla.reii Kmr из плазмиды

0 pUC4K встривали по сайту Benn Hi транс- форманты t, coil HB 101 отбирали по КтгАрг- признаку. Сконструированные таким образом плазмиды несут Kmr ген п имеют делецию внутренней области, обеспечиваю5 щей продукцию капсульного антигена.

Иммунологический анализ (РПГА и РНАТ)28 и37°-культур Е.-соМ сплазмидами pFsSx и pFs 23 показал полное отсутствие способности к синтезу капсульного антиге0 на в культуре с титром мк/мл. Результаты иммунологического анализа подтверждены троекратно.

Пример 2. Изучение механизма образовани  Рга -вариаитов.

5 Дл  этой цели использовали получанный Черепановым П. А. (ВНИИПМ) на основе вакционного штамма Y. pestis ЕВ 11ИИЭГ штамм Y. pestis ЕВ 100, содержащий лишь плазмиду, детерминирующую синтез Fl - и

0 Т-антигенов. Трансформаци  клеток Y. pestis EC 100 плазмидой pFs 23 позволила отобрать клоны KmrAps. Они составл ли 1Ь% попул ции трансформантов. Иммуно- химический анализ (РПГА, РНАТ) вариантов

5 Y. pestis ЕВ 100 с плазмидой pFs 23 показал полное отсутствие способности синтеза капсульного антигена в культуре с титром 5-10 мт/мл. Результаты иммунохимическо- го анализа подтверждены троекратно. Вы0 деленную плазмидную ДНК анализировали с помощью рестриктаз. Установлено, что плазмида содержит делецию и вставку Кглг- фрагмента в области, детерминирующей синтез капсульного антигена, как и предпо5 лагалось.

Использование плазмиды pFsSx дл  трансформации клеток Y. pestis ЕВ 100 не привело к по влению KrnrAps клонов.

Пример 3. Получение Рга -вариан- ТОБ штамма Y. pestis ЕВ НИИЭГ.

Клетки Y. pestis ЕВ НИИЭГ (2-суточнз  28°-на  культура на агаре Хоттингера) трансформируют плазмидами pfs 23 и pFsSx. Отбирают Ктг-клоны, объедин ют их и пассируют на иммунных белых мышах, вакцинированных подкожно введением 20 мкг коммерческого препарата F антигена за 3 недели до заражени , Эта процедура способствует завершению процесса речом- бинации и элюминации из попул ции сохранившихс  Рга+-клеток.

За сутки до заражени  животным ввод т внутрибрюшинно РеЗОл -ТНаО в подсолнечном масле (0,2 мл суспензии, содержащей 0,5 мг соли). Из органов павших животных делают высепы на агар Хоттингера , содержащий Km (25 мкг/мл), Отбирают клоны с фенотипом KmrAps. Использование плазмиды pFs 23 позвол ет получить 50-80% клеток с данным фенотипом , 100% которых не способны продуцировать капсульный антиген Использование плазмиды pFsSx приводило к образованию рекомбинантных клонов лишь с фенотипом АргКглг. 25% из них были не способны к продукции капсульного антигена,

Пример 4, Оценка антигенного состава рекомбинантных клонов Y. pestfs ЕВ ВНИИЭГрРз23.

Наличие FI антигена провер ют о 100 клонах путем постановки серологических реакций РПГА и РНАТ 28° и 37°-ных культур, выращенных на агаре Хоттингера. FJ антиген отсутствовал в культуре с титром 5108 м-к/мл.

Синтез мышиного токсина и V-антиге- на определ ют в реакции диффузионной преципитации в геле.

0

5

0

5

9 1

Са -зависимость, способность к пигмент-сорбции фибринолитическую плаз- мокоагулазную активности и способность к синтезу пестицина I тестируют согласно руководству , 100% клонов обладали фенотипом FraTnxV Lcr+PstfFlb fCaa+Psb.

Основным преимуществом предлагае- мсго способа  вл етс  получение бескап- сульных вариантов чумного микроба, сохранивших все остальные фенотипиче- ские признаки исходных штаммов. В их геноме происходит лишь целенаправленное .замещение структурной части fra-оперона п генблок детерминирующей синтез кана- мицинфосфотрансферазы.

Способ примен етс  в генетических исследовани х Y. pestis дл  изучени  ролЈ. антигена фракции Г в биологии этого микроорганизма и дл  получени  плазмид pFra/Tox, маркированным геном антибио- тикоустойчивости в заранее выбранном сайте ,

Способ не требует дорогих реактивов и занимает мало времени.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  мутантов чумного микриба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I, предусматривающий выращивание клеток чумного микроба на питательной среде, отбор м/тантов, содержащих плазмиду pFra/Tox с делецией в генах, ответственных за синтез капсульно- го антигена, отличающийс  тем, что, с целью повиыеьи  выхода мутантов со строго определенными делеци ми, в клетки чумного микроба ввод т плазмиду pFs 23, а мутанты отбирают по KmR Aps фенотипу.