JPS59169496A - ｒＤＮＡクロ−ニング用ベクタ−ｐＶＥ１，欠失および雑種変異体、およびその組換え誘導体、生産物および方法 - Google Patents
ｒＤＮＡクロ−ニング用ベクタ−ｐＶＥ１，欠失および雑種変異体、およびその組換え誘導体、生産物および方法Info
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- JPS59169496A JPS59169496A JP59044794A JP4479484A JPS59169496A JP S59169496 A JPS59169496 A JP S59169496A JP 59044794 A JP59044794 A JP 59044794A JP 4479484 A JP4479484 A JP 4479484A JP S59169496 A JPS59169496 A JP S59169496A
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、細胞系への核酸の取込み、そのような取込み
を行なわせるベクター、および、そのようなベクターを
含む微生物に関するものである。
を行なわせるベクター、および、そのようなベクターを
含む微生物に関するものである。
より明確に言うと、本発明は、特にプラスミドｐＶＥ１
の宿主株である例えば、ストレプトマイセス・アベルミ
タイリス（ＳｔｒｅｐｔＯ−ｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉ
ｔｉｌｉｓ ） Ｍ Ａ ４９９０、ニス・リビタント
（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ ）もしくは、その類似のも
のを含む４１Ｂ菌などの微生′物りローニンク”用ベク
ターとして有用な新規プラスミドｐＶＥＩそれ自体；そ
のゲノム；もしくは全域または断片としての遺伝成分（
ＤＮＡ）；およびその誘導体（その欠失および雑種変形
木）に関するものである。その結果、修飾を受けた細胞
）ま新規のものであり、細胞の復製を通して異種核、俊
及び／捷たは、その生産・吻を生成する手段として、あ
るい（１その中にある異種核酸の存在によって、細胞に
有益な性質を与えることによつ−Ｃ有用である。
の宿主株である例えば、ストレプトマイセス・アベルミ
タイリス（ＳｔｒｅｐｔＯ−ｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉ
ｔｉｌｉｓ ） Ｍ Ａ ４９９０、ニス・リビタント
（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ ）もしくは、その類似のも
のを含む４１Ｂ菌などの微生′物りローニンク”用ベク
ターとして有用な新規プラスミドｐＶＥＩそれ自体；そ
のゲノム；もしくは全域または断片としての遺伝成分（
ＤＮＡ）；およびその誘導体（その欠失および雑種変形
木）に関するものである。その結果、修飾を受けた細胞
）ま新規のものであり、細胞の復製を通して異種核、俊
及び／捷たは、その生産・吻を生成する手段として、あ
るい（１その中にある異種核酸の存在によって、細胞に
有益な性質を与えることによつ−Ｃ有用である。
プラスミドのクローニング用へフタ−としての利用は、
確立された手法である。しかし、これらの技法の放線菌
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）への応用は比較的新ら
しい。
確立された手法である。しかし、これらの技法の放線菌
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）への応用は比較的新ら
しい。
プラスミドベクターと放線菌とでのＤＮＡクローニング
は、最初に、３．１ｉｖｉｄａｎｓ および、Ｓ、
ｃ＋：＋ｅｌｉｃＯＩＯｒＡ ３ （２）でなされた、
３１Ｋｂ（キロ塩基）の低コピー数プラスミド５ＣＰ２
は、メチレノマイシン耐ｊ生のクローニング［（１）
Ｂｉｂｂ、 ＲＩｌ、 Ｊ、、 ５ｃｈＯｔｔｅｌ、
Ｊ、 Ｌ、、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、 。
は、最初に、３．１ｉｖｉｄａｎｓ および、Ｓ、
ｃ＋：＋ｅｌｉｃＯＩＯｒＡ ３ （２）でなされた、
３１Ｋｂ（キロ塩基）の低コピー数プラスミド５ＣＰ２
は、メチレノマイシン耐ｊ生のクローニング［（１）
Ｂｉｂｂ、 ＲＩｌ、 Ｊ、、 ５ｃｈＯｔｔｅｌ、
Ｊ、 Ｌ、、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、 。
１９８０年、“′抗生物質土産性放線菌（・ておける種
間′遺伝子転移のためのＤＮＡクローニング−シス７
ム”ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２４８巻５２６−
５３１頁〕；および栄養要求性変異を相補する３、 ｃ
ｏｅｌ １ｃ０１ｏｒ 遺太子のクローニング［（２
） ＴｈＯｍｐｓＯｎ、ＣＪ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、お
よびＨｏｐｗＯｏｄ、 Ｄ、 、 １９８２年“′放線
菌における抗生物質耐性および栄養性遺伝子のクローニ
ンク″細菌学雑誌（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）、
１５１巻°６６８−６７７頁〕に用いられた。ネオ
マイシン、チオストレプトン、およびバイオマイ、シン
に対する耐性を指示する遺伝子は、３− ｃＯｅｌｉｃ
＋：＋１０ｒＡ ３ （２）染色体より得られた一群の
低コピー数プラスミドである５ＬＰＩプラスミド族中Ｑ
ζクローンされているＣ （３） Ｂｉｂｂ、 Ｍ ’
Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、Ｍ。
間′遺伝子転移のためのＤＮＡクローニング−シス７
ム”ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２４８巻５２６−
５３１頁〕；および栄養要求性変異を相補する３、 ｃ
ｏｅｌ １ｃ０１ｏｒ 遺太子のクローニング［（２
） ＴｈＯｍｐｓＯｎ、ＣＪ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、お
よびＨｏｐｗＯｏｄ、 Ｄ、 、 １９８２年“′放線
菌における抗生物質耐性および栄養性遺伝子のクローニ
ンク″細菌学雑誌（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）、
１５１巻°６６８−６７７頁〕に用いられた。ネオ
マイシン、チオストレプトン、およびバイオマイ、シン
に対する耐性を指示する遺伝子は、３− ｃＯｅｌｉｃ
＋：＋１０ｒＡ ３ （２）染色体より得られた一群の
低コピー数プラスミドである５ＬＰＩプラスミド族中Ｑ
ζクローンされているＣ （３） Ｂｉｂｂ、 Ｍ ’
Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、Ｍ。
Ｋｉｅｓｅｒ、 Ｔ、、 Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、お
よびＨＯｐＷ’ｌ）Ｏｄ、 Ｄ、 。
よびＨＯｐＷ’ｌ）Ｏｄ、 Ｄ、 。
１９８１年“ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓ ｃＯｅｌｉｃ
Ｏ１＋：＋ｒの染色体ＤＮＡ配列の切出しは、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ１ｉｖｉｄａｎｓ中で検出可能な新規
なプラスミド族を形成するパ分子一般遺伝学（Ｍ、）
ｌ、にｅｎ。
Ｏ１＋：＋ｒの染色体ＤＮＡ配列の切出しは、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ１ｉｖｉｄａｎｓ中で検出可能な新規
なプラスミド族を形成するパ分子一般遺伝学（Ｍ、）
ｌ、にｅｎ。
Ｇｃｎｅｔ、 ）、 １．８４巻：２３０−２４０頁；
（４）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ−、Ｗ＠ｒｄ、 Ｊ
−Ｍ、およびＨＯｐＷＯＯｄ。
（４）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ−、Ｗ＠ｒｄ、 Ｊ
−Ｍ、およびＨＯｐＷＯＯｄ。
Ｄん、１９８０年、゛放線菌におけるＤＮＡクローニン
グ、抗生物質耐性種からの耐性遺伝子パ、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻： ５２５−５２７頁： Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、
ＭおよびＨＯｐＷＯＯｄ 。
グ、抗生物質耐性種からの耐性遺伝子パ、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻： ５２５−５２７頁： Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、
ＭおよびＨＯｐＷＯＯｄ 。
Ｄ、Ａ、、１９８２年、前出〕。ネオマイシン、チオス
トレプトンおよびバイオマイシン面士）生（各々、ａｐ
ｈ、 ｔｓｒおよびｖｐｈ ）は又、Ｓ、 １ｉｖｉｄ
ａｎｓＴＳＰ５４．３４ から得られた高コピー数、広
宿主域プラスミドｐＩＪ１０１中にもクローンされた（
（５） Ｋｉ ｅｓｅｒ、 Ｔ、 、 ＨＯｐｗＯｏ
ｄ、 Ｄ、 Ａ、 、 Ｗｒｉｇｈｔ。
トレプトンおよびバイオマイシン面士）生（各々、ａｐ
ｈ、 ｔｓｒおよびｖｐｈ ）は又、Ｓ、 １ｉｖｉｄ
ａｎｓＴＳＰ５４．３４ から得られた高コピー数、広
宿主域プラスミドｐＩＪ１０１中にもクローンされた（
（５） Ｋｉ ｅｓｅｒ、 Ｔ、 、 ＨＯｐｗＯｏ
ｄ、 Ｄ、 Ａ、 、 Ｗｒｉｇｈｔ。
１１−ＭおよびＴｈｏｍｐｓＯｎ、 Ｃ，Ｊ、、 １９
８２年、ｐＩＪｌｏｌ、゛′多コピー広宿主域放線菌プ
ラスミド：ＤＮＡクローニングベクターの（幾能的解析
および開発゛′分子一般遺伝学〔舅。
８２年、ｐＩＪｌｏｌ、゛′多コピー広宿主域放線菌プ
ラスミド：ＤＮＡクローニングベクターの（幾能的解析
および開発゛′分子一般遺伝学〔舅。
Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅＬ ） １８５巻：２２３−２３８
貞〕。
貞〕。
このプラスミドはＳ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＡＴＣ
Ｃ１０１４７からも単離されている［ （６） Ｐｅｒ
ｎｏｄｅ ｔ、 Ｊ、およびＧｕｅｒｉｎｅａｕ、 １
９８１年、°′放、腺菌プラスミドの単離と物理的特性
°°分子一般遺伝学（Ｍｏｌ。
Ｃ１０１４７からも単離されている［ （６） Ｐｅｒ
ｎｏｄｅ ｔ、 Ｊ、およびＧｕｅｒｉｎｅａｕ、 １
９８１年、°′放、腺菌プラスミドの単離と物理的特性
°°分子一般遺伝学（Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １８２巻：５３−５９頁〕。
３Ｃ，Ｐ２．５ＬＰＩおよびｐｌＪ１０］は全て自己伝
、幸可能なプラスミドである。これらプラスミドの１つ
を含む株をプラスミドを含まない株の上に塗布すると、
ポック（ｐＯｃｋ、アバタ）として知られる小さな生育
用１Ｆ域が、プラスミド含有様の周辺につくられる。プ
ラスミドＤＮＡは、プロトプラストのポリエチレングリ
コール（ＰＥＣ，）媒介形部転換により、放線菌中に導
入される［ （１７） ０ｋａｎｉ’５−ｈｉ。
、幸可能なプラスミドである。これらプラスミドの１つ
を含む株をプラスミドを含まない株の上に塗布すると、
ポック（ｐＯｃｋ、アバタ）として知られる小さな生育
用１Ｆ域が、プラスミド含有様の周辺につくられる。プ
ラスミドＤＮＡは、プロトプラストのポリエチレングリ
コール（ＰＥＣ，）媒介形部転換により、放線菌中に導
入される［ （１７） ０ｋａｎｉ’５−ｈｉ。
Ｍ、 ５ｕｚｕｋｉ、 Ｋ 、およびＵｍｅｚａｗａ、
Ｈ，、１，９７４年、“放線菌プロトプラストの形成
と回復：培養条件および形態学的研究、″一般微生物学
雑誌（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） ８
０巻：３８９−４００頁； （８） Ｂ ｉｂｂ、 Ｍ
、 Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｋおよび）（ＯｐＷ
ＯＯｄ。
Ｈ，、１，９７４年、“放線菌プロトプラストの形成
と回復：培養条件および形態学的研究、″一般微生物学
雑誌（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） ８
０巻：３８９−４００頁； （８） Ｂ ｉｂｂ、 Ｍ
、 Ｊ、 、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｋおよび）（ＯｐＷ
ＯＯｄ。
Ｄ、Ａ、、１９７８・牢、″放、腺菌中への高頻度での
プラスミドＩ）ＮＡ形質転換、″ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ２７４巻：３９８−４００頁〕。
プラスミドＩ）ＮＡ形質転換、″ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ２７４巻：３９８−４００頁〕。
バクテリオファージも放線菌へのクローニングヘクター
として用いられているＣ （９） ＩＳ、）−ｇａｉ、
Ｔ、 、 Ｔａｋａｈａｓｈ ｉ、 Ｔ（、、および
５ａｉｔｏ、 ）Ｌ、 ］ ９９８１年“放線菌におけ
るＤＮＡクローニンクベクターとしての放線菌ファージ
Ｒ４” 、一般応用倣生物学雑誌ＣＪ−Ｇｅｎ、 Ａｐ
ｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ）２７巻二３７．３−
３７９頁： （１０）Ｓｕａｒｅｚ、 Ｊ、 Ｅ。
として用いられているＣ （９） ＩＳ、）−ｇａｉ、
Ｔ、 、 Ｔａｋａｈａｓｈ ｉ、 Ｔ（、、および
５ａｉｔｏ、 ）Ｌ、 ］ ９９８１年“放線菌におけ
るＤＮＡクローニンクベクターとしての放線菌ファージ
Ｒ４” 、一般応用倣生物学雑誌ＣＪ−Ｇｅｎ、 Ａｐ
ｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ）２７巻二３７．３−
３７９頁： （１０）Ｓｕａｒｅｚ、 Ｊ、 Ｅ。
およびＣｈａｔｅｒ、 Ｋ、 Ｆ、 、 １９８０年、
゛放線菌におけるＤＮＡクローニング：放線菌ファージ
中に挿入されたｐＢＲ３２２からなる２機１屯レプリコ
ン″、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻：５２７
−５２９頁〕。放線菌クローニングにおける方法および
最近の進歩についての１１ ？ｊＡけ、（月） Ｃｈａ
ｔｅｒ、 Ｋ Ｆ、 、 Ｈ＋：＋ｐｗＯＯｄ、 Ｄ、
Ａ、 、ＫｉｅｓｅｒＴ、およびＴｈＯｍｐｓＯｎ、
Ｃ，Ｊ、、 １９８２年、″放線免疫学における最近の
話題（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍｉ ｃｒｏ−見出され
る。
゛放線菌におけるＤＮＡクローニング：放線菌ファージ
中に挿入されたｐＢＲ３２２からなる２機１屯レプリコ
ン″、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８６巻：５２７
−５２９頁〕。放線菌クローニングにおける方法および
最近の進歩についての１１ ？ｊＡけ、（月） Ｃｈａ
ｔｅｒ、 Ｋ Ｆ、 、 Ｈ＋：＋ｐｗＯＯｄ、 Ｄ、
Ａ、 、ＫｉｅｓｅｒＴ、およびＴｈＯｍｐｓＯｎ、
Ｃ，Ｊ、、 １９８２年、″放線免疫学における最近の
話題（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍｉ ｃｒｏ−見出され
る。
大腸菌（Ｅ、ｃ＋ｌｉ）および放線菌中で機能する雑種
レプリコンは、大腸菌プラスミドであるｐＢＲ３２２を
放線菌ファージφＣ３１（５ｕａｒｅｚ、 Ｊ、 Ｅ、
およびＣｈａｔｅｒ、 Ｋ Ｆ、 、 １９８０年、前
出）、５ＬＰＩの誘導体（Ｃｈａｔｅｒ、 Ｋ、 Ｆ、
。
レプリコンは、大腸菌プラスミドであるｐＢＲ３２２を
放線菌ファージφＣ３１（５ｕａｒｅｚ、 Ｊ、 Ｅ、
およびＣｈａｔｅｒ、 Ｋ Ｆ、 、 １９８０年、前
出）、５ＬＰＩの誘導体（Ｃｈａｔｅｒ、 Ｋ、 Ｆ、
。
ＨＯｐｗｏｏｄ、Ｄ−Ａ、、 Ｋｉｅｓｅｒ、 Ｔ、お
よびＴｈＯｍｐｓＯｎ、 Ｃ。
よびＴｈＯｍｐｓＯｎ、 Ｃ。
Ｊ、 １９８２年、前出）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
’ｅｓｅｓｐｉｎ＋：＋ｓｕｓプラスミドｐ Ｕ Ｃ６
Ｃ（１２）ヨーロッパ特許出願第００３５９１４Ａ２号
：第８１３０１００９．７号；１９８１年９月１６日公
開〕への連結およびｐＡｃＹｃ１７７あるいはｐＡｃＹ
ｃ１８４を、５ＬＰＩの１透導体に結合［（１３） ５
ｃｈｏｔｔｅ Ｉ、 Ｊ、 Ｌ、 、 Ｂｉｂｂ、 Ｈ
，Ｊ、お、よひＣ０ｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、、、 １９８
１年、Ｓｔｒｅｐｔ０ｍｙｃｅｓ ｌ ｉｖｊ −ｄａ
ｎｓにおける犬ｊ腸閑から得られた抗生物質耐性遺伝子
のクローニングおよび発現“細菌学雑誌（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ、 ）１４−６巻： ３６０−３０８頁〕
することによっても構築されている。
’ｅｓｅｓｐｉｎ＋：＋ｓｕｓプラスミドｐ Ｕ Ｃ６
Ｃ（１２）ヨーロッパ特許出願第００３５９１４Ａ２号
：第８１３０１００９．７号；１９８１年９月１６日公
開〕への連結およびｐＡｃＹｃ１７７あるいはｐＡｃＹ
ｃ１８４を、５ＬＰＩの１透導体に結合［（１３） ５
ｃｈｏｔｔｅ Ｉ、 Ｊ、 Ｌ、 、 Ｂｉｂｂ、 Ｈ
，Ｊ、お、よひＣ０ｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、、、 １９８
１年、Ｓｔｒｅｐｔ０ｍｙｃｅｓ ｌ ｉｖｊ −ｄａ
ｎｓにおける犬ｊ腸閑から得られた抗生物質耐性遺伝子
のクローニングおよび発現“細菌学雑誌（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ、 ）１４−６巻： ３６０−３０８頁〕
することによっても構築されている。
多種゛Φのプラスミドが多くの異７する放線菌中に観察
されており、クローニング用のベクターとして開発され
る可能性を有する。例えは、以下を参照： （１４）、 Ｃｈｕｎｇ、 Ｓ、 −Ｔ、、 １９８２
年“放１線菌ファージφＳＦＩのプロファージであるＳ
ｔｒｃｐｔ６−ｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅプラスミド
の単離とその時注パ遺伝子（Ｇｅｎｅ）、 １７巻：
２３９−２４６頁（１５） Ｍａｎｉｓ、 Ｊ、 Ｊお
よびＨｉｇｈｌａｎｄｅｒ、 Ｓ、 Ｋ ｌ ９８２年
、“ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓ ｅｓｐｉｎＯｓｕｓか
らの小型多コピープラスミドの部分特注おまひ高コピー
数欠失変異株の誘導”′遺伝子（凹）。
されており、クローニング用のベクターとして開発され
る可能性を有する。例えは、以下を参照： （１４）、 Ｃｈｕｎｇ、 Ｓ、 −Ｔ、、 １９８２
年“放１線菌ファージφＳＦＩのプロファージであるＳ
ｔｒｃｐｔ６−ｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅプラスミド
の単離とその時注パ遺伝子（Ｇｅｎｅ）、 １７巻：
２３９−２４６頁（１５） Ｍａｎｉｓ、 Ｊ、 Ｊお
よびＨｉｇｈｌａｎｄｅｒ、 Ｓ、 Ｋ ｌ ９８２年
、“ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓ ｅｓｐｉｎＯｓｕｓか
らの小型多コピープラスミドの部分特注おまひ高コピー
数欠失変異株の誘導”′遺伝子（凹）。
１８巻：］３３２２０
頁１６） Ｋｉ ｒｂｙ、 Ｒ、Ｌｅｗｉ ｓ、 Ｅ、
およびＢＯｔｈａ、 Ｃ，、１９８２年、“放線菌種に
おける種々の方法を用いた閉環状（ＣＣＣ）ＤＮＡの探
索°′、ＦＥＭＳ微生吻学通言（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 Ｌｅｔ、 ）、 １３巻ニア９−８２頁 （１７） Ｏｍｕｒａ、’ Ｓ、 ＋’ Ｉｋｅｄａ、
Ｉ（、およびＴａｎａｋａ、 Ｉ−Ｌ 。
およびＢＯｔｈａ、 Ｃ，、１９８２年、“放線菌種に
おける種々の方法を用いた閉環状（ＣＣＣ）ＤＮＡの探
索°′、ＦＥＭＳ微生吻学通言（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 Ｌｅｔ、 ）、 １３巻ニア９−８２頁 （１７） Ｏｍｕｒａ、’ Ｓ、 ＋’ Ｉｋｅｄａ、
Ｉ（、およびＴａｎａｋａ、 Ｉ−Ｌ 。
１９８１年、“マクロライド抗生″物質主産放線菌から
のプラスミドの抽出と特］生パ抗生物質雑誌（Ｊ、Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ） ３４巻。
のプラスミドの抽出と特］生パ抗生物質雑誌（Ｊ、Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ） ３４巻。
４７８−４．８１頁
（１８） Ｙｉ−Ｇｕａｎｇ、 Ｗ 、 Ｄａｖｉｅｓ
、 Ｊ、およびＨｕｔｃｈｉｎｓＯｎ。
、 Ｊ、およびＨｕｔｃｈｉｎｓＯｎ。
Ｃ，Ｊ １９８２年、“エリスロマイシン生産微生物Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ＮＲＲ
Ｌ２３３８中のプラスミドＤＮＡ’”抗生・吻！ Ｋｆ
ｆ誌（Ｊ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ） ３５巻 ３３
５−３４２頁（１９） Ｔｏｙａｍａ、 Ｋ 、 Ｈａ
ｙａｓｈｉ、 Ｅ、 、 Ｎｏ ｊ ｉｒｉ、 Ｃ，、
Ｋａｔｓｕ −ｍａｔａ、 Ｋ、 Ｍｊｙａｔａ、 Ａ
、およびＹａｍａｄａ、 Ｙ、 、 ］、 ９８２年、
゛′放線菌からの小型プラスミドの単離と特性″抗生物
質雑誌（Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ）３５巻：３６
９−３７３頁 （２０） ０ｋａｎｉｓｈｉ、 Ｍ、、 ＭａｎＯｍｅ
、 ＴおよびＵｍｅｚａｗａ。
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ＮＲＲ
Ｌ２３３８中のプラスミドＤＮＡ’”抗生・吻！ Ｋｆ
ｆ誌（Ｊ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ） ３５巻 ３３
５−３４２頁（１９） Ｔｏｙａｍａ、 Ｋ 、 Ｈａ
ｙａｓｈｉ、 Ｅ、 、 Ｎｏ ｊ ｉｒｉ、 Ｃ，、
Ｋａｔｓｕ −ｍａｔａ、 Ｋ、 Ｍｊｙａｔａ、 Ａ
、およびＹａｍａｄａ、 Ｙ、 、 ］、 ９８２年、
゛′放線菌からの小型プラスミドの単離と特性″抗生物
質雑誌（Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ）３５巻：３６
９−３７３頁 （２０） ０ｋａｎｉｓｈｉ、 Ｍ、、 ＭａｎＯｍｅ
、 ＴおよびＵｍｅｚａｗａ。
Ｉ−Ｌ；１９８０年、パ放線菌におけるプラスミドＤ
Ｎ 、ｊの単離と特性ご°抗生」勿質帷誌（Ｊ、Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ） ８３巻：８８−９１頁（２１）
Ｈａｙａｋａｗａ、 Ｔ、 、 ０ｔａｋｅ、 Ｎ、
、 Ｙｏｎｅｈａｒａ、 Ｊ（Ｌ 。
Ｎ 、ｊの単離と特性ご°抗生」勿質帷誌（Ｊ、Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ） ８３巻：８８−９１頁（２１）
Ｈａｙａｋａｗａ、 Ｔ、 、 ０ｔａｋｅ、 Ｎ、
、 Ｙｏｎｅｈａｒａ、 Ｊ（Ｌ 。
’ｌ：’ａｎａｋａ、 Ｔ、およびＳａｋａｇｕｃｈ
ｉ、 Ｋ 、 １９７９年“放線菌からのプラスミドの
単離および！特注、°′抗生物質雑誌（Ｊ、’Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ） ３２巻：１３４．８−１３５’０頁 （２２）イギリス特許出願ＧＢ、第２０４５２５３Ａ号
；第８００７０８０号；１９８０年１０月２９日公開（
ｐＵｃｌ） （２３）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４５２５２
Ａ号；第８００７０７９号；１９８０年１０月２９日公
開（ｐＵＣ２） （２４）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２’０４４７７
３Ａ号；第８００７０７７号；１９８０年ｌＯ月２２日
公開（ｐＵＣ３） （２５）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、笛２０４．３６５
２Ａ号；第８００７１５８号；１９８０年ｌＯ月８日公
開（ｐＵＣ６） （２６）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４６２７２
Ａ号弓第８０１１０００号；１９８０年１１月１２日公
開（ｐＵＣ７） （２７）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４４５．２
５１Ａ号、第８００７０７８号；１９８０年１０月２２
日公開（ｐＵＣ８） （２８） イギリス特許出願Ｃ，Ｂ、第２０４５２５
４Ａ号；第８００７０８１号；１９８０年１０月２９日
公（開（ｐＵＣ９） （２９）ヨーロッパ特許出願第００３８１５６Ａ２号；
第８．１３０１４８２．６号；１９８１年１０月２１日
公［開（＋）ＵＣＩＯ）（３０）ヨーロッパ特許出！＠
第００３５９１４Ａ２号；第８１：３０１００９．７号
；１９８１年９月１６日公開（ｐＵＣ１０１２およびｐ
Ｕｃ１０１３） （３１）ヨーロッパ特許出願第００２０２５１Ａ２号；
第８０４０’０７２，２．７号；１９８０年１２月１０
日公開（Ｂ型肝炎プラスミドベクター） （３２）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０３１．４．
３４Ａ号：第一７９２８１５６号；１９８０年４月２３
日公開（Ｂ型肝炎抗原を作るだめのキメラ蛋白） プラスミドｐＶＥ１は、ある特殊環境下では、他のクロ
ーニング用ベクターを越える特異な利点をもたらす物理
的および遺云的性質の独！侍な組合せを荊えたプラスミ
ドである。
ｉ、 Ｋ 、 １９７９年“放線菌からのプラスミドの
単離および！特注、°′抗生物質雑誌（Ｊ、’Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ） ３２巻：１３４．８−１３５’０頁 （２２）イギリス特許出願ＧＢ、第２０４５２５３Ａ号
；第８００７０８０号；１９８０年１０月２９日公開（
ｐＵｃｌ） （２３）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４５２５２
Ａ号；第８００７０７９号；１９８０年１０月２９日公
開（ｐＵＣ２） （２４）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２’０４４７７
３Ａ号；第８００７０７７号；１９８０年ｌＯ月２２日
公開（ｐＵＣ３） （２５）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、笛２０４．３６５
２Ａ号；第８００７１５８号；１９８０年ｌＯ月８日公
開（ｐＵＣ６） （２６）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４６２７２
Ａ号弓第８０１１０００号；１９８０年１１月１２日公
開（ｐＵＣ７） （２７）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０４４５．２
５１Ａ号、第８００７０７８号；１９８０年１０月２２
日公開（ｐＵＣ８） （２８） イギリス特許出願Ｃ，Ｂ、第２０４５２５
４Ａ号；第８００７０８１号；１９８０年１０月２９日
公（開（ｐＵＣ９） （２９）ヨーロッパ特許出願第００３８１５６Ａ２号；
第８．１３０１４８２．６号；１９８１年１０月２１日
公［開（＋）ＵＣＩＯ）（３０）ヨーロッパ特許出！＠
第００３５９１４Ａ２号；第８１：３０１００９．７号
；１９８１年９月１６日公開（ｐＵＣ１０１２およびｐ
Ｕｃ１０１３） （３１）ヨーロッパ特許出願第００２０２５１Ａ２号；
第８０４０’０７２，２．７号；１９８０年１２月１０
日公開（Ｂ型肝炎プラスミドベクター） （３２）イギリス特許出願Ｇ、 Ｂ、第２０３１．４．
３４Ａ号：第一７９２８１５６号；１９８０年４月２３
日公開（Ｂ型肝炎抗原を作るだめのキメラ蛋白） プラスミドｐＶＥ１は、ある特殊環境下では、他のクロ
ーニング用ベクターを越える特異な利点をもたらす物理
的および遺云的性質の独！侍な組合せを荊えたプラスミ
ドである。
その特異な制限地１図から、ｐＶＥｌのみに適するよう
な制限１酵素もしくは酵素の組合せの使用が可能である
。放線菌におけるクローニングに多コピーおよび１コピ
ープラスミドが用いられている。ある種の実験において
は、例えば、クローンされた遺伝子産物量を酸大にする
ために、１ｌ（Ｉｌ胞当ＤＫクローンされた遺伝子が多
コピー存在することが望”まれる。多コピー数クローニ
ング用ベクターは、この目標に至る一つの方法である。
な制限１酵素もしくは酵素の組合せの使用が可能である
。放線菌におけるクローニングに多コピーおよび１コピ
ープラスミドが用いられている。ある種の実験において
は、例えば、クローンされた遺伝子産物量を酸大にする
ために、１ｌ（Ｉｌ胞当ＤＫクローンされた遺伝子が多
コピー存在することが望”まれる。多コピー数クローニ
ング用ベクターは、この目標に至る一つの方法である。
ｐｖＥＩＶｉ、そのような多コピー数プラスミドである
。ｐＶＥｌは、自己伝・辛・１生プラスミドでもある。
。ｐＶＥｌは、自己伝・辛・１生プラスミドでもある。
この性質は、宿主にプラスミドを移入する際の・もう一
つ２の方法として有利である。例えば、ある放線菌宿主
が、再生するプロトプラストを作製することが困難なた
めに形質転換され得ない場合に、先ずｐＶＥ１誘導体を
Ｓ−１ｉｖｉｄａｎｓのプロトプラストに形質転換し、
次にこの株を興味の対象である放線菌宿主と接合させる
ことが可能である。プラスミドは改、腺菌踵間において
、狭いあるいは非常に広い異なる宿され、他の放線菌種
に対しても可能性のあるクローニング用ベクターである
ことができる。
つ２の方法として有利である。例えば、ある放線菌宿主
が、再生するプロトプラストを作製することが困難なた
めに形質転換され得ない場合に、先ずｐＶＥ１誘導体を
Ｓ−１ｉｖｉｄａｎｓのプロトプラストに形質転換し、
次にこの株を興味の対象である放線菌宿主と接合させる
ことが可能である。プラスミドは改、腺菌踵間において
、狭いあるいは非常に広い異なる宿され、他の放線菌種
に対しても可能性のあるクローニング用ベクターである
ことができる。
このプラスミド核酸は、長さ１１．０キロ頃基対の環状
２本釧Ｄ Ｎ Ａ分子である。図１はこのプラスミドの
制限エンドヌクレーアーゼ開裂部位の位置を示す地図で
ある。その位１碌は、［ｉｎｄ ｍ 制限酵素による開
裂によりつくられたプラスミドＤＮＡの末端からの、そ
の部位の距離をキロ塩基対で与えである。地図は、アガ
ロースとポリアクリルアミドルゲル電気泳動おユび０１
キロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチジウム染色
で決定された酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、 ＥｃｏＲＩ’、
Ｅ（！ＯＲ’Ｖ、 Ｂａｍ ＨＩ 。
２本釧Ｄ Ｎ Ａ分子である。図１はこのプラスミドの
制限エンドヌクレーアーゼ開裂部位の位置を示す地図で
ある。その位１碌は、［ｉｎｄ ｍ 制限酵素による開
裂によりつくられたプラスミドＤＮＡの末端からの、そ
の部位の距離をキロ塩基対で与えである。地図は、アガ
ロースとポリアクリルアミドルゲル電気泳動おユび０１
キロ塩基対およびそれ以上の断片の臭化エチジウム染色
で決定された酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、 ＥｃｏＲＩ’、
Ｅ（！ＯＲ’Ｖ、 Ｂａｍ ＨＩ 。
ＰＶＬＩ ｌ、Ｂｃｌ Ｉ 、Ｐｓｔ ｌ、ｓｐ
ｈ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、ｓｔｕ！。
ｈ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、ｓｔｕ！。
裂）部位を示している。以下の酵素は、このＤＮＡを開
裂しなかつ７’ｔ ： Ｈｐａ Ｉ 、 Ｋｐｎ Ｉ、
ＮＣＬＩ ｌ 。
裂しなかつ７’ｔ ： Ｈｐａ Ｉ 、 Ｋｐｎ Ｉ、
ＮＣＬＩ ｌ 。
Ｎｄｅ Ｉ 、’ Ｐａｅ Ｒ７、およびＸｈｏｌ＋あ
る種のプラスミド欠失変種および雑踵ファージ誘導体は
、同謙に以−Ｆに述べられている。プラスミドｐＶＥＩ
は、以下によシ詳細に述べられてい乙；そこでは単離、
保持、特に大きさと制限地図で明らかにされたプラスミ
ドの増殖（て関連するばつきシしたｉ゛青ルａ己されて
いる。さらに、以下に述べるように、ｐＶＥＩおよび代
表的なｐ、 Ｖ Ｅ ］誘導体を含む微生５吻ンよ、特
許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペス
ト条約により認められだ床存菌株中に寄託されている（
表１参照）。
る種のプラスミド欠失変種および雑踵ファージ誘導体は
、同謙に以−Ｆに述べられている。プラスミドｐＶＥＩ
は、以下によシ詳細に述べられてい乙；そこでは単離、
保持、特に大きさと制限地図で明らかにされたプラスミ
ドの増殖（て関連するばつきシしたｉ゛青ルａ己されて
いる。さらに、以下に述べるように、ｐＶＥＩおよび代
表的なｐ、 Ｖ Ｅ ］誘導体を含む微生５吻ンよ、特
許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペス
ト条約により認められだ床存菌株中に寄託されている（
表１参照）。
ここに開示されるように、プラスミドｐＶＥ１およびそ
の組換え誘導体もしくは、その部分はなかんずく組換え
ＤＮＡ方１去におけるクローニングビヒクルとして有用
性を有する。
の組換え誘導体もしくは、その部分はなかんずく組換え
ＤＮＡ方１去におけるクローニングビヒクルとして有用
性を有する。
用ベクターとして種々の方法で用い得る独特のプラスミ
ドである。このプラスミドのいくつかの性攻が、これを
有用なりローニンク′ビヒクルとしている。一つの重要
な特徴は、高コピー数で、かつ小型のプラスミドである
ことである。この性質により、多量のプラスミドＤＮＡ
の単離が実行可能であり簡易となる。
ドである。このプラスミドのいくつかの性攻が、これを
有用なりローニンク′ビヒクルとしている。一つの重要
な特徴は、高コピー数で、かつ小型のプラスミドである
ことである。この性質により、多量のプラスミドＤＮＡ
の単離が実行可能であり簡易となる。
プラスミドが高コピー数であることは、その中にクロー
ンされたどのような遺伝子もまた細胞当り多コピー存在
することを意味する。
ンされたどのような遺伝子もまた細胞当り多コピー存在
することを意味する。
このことは、クローンされた遺伝子産物あるいは、その
遺伝子産物によシつくられる代謝産物を多量に生産する
手段と与える。ｐＶＥｌのもう一つの有利な特徴は、ｐ
ＶＥ２８中における７Ｋｂ欠失によって明らかとなった
プラスミド保持に必須でないと思われ、るプラスミドの
大頒截があるということである。このことは、異種ＤＮ
Ａがクローンされ得る種々の制限部位をもった、恐らく
は大きな広がりを有するＤＮＡを与えることになる。こ
のようにして、この−１頂載内のＢａｍ Ｈ’Ｉ、 Ｅ
ｃｏＲＩ。
遺伝子産物によシつくられる代謝産物を多量に生産する
手段と与える。ｐＶＥｌのもう一つの有利な特徴は、ｐ
ＶＥ２８中における７Ｋｂ欠失によって明らかとなった
プラスミド保持に必須でないと思われ、るプラスミドの
大頒截があるということである。このことは、異種ＤＮ
Ａがクローンされ得る種々の制限部位をもった、恐らく
は大きな広がりを有するＤＮＡを与えることになる。こ
のようにして、この−１頂載内のＢａｍ Ｈ’Ｉ、 Ｅ
ｃｏＲＩ。
ＢｇｌｌおよびＢｃ１１部位がクローニングに用いられ
た。
た。
ここでの・列で説明されているクローニングに用いられ
た方法は、ｔｓｒ遺伝子のｐＶＥｌのいくつかの部位へ
の直瀬クローニングと同時に相互組込みプラスミドｐＶ
Ｅ３およびｐＶ’Ｅ４の構築をも含んでいる。これらの
方法およびそれに加えた有用なりローニング技術は、前
に引用した手引き（Ｄａｖ ｉ ｓ−Ｒ，Ｗ 、 Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ。
た方法は、ｔｓｒ遺伝子のｐＶＥｌのいくつかの部位へ
の直瀬クローニングと同時に相互組込みプラスミドｐＶ
Ｅ３およびｐＶ’Ｅ４の構築をも含んでいる。これらの
方法およびそれに加えた有用なりローニング技術は、前
に引用した手引き（Ｄａｖ ｉ ｓ−Ｒ，Ｗ 、 Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ。
Ｄ、およびＲｏｔｈ、 Ｊ、 Ｒ，、１９８０年、前出
；Ｍａｎｊａ−ｔｉｓ、 Ｔ、 、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
Ｂ Ｆ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、。
；Ｍａｎｊａ−ｔｉｓ、 Ｔ、 、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
Ｂ Ｆ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、。
１９８２年、前出）に豊富に述べられている。
クローニング手法は、種々の方法に改変することが出来
る。先ず、ここに述べられたｐＶＥＩから構築されたど
の誘導体を用いることもＯｒ能である。例えば、ネオマ
イシンに対する耐性のような他の選択マーカーを挿入す
ることによｐ、ｐＶＥＩレプリコンを基礎とする新たな
ベクターを構築することも可能である（ Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ、 Ｃ，Ｊ−、Ｗａｒｄ、 Ｊ、 ＭおよびＨｏｐ
−ｗｏｏｄ、 Ｄ、 Ａ、、 １９８０年、前出）。追
加の有用なベクターは、試験管内でつくられた欠失によ
っても構築されることができる。ｐＶＥｌを制限酵素で
消化し、その断片もしくは１φ片の小集団を結合し、そ
して放線菌中に形質転換することにより、短かくなった
プラスミドを得ることもできよう。
る。先ず、ここに述べられたｐＶＥＩから構築されたど
の誘導体を用いることもＯｒ能である。例えば、ネオマ
イシンに対する耐性のような他の選択マーカーを挿入す
ることによｐ、ｐＶＥＩレプリコンを基礎とする新たな
ベクターを構築することも可能である（ Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ、 Ｃ，Ｊ−、Ｗａｒｄ、 Ｊ、 ＭおよびＨｏｐ
−ｗｏｏｄ、 Ｄ、 Ａ、、 １９８０年、前出）。追
加の有用なベクターは、試験管内でつくられた欠失によ
っても構築されることができる。ｐＶＥｌを制限酵素で
消化し、その断片もしくは１φ片の小集団を結合し、そ
して放線菌中に形質転換することにより、短かくなった
プラスミドを得ることもできよう。
異種（ｆｏｒｅｉｇｎ） Ｄ Ｎ Ａは、種、々の方法
でｐＶＥＩ中に挿入し得る。両１）ＮＡ分子は、同じ制
限酵素により切断され、相同の末端をもつこれらの分子
は相互に結合され得る。ベクターおよび挿入ＤＮＡを効
率のよいペア形成と、結合を可能とする同一の一本鎖伸
長部分を生成するような異なる酵素で消化することも出
来る。ベクターおよび挿入ＤＮＡを、全く異なる開隔酵
素で開裂し、開裂ＤＮＡを、Ｓ１ヌクレアーｉまたはＤ
ＮＡポリメラービで処理することによシ各々一本鎖突出
末端を除去するが、そのような末端の相補鎖を合成して
もよい。この方法で二本鎖末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅ
ｄ） ＤＮＡ ：ｆ）子ができ、相互に結合し得るもう
一つの石川し侵る廖＃法は、末端デオキシヌクレオチド
転移酵素系に、１ニジ、直鎖のベクターおよび異種ＤＮ
Ａの３′末端に短かいホモポリマーの伸長を付加するも
のである。
でｐＶＥＩ中に挿入し得る。両１）ＮＡ分子は、同じ制
限酵素により切断され、相同の末端をもつこれらの分子
は相互に結合され得る。ベクターおよび挿入ＤＮＡを効
率のよいペア形成と、結合を可能とする同一の一本鎖伸
長部分を生成するような異なる酵素で消化することも出
来る。ベクターおよび挿入ＤＮＡを、全く異なる開隔酵
素で開裂し、開裂ＤＮＡを、Ｓ１ヌクレアーｉまたはＤ
ＮＡポリメラービで処理することによシ各々一本鎖突出
末端を除去するが、そのような末端の相補鎖を合成して
もよい。この方法で二本鎖末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅ
ｄ） ＤＮＡ ：ｆ）子ができ、相互に結合し得るもう
一つの石川し侵る廖＃法は、末端デオキシヌクレオチド
転移酵素系に、１ニジ、直鎖のベクターおよび異種ＤＮ
Ａの３′末端に短かいホモポリマーの伸長を付加するも
のである。
相補のホモポリマー尾部をもつベクターおよび挿入ＤＮ
Ａをアニール（ａｎｎｅａｌ）した後、前以って結合（
Ｉｉｇａｔｅ）することなしに維菌宿主中に形質転換す
る。
Ａをアニール（ａｎｎｅａｌ）した後、前以って結合（
Ｉｉｇａｔｅ）することなしに維菌宿主中に形質転換す
る。
ｐＶＥｌおよびその調導体１は、放線菌の第−次代破産
物遺伝子、例えは、アミノ酸、ヒタミン、プリンおよび
ピリミジンの生合成に関与する遺１云子をクローンする
のに用いることができる。そのような組換えプラスミド
を検出するの（で結合したＤＮＡを、国々の栄養要求株
のプロトプラストに形攻転侯する。形質拡遺体は、最初
にベクターによって与えられる表現型、列えばＴｈ１ｏ
ｒ（チオストレプトン計屁ンによって選択される。これ
らプラスミド含有法は、栄養要求性によって要求され。
物遺伝子、例えは、アミノ酸、ヒタミン、プリンおよび
ピリミジンの生合成に関与する遺１云子をクローンする
のに用いることができる。そのような組換えプラスミド
を検出するの（で結合したＤＮＡを、国々の栄養要求株
のプロトプラストに形攻転侯する。形質拡遺体は、最初
にベクターによって与えられる表現型、列えばＴｈ１ｏ
ｒ（チオストレプトン計屁ンによって選択される。これ
らプラスミド含有法は、栄養要求性によって要求され。
る栄養素の無いところでの生育を試験される。
組換え体プラスミド中の野生型相補遺伝子を獲得した株
のみが、生育町１′１ヒである。
のみが、生育町１′１ヒである。
ｐＶＥｌは、抗生物質の生産に関与する遺伝子のような
二次代古射の遺伝子をクローンするの１ｃオυ用できる
。組換えプラスミドは、代謝産物の生産が遮断された変
異株中に形質転換される。形質転換株（は、プラスミド
表現型によシ選択される。次に、これらの形質転換株に
つき、二次代謝産物の生産を遮断する変異を相補するプ
ラスミドを有するものを同定するための試１験をする。
二次代古射の遺伝子をクローンするの１ｃオυ用できる
。組換えプラスミドは、代謝産物の生産が遮断された変
異株中に形質転換される。形質転換株（は、プラスミド
表現型によシ選択される。次に、これらの形質転換株に
つき、二次代謝産物の生産を遮断する変異を相補するプ
ラスミドを有するものを同定するための試１験をする。
変異によひ二次代謝の遺伝子は、通常生育をて影響しな
いので、この試験１ｒｉ幾分より複雑であり、関匈する
特異な代謝産物により左右される。生産物ρ≦抗生物質
の場合、は、形質転換集落に抗生物質感受性菌を重層す
る。クローンされた相補、遺伝子を含む集落は抗生物質
を生産し、この感受性試、験閑の生育阻止域に囲まれる
であろう。その生産物に対する簡単な生物学的試、験が
存在しない際は、物理的あるいは化学的な検出法の適用
かり］止である。例えば、Ｆ３． ａｖｅｒｍｊ ｔＮ
ｊｓによる駆虫性化合物アバヌクチン群（ａＶｅｒｍ
ｅｅ−ｔｉｎｅｓ） の生ｆｆｉ （Ｂｕｒｇ、 Ｒ
，Ｗほか、１９７９年、抗微生物剤と化学療法（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒＯｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓａｎｄ Ｃｈｅｍ
Ｏｔｈｅｒｅｒａｐｙ） １５巻： ３６１−３６７頁
）は、通常高圧液体クロマトグラフィーにより試験され
ている。
いので、この試験１ｒｉ幾分より複雑であり、関匈する
特異な代謝産物により左右される。生産物ρ≦抗生物質
の場合、は、形質転換集落に抗生物質感受性菌を重層す
る。クローンされた相補、遺伝子を含む集落は抗生物質
を生産し、この感受性試、験閑の生育阻止域に囲まれる
であろう。その生産物に対する簡単な生物学的試、験が
存在しない際は、物理的あるいは化学的な検出法の適用
かり］止である。例えば、Ｆ３． ａｖｅｒｍｊ ｔＮ
ｊｓによる駆虫性化合物アバヌクチン群（ａＶｅｒｍ
ｅｅ−ｔｉｎｅｓ） の生ｆｆｉ （Ｂｕｒｇ、 Ｒ
，Ｗほか、１９７９年、抗微生物剤と化学療法（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒＯｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓａｎｄ Ｃｈｅｍ
Ｏｔｈｅｒｅｒａｐｙ） １５巻： ３６１−３６７頁
）は、通常高圧液体クロマトグラフィーにより試験され
ている。
クローンされた遺伝子を含む組換えプラスミドには、多
くの実験的な用途がある。精製遺伝子のこのような豊唐
な共、給源によって、遺伝子の制御項域および構造遺伝
子のコード頑俄を同定するだめの詳細な遺伝学的ならひ
に物理的解析を行なうことが「可能である。遺伝子ある
いはその部分のＤＮＡ配列ンウ；決定され得る。興味の
対象である遺伝子が、大ノ易菌および放：線菌の両方で
複製するｐＶＥ３あるい（１ｐＶＥ４のような二機能レ
プリコンであるベクター中にクローンされるなら、多く
の付加的な実験も可１指である。大腸菌の徹底的な遺伝
的な特；生付けのおかげで、ｐＶＥ３およびｐＶＥ４の
ようなベクターでは、放１腺山中では末た可能でないよ
うな種々の主体内遺伝的操作を大腸菌において行なうこ
とが可能となる。
くの実験的な用途がある。精製遺伝子のこのような豊唐
な共、給源によって、遺伝子の制御項域および構造遺伝
子のコード頑俄を同定するだめの詳細な遺伝学的ならひ
に物理的解析を行なうことが「可能である。遺伝子ある
いはその部分のＤＮＡ配列ンウ；決定され得る。興味の
対象である遺伝子が、大ノ易菌および放：線菌の両方で
複製するｐＶＥ３あるい（１ｐＶＥ４のような二機能レ
プリコンであるベクター中にクローンされるなら、多く
の付加的な実験も可１指である。大腸菌の徹底的な遺伝
的な特；生付けのおかげで、ｐＶＥ３およびｐＶＥ４の
ようなベクターでは、放１腺山中では末た可能でないよ
うな種々の主体内遺伝的操作を大腸菌において行なうこ
とが可能となる。
クローンされた遺伝子を含むプラスミドは、その二次代
謝産物の生合成、経路中の遺伝子を、高コピー数にした
際の効采を検討する目的で、野生型宿主生物中に再移入
することもできる。
謝産物の生合成、経路中の遺伝子を、高コピー数にした
際の効采を検討する目的で、野生型宿主生物中に再移入
することもできる。
例えば、経路中の律速段階がクローンされている場合は
、との遺伝子を、細胞当シ多故コピー供給すれは、その
代謝産物のＪヌ量が大きく増大するかも知れない。特定
の代ａ経路のいくつか、あるいは全ての遺伝子がクロー
ンされている。場合は、試験管内で、完宅な経路を含む
単ゴブラスミドを構成することが可能かも知れない。こ
のことは、内包される全段階の遺伝子量を増−やすこと
になシ、恐らくは、それによって、その株の生産能を高
めるであろう。
、との遺伝子を、細胞当シ多故コピー供給すれは、その
代謝産物のＪヌ量が大きく増大するかも知れない。特定
の代ａ経路のいくつか、あるいは全ての遺伝子がクロー
ンされている。場合は、試験管内で、完宅な経路を含む
単ゴブラスミドを構成することが可能かも知れない。こ
のことは、内包される全段階の遺伝子量を増−やすこと
になシ、恐らくは、それによって、その株の生産能を高
めるであろう。
クローンされた遺伝子は、その発現程度を増大させるた
めに、試１験管内で種々の方法で操作され得る。そのＤ
ＮＡの試、験管内変異誘起は、その遺伝子の発現に対し
、正および負の両方の効果をもたらすと思われる。高効
率プロモーターのような制御配列を、クローンされた遺
伝子の隣に取込ませることにより、その発現程度を増大
し得る。全ての変異による効果は、変換したクローン遺
伝子を、宿主放、被閑中に再移入することにより監察さ
れる。
めに、試１験管内で種々の方法で操作され得る。そのＤ
ＮＡの試、験管内変異誘起は、その遺伝子の発現に対し
、正および負の両方の効果をもたらすと思われる。高効
率プロモーターのような制御配列を、クローンされた遺
伝子の隣に取込ませることにより、その発現程度を増大
し得る。全ての変異による効果は、変換したクローン遺
伝子を、宿主放、被閑中に再移入することにより監察さ
れる。
ｐＶＥルプリコンを、異種蛋白の生産をさせるために、
非放線菌源からのＤＮＡをクローンするのに用いること
ができる。この型の操作のために（は、その異種遺伝子
を、既して放：線菌の制御配列の支配下で転写され、翻
訳されているベクターの領域に挿入することが必要であ
る。例えば、−８，ｆｒａｄｉａｅからｐＩＪ２にクロ
ーンされた、ネオマイシン耐性のためのａｐｈ遺伝子を
用いることが町４目である（ＴｈａｍｐｓＯｎ、んＪ６
． Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｎ、およびＨＯｐｗＯＯｄ、
Ｄ。
非放線菌源からのＤＮＡをクローンするのに用いること
ができる。この型の操作のために（は、その異種遺伝子
を、既して放：線菌の制御配列の支配下で転写され、翻
訳されているベクターの領域に挿入することが必要であ
る。例えば、−８，ｆｒａｄｉａｅからｐＩＪ２にクロ
ーンされた、ネオマイシン耐性のためのａｐｈ遺伝子を
用いることが町４目である（ＴｈａｍｐｓＯｎ、んＪ６
． Ｗａｒｄ、 Ｊ、 Ｎ、およびＨＯｐｗＯＯｄ、
Ｄ。
ん、１９８０年、前出）。この遺伝子は高水準で転写な
らひに翻訳される（Ｊ、 Ｄａｖｉｓ、 １９８２年６
月、第４回工業微生物の遺伝学に関する国際シンポジウ
ムで提示）。異種直１宏子がａｐｈ中に挿入されるとａ
ｐｈ蛋白と異踵蛋白間の融合蛋白を高水準でつくること
か可、止となろう。
らひに翻訳される（Ｊ、 Ｄａｖｉｓ、 １９８２年６
月、第４回工業微生物の遺伝学に関する国際シンポジウ
ムで提示）。異種直１宏子がａｐｈ中に挿入されるとａ
ｐｈ蛋白と異踵蛋白間の融合蛋白を高水準でつくること
か可、止となろう。
プラスミド宿主５ｔｒｅｐｔＯｒｎｙｃｅｓ ａｖｃｒ
ｍｉｔｉｌｉｓは、非常に強力な駆虫活性を示ナアハメ
クチンと呼ばれる化学的に関連した吻Ｒ複合体を生産す
る（ Ｒ，Ｊ、 Ｂｕｒｇほか、Ｊ５、抗微生物剤およ
び化学療法（ＡｎｔｉｍｉｃｒＯｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ
ｓ ａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅ、ｒａｐｙ ） ３６１−
３６７頁（１９７９年）参照）。プラスミドは、これら
遺伝子中の変異に対する遺伝的相補によって、これ、ら
重要な化合物の合成および合成の制御に関与している遺
伝子および遺伝子産肉の同定、単離および解析に用い得
る（例えば、例１Ｇ節参照）。
ｍｉｔｉｌｉｓは、非常に強力な駆虫活性を示ナアハメ
クチンと呼ばれる化学的に関連した吻Ｒ複合体を生産す
る（ Ｒ，Ｊ、 Ｂｕｒｇほか、Ｊ５、抗微生物剤およ
び化学療法（ＡｎｔｉｍｉｃｒＯｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ
ｓ ａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅ、ｒａｐｙ ） ３６１−
３６７頁（１９７９年）参照）。プラスミドは、これら
遺伝子中の変異に対する遺伝的相補によって、これ、ら
重要な化合物の合成および合成の制御に関与している遺
伝子および遺伝子産肉の同定、単離および解析に用い得
る（例えば、例１Ｇ節参照）。
プラスミドｐＶＥ１のある種の雑種誘導体（は、他の方
法に有用である。構成と性質が、例１、Ｄ節に述べであ
るこれら雑種群は、ｐＶＥ１ベクター誘導体が、大腸菌
中でプラスミドとして複製できるようにする。これらプ
ラスミド−プラスミドベクター雑種は、形質転換により
種間での転移が可能である。この性質により、大腸菌の
ために開発された遺伝技法を用い得るようになるので非
常に有用である。
法に有用である。構成と性質が、例１、Ｄ節に述べであ
るこれら雑種群は、ｐＶＥ１ベクター誘導体が、大腸菌
中でプラスミドとして複製できるようにする。これらプ
ラスミド−プラスミドベクター雑種は、形質転換により
種間での転移が可能である。この性質により、大腸菌の
ために開発された遺伝技法を用い得るようになるので非
常に有用である。
例えば、放線菌種からの遺伝子が、大腸菌の変異を相補
し得ることが見出されるかも知れない。例えば、トラン
スポゾン変異法により大腸菌中で、放線菌遺伝子中に要
具を導入することもできるようにあるいは、ナンセンス
サプレッサーによりサプレスされ得るような変異（翻訳
停止コドン）が単離されるかも知れない。後者の変異遺
伝子は、放線菌中に逆戻しされ、放線菌中で翻訳停止コ
ドンをサプレスし得るような変異を単離するのに用いら
れる。このようなサブレツナ−変異は、このような生命
学的研究に非常に有用である。
し得ることが見出されるかも知れない。例えば、トラン
スポゾン変異法により大腸菌中で、放線菌遺伝子中に要
具を導入することもできるようにあるいは、ナンセンス
サプレッサーによりサプレスされ得るような変異（翻訳
停止コドン）が単離されるかも知れない。後者の変異遺
伝子は、放線菌中に逆戻しされ、放線菌中で翻訳停止コ
ドンをサプレスし得るような変異を単離するのに用いら
れる。このようなサブレツナ−変異は、このような生命
学的研究に非常に有用である。
ｅ６ ヘト美寸の寸哨［Ｆ］ト■〇一本発明のいくつ
かの具体化が″例示“の形でこの節で代表的に開示され
ている。この体裁は、開示の便宜的な形としてのみ選ば
れたものであり、本発明を、上文に開示されたものとし
て制限するものではないと理解されるべきである。
かの具体化が″例示“の形でこの節で代表的に開示され
ている。この体裁は、開示の便宜的な形としてのみ選ば
れたものであり、本発明を、上文に開示されたものとし
て制限するものではないと理解されるべきである。
例１
１）ＶＥＩベクターの単離、構築、保持及び増殖このプ
ラスミドＤＮＡは、クローニング用ベクターとして用い
られる他のプラスミドについての業績により確立された
ような方法とほとんど違わない手法により単離され、取
扱われた。良い手法の手引きは、Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖ ｉ
ｓ、Ｄ、 ＢＯｔｓｔｅｉｎ、およびＪ、 Ｒ，ｌ’ｊ
ｏｔｈ、”遺伝子工学の手引き二上級細菌遺伝学“、ニ
ューヨーク州、コールドスプリングハーバ−、コールド
スプリングハーバ−研究所（１９８０年）である。この
仕事で用いられた独特の手法は、上述の手引きに与えら
れているものと同一でない場合は、ここに記述されてい
る。ｐＶＥ１ベクターおよびその誘導体の性格付けに与
ったシ、それらを他のクローニング用ベクターから区別
するのに役立つ結果は、適当なところに指摘されている
。
ラスミドＤＮＡは、クローニング用ベクターとして用い
られる他のプラスミドについての業績により確立された
ような方法とほとんど違わない手法により単離され、取
扱われた。良い手法の手引きは、Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖ ｉ
ｓ、Ｄ、 ＢＯｔｓｔｅｉｎ、およびＪ、 Ｒ，ｌ’ｊ
ｏｔｈ、”遺伝子工学の手引き二上級細菌遺伝学“、ニ
ューヨーク州、コールドスプリングハーバ−、コールド
スプリングハーバ−研究所（１９８０年）である。この
仕事で用いられた独特の手法は、上述の手引きに与えら
れているものと同一でない場合は、ここに記述されてい
る。ｐＶＥ１ベクターおよびその誘導体の性格付けに与
ったシ、それらを他のクローニング用ベクターから区別
するのに役立つ結果は、適当なところに指摘されている
。
Ａプラスミド単離の目的でのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＭＡ４１９２ （ＡＴＣＣ１４
５８５）の生育単一集落’Ｆｃ、２５０ｍ１の邪魔板つ
きフラスコ中のＹＩＩＥＭＥ（ｌ を中に３７酵母エキ
ス、５ｆペプトン、３グ麦芽エキス、１ググリコースを
含む）に、３４％蔗糖および５ ｍＭ塩化マグネシウム
とともに植菌した（ Ｂｉｂｂ、 Ｍ、 Ｊ、、Ｆｒｅ
ｅｎ−ａｎＸＲ，Ｆ、おｘｏ−）（ｏｐｗｏｏｄ、 Ｉ
）、 Ａ、 １９７７年、分子一般遺伝学（Ｍｏ１ｅｃ
、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） １５４巻：１５５〜１６
６頁）。培養は、２７℃２２０ ｒｌ）ｍの振盪で２日
間行った。この培養は、２ｔフラスコ中の５００ ｍｌ
の同−培地中に稀釈し、上記同様、更に２日間続けた。
ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＭＡ４１９２ （ＡＴＣＣ１４
５８５）の生育単一集落’Ｆｃ、２５０ｍ１の邪魔板つ
きフラスコ中のＹＩＩＥＭＥ（ｌ を中に３７酵母エキ
ス、５ｆペプトン、３グ麦芽エキス、１ググリコースを
含む）に、３４％蔗糖および５ ｍＭ塩化マグネシウム
とともに植菌した（ Ｂｉｂｂ、 Ｍ、 Ｊ、、Ｆｒｅ
ｅｎ−ａｎＸＲ，Ｆ、おｘｏ−）（ｏｐｗｏｏｄ、 Ｉ
）、 Ａ、 １９７７年、分子一般遺伝学（Ｍｏ１ｅｃ
、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） １５４巻：１５５〜１６
６頁）。培養は、２７℃２２０ ｒｌ）ｍの振盪で２日
間行った。この培養は、２ｔフラスコ中の５００ ｍｌ
の同−培地中に稀釈し、上記同様、更に２日間続けた。
菌糸を１４，０００）ｊ ｆ？１５分の遠心によシ収獲
し、０．８５％生理食塩水で１回洗浄した。
し、０．８５％生理食塩水で１回洗浄した。
プラスミドの単離：手法１ 前出の１３ｉｂｂはか、（
１９７７年）により記載された方法の変法を用いた。菌
糸を３４％蔗糖を含む２５ｍ１のＴＥ緩衝液ＣＯ，０１
Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ ）およびＯ，ｏｏｉＭエチレンジアミンテトラアセ
テート（ＥＤＴＡ））ｐ１３７．９中に再懸濁した。こ
の混合物°と３７℃２０分インキュベートし、水浴中に
移し、３４％蔗糖を含む２０ｍ１のＴＥ緩衝液を添加し
た。
１９７７年）により記載された方法の変法を用いた。菌
糸を３４％蔗糖を含む２５ｍ１のＴＥ緩衝液ＣＯ，０１
Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ ）およびＯ，ｏｏｉＭエチレンジアミンテトラアセ
テート（ＥＤＴＡ））ｐ１３７．９中に再懸濁した。こ
の混合物°と３７℃２０分インキュベートし、水浴中に
移し、３４％蔗糖を含む２０ｍ１のＴＥ緩衝液を添加し
た。
ＴＥ緩衝液に溶解したドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ’Ｄ
Ｓ）を終濃度１％になるように添加し、次いで塩化ナト
リウムを終濃度ＩＭになるように加えた。ＳＤＳ沈殿を
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）６１ Ｔｉローター、
３０． ｏｏｏｒｐｍ ４．５分４℃の遠心によシ除去
した。上澄に平均分子量６、０００のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ ）（５縫製度１０％に加え、混合物を
２時間、ないし、−夜４℃でインキュベートした。ＤＮ
Ａ −ＰＥＧ沈殿を５．．００．ＯＸｇ １５分４℃遠
心により収獲した。このペレットを塩化セシウム密度勾
配に用いた およびｑｕｉｇｌｅｙ、 Ｍ、、１９８１年分析生化学
（Ａｎａｌ。
Ｓ）を終濃度１％になるように添加し、次いで塩化ナト
リウムを終濃度ＩＭになるように加えた。ＳＤＳ沈殿を
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）６１ Ｔｉローター、
３０． ｏｏｏｒｐｍ ４．５分４℃の遠心によシ除去
した。上澄に平均分子量６、０００のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ ）（５縫製度１０％に加え、混合物を
２時間、ないし、−夜４℃でインキュベートした。ＤＮ
Ａ −ＰＥＧ沈殿を５．．００．ＯＸｇ １５分４℃遠
心により収獲した。このペレットを塩化セシウム密度勾
配に用いた およびｑｕｉｇｌｅｙ、 Ｍ、、１９８１年分析生化学
（Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ） ７０巻： ４３１−４４１頁に
記載された方法の変法を用いた。洗浄菌糸を２０ｍ１の
５ＴＥＴ緩衝液（８％ 蔗糖、５％トリトンＸ−１００
，５０ｍ、Ｍ ＥＤＴＡおよび５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ。
記載された方法の変法を用いた。洗浄菌糸を２０ｍ１の
５ＴＥＴ緩衝液（８％ 蔗糖、５％トリトンＸ−１００
，５０ｍ、Ｍ ＥＤＴＡおよび５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ。
ｐＨ８，０）中に懸濁した。０．５ｍｌのリゾチム（５
０ｓｎｇ／ｍｌ Ｏ，Ｑ Ｉ Ｍ Ｔｒｉｓ中）を添加
し、その混合物を３０分３７℃でインキュベートした。
０ｓｎｇ／ｍｌ Ｏ，Ｑ Ｉ Ｍ Ｔｒｉｓ中）を添加
し、その混合物を３０分３７℃でインキュベートした。
その混合物を沸騰水浴中に２．５分移した。
これをベックマン６０Ｔｉローター中で、３０、０００
ｒＩ）ｍ ４５分４℃で遠心した。上澄に等量のイソ
プロパツールを添加した。その混合物を少なくとも１時
間−２０℃で冷却し、１２、 ｏｏｏｘｇ １ ’５分
４℃で遠心した。ＤＮＡ−ＰＥＧペレット（手法１よシ
）、あるいはイソプロパツール沈殿からのＤＮＡペレッ
トを１３ｍ１の１０倍濃度ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
ｒＩ）ｍ ４５分４℃で遠心した。上澄に等量のイソ
プロパツールを添加した。その混合物を少なくとも１時
間−２０℃で冷却し、１２、 ｏｏｏｘｇ １ ’５分
４℃で遠心した。ＤＮＡ−ＰＥＧペレット（手法１よシ
）、あるいはイソプロパツール沈殿からのＤＮＡペレッ
トを１３ｍ１の１０倍濃度ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。
１５．６２の塩化セシウムを加え、次いで０．５ ｍｌ
の臭化エチジウム（，１’５ ｒｎｇ ／’ｍｌ水中）
を加えた。
の臭化エチジウム（，１’５ ｒｎｇ ／’ｍｌ水中）
を加えた。
その勾配を、ベックマン５０ Ｔｉローターで、３７、
０００ ｒｐｒｎ ４８時間遠心した。プラスミド・バ
ンドを集め、次の塩化セシウム密度勾配により再精錬し
た。臭化エチジウムを等量のインアミルアルコールで３
回抽出することにより除去した。塩化セシウムは、１，
０００倍量のＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓｐｌ（
７，９，１０”ｍＭＮａｃｔ、 ０．１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ）を３回交換する透析により除去した。プラスミド
ＤＮＡを等量の平衡化フェノールで一回、ジエチルエー
テルで３回抽出した。プラスミドＤＮＡはエタノール沈
殿により濃縮した。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐ１
１６および３容の１００％エタノールをＤＮＡに加えた
。混合物を一２０℃で少なくとも２時間冷却し、次いで
１５． ＯＯＯｘｇ １５分４℃で遠心した。ＤＮＡペ
レットヲ０．５から１、ｏｍｌ！のＤＮＡ緩衝液中に再
懸濁し、４℃で貯蔵した。、５Ｑ□ｍｌの細胞からのＤ
ＮＡの収量は３００から６００μグであつ７λ（このプ
ラスミドが高コピー数−１細胞当り５０コピ一以上であ
ることを示唆する）。
０００ ｒｐｒｎ ４８時間遠心した。プラスミド・バ
ンドを集め、次の塩化セシウム密度勾配により再精錬し
た。臭化エチジウムを等量のインアミルアルコールで３
回抽出することにより除去した。塩化セシウムは、１，
０００倍量のＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓｐｌ（
７，９，１０”ｍＭＮａｃｔ、 ０．１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ）を３回交換する透析により除去した。プラスミド
ＤＮＡを等量の平衡化フェノールで一回、ジエチルエー
テルで３回抽出した。プラスミドＤＮＡはエタノール沈
殿により濃縮した。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐ１
１６および３容の１００％エタノールをＤＮＡに加えた
。混合物を一２０℃で少なくとも２時間冷却し、次いで
１５． ＯＯＯｘｇ １５分４℃で遠心した。ＤＮＡペ
レットヲ０．５から１、ｏｍｌ！のＤＮＡ緩衝液中に再
懸濁し、４℃で貯蔵した。、５Ｑ□ｍｌの細胞からのＤ
ＮＡの収量は３００から６００μグであつ７λ（このプ
ラスミドが高コピー数−１細胞当り５０コピ一以上であ
ることを示唆する）。
プラスミドの単離：手法３ Ｈｏ１ｎｅｓ、 Ｄ、
Ｓ。
Ｓ。
およびＱｕｌｇｌｅｙ、 Ｍ、、（１９８１年前出）か
ら改変した方法を用いた。これは、多数の小規模培養か
ら少量のプラ双ドＤＮＡを速やかに得ることを目的とし
て考案されたものである。
ら改変した方法を用いた。これは、多数の小規模培養か
ら少量のプラ双ドＤＮＡを速やかに得ることを目的とし
て考案されたものである。
２５０ｍ１の邪魔板つきフラスコ中の２０ｄのＹＥＭＥ
−３４Ｍ糖−５ｍＭＭｇα２にプラスミドの存在を試験
するべき菌株の単一集落を植菌する。
−３４Ｍ糖−５ｍＭＭｇα２にプラスミドの存在を試験
するべき菌株の単一集落を植菌する。
これを２７℃２２ Ｏｒｐｍ振盪で３から５日間生育さ
せた。細胞を１０． ｏｏｏｘｇ １０分の遠心で収獲
し、０゜８５％生理食塩水で１回洗浄した。細胞ペレッ
トはこの段階で凍結保存が可能であった１このペレット
を約０．８ ｍｌ＋７） ５ＴＥＴ緩衝液中に再懸濁し
た。ｏ、ｏｓｍｌのリゾチム（５０ｍｇ １ｍ１ＴＥ中
）を加え、混合物を３７℃３０分、次いで沸騰水浴中９
０秒インキュベートした。溶菌液を１２．０００Ｘｇ
１５分間遠心した。＋０．５ｍｌの上澄を回収し、等量
の平衡化フェノールで一回抽出、核酸を等量のイソプロ
パツールで沈殿させた。ペレットを１００μｌのＤＮＡ
緩衝液にｐｊ懸濁１７た。このＤＮＡは放線醒または太
陽菌中への形質転換に適用した。このＤＮＡ ］乃至１
ｏμｔを制限酵素で開裂し、２０μＶ ／ ｍｌリボヌ
クレアーｔｉ′Ａで１５分間３７℃で処理し、アカロー
スケル電気泳動で解析することか可能だった。
せた。細胞を１０． ｏｏｏｘｇ １０分の遠心で収獲
し、０゜８５％生理食塩水で１回洗浄した。細胞ペレッ
トはこの段階で凍結保存が可能であった１このペレット
を約０．８ ｍｌ＋７） ５ＴＥＴ緩衝液中に再懸濁し
た。ｏ、ｏｓｍｌのリゾチム（５０ｍｇ １ｍ１ＴＥ中
）を加え、混合物を３７℃３０分、次いで沸騰水浴中９
０秒インキュベートした。溶菌液を１２．０００Ｘｇ
１５分間遠心した。＋０．５ｍｌの上澄を回収し、等量
の平衡化フェノールで一回抽出、核酸を等量のイソプロ
パツールで沈殿させた。ペレットを１００μｌのＤＮＡ
緩衝液にｐｊ懸濁１７た。このＤＮＡは放線醒または太
陽菌中への形質転換に適用した。このＤＮＡ ］乃至１
ｏμｔを制限酵素で開裂し、２０μＶ ／ ｍｌリボヌ
クレアーｔｉ′Ａで１５分間３７℃で処理し、アカロー
スケル電気泳動で解析することか可能だった。
すぐ上に述べたプラスミド微量調製法を、ｐＩＪ６ （
細胞当りコピー数１から２の５ＬＰ１．２の誘導体）、
ｐＵ３０３（細胞当り５ｏコピ一以上存在するｐＪＪｌ
、０１の誘導体）、およびｐＶＥＩとここに述へるその
誘導体を担−っている且Ｉ １ｖｉｄａｕｓからのプラ
スミドＤＮＡを調へるのＫＪｆｌいた。各々の試料は平
行して、アカロース電気泳動にょシ分析した。プラスミ
ドは、臭化エチジウムで染色したゲルの紫外線の下での
写真によシ視覚化した。プラスミドバンドの螢光の量は
、プラスミドＤＮＡ量に直接比例する。ｐＩＪ６ｕ、そ
の低コピー数故に、常にかすかに螢光を発するバンドと
して出現しドとして出現した。ｐＶＥＩとその誘導体は
常に、ｐＩＪ３０３と同等もしくはそれ以上の光るバン
ドを形成した。この結果は、ｐＶＥＩが高コピー数プラ
スミドであることを示唆した。
細胞当りコピー数１から２の５ＬＰ１．２の誘導体）、
ｐＵ３０３（細胞当り５ｏコピ一以上存在するｐＪＪｌ
、０１の誘導体）、およびｐＶＥＩとここに述へるその
誘導体を担−っている且Ｉ １ｖｉｄａｕｓからのプラ
スミドＤＮＡを調へるのＫＪｆｌいた。各々の試料は平
行して、アカロース電気泳動にょシ分析した。プラスミ
ドは、臭化エチジウムで染色したゲルの紫外線の下での
写真によシ視覚化した。プラスミドバンドの螢光の量は
、プラスミドＤＮＡ量に直接比例する。ｐＩＪ６ｕ、そ
の低コピー数故に、常にかすかに螢光を発するバンドと
して出現しドとして出現した。ｐＶＥＩとその誘導体は
常に、ｐＩＪ３０３と同等もしくはそれ以上の光るバン
ドを形成した。この結果は、ｐＶＥＩが高コピー数プラ
スミドであることを示唆した。
ＢプラスミドＤＮＡの制限分析
ＤＮＡの制限分析およびアガロースゲル電気泳動の手法
は、他の組換えＤＮＡ工学の標準技術と同様に、２つの
有能な手引き中に中介記載されている： １）ａｖｉｓ
、 Ｒ，Ｗ、、１３ｏｔｓｔｅｉｎＸＤ、およびＲｏｔ
ｈ、Ｊ、Ｒ６１９８０年、上級細菌遺伝学、コールドス
プリングハーバ−、コールトスプリンクハーバ−研究所
：およびＭａ ｎ ｉ ａ ｔ ｉ ５ＸＴ０、Ｆｒｉ
ｔｓｃｈＸＥ、 Ｅ、およびＳａｍｌ）ｒｏｏｋ、、
Ｊ、 、１．９８２４１Ｅ１分子クロー二゛ング、コ
ールドスプリングハーバ−、コールドスプリングハーバ
−研究所、１）ＶＥＩ ＤＮＡ を種々の制限酵素およ
び酵素の組合せにより開裂した。Ｉ）Ｎ Ａ断片は、０
．０８ＭＴｒｉｓ−アセテート−０，００４，Ｍ ＥＤ
ＴＡ ヲ緩ｉ液として用いる０、８％アカロース中での
電気泳動により分析した。ｐＶＥ’ｌ断片の大きさは、
既知分子量のファージＤＮＡ断片との対比により決定し
た。ｐＶＥ ］は、１’ １．０ ｋｂのプラスミドで
ある、３それは、制限酵素り皿ｌｆｔ （０／１１．
０ｋｂ標準点として選択した）、ＥＣ０Ｒ１，、Ｂａｍ
Ｈｉおよびｐｖｕ ｉに対し、単一部位を有する。Ｔ３
ＣｔＩ、Ｂｇｌ Ｉｆ、Ｃ１ａ Ｉ、Ｎ０ｔｌ、Ｎｒｕ
Ｌ ｐｓｔ （、ｐ’ｖｕ ｆｆ、ＳｐＪおよび３ｔ
ｕ ■に対し多数部位を有する。これら酵素に対する制
限部位は、マツプされ、図１に示しである。このプラス
ミドは、酵素ＡＣＣＩ、ＡｖａＩＸＡｖａ■、ＢｇｔＩ
、ＢｓｔＢ４．１ａｅｌｌ、Ｈｅａｌｌｌ、ｎｇ ＩＡ
Ｌ庶盟■、」袢■、ヱ兜Ｉ、研巴■、！■、鮨ｌ３ａ
ｌｌ、≦理■、）す■、脂乏■、Ｔａｑ ｌ、および工
ｔｈｌｌｌＩにより多数個開裂される。以下の酵素ｆｄ
、 ｐＶＥ １ドプラストによるＰＥＧ−介在ＤＮＡ
取込みによシなされた。プロトプラストを作るのに用い
られた手法は、基本的にＴｈｃｍｐｓｏｒ＋ＸＣ，Ｊ、
、Ｗａｒｄ。
は、他の組換えＤＮＡ工学の標準技術と同様に、２つの
有能な手引き中に中介記載されている： １）ａｖｉｓ
、 Ｒ，Ｗ、、１３ｏｔｓｔｅｉｎＸＤ、およびＲｏｔ
ｈ、Ｊ、Ｒ６１９８０年、上級細菌遺伝学、コールドス
プリングハーバ−、コールトスプリンクハーバ−研究所
：およびＭａ ｎ ｉ ａ ｔ ｉ ５ＸＴ０、Ｆｒｉ
ｔｓｃｈＸＥ、 Ｅ、およびＳａｍｌ）ｒｏｏｋ、、
Ｊ、 、１．９８２４１Ｅ１分子クロー二゛ング、コ
ールドスプリングハーバ−、コールドスプリングハーバ
−研究所、１）ＶＥＩ ＤＮＡ を種々の制限酵素およ
び酵素の組合せにより開裂した。Ｉ）Ｎ Ａ断片は、０
．０８ＭＴｒｉｓ−アセテート−０，００４，Ｍ ＥＤ
ＴＡ ヲ緩ｉ液として用いる０、８％アカロース中での
電気泳動により分析した。ｐＶＥ’ｌ断片の大きさは、
既知分子量のファージＤＮＡ断片との対比により決定し
た。ｐＶＥ ］は、１’ １．０ ｋｂのプラスミドで
ある、３それは、制限酵素り皿ｌｆｔ （０／１１．
０ｋｂ標準点として選択した）、ＥＣ０Ｒ１，、Ｂａｍ
Ｈｉおよびｐｖｕ ｉに対し、単一部位を有する。Ｔ３
ＣｔＩ、Ｂｇｌ Ｉｆ、Ｃ１ａ Ｉ、Ｎ０ｔｌ、Ｎｒｕ
Ｌ ｐｓｔ （、ｐ’ｖｕ ｆｆ、ＳｐＪおよび３ｔ
ｕ ■に対し多数部位を有する。これら酵素に対する制
限部位は、マツプされ、図１に示しである。このプラス
ミドは、酵素ＡＣＣＩ、ＡｖａＩＸＡｖａ■、ＢｇｔＩ
、ＢｓｔＢ４．１ａｅｌｌ、Ｈｅａｌｌｌ、ｎｇ ＩＡ
Ｌ庶盟■、」袢■、ヱ兜Ｉ、研巴■、！■、鮨ｌ３ａ
ｌｌ、≦理■、）す■、脂乏■、Ｔａｑ ｌ、および工
ｔｈｌｌｌＩにより多数個開裂される。以下の酵素ｆｄ
、 ｐＶＥ １ドプラストによるＰＥＧ−介在ＤＮＡ
取込みによシなされた。プロトプラストを作るのに用い
られた手法は、基本的にＴｈｃｍｐｓｏｒ＋ＸＣ，Ｊ、
、Ｗａｒｄ。
Ｊ、Ｍ、およびＨｏｐｗｏｏｄＸＤ、Ａ、 （１９８２
年、前出）に記載されたものであった。３４％蔗糖、５
ｍＭＭｇＣｔ２および、Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓ用には
０．５％グリシ：／ （Ｓ、ａｖｅｒｍｉｔ１＋ｉｓ用
には１％グリシン）を含む２５ ｗＬＩ ＹＥＭＥに、
１０８胞子を植菌した。これｆ：’２５．Ｏｍｌの邪魔
板つきフラスコ中で、２日間２７℃２２０ ｒｐｍ振盪
でインキュベートした。細・胞を遠心により収穫し、０
、８ ’５％生理食塩水で１回洗浄した。ペレット’ｔ
１ ｍｅ／ｍｌリソチムを含む培地Ｐ約１０ｍ６中に
再懸濁した。培地ｐ （□ｋａｎｉｓｈｉ、Ｍ８．５ｕ
ｚｕｋ ｉ、ＫおよびＴＪｍｅｚａｗａ、、Ｈ，１９７
４年、前出）は、１を当り、１０３２蔗糖、０．２５
ｆＫ、、ＳＯ２，２０３，Ｓ’ ＭｇＱ！ ・６ Ｒ２
０，２ｍｌの微量成分溶液を含む。微量成分溶液は、１
を当り４０ｍｙ ＺｎＣｌ２．２００Ｉｎ９Ｆｅα３・
、６Ｈ２！ Ｑ； １０ｉｐ ｕα２ ・２ Ｒ２０，
，１０ｍ９Ｍｎｃ１２・４Ｈ２０，１０ｍ９Ｎａ２Ｂ４
０７・１０Ｈ２０および１０ ｍ９ （ＮＨ４）６ＭＯ
７０２４７４Ｒ２０”ｊｚ含む。１０＋ｄの滅菌０，５
’７、ＫＨ２ＰＯ４の後：ｃ １０ ｍｌの２．５ＭＣ
ａＣｌ２および一１０ｍ１の２５０ ｍＭ ＴＥＳｐＨ
７，２（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタン−スルホン酸）を加えて完全な培地ｐ１つ
くる。Ｓ、ａｖｅｒｍｉｔｉｌｊｓ ｉｃッｌｘテは、
ＴＥＳの代りに４０ｍ１の２５０ ｍＭ ＭＥＳ。
年、前出）に記載されたものであった。３４％蔗糖、５
ｍＭＭｇＣｔ２および、Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓ用には
０．５％グリシ：／ （Ｓ、ａｖｅｒｍｉｔ１＋ｉｓ用
には１％グリシン）を含む２５ ｗＬＩ ＹＥＭＥに、
１０８胞子を植菌した。これｆ：’２５．Ｏｍｌの邪魔
板つきフラスコ中で、２日間２７℃２２０ ｒｐｍ振盪
でインキュベートした。細・胞を遠心により収穫し、０
、８ ’５％生理食塩水で１回洗浄した。ペレット’ｔ
１ ｍｅ／ｍｌリソチムを含む培地Ｐ約１０ｍ６中に
再懸濁した。培地ｐ （□ｋａｎｉｓｈｉ、Ｍ８．５ｕ
ｚｕｋ ｉ、ＫおよびＴＪｍｅｚａｗａ、、Ｈ，１９７
４年、前出）は、１を当り、１０３２蔗糖、０．２５
ｆＫ、、ＳＯ２，２０３，Ｓ’ ＭｇＱ！ ・６ Ｒ２
０，２ｍｌの微量成分溶液を含む。微量成分溶液は、１
を当り４０ｍｙ ＺｎＣｌ２．２００Ｉｎ９Ｆｅα３・
、６Ｈ２！ Ｑ； １０ｉｐ ｕα２ ・２ Ｒ２０，
，１０ｍ９Ｍｎｃ１２・４Ｈ２０，１０ｍ９Ｎａ２Ｂ４
０７・１０Ｈ２０および１０ ｍ９ （ＮＨ４）６ＭＯ
７０２４７４Ｒ２０”ｊｚ含む。１０＋ｄの滅菌０，５
’７、ＫＨ２ＰＯ４の後：ｃ １０ ｍｌの２．５ＭＣ
ａＣｌ２および一１０ｍ１の２５０ ｍＭ ＴＥＳｐＨ
７，２（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタン−スルホン酸）を加えて完全な培地ｐ１つ
くる。Ｓ、ａｖｅｒｍｉｔｉｌｊｓ ｉｃッｌｘテは、
ＴＥＳの代りに４０ｍ１の２５０ ｍＭ ＭＥＳ。
ｐＨ６、，０（２−（Ｍ−モルフォリノ）エタンスルホ
ン酸）を用いた。菌糸をリソチムと共に３７℃１時間イ
ンキュベートした。懸濁液を３ＣＣのグラスウールでＦ
Ａし、Ｆ′Ｇ、’ｔ４０００ｘｇ５分遠心した。ペレッ
トを２から５ ｍｌの培地Ｐ中に再懸濁した。プロトプ
ラストは直ちに用いるか、−７０℃で凍結した。
ン酸）を用いた。菌糸をリソチムと共に３７℃１時間イ
ンキュベートした。懸濁液を３ＣＣのグラスウールでＦ
Ａし、Ｆ′Ｇ、’ｔ４０００ｘｇ５分遠心した。ペレッ
トを２から５ ｍｌの培地Ｐ中に再懸濁した。プロトプ
ラストは直ちに用いるか、−７０℃で凍結した。
（２）形質転換法 形質転換には、洗浄のために、０．
２ｍｌのプロトプラスト（約１０８７ｍ１）を、２−０
ｍ１ｒ７）培ｉｐ中に稀釈し、３．’０００Ｘｇ５分遠
心、残りの培地中に再懸ｃ濁した。ＤＮＡ試Ｈ（］ Ｏ
ｍｌ（７） ＤＮＡ緩衝液中０．０１ カら］、。
２ｍｌのプロトプラスト（約１０８７ｍ１）を、２−０
ｍ１ｒ７）培ｉｐ中に稀釈し、３．’０００Ｘｇ５分遠
心、残りの培地中に再懸ｃ濁した。ＤＮＡ試Ｈ（］ Ｏ
ｍｌ（７） ＤＮＡ緩衝液中０．０１ カら］、。
μ７）を、プロトプラストと混合した。Ｑ、５ｍｌの培
地Ｔを加え、混合物を室温で１分インキュベートした。
地Ｔを加え、混合物を室温で１分インキュベートした。
培地Ｔは、異なる濃度の蔗糖（２，５％）およびＣａｐ
（０、１Ｍ）をきみ、５０ｍＭ ｌ−リス−マレイン
酸（ｐＨ８）で緩衝化し、２５％（Ｗ９／ｖｏｔ） Ｐ
ＥＧ １．０００を含むことを除いては、培地Ｐと同様
である、混合物を培地Ｐで逐次稀釈し、０４ｍ１量ｆ：
Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ用には、Ｒ２ＹＥ、 Ｓ、 ａｖ
ｅｒｍｊｔｉｌ≦用にはＲＭ１４の再生培地上に平板塗
布し、プロトプラストが細胞壁を再生出来るようにした
。
（０、１Ｍ）をきみ、５０ｍＭ ｌ−リス−マレイン
酸（ｐＨ８）で緩衝化し、２５％（Ｗ９／ｖｏｔ） Ｐ
ＥＧ １．０００を含むことを除いては、培地Ｐと同様
である、混合物を培地Ｐで逐次稀釈し、０４ｍ１量ｆ：
Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ用には、Ｒ２ＹＥ、 Ｓ、 ａｖ
ｅｒｍｊｔｉｌ≦用にはＲＭ１４の再生培地上に平板塗
布し、プロトプラストが細胞壁を再生出来るようにした
。
Ｒ２ＹＥは、１を当り１７０７蔗糖、３グプロリンおよ
び０．２５ ｆ Ｋ２Ｓｏ、、１０．１ ＰＭｇ（４−
６Ｈ，，０１１０クグリコース１．０．Ｉ Ｐカザミノ
酸、２ｍｌの微量成分溶液、３？の酵母エキスおよび、
１５）寒天を含む。後でのＣａα２、Ｋ）（、、ＰＯ４
およびＴＥＳの無菌添加は、培地Ｐの場合と同じである
。ＲＭ １４は、１を当り２０５１蔗糖、２０Ｌ？寒天
および、３７オートミール寒天の追加を含む事を除き、
Ｒ２ＹＥとほぼ同様である。添加する緩衝液は、培地Ｐ
について記載したものと同じである。
び０．２５ ｆ Ｋ２Ｓｏ、、１０．１ ＰＭｇ（４−
６Ｈ，，０１１０クグリコース１．０．Ｉ Ｐカザミノ
酸、２ｍｌの微量成分溶液、３？の酵母エキスおよび、
１５）寒天を含む。後でのＣａα２、Ｋ）（、、ＰＯ４
およびＴＥＳの無菌添加は、培地Ｐの場合と同じである
。ＲＭ １４は、１を当り２０５１蔗糖、２０Ｌ？寒天
および、３７オートミール寒天の追加を含む事を除き、
Ｒ２ＹＥとほぼ同様である。添加する緩衝液は、培地Ｐ
について記載したものと同じである。
（３）形質転換の検出 形質転換したプロトプラストを
稀釈し、再生培地上に平板塗布した。
稀釈し、再生培地上に平板塗布した。
平板を２７℃でインキュベートした。形質転換ＤＮＡが
、ｔｓｒ遺伝子をもったｐＶＥＩの誘導体の場合、平板
を２４時間目に、終濃度５０μｙ／１ａｌｌ濃度全力え
るに十分なチオストレプトンを含む０．７％寒天の阿生
培地４ ｍｌで重層した。更に、３から４日のインキュ
ベーションの後に’Ｉ’ｈｉｏｒ（チオストレプトン耐
性）集落が生成した。形質転換株は、もとの再生平板を
４から７日インキユヘートし、これを１０から５０μｆ
／／ｍｌチオストレプトン含有の同様培地に平板転写す
る事によっても検出された。形質転換鳳が： Ｉ）ＶＥ
Ｉのように選択マーカーをもたないプラスミドであるか
、又は、なお自己伝達能のある誘導体である場合は形質
転換株は、ポック形成により検出された。
、ｔｓｒ遺伝子をもったｐＶＥＩの誘導体の場合、平板
を２４時間目に、終濃度５０μｙ／１ａｌｌ濃度全力え
るに十分なチオストレプトンを含む０．７％寒天の阿生
培地４ ｍｌで重層した。更に、３から４日のインキュ
ベーションの後に’Ｉ’ｈｉｏｒ（チオストレプトン耐
性）集落が生成した。形質転換株は、もとの再生平板を
４から７日インキユヘートし、これを１０から５０μｆ
／／ｍｌチオストレプトン含有の同様培地に平板転写す
る事によっても検出された。形質転換鳳が： Ｉ）ＶＥ
Ｉのように選択マーカーをもたないプラスミドであるか
、又は、なお自己伝達能のある誘導体である場合は形質
転換株は、ポック形成により検出された。
もとの再生平板は４乃至７日２７℃でインキュベートし
た。ポックとして知られる生育阻害又は気菌糸形成の阻
害による小さな領域（１−２８）が、再生した生育面に
出現する。これはプラスミドが、もとの形質転換された
細胞から、周囲のプラスミドをもたない細胞中に伝達さ
れることにより、菌糸の生育を阻害したことによるもの
である。
た。ポックとして知られる生育阻害又は気菌糸形成の阻
害による小さな領域（１−２８）が、再生した生育面に
出現する。これはプラスミドが、もとの形質転換された
細胞から、周囲のプラスミドをもたない細胞中に伝達さ
れることにより、菌糸の生育を阻害したことによるもの
である。
上述の方法によるＩ）ＶＥ １のＳ、 １ｉｖｉｄａｎ
ｓ中への形質転換が、ポックの生成をもたらしたことは
、このプラスミドが、自己伝達能をもっことを示唆する
。細胞はポックの領域からの胞子を新鮮培地に再塗布す
ることにょ９純化した。単一集落を取上げ、生育させ、
上述のプラスミド微量調製法にょシ分析した。ポックか
ら得られた全ての集落がｐＶＥｌが、調己伝達能をもつ
プラスミドであることが結論された。
ｓ中への形質転換が、ポックの生成をもたらしたことは
、このプラスミドが、自己伝達能をもっことを示唆する
。細胞はポックの領域からの胞子を新鮮培地に再塗布す
ることにょ９純化した。単一集落を取上げ、生育させ、
上述のプラスミド微量調製法にょシ分析した。ポックか
ら得られた全ての集落がｐＶＥｌが、調己伝達能をもつ
プラスミドであることが結論された。
Ｄ ｐＶＥＩとｐＩＪ３９との間の相互組込みプラスミ
ドの形成 □ この実験（ｒま、異種ＤＮＡをｐＶＥｌ中へクローニン
グすることが可能であることを示している。
ドの形成 □ この実験（ｒま、異種ＤＮＡをｐＶＥｌ中へクローニン
グすることが可能であることを示している。
１）ＩＪ ３９は、プラスミドｐＩＪ６ （Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ、 ｃ、 Ｊ、、Ｗａ ｒｄ Ｘｔｒ、 Ｍ、お
よびＨｏｐｗｏｏｄ ＸＤ、 Ａ、 １９８０年、前出
）から、アンピシリン耐性大腸菌プラスミドｐＢＲ３２
２（５ｕｔｃｌ ｉｆｆ 、 Ｉ’、、Ｇ、 １９７８
年、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
） ５巻： ２７２１−２７２８頁〕の１３ａｍ Ｈ
）部位ヘクローンしｆＪＬｔｓｒ（チオストレプトン耐
性）遺伝子を含む１．９ｋｂ ｐａｍ Ｊ（７断片を含
んでいる。ｐＶＥＩおよびｐｌＪ３９は各々別々に標準
法に従ってＥＣＯＲ’ １によシ直鎖化した。２μ７の
直鎖にしたｐＶＥｌを１５μ７（５分子量過剰）の直鎖
化したｐＩＪ３９と混合し、終ＤＮＡ濃度ｆ ６００μ
？ 、！：した。これを、ＤａｖｉｓＸＲ，Ｖ、、Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎＸＤ、お、１： ヒＲｏｔｈＸＪ、 Ｒ１
，１９８０年、前出に記載されている標準法により、リ
ガーゼ緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリカーゼで処理した。結
合した混合物ｉＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２Ｒ，ＲＩ Ｃ
ＢｏｌｉｖａｒＸＦｌ、Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ。
ｓｏｎ、 ｃ、 Ｊ、、Ｗａ ｒｄ Ｘｔｒ、 Ｍ、お
よびＨｏｐｗｏｏｄ ＸＤ、 Ａ、 １９８０年、前出
）から、アンピシリン耐性大腸菌プラスミドｐＢＲ３２
２（５ｕｔｃｌ ｉｆｆ 、 Ｉ’、、Ｇ、 １９７８
年、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
） ５巻： ２７２１−２７２８頁〕の１３ａｍ Ｈ
）部位ヘクローンしｆＪＬｔｓｒ（チオストレプトン耐
性）遺伝子を含む１．９ｋｂ ｐａｍ Ｊ（７断片を含
んでいる。ｐＶＥＩおよびｐｌＪ３９は各々別々に標準
法に従ってＥＣＯＲ’ １によシ直鎖化した。２μ７の
直鎖にしたｐＶＥｌを１５μ７（５分子量過剰）の直鎖
化したｐＩＪ３９と混合し、終ＤＮＡ濃度ｆ ６００μ
？ 、！：した。これを、ＤａｖｉｓＸＲ，Ｖ、、Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎＸＤ、お、１： ヒＲｏｔｈＸＪ、 Ｒ１
，１９８０年、前出に記載されている標準法により、リ
ガーゼ緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリカーゼで処理した。結
合した混合物ｉＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ−１２Ｒ，ＲＩ Ｃ
ＢｏｌｉｖａｒＸＦｌ、Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ。
Ｒ，Ｌ、、ＢｅｔｌａｃｈＸＫ Ｃ，およびＢｏｙｅｒ
、 Ｈ，Ｗ、 。
、 Ｈ，Ｗ、 。
１９７７年、遺伝子（二μ巻ニア５−９３頁〕のコンピ
テント細胞の形質転換に用いた。ＲＲＩは、Ｍａｎｄｅ
’ｌ、 Ｍ、およびＨｉｇａＸＡ９．１９７０年分子生
物学雑芋（Ｊ、Ｍｏ１．ＢｉｏＪ ） ５３巻：ｌ５９
−１６２頁−の方法によシコンピテントにした。
テント細胞の形質転換に用いた。ＲＲＩは、Ｍａｎｄｅ
’ｌ、 Ｍ、およびＨｉｇａＸＡ９．１９７０年分子生
物学雑芋（Ｊ、Ｍｏ１．ＢｉｏＪ ） ５３巻：ｌ５９
−１６２頁−の方法によシコンピテントにした。
細胞をＬＢ培地（ｌｔ中に１０グトリプトン、５１酵母
エキス゛、５グＮａα）中でＡ ｔｏｏ ＝ ０．４５
トした。細胞をペレットにし、０．１ Ｍ Ｃａα２中
に最初の半量で再Ｉｗ、濁した。氷上で２０分の後、細
胞を再びペレットにし、Ｏ，］’Ｃａα２中に最初の０
．１量で再懸濁した。これらのコンピテント細胞を形質
転換に用いるが、グリセロール中で１５％にして一７０
℃で保存した。
エキス゛、５グＮａα）中でＡ ｔｏｏ ＝ ０．４５
トした。細胞をペレットにし、０．１ Ｍ Ｃａα２中
に最初の半量で再Ｉｗ、濁した。氷上で２０分の後、細
胞を再びペレットにし、Ｏ，］’Ｃａα２中に最初の０
．１量で再懸濁した。これらのコンピテント細胞を形質
転換に用いるが、グリセロール中で１５％にして一７０
℃で保存した。
形質転換には、ｏ、、２ｍｌのコンピテント細胞金、１
０％ｐＶＥ１とＩ）ＩＪ ３９との間のライゲーション
反応からのＤＮＡと混合した。混合物を３７℃で２分、
次いで氷上で１時間インキュベートした。１８ｘｌ’０
０ｍｍ試験管内の混合物中に３ ｍｌのＬＢＪ＠地を加
え、それを２２Ｃ１ｒｐｍ、３７℃１．５時間振盪シタ
。ｐＩ、Ｊ：３９−ｍ質転換した細胞を選択するために
一部を１ｏ。
０％ｐＶＥ１とＩ）ＩＪ ３９との間のライゲーション
反応からのＤＮＡと混合した。混合物を３７℃で２分、
次いで氷上で１時間インキュベートした。１８ｘｌ’０
０ｍｍ試験管内の混合物中に３ ｍｌのＬＢＪ＠地を加
え、それを２２Ｃ１ｒｐｍ、３７℃１．５時間振盪シタ
。ｐＩ、Ｊ：３９−ｍ質転換した細胞を選択するために
一部を１ｏ。
μｆｌ ／ ｍｌアンピシリンを加えたＩ、Ｂ寒天上に
平板塗布した。
平板塗布した。
望みの組換えプラスミドを含む株を同定するために、Ａ
ｍｐｒ形質転換株について、上述と同様のプラスミド微
量調製分析を行った。単−Ｓ落ｆ５ｍｌのアンピシリン
倉有ＬＢｌｌ？ｌ：［菌し、−夜培養遠心にょシペレッ
トとし、０．４ ｒｎｌ（７） ５ＴＥＴ緩衝液に再懸
濁した。ｏ、、ｏｓｍｌのリゾチム（５０ｍ９ ／ ｒ
ａｌ ＴＥ中）を加えた。
ｍｐｒ形質転換株について、上述と同様のプラスミド微
量調製分析を行った。単−Ｓ落ｆ５ｍｌのアンピシリン
倉有ＬＢｌｌ？ｌ：［菌し、−夜培養遠心にょシペレッ
トとし、０．４ ｒｎｌ（７） ５ＴＥＴ緩衝液に再懸
濁した。ｏ、、ｏｓｍｌのリゾチム（５０ｍ９ ／ ｒ
ａｌ ＴＥ中）を加えた。
混合物を沸騰水中６０秒インキュベートし、１２、００
０’ｘｇ １２分遠心、上澄を、等量の−ｒツブロバノ
ールで沈殿させた。核酸’ｚｌｏｏμｔのＤＮＡ緩衝液
中に再懸濁し、市１ｎ恨消化および７カロースゲル電気
泳動にょシ分析した。
０’ｘｇ １２分遠心、上澄を、等量の−ｒツブロバノ
ールで沈殿させた。核酸’ｚｌｏｏμｔのＤＮＡ緩衝液
中に再懸濁し、市１ｎ恨消化および７カロースゲル電気
泳動にょシ分析した。
両方の可能な組換えプラスミドが得られた、ｐＶＥ３お
よびｐＶＥ ４は、ｐｌＪ ３９とｐＶＥｌとが、それ
らのＥｃｏＲ１部位で２つの可能な方向で結合された相
互組込みプラスミドである。ｐＶＥ３およびＩ）ＶＦ６
は、５ｏｏｒｎｌノ細胞がらＣｌｅｗｅｌｌ、Ｄ、 Ｂ
、および）（ｅｌｉｎｓｋｉ、Ｄ、 Ｒ，，１９６９年
、アメリカ利学χカデミー会報（ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
よびｐＶＥ ４は、ｐｌＪ ３９とｐＶＥｌとが、それ
らのＥｃｏＲ１部位で２つの可能な方向で結合された相
互組込みプラスミドである。ｐＶＥ３およびＩ）ＶＦ６
は、５ｏｏｒｎｌノ細胞がらＣｌｅｗｅｌｌ、Ｄ、 Ｂ
、および）（ｅｌｉｎｓｋｉ、Ｄ、 Ｒ，，１９６９年
、アメリカ利学χカデミー会報（ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ） ６２巻： １１５９−１１６６
頁のトリトンＸ−１００クリアート・ライゼイト法にょ
シ精製された。
頁のトリトンＸ−１００クリアート・ライゼイト法にょ
シ精製された。
Ｓ、 、１１ｖｉｄａｎｓの形質転換には、上述のよう
會 にプラスミドｐＶＥ３ ＤＮＡを用いた。７日生育の後
、再生平板にポック形成が示された。これらの平板を１
０μｇ ／ ｍｌ！チオストレプトン金含ｋＲ２ＹＥ培
地に転写平板し、３日間２７℃インキュベートした。Ｔ
１１１Ｏｒ集落の位置は正確にもとの再生平板中のポッ
クに対応し、相互組込みプラスミドによる形質転換が行
われλまた、ｐＶＥ３がなお自己伝達能を有する義が示
された。１０個の’ｌ”ｈｉｏ’集落を純化し、プラス
ミド微量調製法のために培養するのに用いた。得られた
ＤＮＡの制限分析により、これらの集落が、プラスミド
ｐＶＥａを含むことが示された。
會 にプラスミドｐＶＥ３ ＤＮＡを用いた。７日生育の後
、再生平板にポック形成が示された。これらの平板を１
０μｇ ／ ｍｌ！チオストレプトン金含ｋＲ２ＹＥ培
地に転写平板し、３日間２７℃インキュベートした。Ｔ
１１１Ｏｒ集落の位置は正確にもとの再生平板中のポッ
クに対応し、相互組込みプラスミドによる形質転換が行
われλまた、ｐＶＥ３がなお自己伝達能を有する義が示
された。１０個の’ｌ”ｈｉｏ’集落を純化し、プラス
ミド微量調製法のために培養するのに用いた。得られた
ＤＮＡの制限分析により、これらの集落が、プラスミド
ｐＶＥａを含むことが示された。
これら集落を’Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓのストレプトマ
イシン耐性誘導法との接合実験に用いた。全ての株を、
１８ＸｉＯＯｍ試験管中、２ｍｌのＹＥＭＥ −３４％
蔗糖−５ｍＭＭｇα２で２時間生育させた。Ｒ２ＹＥ寒
天平板またはＹＤ平板（］を中４２酵母エキス、１０？
麦芽エキス、４グデキストロースおよび１５７寒天、］
Ｏｍ’ＭＣａＣ１！２、および１０ ｍＭ Ｍｇα２）
に、０．１ ｍｌの受容菌Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓスト
レプトマイシン耐性培養を塗布した。この生育、Ｈの上
に、各供与菌’Ｉ’ｈｉｏｒ培養−液５μｔ’ｆ（スポ
ットした。３５℃で７日インキュベーション後、接合平
板乞非接合供与菌および受容菌細胞の平板と共に、１０
μ１ｉｌＩ／ ｍｌチオストレプトンおよび１００１
ｉ’／ ｍｌストレプトマイシンを含むＲ２ＹＥ平板に
転写し、接合体を選択した。
イシン耐性誘導法との接合実験に用いた。全ての株を、
１８ＸｉＯＯｍ試験管中、２ｍｌのＹＥＭＥ −３４％
蔗糖−５ｍＭＭｇα２で２時間生育させた。Ｒ２ＹＥ寒
天平板またはＹＤ平板（］を中４２酵母エキス、１０？
麦芽エキス、４グデキストロースおよび１５７寒天、］
Ｏｍ’ＭＣａＣ１！２、および１０ ｍＭ Ｍｇα２）
に、０．１ ｍｌの受容菌Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓスト
レプトマイシン耐性培養を塗布した。この生育、Ｈの上
に、各供与菌’Ｉ’ｈｉｏｒ培養−液５μｔ’ｆ（スポ
ットした。３５℃で７日インキュベーション後、接合平
板乞非接合供与菌および受容菌細胞の平板と共に、１０
μ１ｉｌＩ／ ｍｌチオストレプトンおよび１００１
ｉ’／ ｍｌストレプトマイシンを含むＲ２ＹＥ平板に
転写し、接合体を選択した。
３５℃で３から４日インキュベーション後に、選択平板
は、ｐｖＥ３が供与菌からストレプトマイシン耐性受容
菌に伝達されることにより生じたチオストレプトン耐性
ストレプトマイシン耐性の集落を含んでいた。非接合対
照培養液には、二重耐性集落は出現しなかつ丸この結果
悼、相互組込みプラスミドｐＶＥ３が、自己伝痒し得る
ことを示した。
は、ｐｖＥ３が供与菌からストレプトマイシン耐性受容
菌に伝達されることにより生じたチオストレプトン耐性
ストレプトマイシン耐性の集落を含んでいた。非接合対
照培養液には、二重耐性集落は出現しなかつ丸この結果
悼、相互組込みプラスミドｐＶＥ３が、自己伝痒し得る
ことを示した。
チオストレプトン耐性（１）ＢＲのＤＮＡ ｉｄ含まな
い）をコードしているＤＮＡのみを含む断片をｐＶＥ’
ｌの種々の制限部位中にクローンした。この実験は、Ｄ
ＮＡを開裂した際に、酵素］３ａｍＨＪ。
い）をコードしているＤＮＡのみを含む断片をｐＶＥ’
ｌの種々の制限部位中にクローンした。この実験は、Ｄ
ＮＡを開裂した際に、酵素］３ａｍＨＪ。
Ｂｇｔ ｎおよびＢＣｔＩが、同じ４塩基５′伸長部Ｇ
ＡＴＣ’ｉ与える事実を利用した。このことから、これ
ら酵素の各々により生成した断片を、これら酵素のどれ
か１つにより生成した断片とアニールし、ライゲート（
Ｉｉｇａｔｅ ）することが可能となる。
ＡＴＣ’ｉ与える事実を利用した。このことから、これ
ら酵素の各々により生成した断片を、これら酵素のどれ
か１つにより生成した断片とアニールし、ライゲート（
Ｉｉｇａｔｅ ）することが可能となる。
プラスミドｐＩＪ３９は、リエ遺伝子をもつ１．９ｋｂ
即思ＨＪ断片を含む（図６参照）。この上−Ｈｌ断片中
に、完全な吏遺壬子を含む５ｅｔＨ，ｌｋｂ断片がある
。ＢＣｌｌはｄａｍ遺伝子による修飾の結果メチル化さ
れ−た大腸菌ＤＮＡを開裂しない（’ ｌ（ａ ｔ ｔ
ｍｅｒ＋ＸＳ、、Ｂｒｏｏｋｓ、 Ｊ、 Ｅ、およびＭ
ａｓｕｒｅｋａｒ。
即思ＨＪ断片を含む（図６参照）。この上−Ｈｌ断片中
に、完全な吏遺壬子を含む５ｅｔＨ，ｌｋｂ断片がある
。ＢＣｌｌはｄａｍ遺伝子による修飾の結果メチル化さ
れ−た大腸菌ＤＮＡを開裂しない（’ ｌ（ａ ｔ ｔ
ｍｅｒ＋ＸＳ、、Ｂｒｏｏｋｓ、 Ｊ、 Ｅ、およびＭ
ａｓｕｒｅｋａｒ。
Ｍｌ、１９７８年、分子生物学雑誌（Ｊ、Ｍｏ１． Ｂ
ｉｏｌ ）１２６巻： ２６７−３８０ ：）から、プ
ラスミドｐ Ｉ Ｊ３９試料は、ｄａｍ ’ ｄｃｍ−
宿主ＧＭ ２７２ 〔’Ｍａｒｉｎｕｓ、。
ｉｏｌ ）１２６巻： ２６７−３８０ ：）から、プ
ラスミドｐ Ｉ Ｊ３９試料は、ｄａｍ ’ ｄｃｍ−
宿主ＧＭ ２７２ 〔’Ｍａｒｉｎｕｓ、。
Ｍ−Ｇ、およびＫｏｎｒａｄ、 Ｅ、 Ｂ、、１９７６
年、分子一般遺伝学（Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ、 Ｑｅｎｅｔ
、 ） １４９巻＋ ２７３−２７７頁〕から調製し
た。１．ｌｋｂのとヱ■ｔｓｒ断片をｐＶＥｌの、１個
所ある立川部位および、４個所あるＢＣ１１部位の少な
くとも２個所に挿入した。
年、分子一般遺伝学（Ｍｏｌ 、Ｇｅｎ、 Ｑｅｎｅｔ
、 ） １４９巻＋ ２７３−２７７頁〕から調製し
た。１．ｌｋｂのとヱ■ｔｓｒ断片をｐＶＥｌの、１個
所ある立川部位および、４個所あるＢＣ１１部位の少な
くとも２個所に挿入した。
さらに、１．９ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ工Ｕ断片を、ｐＶ
Ｅｌ中にクローンした。この手法の詳細に以下のようで
ある。
Ｅｌ中にクローンした。この手法の詳細に以下のようで
ある。
ｐＶＥｌおよび、ｐＩＪ３９ ｉ各々別々にＢａｍＩ（
Ｉで開裂した。制限酵素を不活化した後、２μｍの直鎖
にしたｐＶＥｉｉ、５モル過剰、６μグ、のＢａｍ Ｈ
ｉ開裂ｐＩＪ３９と混合踵 リガーゼ緩衝液中ＤＮＡ濃
度４００μグ／ ｍｌで、１６℃−夜Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼと共にインキュベートした。
Ｉで開裂した。制限酵素を不活化した後、２μｍの直鎖
にしたｐＶＥｉｉ、５モル過剰、６μグ、のＢａｍ Ｈ
ｉ開裂ｐＩＪ３９と混合踵 リガーゼ緩衝液中ＤＮＡ濃
度４００μグ／ ｍｌで、１６℃−夜Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼと共にインキュベートした。
この反応混合物の半量を、Ｓ、 Ｉ １ｖｉｄａｎｓプ
ロトプラストの形質転換に用いた。Ｔｈ１ｏ 形質転
換株を、上述の重層法により検出した。
ロトプラストの形質転換に用いた。Ｔｈ１ｏ 形質転
換株を、上述の重層法により検出した。
ｐＶＥｌは、３個所の弧■部位および４つのＢｇｔ １
部位を含む。可能な部位の各々にと伍をもった独立の組
換えプラスミドを得ることが望まれた。従って、ｐＶＥ
ｌとの制限酵素のインキヱーションにより、ＤＮＡ試料
が、その酵素で部分的にのみ消化され、その酵素で一度
だけ開裂されたプラスミド分子がかなりの数得られるよ
うに条件を設定した。これらの直鎖にした分子は、ライ
ゲーションに好ましい基質となった。この集団は、Ｉ）
ＶＥＩを各々の可能な部位で直鎖にしたものの混合物で
あると思われる。Ｉ）ＶＥＩをμ？ ＤＮＡ当り、Ｂｇ
ｔＩＩまたは膓＋、／；ｉ ０．１から１゜０単位酵
素濃度でインキュベートした。試料を５．１０，２０．
４０および８０分に取出し、アガロースゲル電気泳動で
分析することによって完全消化産物の量が最小で直鎖状
分子が大部分を占めるような条件を決定した。これらの
条件は、各酵素バッチに対し、経験的に決定しなくては
ならなかった。
部位を含む。可能な部位の各々にと伍をもった独立の組
換えプラスミドを得ることが望まれた。従って、ｐＶＥ
ｌとの制限酵素のインキヱーションにより、ＤＮＡ試料
が、その酵素で部分的にのみ消化され、その酵素で一度
だけ開裂されたプラスミド分子がかなりの数得られるよ
うに条件を設定した。これらの直鎖にした分子は、ライ
ゲーションに好ましい基質となった。この集団は、Ｉ）
ＶＥＩを各々の可能な部位で直鎖にしたものの混合物で
あると思われる。Ｉ）ＶＥＩをμ？ ＤＮＡ当り、Ｂｇ
ｔＩＩまたは膓＋、／；ｉ ０．１から１゜０単位酵
素濃度でインキュベートした。試料を５．１０，２０．
４０および８０分に取出し、アガロースゲル電気泳動で
分析することによって完全消化産物の量が最小で直鎖状
分子が大部分を占めるような条件を決定した。これらの
条件は、各酵素バッチに対し、経験的に決定しなくては
ならなかった。
Ｂ（４Ｉで部分開裂したｐＶＥｌおよびＢｇｔＵで部分
開裂しｉ １）ＶＥＩ ’ｅ、ＢＣｔｌで開裂したｐＩ
Ｊ３９と、他のライゲーションで述べた条件下で混合、
連結し、Ｔｈ１Ｏｒ形質転換株を、上述の重層法により
検出した。
開裂しｉ １）ＶＥＩ ’ｅ、ＢＣｔｌで開裂したｐＩ
Ｊ３９と、他のライゲーションで述べた条件下で混合、
連結し、Ｔｈ１Ｏｒ形質転換株を、上述の重層法により
検出した。
（２）組換えプラスミドの解析
チオストレプトン耐性集落を２度Ｒ２ＹＥ −１ｈ ｉ
Ｏ培地上で純化し、各ライゲーションからのいくつか
の培養液を、プラスミド微量調製分析により解析した。
Ｏ培地上で純化し、各ライゲーションからのいくつか
の培養液を、プラスミド微量調製分析により解析した。
土挿入部位と、ヒＨＩ １．９ ｋｌ）毘断片または見
：、５Ｉ １，１ ｋＬ＋三断片の方向性を決定するた
めに制限消化を行った。全てのライゲーション実験につ
いて、方向と位置を決めるために制限酵素唾旦Ｉを用い
た。ＢＣｌＩで部分開裂したｐＶＥｌを検討した実験で
は、酵素ｐｖｕ ■も用いた。各々が、ｐＶＥｌを３回
（図１参照）および上断片を１回（図６参照）開裂する
ので、これらの実験には、この２つの酵素が有用であっ
た。二ニＨ（捷たはＢＣ７ｉ断片は、各々１つの非対照
的に位置する卑１部位およびｐｖｕ１１部位を含んでい
る。こρことで、！断片に対する方向の決定が可能とな
る。土中の旦び■部位は、Ｌ Ｓ ｒカらの２つの（Ｈ
ｌａ １−ＢｃｌＩ断片の小さい方にあるＱＩａ１部位
のごく近くにマツプされることが決定された。組換えＴ
旧０′プラスミドｔ （ｊａ ｆ−ｉｐ ｐゴ辷四■で
消化することにより、ｐＶＥｌおよび１肛の制限地図か
ら予言され得た断片が生じ°た。方向１は、ＢａｍＨＩ
またはＢＣＡＩの巨断片が、図２で描かれた組換えプラ
スミドの回りを、時計廻りに動いたとき、ｔｓｒ断片の
中点を過ぎてから旦１ａｌ−またはｐｖｕＨ部位に出会
うような方向と定義した。方向′２は、この向きの反対
であった。
：、５Ｉ １，１ ｋＬ＋三断片の方向性を決定するた
めに制限消化を行った。全てのライゲーション実験につ
いて、方向と位置を決めるために制限酵素唾旦Ｉを用い
た。ＢＣｌＩで部分開裂したｐＶＥｌを検討した実験で
は、酵素ｐｖｕ ■も用いた。各々が、ｐＶＥｌを３回
（図１参照）および上断片を１回（図６参照）開裂する
ので、これらの実験には、この２つの酵素が有用であっ
た。二ニＨ（捷たはＢＣ７ｉ断片は、各々１つの非対照
的に位置する卑１部位およびｐｖｕ１１部位を含んでい
る。こρことで、！断片に対する方向の決定が可能とな
る。土中の旦び■部位は、Ｌ Ｓ ｒカらの２つの（Ｈ
ｌａ １−ＢｃｌＩ断片の小さい方にあるＱＩａ１部位
のごく近くにマツプされることが決定された。組換えＴ
旧０′プラスミドｔ （ｊａ ｆ−ｉｐ ｐゴ辷四■で
消化することにより、ｐＶＥｌおよび１肛の制限地図か
ら予言され得た断片が生じ°た。方向１は、ＢａｍＨＩ
またはＢＣＡＩの巨断片が、図２で描かれた組換えプラ
スミドの回りを、時計廻りに動いたとき、ｔｓｒ断片の
中点を過ぎてから旦１ａｌ−またはｐｖｕＨ部位に出会
うような方向と定義した。方向′２は、この向きの反対
であった。
以下の組換えＤＮＡを、プラスミド微量調製ＤＮＡの消
化から得られたＣ１ａ ｌおよび旦ｖｕｌｌ制限パター
ンの解析によシ同定した。ｐＶＥ９およびｐＶＥｌｌは
、１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ｔｓｒ断片を、ｐＶＥｌの
ユニＨ（部位に各々、方向ｌおよび２で含んでいた。ｐ
ＶＥ、１３およびｐＶＥｌ ７は、１、ｌｋｂのＢｃ、
ｌ−■断片を、３ａｍ）（ｉ部位に各々方向１および２
で含んでいた。ｐＶＥ １９およびｐＶＥ ２１は、貼
ｌＩ上断片を、６４５ｋｂのＢｇｔ■部位に各々方向２
および１で含んでいた。っｐＶＥ２３は、ｌ、 ｌｋｂ
の見ｌＩ−リビ断片を、７．１５ｋｂのＢｇｔ■部位に
含む。ｐＶＥ２４およびｐＶＥ２６は、この上断片を、
１μ［１，５ｋｂ部位に各々方向２および１で含んでい
た。ｐＶＥ３３およびｐＶＥ３５は、ｌ、 ｌ ’ｋｂ
肛、７Ｉ−り已断片を、ｐＶＥｌ上の０．３３またはＱ
、４．ｋｂの止１１部位に各々方向２および１で含んで
いた。しかし、これら２つの部位のどちらに挿入が位置
しているかは決定されなかった。ｐＶＥ３７およびｐＶ
Ｅ３９は、この断片を旺±１４，３ｋｂ部位中に各々方
向２および１で含んでいた。
化から得られたＣ１ａ ｌおよび旦ｖｕｌｌ制限パター
ンの解析によシ同定した。ｐＶＥ９およびｐＶＥｌｌは
、１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ｔｓｒ断片を、ｐＶＥｌの
ユニＨ（部位に各々、方向ｌおよび２で含んでいた。ｐ
ＶＥ、１３およびｐＶＥｌ ７は、１、ｌｋｂのＢｃ、
ｌ−■断片を、３ａｍ）（ｉ部位に各々方向１および２
で含んでいた。ｐＶＥ １９およびｐＶＥ ２１は、貼
ｌＩ上断片を、６４５ｋｂのＢｇｔ■部位に各々方向２
および１で含んでいた。っｐＶＥ２３は、ｌ、 ｌｋｂ
の見ｌＩ−リビ断片を、７．１５ｋｂのＢｇｔ■部位に
含む。ｐＶＥ２４およびｐＶＥ２６は、この上断片を、
１μ［１，５ｋｂ部位に各々方向２および１で含んでい
た。ｐＶＥ３３およびｐＶＥ３５は、ｌ、 ｌ ’ｋｂ
肛、７Ｉ−り已断片を、ｐＶＥｌ上の０．３３またはＱ
、４．ｋｂの止１１部位に各々方向２および１で含んで
いた。しかし、これら２つの部位のどちらに挿入が位置
しているかは決定されなかった。ｐＶＥ３７およびｐＶ
Ｅ３９は、この断片を旺±１４，３ｋｂ部位中に各々方
向２および１で含んでいた。
ｐＶＥＩ ＤＮＡ中に欠失倉有する２つのｍ換えプラス
ミドも得られた。欠失の屹囲は、図１中に示した酵素を
利用した制限分析により明らかＫＬ＊。ｐＶＥ３０ハ、
１．１ ｋｂ ＢＣＡ■ｔｓｒ断片を、６．１５および
７．１５ ｋｂにある２つの邦Ａ■部位間での１．□ｋ
ｂの欠失を伴つｆｃＢｇｔＵ６．１５ｋｂ部１位に方向
２で含んでいた。その結果、ｐＶＥ３０は、１．５ｋｂ
）位置ニタだ１個所のＢｇｔｌＪ部位を有した。このプ
ラスミドは、はぼ７ｋｂの欠失によって、大きされずか
に５、ｌｋｂであった。その欠失は、、］□ｋｂの二１
１部位の近傍、除くことはなかったが、に始１ ’）、
Ｏ／］１ｋｂ部位を越えて続き、はぼ、品玉が挿入され
たところであるＢｇｔ■６、１５ ｋｂ部位までのｐＶ
ＥＩ ＤＮＡ全除去した。
ミドも得られた。欠失の屹囲は、図１中に示した酵素を
利用した制限分析により明らかＫＬ＊。ｐＶＥ３０ハ、
１．１ ｋｂ ＢＣＡ■ｔｓｒ断片を、６．１５および
７．１５ ｋｂにある２つの邦Ａ■部位間での１．□ｋ
ｂの欠失を伴つｆｃＢｇｔＵ６．１５ｋｂ部１位に方向
２で含んでいた。その結果、ｐＶＥ３０は、１．５ｋｂ
）位置ニタだ１個所のＢｇｔｌＪ部位を有した。このプ
ラスミドは、はぼ７ｋｂの欠失によって、大きされずか
に５、ｌｋｂであった。その欠失は、、］□ｋｂの二１
１部位の近傍、除くことはなかったが、に始１ ’）、
Ｏ／］１ｋｂ部位を越えて続き、はぼ、品玉が挿入され
たところであるＢｇｔ■６、１５ ｋｂ部位までのｐＶ
ＥＩ ＤＮＡ全除去した。
２１組換えブラシミドの伝達性の決定
各組換えプラスミドを含むＳ、 １ｉｖｉｄａｎｓの菌
株を用いて接合を行ない、ｐＶＥｌの自己′伝達能にと
って、どの部位への挿入が必須および必須でないかを決
定した。Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓのストレプトマイシン
耐性誘導株への接合は、相互組込みプラスミドｐＶＥ３
ｅ用いて、接合実験の項で述べたように実施した。接
合は、Ｒ２ＹＥ平板上で行い、次に、チオストレプトン
およびストレプトマイシンを含むＲ２ＹＥ 培地に転写
した。
株を用いて接合を行ない、ｐＶＥｌの自己′伝達能にと
って、どの部位への挿入が必須および必須でないかを決
定した。Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓのストレプトマイシン
耐性誘導株への接合は、相互組込みプラスミドｐＶＥ３
ｅ用いて、接合実験の項で述べたように実施した。接
合は、Ｒ２ＹＥ平板上で行い、次に、チオストレプトン
およびストレプトマイシンを含むＲ２ＹＥ 培地に転写
した。
挿入を、Ｊ）ＶＥＩのＢａｍＨ１部位にもつ４つのププ
ラスミド（ｐＶＥ９．１１．１３および１７）は、非自
己伝達性であった。、ユニをＢａｍ Ｈ１部位から約１
．Ｏｋｂ離れたＢｇ４［１，５ｋｂ部位に含む１）ＶＥ
２４およびＩ）ＶＥ２６も非自己伝達性であった。
ラスミド（ｐＶＥ９．１１．１３および１７）は、非自
己伝達性であった。、ユニをＢａｍ Ｈ１部位から約１
．Ｏｋｂ離れたＢｇ４［１，５ｋｂ部位に含む１）ＶＥ
２４およびＩ）ＶＥ２６も非自己伝達性であった。
大きな７ｋｂ欠失をもつプラスミドｐＶＥ２８もＴｈ１
ｏ を伝達し得ながった。他の全ての組換え体プラス
ミドは、自己伝達（Ｔｒａ ＋）であった。この中には
、襞ｎ６．１．５または６．１ｊｋｂ部位どちらかに挿
入したプラスミド、同様にこれら２つの部位間のＤＮＡ
の欠失をもったｐＶＥ３０が含まれていた。ｏ、３３ま
たは０．４および４，３ｋｂのＢｃ、ｌ−（部Ｍへの揮
入金有する４（重のプラスミドは、全てＴ＋−ａ十であ
った。
ｏ を伝達し得ながった。他の全ての組換え体プラス
ミドは、自己伝達（Ｔｒａ ＋）であった。この中には
、襞ｎ６．１．５または６．１ｊｋｂ部位どちらかに挿
入したプラスミド、同様にこれら２つの部位間のＤＮＡ
の欠失をもったｐＶＥ３０が含まれていた。ｏ、３３ま
たは０．４および４，３ｋｂのＢｃ、ｌ−（部Ｍへの揮
入金有する４（重のプラスミドは、全てＴ＋−ａ十であ
った。
Ｇ、Ｉ）ＶＥＩ誘導体のｓ、 ａｖｅｒｍｉ ｔ ｉ
Ｉ ｉ ｓ中ヘノ形質転換ｐＶＥ］が、Ｓ、 ａｖｅｒ
ｍｉ ｔ ｉ Ｉ ｉ ｓに対して有用なり臼−ニング
ベクターであるがを確かめるために、Ｓ、 ａｖｅｎｎ
ｉｔｉｌｉｓ ＭＡ ４９９０のプロトプラストをｐｖ
ｒ＝１７（１與Ｈ１部位にｌ、１．ｋｂ町１Ｉｉｓ＋−
’ｅもツ＊ｐＶＥ１）お、１： ヒＩ）ＶＥ２８ （７
ｋｂの欠失をもったプラスミド）のプラスミドＤＮＡで
形質転換した。プロトプラストの調製ならびにプラスミ
ドＤＮＡによる形質転換は、チオストレプトンを含む軟
寒天による重層再生平板法にょシ検出した。ｐＶＥｌ７
およびｐＶＥ２８の両形質転換共Ｓ、 ａｖｅｒｍｉ
ｔ 山ｓのチオストレプトン耐性集落をもたらした。各
形質転換より、１０個の集落を純化し、プラスミドｅ量
調製分析にょシ解析した。制限解析の結果は、全株が、
形質転換に用いた完全なｐＶＥｌ、７およびｐＶＥ２８
を高コピー数含ん壬いることを示唆した。本実験は、ｐ
ＶＥｌの誘導体カージ、侵コシｍ去Ｌす」上でのクロー
ニンクヘクターとして、成功裡に用い得ることを示した
。
Ｉ ｉ ｓ中ヘノ形質転換ｐＶＥ］が、Ｓ、 ａｖｅｒ
ｍｉ ｔ ｉ Ｉ ｉ ｓに対して有用なり臼−ニング
ベクターであるがを確かめるために、Ｓ、 ａｖｅｎｎ
ｉｔｉｌｉｓ ＭＡ ４９９０のプロトプラストをｐｖ
ｒ＝１７（１與Ｈ１部位にｌ、１．ｋｂ町１Ｉｉｓ＋−
’ｅもツ＊ｐＶＥ１）お、１： ヒＩ）ＶＥ２８ （７
ｋｂの欠失をもったプラスミド）のプラスミドＤＮＡで
形質転換した。プロトプラストの調製ならびにプラスミ
ドＤＮＡによる形質転換は、チオストレプトンを含む軟
寒天による重層再生平板法にょシ検出した。ｐＶＥｌ７
およびｐＶＥ２８の両形質転換共Ｓ、 ａｖｅｒｍｉ
ｔ 山ｓのチオストレプトン耐性集落をもたらした。各
形質転換より、１０個の集落を純化し、プラスミドｅ量
調製分析にょシ解析した。制限解析の結果は、全株が、
形質転換に用いた完全なｐＶＥｌ、７およびｐＶＥ２８
を高コピー数含ん壬いることを示唆した。本実験は、ｐ
ＶＥｌの誘導体カージ、侵コシｍ去Ｌす」上でのクロー
ニンクヘクターとして、成功裡に用い得ることを示した
。
１）ＶＥＩレプリコンが、どのように用いられ得るか（
でついての２つの詳細な例を以下に述べた。
でついての２つの詳細な例を以下に述べた。
！且
アバメクチン遺伝子のクローニング
１）ＶＥＩ７および、ｐＶＥ２８は、成功裡１／Ｃｓ、
ａｖｅｒ５旦旦」中に導入された。従って、好適なり
ローニングベクターである。ｐｖＥｉレプリコン関連の
ものはどれも、この目的に機能すると思われる。ｐＶＥ
ｌ７を止ｌ■または一匹μ■によす部分的に消化する。
ａｖｅｒ５旦旦」中に導入された。従って、好適なり
ローニングベクターである。ｐｖＥｉレプリコン関連の
ものはどれも、この目的に機能すると思われる。ｐＶＥ
ｌ７を止ｌ■または一匹μ■によす部分的に消化する。
同様に、ｐＶＥ２８をＢｇＡ［によシ直鎖にする。Ｓ、
ａｖｅｒｍｉ １ ｉ Ｉ ｉ ｓの染色体ＤＮＡを
５ａｕ３Ａにより部分的に消化する。これらの酵素は、
同じ５′４塩基伸長部を産生ずる。アカロース・ゲル電
気泳動による分離の後（３から１０ｋｂのＳ、 ａｖｅ
ｒｍｉ ｔ ｉ Ｉ ｉ ｓ染色体断片を抽出する。こ
れらの断片を開発したプラスミドＤＮＡと連結する。連
結混合物を、アハメクチン合成系が遮断されたＳ、 ａ
ｖｅｎη１ｔｉｌｉｓの変異株をチオストレプトン耐性
に形質転換するのに用いる。アバメクチン産生を模索す
るための簡単な重層が開発されるまでは、アバメクチン
生産を可能とする組換えＤＮＡ上の野生型の相補遺伝子
を含んだ集落を同定するために、チオストレプトン耐性
集落からの少量の培養液を、高圧液体クロマトグラフィ
ーで検索する必要がある。
ａｖｅｒｍｉ １ ｉ Ｉ ｉ ｓの染色体ＤＮＡを
５ａｕ３Ａにより部分的に消化する。これらの酵素は、
同じ５′４塩基伸長部を産生ずる。アカロース・ゲル電
気泳動による分離の後（３から１０ｋｂのＳ、 ａｖｅ
ｒｍｉ ｔ ｉ Ｉ ｉ ｓ染色体断片を抽出する。こ
れらの断片を開発したプラスミドＤＮＡと連結する。連
結混合物を、アハメクチン合成系が遮断されたＳ、 ａ
ｖｅｎη１ｔｉｌｉｓの変異株をチオストレプトン耐性
に形質転換するのに用いる。アバメクチン産生を模索す
るための簡単な重層が開発されるまでは、アバメクチン
生産を可能とする組換えＤＮＡ上の野生型の相補遺伝子
を含んだ集落を同定するために、チオストレプトン耐性
集落からの少量の培養液を、高圧液体クロマトグラフィ
ーで検索する必要がある。
例３
放線菌中へのＢ型肝炎表面抗原のクローニングＢ型肝炎
表面抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原のＣ−末端部の大部分を
Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ中で発現される遺伝子中に挿入す
ることによシクローニングすることができる。表面抗原
挿入部分が正しい方向および翻訳あるいは、リーディン
グ、 〕Ｌ／ −ム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ読み
とり枠）にある場合は、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性を有
する融合蛋白が生産される（ ＥＣｉｍａｒ＋ＸＪ’、
Ｃ，、ＨａＩ Ｉｅｗｅｌ ｌ、Ｒ＋几、Ｖａｌｅｎ
ｚｕｅｌａ、ｐ＋、Ｇｏｏｄｍａｎ。
表面抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原のＣ−末端部の大部分を
Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ中で発現される遺伝子中に挿入す
ることによシクローニングすることができる。表面抗原
挿入部分が正しい方向および翻訳あるいは、リーディン
グ、 〕Ｌ／ −ム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ読み
とり枠）にある場合は、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性を有
する融合蛋白が生産される（ ＥＣｉｍａｒ＋ＸＪ’、
Ｃ，、ＨａＩ Ｉｅｗｅｌ ｌ、Ｒ＋几、Ｖａｌｅｎ
ｚｕｅｌａ、ｐ＋、Ｇｏｏｄｍａｎ。
ＦＬＭ、およびＢｎＨｅｒＸＷ、Ｊ、、１９８１年“Ｂ
型肝炎表面および、コアー抗原の大腸菌中での合成″ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ ） ２９１巻：５０３−５０６
頁〕。
型肝炎表面および、コアー抗原の大腸菌中での合成″ネ
イチャ（Ｎａｔｕｒｅ ） ２９１巻：５０３−５０６
頁〕。
本例においては、Ｂ型肝炎表面抗原を、ネオマイシン耐
性を与える遺伝子中に挿入した。
性を与える遺伝子中に挿入した。
Ｎｅ０ｒ（図６参照）を与えるａｐｈ遺伝子は、ＰＩＪ
２ＤＮＡを針±Ｈによシ開裂して得られた。
２ＤＮＡを針±Ｈによシ開裂して得られた。
この１．□ｋｂ断片は、アガロースゲル電気泳動で純化
した。そのベクターＤＮＡ （Ｉ）ＶＥＩの唯一のＢａ
ｍ ）（１部位にμヱＩ工狂断片を挿入した１）ＶＥＩ
の誘導体で、例えば、ｐＶＥｌ３捷たはｐＶＥｌ７）を
、３ｓｔ［で部分的に消化した。
した。そのベクターＤＮＡ （Ｉ）ＶＥＩの唯一のＢａ
ｍ ）（１部位にμヱＩ工狂断片を挿入した１）ＶＥＩ
の誘導体で、例えば、ｐＶＥｌ３捷たはｐＶＥｌ７）を
、３ｓｔ［で部分的に消化した。
１）ＶＥＩは、数個所の旦ｓｔ［部位を有するので、直
鎖分子を高収率で得るためには、部分消化が必要である
。開裂ベクターＤＮＡ ｉ 、１．Ｏｋｂのａｐｈ断片
と連結し、Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓ ｆ＜ ’ｌ’ｈｊ
ｏｒＮｅ０ｒに形質転換するのに用いた。
鎖分子を高収率で得るためには、部分消化が必要である
。開裂ベクターＤＮＡ ｉ 、１．Ｏｋｂのａｐｈ断片
と連結し、Ｓ、 ｌ１ｖｉｄａｎｓ ｆ＜ ’ｌ’ｈｊ
ｏｒＮｅ０ｒに形質転換するのに用いた。
Ｎｅ０ｒＴｈｉＯｒプラスミドのＤＮＡをＢａｍＨｌで
開裂する。ベクターは、ネオマイシン剛性をコードして
いる遺伝子の中央に近い位置に唯一のＢａｍＨ１部位を
有する。ベクターに、末端デオキシヌクレオチド転移酵
素により約１０から１５デオキシグアノシン・ヌクレオ
チド残基を末端付加する。クローンしたＢ型肝炎ウィル
スＤＮＡをＨｉｎｃ １７で消化し、Ｂ型肝炎表面抗原
の部分（２２アミノ末端アミノ酸を欠く）ヲ含む７４４
塩基対をポリアクリルアミドゲル電気泳動（）ｉ：ｄｍ
ａｒ＋ＸＪ、 Ｃ，ほか、１９８１年、前出）により単
離する。この断片に約１０から１５デオキシ・シチジン
ヌクレオチド残基を末端付加する。この断片を次に、末
端付加したベクターと対合させ、その混合物を３、 ｌ
１ｖｉｄａｎｓプロトプラストの形質転換に用いて’ｌ
’ｈｉｏｒを得、シ止遺壬子中への挿入に由来するネオ
マイシン感受性について検索する。
開裂する。ベクターは、ネオマイシン剛性をコードして
いる遺伝子の中央に近い位置に唯一のＢａｍＨ１部位を
有する。ベクターに、末端デオキシヌクレオチド転移酵
素により約１０から１５デオキシグアノシン・ヌクレオ
チド残基を末端付加する。クローンしたＢ型肝炎ウィル
スＤＮＡをＨｉｎｃ １７で消化し、Ｂ型肝炎表面抗原
の部分（２２アミノ末端アミノ酸を欠く）ヲ含む７４４
塩基対をポリアクリルアミドゲル電気泳動（）ｉ：ｄｍ
ａｒ＋ＸＪ、 Ｃ，ほか、１９８１年、前出）により単
離する。この断片に約１０から１５デオキシ・シチジン
ヌクレオチド残基を末端付加する。この断片を次に、末
端付加したベクターと対合させ、その混合物を３、 ｌ
１ｖｉｄａｎｓプロトプラストの形質転換に用いて’ｌ
’ｈｉｏｒを得、シ止遺壬子中への挿入に由来するネオ
マイシン感受性について検索する。
これらの株からのプラスミド微量調製Ｉ）ＮＡと、制限
分析によシ検削し、Ｂ型肝炎表面抗原断片の挿入された
プラスミド全同定する。これらの株を、期待されるネオ
マイシン燐酸転移酵素−Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白の生
産に関して調べる。
分析によシ検削し、Ｂ型肝炎表面抗原断片の挿入された
プラスミド全同定する。これらの株を、期待されるネオ
マイシン燐酸転移酵素−Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白の生
産に関して調べる。
図１ニブラスミドｐＶＥ１の制限地図 位置は、唯一の
）（ｉ ｎｄｆｆ１部位である、標準のＯ／１１キロ塩
基点からのその部位の距離がキロ塩基対として与えられ
ている。地図は、０．１キロ塩基対以上の断片のアガロ
ースおよびポリアクリルアミドのゲル電気泳動および臭
化エチジウムの染色により決定し得る部位を酵素群につ
いて示している。 図２ ： ｐＶＥｌを１個所で切く制限酵素 この図は
、便宜的に環状のｐＶＥ１プラスミドおよびその中にあ
る唯一の制限部位の位置を示している。 の図は、各々、ｐＶＥｌの２つの欠失変種ｐＶＥ２８お
よびｐＶＥ３０を示している。 ｐＶＥ２８オよびｐＶＥ ３０は、Ｂｃ、ｇｌ ｔｓｒ
断片を、Ｂｇｌｍで部分的に消化したＩ）ＶＥ ｌ中に
クローンする実験により得られたプラスミドである。 二遺壬子のｐＶＥ３０中への挿入は、ｐＶＥｌ上の６．
１５および７．１５ ｋｂにある２つのＢｇｔ１部位の
間にあるＤＮＡの欠失を伴っている。 ｐＶＥ３０は１３個のＩｎ部位を含むＩ）ＶＥＩに対比
して、唯一のＢｇｌＨ部位のみを含んでいる。 ｐＶＥ２−８は、ずっと小型のプラスミドである。 ｔｓｒ断片のＢｇｔｍ ６．１５ ｋｂ部位への挿入は
、７．２ｋｂの自然欠失を伴っている。ｐＶＥ２８は、
クローニングに適当である唯一のＢｇｔＵ部位を有する
。 構築 この図は、２つの提示されたプ ラスミドの相互組込み体を調製するのに用いられた方法
を述べている。 図６： この図は、チオストレプトン（ｔｓｒ ）およ
びネオマイシン（ａｐｈ ’）に対する耐性をコードす
るＢａｍ）（）断片の制限地図を示己ている。 図７：プラスミド保持に必須でないｐＶＥ １の領域こ
の図中の白い領域は、プラスミドの安定性を損うことな
く欠失させ得る部分を示している。 定性および自己伝達能に影響するプラスミド上の部位を
述べている。 図中、Ｕは、この部分への挿入がプラスミドを不安定に
することを示し：＋は、この部分への挿入を含むプラス
ミドがなお自己伝達性であることを示し、ニーは、この
部分への挿入を含むプラスミドが最早自己伝達性でない
ことを示す。 出 願 人 ： メルク エンド カムパニーインコー
ポレ・−テッド 安 井 幸 −雪一嘗ｊ ＦＩＧ、 ２ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｖ １．０８ｋｂのｌ ｈ ｉ ｎ断片が １．０ ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ断片に置換する市 Ｉζ、Ｃ０ＬＩＫ−１２ＲＲ１に形質転換會 ）〜・・・ ＦＩＧ、５ ”” ＦＩＧ、６ＦＩＧ
、７ ＦＩＧ、 ８
）（ｉ ｎｄｆｆ１部位である、標準のＯ／１１キロ塩
基点からのその部位の距離がキロ塩基対として与えられ
ている。地図は、０．１キロ塩基対以上の断片のアガロ
ースおよびポリアクリルアミドのゲル電気泳動および臭
化エチジウムの染色により決定し得る部位を酵素群につ
いて示している。 図２ ： ｐＶＥｌを１個所で切く制限酵素 この図は
、便宜的に環状のｐＶＥ１プラスミドおよびその中にあ
る唯一の制限部位の位置を示している。 の図は、各々、ｐＶＥｌの２つの欠失変種ｐＶＥ２８お
よびｐＶＥ３０を示している。 ｐＶＥ２８オよびｐＶＥ ３０は、Ｂｃ、ｇｌ ｔｓｒ
断片を、Ｂｇｌｍで部分的に消化したＩ）ＶＥ ｌ中に
クローンする実験により得られたプラスミドである。 二遺壬子のｐＶＥ３０中への挿入は、ｐＶＥｌ上の６．
１５および７．１５ ｋｂにある２つのＢｇｔ１部位の
間にあるＤＮＡの欠失を伴っている。 ｐＶＥ３０は１３個のＩｎ部位を含むＩ）ＶＥＩに対比
して、唯一のＢｇｌＨ部位のみを含んでいる。 ｐＶＥ２−８は、ずっと小型のプラスミドである。 ｔｓｒ断片のＢｇｔｍ ６．１５ ｋｂ部位への挿入は
、７．２ｋｂの自然欠失を伴っている。ｐＶＥ２８は、
クローニングに適当である唯一のＢｇｔＵ部位を有する
。 構築 この図は、２つの提示されたプ ラスミドの相互組込み体を調製するのに用いられた方法
を述べている。 図６： この図は、チオストレプトン（ｔｓｒ ）およ
びネオマイシン（ａｐｈ ’）に対する耐性をコードす
るＢａｍ）（）断片の制限地図を示己ている。 図７：プラスミド保持に必須でないｐＶＥ １の領域こ
の図中の白い領域は、プラスミドの安定性を損うことな
く欠失させ得る部分を示している。 定性および自己伝達能に影響するプラスミド上の部位を
述べている。 図中、Ｕは、この部分への挿入がプラスミドを不安定に
することを示し：＋は、この部分への挿入を含むプラス
ミドがなお自己伝達性であることを示し、ニーは、この
部分への挿入を含むプラスミドが最早自己伝達性でない
ことを示す。 出 願 人 ： メルク エンド カムパニーインコー
ポレ・−テッド 安 井 幸 −雪一嘗ｊ ＦＩＧ、 ２ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｖ １．０８ｋｂのｌ ｈ ｉ ｎ断片が １．０ ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ断片に置換する市 Ｉζ、Ｃ０ＬＩＫ−１２ＲＲ１に形質転換會 ）〜・・・ ＦＩＧ、５ ”” ＦＩＧ、６ＦＩＧ
、７ ＦＩＧ、 ８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 プラスミドｐＶＥ１゜ ２、ｐＶＥｌおよびその誘導体のゲノム全域おまひ部分
を含むクローニング用ベクター。 ３、ｐＶＦ３、ｐＶＥ９、ｐＶＥＩＩ、ＰＶＥ１３、ｐ
Ｖ ｇ １７、ｐＶＥｌ９、ｐＶＥ２１、ｐＶＥ２３
、ｐＶＥ２４、ｐＶＥ２６、ｐＶＥ２８、ｐ ’Ｖ Ｅ
３０、ｐＶＥ３３、ｐＶＥ３５、ｐＶＥ３７、および
ｐＶＥ３９からなる群よシ選択されたプラスミドクロー
ニング用ベクターである特許請求の範囲第２項に記載の
ベクター。 ４、ｐＶＥｌを含む微生物。 ５、ｐＶＥｌ誘導体ゲノムを含む微生物。 ６、瞥許清幸吻４硼≠→傾ギ÷禰→微生物がＳｔｒｅｐ
ｔａｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉ ｔｉ ｌ ｉｓ−であ
る特許請求の範囲第４項に記載の微生物。 求の範囲第５項に記載の微生物。 ８、ｐＶＥｌおよびその誘導体のゲノム全域および部分
を含むクローニング用ベクターを含む微生物。 ９、該プラスミドの制限エンドヌクレアービによる開裂
、開裂プラスミドの追加ＤＮＡとの組合せ、およびもと
のプラスミドの全体もしくは部分Ｄ Ｎ、 Ａと追加Ｄ
ＮＡとを取込んだプラスミドの形成を伴う結合を行なわ
せるだめのその混合物の処理を含む、ｐＶＥＩプラスミ
ドもしくはその誘導体中に、追加ＤＮＡを取込ませる方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47318183A | 1983-03-08 | 1983-03-08 | |
| US473181 | 1983-03-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59169496A true JPS59169496A (ja) | 1984-09-25 |
| JPH0145355B2 JPH0145355B2 (ja) | 1989-10-03 |
Family
ID=23878525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044794A Granted JPS59169496A (ja) | 1983-03-08 | 1984-03-08 | ｒＤＮＡクロ−ニング用ベクタ−ｐＶＥ１，欠失および雑種変異体、およびその組換え誘導体、生産物および方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0118367B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59169496A (ja) |
| DE (1) | DE3477936D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0249592A (ja) * | 1988-05-09 | 1990-02-19 | Merck & Co Inc | メチル特異性制限系によるｄｎａ分子の微生物中への組込み方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6158589A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 |
| GB8523768D0 (en) * | 1985-09-26 | 1985-10-30 | Antibioticos Sa | Streptomyces wadayamensis |
| JPS63502636A (ja) * | 1985-12-17 | 1988-10-06 | ルブリゾル ジエネテイクス，インコ−ポレイテツド | ポリケチド抗生物質生合成用遺伝子の単離 |
| US4994389A (en) * | 1987-03-10 | 1991-02-19 | American Cyanamid Company | Promoter-probe plasmid for analysis of transcriptional regulation |
| US5194387A (en) * | 1988-05-09 | 1993-03-16 | Merck & Co., Inc. | Process for the incorporation of DNA molecules into microorganisms with methyl-specific restriction systems |
| US5252474A (en) * | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
| EP0391594B1 (en) * | 1989-03-31 | 1995-10-18 | Merck & Co. Inc. | Cloning genes from streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
| DK2668284T3 (en) | 2011-01-28 | 2014-12-15 | Amyris Inc | Screening of colony micro encapsulated in gel |
| MX2013013065A (es) | 2011-05-13 | 2013-12-02 | Amyris Inc | Metodos y composiciones para detectar la produccion microbiana de compuestos inmiscibles em agua. |
| BR112015002724B1 (pt) | 2012-08-07 | 2022-02-01 | Total Marketing Services | Método para produzir um composto não catabólico heterólogo, e, composição de fermentação |
| BR112015023089A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Amyris Inc | célula hospedeira, método para produzir um isoprenoide, e método para aumentar a produção de acetil-coa ou um composto derivado de acetil-coa |
| CN105934517A (zh) | 2013-08-07 | 2016-09-07 | 阿迈瑞斯公司 | 用于稳定生产乙酰辅酶a衍生化合物的方法 |
| AU2016284689B9 (en) | 2015-06-25 | 2022-01-20 | Amyris, Inc. | Maltose dependent degrons, maltose-responsive promoters, stabilization constructs, and their use in production of non-catabolic compounds |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57188600A (en) * | 1981-05-15 | 1982-11-19 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Novel actinomycetic plasmid |
| DE3128669A1 (de) * | 1981-07-20 | 1983-02-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "plasmid p svh 1 und seine verwendung" |
-
1984
- 1984-03-06 DE DE8484400446T patent/DE3477936D1/de not_active Expired
- 1984-03-06 EP EP19840400446 patent/EP0118367B1/en not_active Expired
- 1984-03-08 JP JP59044794A patent/JPS59169496A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION CATALOG OF STRAINS I FIFTEENTH EDITION=1982 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0249592A (ja) * | 1988-05-09 | 1990-02-19 | Merck & Co Inc | メチル特異性制限系によるｄｎａ分子の微生物中への組込み方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0118367A3 (en) | 1985-08-14 |
| EP0118367B1 (en) | 1989-04-26 |
| DE3477936D1 (en) | 1989-06-01 |
| EP0118367A2 (en) | 1984-09-12 |
| JPH0145355B2 (ja) | 1989-10-03 |
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