JPS6158589A - ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｗ吋辺景■ 技術分野 本発明は、ビアラホス生産遺伝子に関する。 さらに具体的には、本発明は、ビアラホス遺伝子　。 のビアラホス生合成経路のステップをコードする遺伝子
を含むＤＮＡ鎖に関する。 放線菌は、抗生物質をはじめとする石川物質の生産菌ど
して微生物工業において広く使用されている最１〕１Ｆ
要２Ｚ醗酵微生物である。 組行えＯＮＮ核技術放線菌の育種、その遺伝的性質の解
明或いは抗生物質の生産性向上に利用することかできれ
ば、産業上極めて価値ある効果が期待できるどいえｊ；
う。 友江共瀕 放線菌の抗生物質生合成遺伝子（二次代謝産物生合成遺
伝子）のクラスターとしてのクローニングに関する発表
は、抗生物質生産の生合成経路の解明の困難ざもあって
、本発明者らの知る限りでは「ネイブｖ　−（−Ｎａｔ
ｕｒｅ）Ｊ　３０９．４６２（１９８／ｌ）に記載のア
クヂノロージンに関しての〜ｂののみである。 ところで、ストレプトマイセス属に属する菌、特にスト
レグ１〜マイセス・バイグロスコピカスＳＦ１２９３株
、の好気培養によって生産される抗生物質（持分＋ｉｒ
（５１−６３９号公報）ハ「５Ｆ１２９３物質」あるい
は「ビアラホス」という名称で知られていて、ｌｊ園芸
用殺菌剤として（特開昭４８−８２０２　ｆｌ　月公報
）および除草剤として（特公昭５９−２３２８２号公報
）有用なものである。特に、除！、〜剤どしでの用途に
関しては低残留ｔ’ｌという１Ｓｆ色に６１．・）′（
広範な使用が期待されＣいる。 介−１ｙｊ脱−１１２２ し旨 本発明は、ス１〜１）１１〜マイ１！ス・ハイグ１１ス
１ビカスＳ　！−’　１２０３株（ｎ　Ｉｆｆ　７”ｉ
　ホス’Ｉ−ｆ（遺伝−（６Ｑりｌ−’　　”　ン’、
／　’ｌルｔＺ　ｔ’、：　Ｍ　＋、Ｉ−）　”（、−
、：　次代ｇｅｌ　ｉ’ｒ物（゛あるビアー〕ホス抗１
１１りｊ質の’１Ｐｉ１’ｌ向１１．二Ｉ（ｈ”ｒ　（
，１、うとりる１）のである、１ リーなりＩ）、本発明

【ま、ビアラホス生合成経路の少
なくと−ｂ一部を−１−卜する遺伝子を含む１１ＮΔ鎖
をｌ！ｉ！ｉ＋ξするものであり、しかしてこの［）Ｎ
Ａ鎖は下記の群（１）・〜（６）から選ばれた１）ので
、１６る。 （１）　ビアラホスＶ）ＮＡのＩ３ａｍｌ１１消化フラ
グメントどｌ’）　Ｉ　Ｊ　７０２プラスミドＤＮＡｆ
７）ｆ３す１■消化フラグメン１へとからなる、第１図
に示した制限酵素切断サイ１〜を右する、分子ｆｉ９．
１５ｋ　ｂのハイブリッドプラスミドｐＭＳＢ２−４中
の、ビアラホスＩ’）ＮＡ由来のＤＮＡフラグメントど
等価のｒ）ＮＡ鎖。 （２）　ビアラホスＤＮＡの３　ｓｔ　ｌ消化フラグメ
ント〜どｐ　ｒ　Ｊ　７０２プラスミドＤＮＡのＳＳ口
ｄ“１化フラグメントどからなる、第２図に示した制限
酵素切断サイトを有する分子ａｔ１５．６ｋｂのハイブ
リッド１ラスミドｐＭｓＢ１２−１中の、ピアしホスＩ
）Ｎへ山来のＤＮＡフラグメン］〜と等価ａ＞　Ｉ）Ｎ
　Ａ　ｔｒｉ。 （３）　げｊνうホスＩ）ＮＡの５ａｕ３ＡＩ消化フラ
グメントど二１スゼドｐＨｃ７９ＤＮ−Ａの１１ａｌｌ
ｌＬＩ＋消化フラグメントとからなる、第３図に示」ノ
だ制限酵素切断サイトを右する分子ｍ４１１（１）のハ
イブリッドプラスミドｐＭＳ８１３−３中の、ビ）７ラ
ホス山来のＤＮＡフラグメントと等価のＤＮＡ鎖。 （４）　ビアラホスＤＮＡのＢｏｌｌＴ消化フラ勿メン
トどｒ）ＩＪ７’０２プラスミドＤＮＡのＢ　Ｆｌ’Ｊ
Ｔ消化フラグメンＩ−どからイＴる、第４図に示した制
限酵素切断サイトを右する分子間１０．　りｋ　ｂのハ
イブリッドプラスミドｐＭｓＲ１−２中の、１プ゛アラ
ホスＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメン１−と等価のＩ）Ｎ
Ａ鎖。 （５）　ビアラホスＩ’）ＮＡのＢｏｌＴｒ消化フング
メ”／ｌ−とｐＩＪ７０２／’ラスミドＤＮＡのＢｏｌ
Ｔｒ消化フラグメントどからなる、第５図に示した制限
酵素切断サイｈを有する分子ｆｊｔ６．６５ｋｂのハイ
ブリッドプラスミドｐ　Ｍ　Ｓ　Ｂ　１．−６中の、ビ
アラホスｒ）ＮＡ由来のＤＮＡフラグメントと等価のＤ
ＮＡ鎖。 （６）　ビアラホスＤＮＡのＢ（＋１１１消化フラグメ
ントドＰＴＪ７０２７ラスー、　トｒ）　Ｎ　Ａ（７）
ＢＯＩＴｒ消化フラグメントとからなる、第６図に示し
た制限酵素切断サイトを有する分子ｆｔ１４．７ｋｂの
ハイブリッドプラスミドｐＭｓＢ３−１中の、ビアラホ
ス１）ＮＡ由来のＤＮＡフラグメントと等価のＤＮＡ鎖
。 各ハイブリッドプラスミド中のビアラホスｒ）ＮＡ由来
のＤＮＡフラグメントは、第１〜６図の各プラスミドの
１〕Ｎ　Ａ鎖の太い部分である。 幼−里 ビアラホス（１合成に関するｒ）ＮＡ鎖を１１換１）　
ＮΔ技術に利用づることによって、ビアラホス産ノ１放
線菌の！１　＃　（ＩＩ向十に資することができる。 本発明にＪ：るＩ）ＮＡ鎖は、上記のＪ：うに定義され
るムのである。 本発明（１：ｊ訂請求の範囲を解釈する場合を含む）に
おいて「ＤＮＡ鎖」という用ａｔ１は、非環状のフラグ
メン１〜どしての存在の外に、それを組込ｌυだ環状体
、？ｌなわらプラスミド、としての存在を包含するもの
である。後右の場合の具体例は、−に記したＪ：うにｒ
）ＩＪ７０２プラスミドまたはｐＨ０７９コスミドとの
組換体プラスミドである。また、ハイブリッドプラスミ
ド中の「ビアラホ、７．ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメン
トと等価の１）ＮＡ鎖」ということは、該ＤＮＡフラグ
メンｉ・と同一の塩基配列のＤＮＡ鎖の外に１．Ｄ　Ｎ
　Ａコードンの縮重により異なった塩Ｌ！配列を持つが
ジェノタイプにおいては同一であるＤＮＡ鎖をも包含す
ることを意味する−６のである。 なお、上記（おＪ、び第１〜８図）においてＢａｌｌ１
ｆ−１１等が制限酵素を意味することはいうまでもない
。 ＤＮＡ鎖の相互関係 第７図１よ、ｐＭＳＢ２−４．１２＝１および１３−３
の各ハイブリッドプラスミド中の本発明ＤＮＡ鎖がビア
ラホス生合成遺伝子のどの部位に相当するか、３１．た
相ｌｌ関係（、■どのようであるか、ならびに生合成ス
ラップがどの部位に存在するか、を示したｂのである、
。 直線へは、ビアラホス生合成遺伝子を制限酵素切断サイ
トと共に示り゛・ものである。、直線１３，１１’およ
び１１　ＬＬは、ＤＭＳｎ２−’１．１２−１８．１び
、１．３　＝　１そのものではイＣくて、各プラスミド
中の本発明ＤＮＡ鎖を示１１１）の−Ｃル）る。ｌ“１
株Ｃ１，１シＩ含成粁路のステップａ、Ｆ）、Ｇ、（１
，ｅ、ｌ’、ｊｌおＪ：びｈを］−ドする遺伝子のそれ
ぞれの近似位置を示１ムのである。 ビアラホス／５Ｆ１２９３物質 ｉｔ％ｌ呵木造 ス１ヘレブ］〜マイ１ごス・バイグロスコピカス５Ｆ１
２９３菌（ＦＥＲＭ　　１３Ｐ−ｊ３０．ＡＴＣＣ２１
７０５）の産−４Ｌ　ｉる抗生物質がビアラホスあるい
はＳ　Ｆｌ、　２９３物質として公知であることは前記
したどころである。 ビアラホスの分子式は、第８図に示した通りである。 この明細用では、この抗生物質をビアラホスと呼びある
いはＳＦＩ　２９３物質と呼ぶこともあるが、これらは
同等のものとして理解するものとする。 １ゴリ（粗略 ビアラホスの！１合成紅路は、第８図に示した通りであ
る（Ｊ、Δｎｔｉｂｉｏｔｉｃに投稿中）。 この生合成経路におい否、ａ−ｈは生合成の単位ステッ
プであるが、各ステップはそこに示されでいる出発物質
から生成物質（たとえば、ステップａについていえば、
ＰＦ　Ｉ−）どＰ　ｎ　ＰＹ　）への一段階の反応を必
ずしｂハ味ηる１）のＣは／ｉ＜、多段階の反応から／
ｊる場合を！〕包含するｔ）のどｃする。 なお、本発明に関連・する微／１物は必要／７：　Ｗ、
’囲において寄託さね（いる（訂細は、１り明の［関沖
微（１物の寄託１の哨を参！（ｔ（され！、：い）１、
ピｊ′うホス１１　ｊａｒ　；￥Ｊ伝了のり１１−ニン
グクローニンク ビアラホス生産遺伝子のり［Ｉ−ニングに際しては、ス
トシブ１〜マイセス・バイグロス−］ピカスＳＦ１２９
３およびでれより誘脣した変賃株か１）常法ににす、？
ｌなわちスミス等の方法（Ｍｅｌｌ＋ｎｔｌｉｎ　　［
ｎｚｙｍｏｌｏｇＶ、　　１」、５４５　　、（１９６
７））に」：って、ビアラホス生産遺伝子ＤＮＡを抽出
・精製し、これをｐ　ｒ　Ｊ７０２プラスミド（Ｊｏｈ
ｎＴｎｎｅｓ研究所Ｊこり入手可能。Ｊ、　Ｇｅｎｅｒ
ａｌＭ　ｅｃｒＯｈｉｏｌｏｌＩＶ、　　１じ２９　．
２７０３−２７１４（１９８３））をベクターとするハ
イブリッドプラスミドによってＳＦｌ　２９３株の生合
成欠損株（前記生合成杼路のステップａ−ｈの少なくと
も一つを＝１−ドする遺伝子が欠損しているもの）を形
質転換さけて、該欠損株のビアラホス生産の回１ｕの右
無を調べた。 ｊＪ　１，７わ１５、二ｆ÷の革なるタイプの生合成欠
損株（ステップＥ１欠旧株ＮＰ−５０およびステップｆ
欠１（１株Ｎ［〕−５２）をそれぞれ宿主として用い、
ｐＩ　Ｊ　７０２をベタターとし、生産能を回復させる
ｌ）　Ｎ　Ａ断ｊ１をショットガンクローニングした。 得られ！ごプラスミドｐＭＳＢ２−４．（９，１５キ［
１ベース（ｋｂ）、ＮＰ−５０株を宿主どして、寄託し
である。「「ＲＭ　　Ｐ−７８０５＞は、宿主株だ（）
で＜丁＜、伯の生合成欠損株も巾広くビアラホスを牛所
２回ＩＱさＩ！゛た。サブクローニングの結果、プラス
ミドｐＭｓＢ２−４には、生合成の初期反応に閏！うす
る四種の遺伝子（ステップａ、ｂ。 Ｃおよびｄに関する遺伝子）が含まれ、ｐＭｓＢ１２−
１には、生合成後半の四種の遺伝子（ステップｅ、ｆ、
ｇおＪ：びｈに関する遺伝子）が含まれていることが判
明した（ＦＥＲＭ　　Ｐ−一　　１１　− ７８１”）７）。ざら（こ、“「シ丁り１ア・二］リ　
１１３９２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７／１７７）を仲ってス
１−レプ］−マイＩ？ス・ハイグ［１ス：］ピノ】スＳ
　Ｆ−１２９３株のｒ）ＮΔの二ｌスミドライ′ｌラリ
ー不イラリ、これにｐＭＳＩ３２−／ｌどＩ−）　Ｍ　
Ｓ　１１１２−１とをプローブと亀ノてぞれぞれハイブ
リダイズさＩ！　／；：。 その結果、両プローブとｂ同一の＝Ｉスミド１）ＭＳＢ
ｌ３−３にハイブリダイズした。ホスホエノールピルビ
ン酸から十数ステップで生合成される除草活性物質ビア
ラホスの生合成遺伝子の大部分がｐＭｓＢ　１３−３上
にクローン化でき！こと考えられる。コスミドＩ）ＭＳ
Ｂ　１３−３　（４　１　ｋｂｏ）は、Ｆ、Ｃｏ１１１
−Ｅ３９２を宿主として寄託しである（ＦＥＲＭ　　ｌ
”−７８０８）。 同様の実験を、ストレプトマイセス・バイグロスコピカ
ス３６９−１３株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７８０９＞を宿主
とし、プラスミドｐＭＳＢ１−２　（１０，５ｋｂｏ３
６９−１８株を宿主として寄託しである。ＦＥＲＭ　　
Ｐ−７８１０）おＪ：びＤＭＳＢＩ−６（６，６５ｋｂ
、３６９−１８株を宿主として寄託しである。ＦＥＲＭ
　　Ｐ−７８１１）を用いて行った。３６９−１８株は
生合成欠損株ではないが、ビアラホス生産能の低い株で
あり、ｒ）ＭＳＢｌ−２で形質転換したことにＪ、って
ビアラホス生産性が向上した。一方、ｐＭＳＢｌ−６で
形質転換した場合は生産株の力１ｉ１１ｉ　１ｎｌ　ｌ
＋’ｌ　７ア１ｍ　メラｉｔ　７．：。 また、同様の実験を生合成欠損株ＮＰ−５１（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−７８１２）についてプラスミドｐＭｓＩ”３３
−１　（１／１．７ｋｂｏＮＰ５１株を宿１：どして寄
託しである。ＦＥＲＭ　　Ｐ−７８１３）を用いて行っ
た。ＮＰ５１株は生合成欠損株であるｔ−Ｊれども生合
成経路のどのステップが欠損しているのかは不明である
が、形質転換によってＮＰ５１のビアラホス生産回復が
認められた。 上記の実験は、遺伝子組換えに慣用される常法によった
ものであり、その具体的な内容は後記実験例に示した通
りである。これらから、本発明の実施は当業者にとって
可能であろう。 ！阻ｊ１微ブＬ】勿１Ｑ−奇−肛 本発明に関連−りる微／ｉ物は、通商ｎ業省−Ｉ　Ｋ　
＋’＆術院微生物工業ｔａ術（ｉｌ＋究所（微１−研）
に１τ記の通りに寄託されている。。 ｌノＬ」Ｉ；１　、　：ｔ：　’Ｉ　　Ｌ＋１Ｆｌｆ’
ｉ−￥Ｌ＊　２−　　’？４追ｊ−ｉ：ｊ三−（１−８
Ｆ　１２９３　　　　ＢＰ−１３０４１ｉ／　（ｉ／２
！ｉ（＾ＴＣＣ２１７０５） ＮＰ５０　　　　　１”７８０’ｌ　　５９／　８／２
４ＮＰ５０　（ｐＭＳＦ３２−４　） Ｐ　　７８０５　５９／　８／２４ ＮＰ４４　　　　　１”７８０６　５９／８／２４ＮＰ
４４．（ｐＭｓＢｌ　２−１　） Ｐ−７８０７５９／　８／２４ ＬＥ３９２　　　　　Ｐ−７４７７５９／　２／２８Ｌ
Ｆ３９２　（ｐＭＳＢ１３−３） Ｐ−７８０８５９／　８／２４ ３６９−ＩＳ　　　　Ｐ−７８０９５９／８／２４３６
９−Ｉｓ　（ｐＭｓＢｌ−２） １”７８１０　５９／８／２４ ３６９−１８　　（ｐＭｓＢｌ−６） Ｐ−７８１１５９／８／２４ ＮＩ’５１　　　　　　　　　Ｐ−７８１２５９／　　
８／２４ＮＰ５１　　（ｐＭｓＢ３−１） ｒ”−７８１３５！１１／　　８／２４：４＝　１　１
　Ｆ　３９２がエシェリキア・コリである外は、すべて
ストレプトマイセス中バイグロスコピカスである。 １：２「１）−」は微■仙菌奇番号（ｒＦＦＲＭｌ”、
Ｉ）を、ｒ１３Ｐ−Ｊは微■研条寄番号（ｒＦＥｌｌＭ
　　ＢＰ−Ｊ）を、それぞれ示す。 ＊３　寄託日は、昭和年／月７日を示す。 −１＝４　　（１）　　ＮＰ菌および３６９−ＩＳ菌の
菌学的性質は、ビアラホス生合成欠損という遺伝形質を
除けば、その親株であるストレプトマイセス・バイグロ
ス−１ビカスＳＦ１２９３株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１３
（’））（ＡＴＣＣ２１７０５）のそれと同じであって
、これは特公昭５１−６３９号公報に記載されている。 （２）　エシェリキア・コリＬＥ３９２菌の菌学的性質
は、［Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｌ（
Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ編、（：、　ｌｏｄ　３　ｐｒ
ｉｎ（ｌ　ｌ−１ａｒｂｏｒｌ−ＯｂＯｒａｔＯｒｙ　
）に記載されている。 なお、ストレプトマイレス・リビダンス６６（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−６９８２）も寄託されている。 実　　験　　例 以下の実施例において使用しＩこＳ［１２９３１１−合
成欠損株は、下記の欠損状態のちのぐなる。 Ｎ　Ｐ　５０　　　　　　　　　　　ａＮＰ／１７　　
　　　　　　　　　ａ ＮＰ３３　　　　　　　　　ａおＪ、び［）ＮＰ４６　
　　　　　　　　　　ｃ ＮＰ２２１　　　　　　　　　　ｄ ＮＰ２１３　　　　　　　　　　ｅ ＮＰ５２　　　　　　　　　　　ｆ ＮＰ４４　　　　　　　　　　　ｆ ＮＰ４５　　　　　　　　　　０ ＮＰ８　　　　　　　　　　Ｑおよびｈ′ｇＵｊＵ１　
（０ＭＳＢ２−４の作成）ストレプトマイセス・バイグ
ロスコピカス５Ｆ−１２９３をＳ−１培地（２％ソルブ
ルスターチ、１．０％ペプトン、０．３％ミートエキス
トラクト　、　　０　、　０５　％　Ｋ　　　トＩＰＯ
４、ｐＨ７，０＞　　　１０一に植菌し、２８℃で２４
−４８時間培養し、これを種菌としてＭＹＧ培地に５％
植菌量で柚えついだ。Ｍ　Ｙ　Ｇ培地は、１％モルトエ
キス、０．４％イースＩ〜エキス、０．５％グルコース
、ｐＨ７，０（８０ａ＋ｅ）にグリシン２％を添加した
ものである。これを２８℃で２４時間振盪培養に付し、
１１００００Ｘ／１０分間の遠心分離で集菌した。 この菌体からスミス等の公知の方法（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　［ｎ７Ｖ１０１０ｏｙ　１２．５４５．　　（１
９６７）　）で全ＤＮＡを抽出精製し、ＴＥＳＧバッフ
ァー（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣｌ　ｐｌ−１
８，０，１ｍＭＥｌ’）ＴΔ、２．５ｍＭ　　ＮａＣＩ
）で透析して、供与体ｒ）ＮＡとした。 この様にして得た供与体ＤＮＡ１０μ９を総量２００　
Ｉｔ　ｌの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−Ｈｅ　ｌ　　ｐｈ
ｆｆ１２００μｌの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ｌ−ＩＣｌ
　　ｐＨ７，４、５０ｍＭ　　　ＮａＣｌ　　、　１０
ｍＭＭＧＣＩ　　、１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノ
ール組成の反応液中で制限酵素ｒ３ａｍｌ−１１１０中
位を加えて３７℃で２時間反応させた。 プラスミドＦ）　Ｉ　Ｊ　７０２　Ｄ　Ｎ　Ａ　２μシ
を総量４０　μ　１　の　２０ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ　
　　−ト１ｃＩ　　　　　Ｆ）Ｉ＋７．４．１０ｍＭ　
　ＭＯＣＩ　　１１０ｍＭ　　βメルカプトエタノール
組成の反応液中で制限酵素Ｆ３ａ　ｌ　ＩＦ５単位を加
えて、３７℃で２時間反応させた。 これを７０℃で１０分間加熱して酵素を失活させてから
、１／１０１Ｓｔの５００ｍＭ　　ＮａＣｌを添加し、
カーフ・インテスチン・アルカライン・ホスファターゼ
（ｃ、ｉ、ａ、ｐ、）を１０単位加えて、３７℃で６０
分反応を行った。 供与体ＤＮＡ及びプラスミドＤ、ＮＡの反応液のそれぞ
れにＴ　Ｆ　Ｓ　Ｌｌバッファー（０，２ＭＴ’ｒｉｓ
−Ｉ−ＩＣＩ　　＋）１」８．０，２０ｍＭジチオスレ
イ１〜−ル、５０ｍＭ　　ＮａＣ１）が飽和したフェノ
ール溶液を等量ずつ加えて１分間振綱し、両方の液を合
併した。これを１００００ｘｇ１５分間の遠心弁−１後
、上層（水層）をパスツールピペットで取り出した。 ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテル抽出に付し
、フェノールを除去してから等量のエタノールを加え、
−８０℃に２時間放置後、１００００×ｇ１５分間の遠
心分離でＤＮＡを沈殿さｌた。 この様にして得たＤＮＡを５００μｍのエタノールで洗
浄し、減圧下で乾燥してから、５０μｍの加熱滅菌した
純水に溶解した。このＤＮＡを７０℃で１０分間加熱処
理し、ついで室温まで除冷し、バッファー（０，６６Ｍ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ１ｐｌ−１７，６，６６ｍＭ　　
ｆｖｌｃＩ　　、０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍ
Ｍ　　ＡＴＰ）５Ｉ１１とＴ４リガーゼ５　ｔｔ　Ｉ　
”　（１単位）とを加えて２２℃で２時間反応させて、
ｐＴＪ７０２とストレプトマイセス・バイグロスコピカ
スＤＮＡとの組み換え体ＤＮＡを調製した。 このＤＮＡにＪ：る宿主菌ストレプトマイ１７ス・バイ
グロスコピカスＮρ５０の形質転換は放線菌に通常育い
られるプロミープラス＋−ｐ　ＦＧ法（例えばＣｕｒｒ
、　　　Ｔｏｐｉｃｓ　　Ｍｉｃｒｏｔ＋ｉｏ１．　　
ｌｎ＋ｍｕｎｏｌ、　　９６゜６９（１’９８１）等に
示される）に。１こり行イア　＝）／ご。 】゛なわら、８０’ｎｒ（！　（７）　Ｓ培Ｊｌ！Ｉ　
（グルニ＋−，＜１％、ペブＩ〜ン０．４％、イースト
Ｊ１ストラクト０、４％、ＭＧＳｏ　　・７１−１２Ｃ
ｊＯ．０５％、Ｋｌ−Ｉ　　ＰＯ４０．２％、Ｋ２ｔｌ
Ｐｏ４０．＝１％、グリシン５％゛）にストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスＮＰ５０を接種して、２８℃
で１８時間振盪培養を行ない、１０００’Ｏｘりの遠心
分離で菌糸を集めて、０．５Ｍ蔗糖　溶液で１回洗浄し
たのち、１０ｍｆｌのｐｓ’培地（Ｎ　ａ　Ｃ　Ｉ−７
　０ｍＭ。 ５’ｍＭ，２’５ｍＭ　　ＴＥＳＤＨ７’．２＞に懸濁
させた。゛次いで、最終１１１ｆ　Ｉ　ＩＩｔｇ／ｄに
なる様に卵白リゾチームと０．５＃１ｇ／ｄになる“様
にアクロモペプチダーゼとを加え、３７℃に６０分間□
保温してプロトプラストを形成させ、プロトプラスト化
しなかった菌糸は綿が過て除去した。８００ｘｇ／１０
分間の遠心分離によってプロトプラストを集め、Ｐｓ培
地で１回洗浄後、２ａｔｌ！のｐｓ培地に懸濁さ■たプ
ロトプラスト液１００μ＋、３／２淵疫に調整したＰ−
マレイン酸バッファー（２．５％蔗糖、１．４ｍＭ　　
Ｋ　　ＳＯ４、１／５００吊微吊元素溶液、１００ｍＭ
　　ＣａＣ１２、５０ｍＱ　　Ｔｒｌｓ　−マｌ／イン
Ｍ１ｉｐ＋−１８．　０−）　１　００μ１１組み換え
ＤＮＡ溶液５０μｍ及び３７５μｍのポリエチレングリ
コール溶液（ポリエチレングリコール＃１０００　　３
３％／Ｐーマレイン酸バッフ１−）を混合し、１分間室
温数Ｗ後、ｐｓ培地５−で稀釈し、８００Ｘｇ／ｌ　０
分間の遠心分離でプロトプラストを集め、２７ｉのｐｓ
培地に懸濁させた。このプロトプラスト液を０．１＃ｌ
！ずつ２０枚の直径９０ｃＩＲ円形プラスチック製ペト
リ皿に調整したＲ１−１寒天培地（１リツトル中、蔗糖
１７１ｇ、ＫＣ１１４．９ｇ、グルコ−′ス１０ｇ、微
量元素溶液２ｍｅ１Ｋ　　ＳＯ４２．５％　１０Ｉｄ１
プロリン３ｇ、カザミノＭＯ．５ｇ、ポリペブトン２ｇ
、デキストラン０．０５ｇ、０．５％に＋−＋２　ＰＯ
４１０ｍＱ、ＩＭ　　Ｃａｃ１２−２Ｈ２０５０ｍＱ１
０．２５Ｍ　　ＴＥＳ　（ＤＩ−１７゜２）１００ｍ、
Ｃ３０３０ｇ／１０１００Ｏ！１００ｍ＋！、５％アス
パラギン酸１０＃ｉｌりにそれぞれ塗布した後、Ｒｌ−
１培地の寒天濃度が０．５％のものをぞの上層に２　ｔ
ｘｔ９重層した。これと、２８℃で１８時間培養後向じ
ＲＨ（ソフトアガー０．５％）にヂオストＩノブトンを
２０ｇｇ／　ｔｏｅになる様に加えたものをざらに２ｄ
ｆｆｉ層した。これを、１０〜２０目間、９０％に両爪
を保持したチャンバー内で、２８℃で培養をつづけた。 プロ１〜プラストから再生した［＜１１寒天１ｇ地上の
菌を１％ＣΔＳ、５１１９／ｍｅ　　ＣｕＳＯ４・５１
１２０おＪ、び０゜５１＋１！Ｊ　／　ｍｅチ［ｌシン
を含むニコートり工ン１−７万−培地に、市販の剣を用
いて移した。これを２８℃で２日間培養にイ・１した。 その結果、メラニン（ＩＨ累を産１りする」口二一とメ
ラニン〔真木を産１１１シないコロニーとがおＪ、′ｆ
ｌ：１の割合で牛じｌこ。 ストシブ１〜ンイセス・ハイグ１スニ１ピカスＤＮＡは
ベクターｐｌＪ７０２の生産にかかわるメラニン遺伝子
上の８ｇ１■サイトに組み込まれるわ【）であるから、
連結（ｌ　ｉｇａＮｏｎ）時に外来のスト１ノプトマイ
セス・バイグロスコピカスＤＮＡを組込／υだプラスミ
ドが導入したクローンはメラニンを産生しくｒい。しか
しストレプトマイセス・バイグロスコピカスＩ）ＮＡを
ＢＧＩＩＩサイトに組込まなかったプラスミドはメラニ
ン色素を産性する。従って、メラニン色素を産生できな
いコロニーは導入されたプラスミド上にストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスのＤＮＡを組込んでいること
が判定できるわけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを市販のつ
まようじを用いて以下に示す組成のアガーピース］二に
レプリカしＩこ。アガーピースとは０．４％グル］−ス
、０．３５％ホイート・ジャーム、０．２３％ＳＶＰ　
（ソルブル・ベジタ１ル・プロディン）０．０３％　Ｋ
ｌｌ　　ＰＯ４、０，０（３０１％　ＣｏＣｌ　　・６
日２０．２％アガー、ｐ、Ｌｌ　７　、０からなるもの
を直径７〜８ｒｎＩＲ１高さ４〜５　ｍｍの円柱どなる
様コルクポーラでうちぬいたものである。 このアガーピースを２８℃／６日間の培養に付した。こ
れをｐｒｏｔｅｕｓ　　ｓｐ、　ＭＢ−８３８を検定菌
として、３２℃でｌ市内を作るアガーピースがあるか否
かを調べた。その結果、ホワイト・コロニー２５００個
のうち５株の生産回復コロニーを得た。 得られた５株のチオストレプトン耐性でしかもビアラホ
ス生産能の回復したストレプトマイセス・バイグロスコ
ピカスを前述と同様のシード培養を行なったものから各
々８０ｍｅのＭＹＧ培地（グリシン２％添加）に接種し
、２８℃で２４時間振盪した培養菌体から、ハンセン等
による公知の方法（Ｊ、　ＢａｃｔＯｒｉｏｌ、　１３
５．２２７　（１９７Ｂ）でプラスミドを抽出した。こ
れらのプラスミドににって、再びスト１ノプトマイセス
・バイグロスコピカスＮＰ５０及び同じ生合成経路の欠
損変巽株であるストシブ１〜マイセス・バイグロスコピ
カスＮ　Ｐ　４．７を形質転換させた場合、いずれもビ
アラホスの生産性を回復できた。 これらの菌株がビアラホスを産生じているか否かについ
ては、文献［明治製菓研究年報Ｎα２１．７１４〜５１
　（１９８２）Ｊに示される方法で分析を行なった。つ
まり、各々の菌株培養ン戸液をアミノ酸アナライザーを
用いて分析したところ、培地中に産生される抗菌物質を
クロマトグラフ的にビアラホスであると同定できた。 また、この５株から得たプラスミドｐＭｓＢ２−３．２
−４．１−５’、２−７および２−８を制限酵素３ａｍ
ＬＩＩで切断し、１％アガロース電気泳動により調べた
ところ、いずれも共通に１゜３２　ｋ　ｂ　（１’＞　
Ｂ　ａ　ｍ　ｌ−ｌ　１断片を含んでいた。また、最小
ＤＮＡ断片がコードされるプラスミドはＤＭＳＢ２−７
であるので、ビアラホス生合成のステップａの反応を行
なう酵素遺伝子は１．３２゜ｋｂのＢａｍ１−ＩＴフラ
グメントの中に］−ドされる。 このうち、一番挿入断片の大きいプラスミドｒ）ＭＳＢ
２’−４に仙の遺伝子が二１−ドさ罎１．　ＴいイＴい
かどうか調べるために、ｐ　Ｍ　Ｓ　１１２−４Ｉを（
ご゛アラホス牛合成欠損株Ｎ　ｒ）　３３、Ｎ　Ｐ４６
お３１．びＮＰ２２１株に導入しｋどころ、いずれの欠
１（１株の生ｐｔ性を１〕Ｉｉ”ｉ目り（キ１！ること
がでさＩこ１゜この事実（１１、＋）ＭＳｌ１２−／ｌ
に（，１，ビー）ｌうホス／１合成に閏！５−するステ
ップａ−（ｊ　’７）　ＭＶ　素３Ｗ伝ｒが−１−ドさ
れていることを承りものである。 １１例２（虐ＭＳｎ１２−１１７）ｆｉｌＭよストレプ
トマイセス・バイグロスコピカスＳ［−１２９３をＳ−
１培地（２％ソルブルスターヂ、１．０％ペブＩ〜ン、
０．３％ミートエ４ニス１〜シクｈ、０．０５％に２ｌ
−ＩＰＯ４、ｐｌ−１７，０）１０ｍＱに植菌し、２８
℃で２４−４８時間培養し、これを種菌としてＭ　Ｙ　
Ｓ培地に５％植菌吊で植えついだ。Ｍ　Ｙ　Ｇ　ｉｒ’
ｔ　Ｉｔ！＋は、１％モルトエキス、０．４％イースト
■４−ス、０．５％グルコース、ｐｌ−１７，０（８０
ｍｆりにグリシン２％を添加したものである。これを２
８℃で２７１時間振盪培養に付し、１００００ｘｇ／ｌ
　０分間の遠心分離で集菌した。 この菌体からスミス等の公知の方法（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ
ｉロ　［ｎハ＋ｍｏｌｏ（ｌＶ１２．　　　５４５．（
１９６７））で全１’）ＮＡを抽出精製し、ＴＥＳＣバ
ッファー（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣＩ　ｐｌ
−１８，０，１ｍＭ［［）ＴΔ、２．５ｍＭ　　Ｎａ　
Ｃｌ）で透析して、供Ｉｉ体ｒ）ＮＡとした。 この様にして１１１だ供与体Ｄ　Ｎ　Ａ　１０μシを総
Ｍｌ　２　（１（１（ｔ　Ｉの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　
−１−１ｃ　ｌ　　ｐｌ−１７、４、５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭＭＣｌＣｌ　　、１０ｍＭ　　β−メル
カプトエタノール加えて３７℃で２時間反応させた。 プラスミドｐ　ＩＪ　７０２ＤＮＡ２μシを総量／ｌＯ
ｆノーの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ｌ−１ｃ　Ｉ　　ｐ
Ｈ７、４、１０ｍＭ　　Ｍ＜ＩＣＩ　　、１０ｍＭ　　
βメルカプｌー１タノール組成の反応液中で制限酵素３
ｓｔ”■２２単を加えて、３７℃で２時間反応さけた。 これを７０℃で１０分間加熱して酵素を失活させてから
、１／１０量の５００ｍＭ　　ＮａＣｌを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスファターゼ（ｃ
．ｉ　、ａ．ｐ，）を１０中位加えて、３７℃で６０分
反応を行った。 供与体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの反応液のぞれぞれ
にＴ　Ｆ　Ｓ　ＩＩバッフｐ　−　（０．　２ＭＴｒｉ
ｓ−ｔｌｃ　ｌ　　ｐＨ８．０、２０ｍＭジグオスレイ
トール、５０ｍＭ　　ＮａＣＩ）が飽和Ｌ／　タフ　■
／　−ル溶液を等量ずつ加えて１分間振盪し、両方の液
を合併した。これを１　００００Ｘｇ１５分間の遠心分
断後、上層（水層）をパスツールピペツ１〜で取り出し
た。 ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテル抽出に付し
、フェノールを除去してから等量のエタノールを加え、
−８０℃に２時間放置後、１　００００ｘｇ１５分間の
遠心分離でＤＮＡを沈殿させた。 この様にして１！１だＤＮＡを５００μｍのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、５０μｍの加熱滅菌
した純水に溶解した。このＤＮＡを７０℃で１０分間加
熱処理し、ついで室温まで除冷し、バラＪｐ　−　（０
．　６６Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ｌ−１ｃ　１１）ｔ１７．
６、６６ｍＭ　　Ｍ（ＪＣＩ　　、０．１Ｍジチオスレ
イ１〜−ル、１　０ｍＭ　　ＡＴＰ）５ｔｔ　ｌとＴ４
リガーゼ５Ｉ１１　（１単位）とを加えて２２℃で２時
間反応させて、ｐ　ｒ　Ｊ　７　０　２とストレプトマ
イレス・バイグロスコピカスＤＮＡとの組み換え体ＤＮ
Ａを調製した。 このＤＮＡによる宿主菌ストレプトマイセス・バイグロ
スコピカスＮＰ５２の形質転換は放線菌に通常用いられ
るプロトプラストＰＥＧ法（例えばＣｕｒｒ．　　Ｔｏ
ｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　　（ｍｍｕｎｏｌ，
　９６。 ６９（１９８１）等に示される）により行なった。 すなわち、８０＊（！のＳ培地（グルコース１％、ペプ
トン０．１％、イーストエキストラクト０、４％、Ｍｏ
Ｓ０　　・７Ｈ２００．０５％、Ｋｌ−Ｉ　　ＰＯ　　
０．２％、Ｋ２１−ＩＰＯ４０．　４％、グリシン５％
）にストレプトマイセス・バイグロスコピカスＮＰ５２
を接種して、２８℃で１８時間振盪培養を行ない、１　
００００ｘグの遠心分離で菌糸を集めて、０．５Ｍ蔗糖
溶液で１回洗浄したのち、１０ｍＱの１〕Ｓ　）８地（
ＮａＣｌ　７０ｍＭ。 蔗糖０　、５　Ｍ　、Ｍ　＜３　ＣＩ　　・５　ｍ　Ｍ
　１Ｃａ　Ｃｌ　２５ｍＭ１２５ｍＭ　　ＴＥＳｒ）１
１７．２）に懸濁させた。次いで、ｈ４終淵麻１ｍり／
　ｍＱになる様に卵白リゾブームと０　、５　ｍ！７／
　ｍＱにイ「る様にアク［１１ペプチダーゼどを加え、
３７τ］に６０分間保Ｈ，，ｌ　１゜−Ｃ−ｆ　ｎ　ｌ
〜プラス１−を形成さ１！、ブロー・ｌラスト化しなか
った菌糸はｌ１ｉｌ　ＦｒｉＭｒ’ｒで除去した。　１
１００Ｘ　ｇ／１０分間の遠心分１１ｉ１１に１１、っ
Ｃ１＋’ｌ　１・−１−ノスＩ・を集め、ｌ）ｓ　ｊ（
’、　ＩＩ！Ｉ　（”　ｌ同洗ど１ｉｌＧ、２ｍＣのｌ
−）　３０ｉ３　Ｉｆ’！　ｌこ懸濁さｌたプロト１ラ
ス１〜液１００Ｉノ＋、３／２濃度に調整しＩこ［）−
マレイン酸バツフン１−（２，５％蔗糖、１．’１ｍＭ
　　Ｋ　　Ｓｏ、、１／５００ｆｌｌａ吊元素溶液、１
００ｍＭ　　ＣａＣｌ２．５０ｍ（ｌ　　Ｔｒｉｓ−Ｎ
７レイン酸ｐＨ８，ｏ＞　１００１ｔ　ｌ　、組み換え
ＤＮＡ溶液５０　／ｌＩ及び３７５　／１１のポリエチ
レングリコール溶液（ポリエチレングリコール＃１００
０３３％／Ｐ−マレイン酸バッファー）を混合し、１分
間室温放置後、ｐｓ培地５　ｍ（ｌ　テ稀釈し、８００
×ｇ／１０分間の遠心分離でプロ１〜プラス１−を集め
、２　ｍＱのＰｓ培地に懸濁ざ１１た。このプロトプラ
スト液を０．１ｍｅずつ２０枚の直径９０ｃｍ円形プラ
スチック製ペトリ聞に調整したＲｔｌ寒天培地（１リツ
１〜ル中、蔗糖１７１ｇ、ＫＣ＋１４．９ｇ、グルコー
ス１０ｇ、微行１元素溶液２＃Ｉ＋！−Ｋ　　５０４２
．５％　１０ｍｅ、プ１−１リン３ｙ、カーｆミノ酸０
．５ｇ、ポリペプ］ヘン２！１１デ十ストラン０．０５
ｇ、０．５％Ｋｔｌ　　ｌ］０　１０ｍＱ１１　Ｍ　　
Ｃａ　Ｃｌ　２　　・２＋１２０　　！−）Ｏｍｅ、　
０．２５Ｍ　　’Ｔ［Ｓ　（ｐｌ−１７，２＞１００ｍ
（！、Ｃ８０３０ｇ／ｌ　０００ｄ１００ｍｆ！、５％
アスパラＶンＭ　１０　ｍＱ　）にイれぞれ塗布し／＝
　１０、Ｒ１−１培地の寒天濃度が０．５％のｂのをイ
の上層に２　ｍｅ重層しｌζ。これと、２８℃で１　ｆ
ｌ　ＩＩＹ間１８養後向じＲｔ−１（ソフトアガー０．
５％〉にヂＡスト１ノブトンを２０　ＩＩ　Ｓｌ　／　
ｍＱになる様に加えたものをさらに２　ｍ９重層した。 これを、１０−２０１１間、００％に湿度を保持したチ
ャンバー内で、２８°Ｃで培養をつづ【）た。プロトプ
ラストから再生したＲ　Ｌｌ寒天培地上の菌を１％ＣＡ
８，５１１ｇ／ｍＱ　　ＣＬＪＳＯ４・５１−１２０お
よび０゜５１ｎ９　／　ｍＱチ［Ｊシンを含むニコート
リエントアガー培地に、市販のε１を用いて移した。こ
れを２８℃で２日間培養に付した。その結果、メラニン
色素を産性するコロニーとメラニン色素を産性しないコ
ロニーとがおよぞ１：１の割合で生じた。 ストレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡはベク
ターｒ）　Ｉ　Ｊ　７０２の生産にかかわるメラニン遺
伝子上の５ｓｔＩザイトに組み込まれるわけであるから
、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）時に外来のストレプトマイ
レス・バイグロスコピカスＤＮＡを組込んだプラスミド
が導入したクローンはメラニンを産生じない。しかしス
トレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡを５ｓｔ
Ｉザイ１〜に組込まなかったプラスミドはメラニン色素
を産性する。従って、メラニン色素を産生できないコロ
ニーは導入されたプラスミド上にストレプトマイセス・
バイグロスコピカスのＤＮＡを組込んでいることが判定
できるわけである。 このうちメラニン色素を産生じないコロニーを市販のつ
まようじを用いて以下に示す組成のアガーピース」二１
こレプリカした。アガーピースとは０、／１％グル］−
ス、０．３５％ホイー１−・ジャーム、０．２３％ｓｖ
ｐ　＜ソルブル・ベジタブル・プロティン）０．０３％
　Ｋ１−１．、ＰＯ４，０，０００１％　Ｃｏａｌ　　
・６Ｈ２０，２％アガー、ｐＨ７、Ｏからなるものを直
径７〜８　ｍｍ。 高さ４〜５ｍの円柱となる様コルクポーラでうちぬいた
ものである。 このアガーピースを２８℃／６日間の培養に付り、　タ
。これをｐｒｏＩ：ｅｌｆｓ　　Ｓｐ、　ＭＢ−８３８
を検定菌どして、３２℃で阻市内を作るアガーピースが
あるか否かを調べた。イの結果、ホワイト・コロニー１
０００個のうら１株の生産回復コロニーを得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性でしかもビアラホ
ス生産能の回復したストレプトマイセス・バイグロスコ
ピカスを前述と同様のシード培養を行なったものから各
々８０ｄのＭＹＧ培地（グリシン２％添加）に接種し、
２８℃で２４時間振盪した培養菌体から、ハンセン等に
」：る公知の方法（Ｊ、　１３　ａｃｔｅｒｉｎｌ、１
３５，２２７（１９７８）でプラスミドを抽出した。こ
れらのプラスミドにＪ：っで、再びストレプトマイセス
・バイグロスコピカスＮＰ５２及び同じ生合成経路の欠
損変異株であるストレプトマイセス・バイグロスコピカ
スＮＰ４４を形質転換させた場合、いずれもビアラホス
の生産ｆ１を回復できた。 これらの菌株がビアラホスを産生じているか否かについ
ては、文献［明治製菓研究年報Ｎｏ、　２１、／１４〜
５１　（１９Ｂ２）Ｊに示される方法で分析を行りつだ
。つ＝Ｌす、各々の菌株培養ン戸液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生される抗菌
物質をクロマ１〜グラフ的にビアラホスであると同定で
きた。 また、この株から）りたプラスミドを１１１１限酊素Ｓ
　Ｓ　１：　Ｔ　ｔ’切断しＣ１％アガロース電気泳ｖ
１により調べたところ（一般に行なわれる方法及び条ｆ
ｌににる）、ｌ）１．Ｊ７０２の３　ｓ　１：　Ｔリー
イトに９ｋ　ｂのストシブ１〜？イｌ？ス・バイグロス
コピカス由来のＯＮΔ断片が含まれていた。 次にｐＭｓＢ１２−１にもＮＰ５２及びＮＰ４４の各生
合成欠損株の生産性を回復させる遺伝子以外にも生合成
の各ステップに関与する遺伝子が含まれることがｎｔ定
されたので、他の生合成欠損株ＮＰ２１３、Ｎ２２およ
びＮ　Ｐ　４．５にそれぞれｐＭｓｌｌｌ２−１を導入
した。導入の方法は、前述の形質転換法と同じである。 その結果、トランスフォーマントもビアラホスの生産能
を回復することが明らかとなった。 次に、ｌ）ＭＳＢ１２−１をストレプトマイセス・リビ
ダンス６６（昭和５８年３月１０日にＦＥＲＭ　　Ｐ−
６９８２どして微■研に寄託されている。イの菌学的性
質は、特願昭５８−５２２７７号明ｌｌ１ｌ書に記載さ
れている）に導入した。方法はＣｕｒｒ、Ｔｏｐｉｃｓ
　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌ、　９６．
６９（１９８１）に示されたと同様の方法である。 ｐＭｓＢ１２−１を導入されたストレプトマイレス・リ
ビダンス６６の性質を調べるため、ｐＭｓＢ１２−１を
含むＳ、リビダンス６６と含まないＳ、リビダンス６６
とを各々Ｒ２ＹＦ培地にぬりつ【ノて培養してスボアを
形成させた。このスボアをあらかじめディフコ社製市販
のニコ１〜リエントアガー培地にビアラホスを１０００
μｒ１　／ｍ■側になる様に調整した培地にぬりつけて
、３７℃で３日間培養した。その結果、ｐＭｓＢ１２−
１を含むＳ、リビダンスは生育したが、野生株のＳ、リ
ビダンスは１１育できなかった。野生株は同様イｒ条件
で２００　ＩＩ　丁？　／　ｍ（！の培Ｉｌｌ！では生
育できる。 このようにｐＭｓｌｌｌ　２−１を導入されたＳ。 リビダンスはｐＭｓｌｌｌ２　１を含＋Ｉ：　／ｌい株
に比較してビアラホスにり・：する酎１す１σが２倍か
ら１３倍に向トしていることが明らかに／ｊつた。この
中実は、ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｒ１２−１にはビプＩう１１＼ス
に対ｉ）る耐性遺伝子が含Ｊ、れることを示＋１１）の
で・ある。 この様に、ｐＭｓｌｌｌ２−１には前記の各遺伝子がコ
ードされるばかりで／ｉ＜、ビアラホスに対Ｊる耐性遺
伝子−ｂ］−ドされていることがわかる。 ＮＰ５２の生産能を回復さ１！る遺伝子（ステップｆ） ＮＰ／ｌ／ｌの生産能を回復させる遺伝子（ステップｆ
） Ｎ２２の生産能を回復させる遺伝子 （ステップｆおよびｈ） ＮＰ４５の生産能を回復さゼる遺伝子 （ステップｇ） ＮＰ２１３の生産能を回復させる遺伝子（ステップｅ） 尤茄例３（醪−８１３１：３−３の・ ビアラホス生産菌ストレプトマイセス・バイグロスコピ
カスＳ　「＝１２９３をＳ−１培地（ソルブル・スター
チ２％、ポリペプトン１％、ミート・エキ’；１．　ｈ
　ラ’）　ｈ　０　、３　％、Ｋ２１−ＩＰＯ４０，０
５％、ｒ）１１７．０＞　１０ｍｆｌに接種し、２８℃
／２日間のｆｆｌ培養を行ない、このようにして得た前
培養液４ｍｅをＭＹＧ＋グリシン培地（モルト・エキス
トラクト１％、イーストエキストラクト０．４％、グル
コース２％、グリシン２％、ｐト１７．０）８０−に接
種して、２８℃で一晩Ｎ盪培養した。 培養液を、１００００ｘ　ｇ　／　１０　ＩＩ間の）Ｎ
！心分離にイ１しく、集菌した１、この菌体力目）スミ
スｔ９の公知の方法（Ｍ、　Ｇ、　Ｓｍ１ｔｈ：　ＭＯ
ＩＩＩＯＩＩＳ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏＯＶ、　　１２
　．５４５　（１９６７）　）で全ＤＮＡを抽出精製し
、ＴＥ［ｉ液（１０ｍＭＴｒｉｓ　　１−１ｃ　ｌ　、
ｐＨ８，０，１ｍ　Ｍ　　Ｉ：：　ｌ−１−Ｉ−△）で
透析して供与体ＤＮＡどした。 このｊ：うにして畳た供与体ＤＮＡ１０ｍ、ｑに制限酵
素５ａｕ３Ａを２１１１位を加え、１０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ１７１ｃ　ｌ　、ｐＩ−ｊ７．　２．１０ｍＭジチオ
スレイト−ル、１５０ｍＭ　　ＮａＣ１の組成の緩衝液
５０μｍ中で１０分間反応させた。反応液にＴ［緩衝液
で飽和した）１ノ一ル５０μｍを加えて１分間震盪した
後、１０ＱＯＯｘｇ１５分間の遠心分離を行ない、上層
をパスツールピペットで取り出した。ＤＮＡを含むこの
水層をエチルエーテルで２回抽出し、フェノールを除去
してから１００００×ｇ１５分間の遠心分離を行なって
、ＤＮＡを沈澱物として回収した。回収したＤＮＡをエ
タノール５００　ｔｌｌで１回洗滌し、減圧下で乾燥さ
せてから、２０　／ｌｌの加熱滅菌した純水に溶解して
、供！ｊ　（４０Ｎ△と１）だ。 −・方、］ススミラドベクター）　ＨＣ７９（ｌｌａｒ
ｂｒａ　１ｌｏｌ＋ｎｃｔ　ａｌ　　：Ｇｅｎｅ　、１
１．２９１−２９８（１９８０）。市販品＞２！１ｇを
１０ｒｎＭ　　　　−「　ｒｉｓ　　　　　ｌｌｃ　　
ｌ　　、　　ＤＩ−１７，２、１０ｍＭ　　ジ′）Ａ゛
スレイ１〜ル、１００ｍＭ　　ＮａＣｌの組成の緩衝液
２０　ｕ　ｌで制限酵素Ｂａｍｌ−１１４単位と３７℃
で２時間反応させた。さらに７５℃で１０分間加熱した
後、市販の大腸菌由来のアルカリホスファターゼ１単位
を加えて５０℃で１時間反応さ１１その後フェノール処
理、エタノール沈澱おＪ：び王タノール洗滌をしてから
、ベクターＤＮＡどして１０μｍ０滅菌水に溶解した。 前記供！ｊ体ＤＮＡ２０μｍと上記ベクターＩ）ＮＡ１
０μｍとを混合し、７０℃で１０分間加熱処理し、室温
まで徐冷した後、緩衝液（０，６６Ｍ　　Ｔｒｉｓ　　
ｌｌＣｌ、ｐｌ−１１０ｍＭ　　ＡＴＰ）４／ｌｌ　、
！ニア４ＤＮＡ’Ｊカーセ２ｔｌ　ｌ　ト’Ａ１１Ｉｒ
ｌ工Ｔ２２℃で１４時間反応させて、ｐ　ｌ−Ｉ　Ｃ７
９とストレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡど
の組換体ＤＮＡを作成した。 −この組換体ＤＮＡで大引！ＩＬＥ３９２を形質転換す
る方法は、ホーン等の公知の方法によった（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｆｎａｙｎｏｌｏ（ＩＶ　、　６８．２９
９−３０９（１−９７９））。寸なわち、先に調製した
ｐ　Ｈ０７９とス１−レブトマイセス・バイグロスコピ
カスＤＮＡとの組換体ＤＮＡ３６μｍにエタノール１０
μｍを加え、−８０℃で２時間放置後、１００００ｘｇ
１５分間の遠心分離を行なって、組換体ＤＮＡを沈澱物
どして回収する。これに加熱滅菌水２０　、ｕ　Ｉを加
えて溶解し、この溶液１０μｍをホーン等の１１法によ
り調製されて市販されている試験管内ノ７−ジ粒子形成
溶液５０　Ｉｔ　＋に加えて３７℃で１時間反応ざ「て
、イの後１０■４ｔ　ｌ　ＤＮａｓｅ　Ｉ　、　１０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ　　ＩＩ（ＣＩ、１−１７．４１．１０
ｍＭ　　ＭｏＣｌ　　　Ｏ，１Ｍ２ゝ ＮａＧ　ｌ　、０．０３％Ｂ　Ｓへの組成の緩１＋ｉ　
８に１５０μｍを加えて３７℃で１０分間反応七（１！
る。 次にこの溶液を１００００×ｇ１５分間の遠心分鮒に付
して−に清を取り、組換体ＤＮＡをラムダファージ粒子
内に取り込ませる。 大腸菌Ｋ　−１２１［３９２への形質導入は、以下の様
にして行なった。すなわち、Ｌ　Ｅ　３９２を０．１％
マル１〜−スを含む１−培地（１％ポリペプトン、０．
５％イーストエキス、０．５％ＮａＣＩ）２ｍ！！に接
種し、−晩培養後、先の組換体を導入したファージ粒子
液を加え、その後その０．１．ｍＱずつを１．５％寒天
、５０　Ｉｔ　ｇ／　ｍ（ｌアンピシリンを含むＬ培地
を入れたシャーレに塗布し、３７℃で一晩培養してコロ
ニーを形成さぜ、組換体ＤＮＡをもつＩ　Ｆ”３９２を
コロニーとして出現させた。このコロニーからのビアラ
ホス生合成遺伝子をもつ絹換え体の選別は、公知のコロ
ニー交雑法（Ｇｒｕｎｓｔｅｌｎ、　Ｍ、、　　ｌ−１
ｏｇ１−１ｏ、　Ｑ、　３．、ｐｒＯｃ、、　Ｎ　ａｔ
　＋　、Δｃａｄ、ｓａｉ　（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、）７２
．３９６１−３９６５　（１９７５）、）により行なっ
た。 ぞの際のプローブどしては、３２Ｐで識別したｐ　Ｍ　
Ｓ　１３２−４及びｐＭｓＢｌ　２−Ｉ　ＤＮＡを使用
し、ハイブリダイゼーションは３ｉｂｂ等の条件ニＪニ
リ行なッｋ　（Ｎ　ａｆｏｒＯ，′Ｌ０４．５２７−５
３１　（１９Ｆ’ＩＯ）　）。ｌ’）　Ｍ　Ｓ　ｒ’ｌ
　２−４及びＤ　Ｙ　Ｓ　１１１２−１両７　Ｉ＋　−
−７に反応ｉｌる組換２体Ｆ）ＮＡをも−）１１］ニー
を選別して、ｌ）ＭＳ＋１’Ｍ１−３を取得し！、二、
１ 実＃ｔｌｒ−ｊｐｌ　ｉＩ　　（ｒ２　Ｍ−３−１３１
二２．−の、Ｌ！；！！−ス１〜レフ゛１へマイｌごス
・ハｒグ１１スー１ピカスＳ］−１２９３を５＝−１培
地（２％ツルＪルスター１．１．０％ペプトン、０．３
％ミー１へ１キス１−ラクト　、　　０　、　０５　％
　Ｋ　　　　１−ＩＰＯ，、ｐＨ７，０）　　　１　０
ｍｆｆに植菌し、２８℃で２４−４８時間培養し、これ
を杆菌どし−ＵＭＹＧ培地に５％Ｉｌｖ菌吊で４／＋え
−）いだ。Ｍ　Ｙ　Ｇ培地は、１％モルト工４ニス、０
．／１％イーストエ４−ス、０，５％グルコース、ｏ　
Ｌ１７．０（８０ｍ！りにグリシン２％を添加したもの
である。これを２８℃で２４時間振盪培養にＨし、１０
０００×ｇ／１０分間の遠心分離で集菌した。 この菌体からスミス等の公知の方法’（Ｍ　ｅｔｈｏｄ
ｓｉｎ　［ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ上２．５４５．（１９６
７））で全ＤＮＡを抽出粕製し、ＴＦＳＣバッファー（
１０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ　　−１−ＩＣＩ　　　ｐｔ１
８．０１１ｍＭ　　ｆＥｌつＴ△、２．５ｍＭ　　Ｎａ
ＣＩ）Ｔ”透析して、供１５体ＯＮへとした。 この様にして行た供与体Ｎ０ＡＩＯμグを総Ｆｎ　　２
　　（１０ｔｔ　　　ｌ　　の　２０ｍＭ　　　　　Ｔ
ｒｉｓ　　　−１−ＩＣｌ　　　　　　ｐＨ７、／１，
５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭＭｏＣＩ　　、１０ｍ
Ｍ　　β−メルカプトエタノール組成の；シ応液中で制
限酵素ＢｏｌＵ１０単位を　　゛加えて３７℃で２時間
反応させた。 プラスミドｒ）ＴＪ　７０２ＮＤΔ２μ３を総量４０　
ｔｔ　Ｉの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　ｌ　　
ｐｉ−１７、／１，１０ｍＭ　　ＭＯＣＩ　　、１０ｍ
Ｍ　　βメ２　　。 ルカプト−［タノール組成の反応液中で制限酵素ｒ３ｑ
ｌＷ２甲位を加えて、３７℃で２時間反応さ１！た。 これを７０℃で１０分間加熱して酵素を失活させてから
、１／１０ｍの５００ｍＭ　　ＮａＣｌを添加し、カー
フ・インテスヂンφアルカライン・ホスフンｌラーゼ（
ｃ、ｉ、ａ、Ｉ）、）を１０単位加えて、３７℃で６０
分反応を行った。 供与体Ｉ）ＮＡ及びプラスミドＤＮＡの反応液のそれぞ
れにＴ　Ｅ　Ｓ　１１バツフア　−（０，２ＭＴｒｉｓ
−１−ＩＣＩ　　ｐＨｆ１．（’）、２０ｍＭジチオス
レイ１〜−ル、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ＞が飽和したフェ
ノール溶液を等量ずつ加えて１分間振盪し、両方の液を
合（７１１）だ。これを１００００×ｇ１５分間の遠心
分離後、１層（水層）をパスツールビペラ１−で取り出
ｌノだ。 ｒ）ＮＡを含むこの水層部分をエール、［−）ル抽出に
付し、フー■ノールを除去してから等１ｒｌのエタ／−
ルヲ加ス、−Ｏｒ）　℃ニ２時間４Ｑ　Ｆｆ　ｔＧ、１
００００×ｆｌ／！：）分間の遠心分Ｍｌ　ｒ″ｒ）　
ＮＡを沈殿　′Ｃ＼　１１　ｌこ　。 この様に１ノで得たＤＮＡを５（１０ｆｚｌの１−タノ
ールテ洗ｒｌ′Ｉシ、減ＪＴ’Ｆｒ乾燥シてカラ、５０
７１１の加熱滅菌した純水に溶解した。このＤ　ＮＡを
７０℃で１０分間加熱処押し、ついで室温まで除冷し、
バッファー　（０，６６Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１１ｃ　１
ｐｌ−１７，６，６６ｒＴＴＭ　　ＭＯＣＩ　　、０．
１Ｍジチオスレイ］・−ル、１０ｍＭ　　ＡＴＰ）５Ｉ
ｌｌとＴ４リガーゼ５Ｉｌｌ（１単位）とを加えて２２
℃で２時間反応させて、ｐｌＪ７０２とストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスＤＮＡとの組み換え体１）Ｎ
Ａを調製した。 このＤＮＡによる宿主菌ストレプトマイセス・バイグロ
スコピカス３６９−１８株の形質転換は放線菌に通常用
いられるプロトプラストＰＥＧ法（例えばＣｕｒｒ、　
　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　　ｌｍ５ｕ
ｎｏｌ、９６．６９　（１９８１）等に示される）によ
り行なった。 すなわち、Ｂｏｒｎｅ（ＤＳ培地（グルコース１％、ペ
ブｉ−ン０．４％、イーストエキストラクト０．４％、
Ｍ　ａ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０５％、ＫＨ，、Ｐｏ
、０．２％、Ｋ、、１−ＩＰＯ４０，４％、グリシン５
％）にストレプトマイセス・バイグロス−１ピカス３６
９−１　Ｓ株を接種して、２８℃で１８時間振隔培養を
行’Ｊ　（１’、１１００００Ｘの遠心分離で菌糸を集
めて、０．５Ｍ蔗糖　溶液で１回洗浄したの１５．１０
ｍｔ！のＰｓ培地（Ｎａ０１７０１１Ｍ、蔗糖０．５Ｍ
１Ｍ０Ｃ１２−５ｍＭ。 Ｃａ０１２５ｍＭ、２５ｍＭ　　Ｔ［ＳＩ’）１１７．
２）に懸濁さｌた。次いＣ１最終濶度１■／　ｍｅに／
７る様に卵白リゾチームと０．５ｍｇ／ｍ（ｌに／ｉる
様にアクロモペプヂダーゼとを加え、３７℃に６０分間
保湿してプロトプラストを形成させ、ブ［］］〜プラス
ト化しなかった菌糸は綿か過て除去しＩこ。 ８００ｘｙ／１０分間の遠心分１ｉ１１１によってプロ
１〜プラストを集め、ｐｓ培地で１回洗浄後、２　ｒｎ
（ｌのｐｓ培地に懸濁させたプロ１へブラスト液１００
μｍ、、３／２？１１度に調整したＰ−マレイン酸バッ
フｐ−（２，５％蔗糖、１．４ｍＭ　　Ｋ　　ＳＯ２、
１１５００ｆｉ微宿元素溶液、１００ｍＭＣａＣｌ　　
、　５０ｍＱ　　Ｔｒｉｓ−マレイン酸ｐ　ｔ−１８，
０）１００Ｉｌｌ、組み換えＤＮＡ溶液５０μｍ及び３
７５　ＩＩ　ｌのポリエチレングリコール溶液（ポリエ
チレングリコール＃１０００　３３％／Ｐ−マレイン酸
バッファー）を混合し、１分間室温放置後、ｐｓ培地５
Ｉｄ、で稀釈し、８００Ｘ９／１０分間の遠心分離でプ
ロトプラストを集め、２ｄのｐｓ培地に懸濁させた。こ
のプロ１プラスト−液を０．１ｍＱずつ２０枚の直径９
０ｃｌ１１円形プラスデック製ぺ１〜り皿に調整したＲ
　Ｈ寒天培地（１リッ１−ル中、蔗糖１７１ｇ、ＫＣｌ
１４．９ｇ、グルコース１０ｇ、微量元素溶液２ｊ１１
！、ＫＳ０４２．５％　１０ＩＲ１１プロリン３ｇ、カ
ザミノＮｏ、５ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストラン０
．０５ｇ、０．５％ＫＨ２ＰＯ４１０ｔａｌｌ　１１　
Ｍ　　ＣａＣｌ　　・２　ｌ−１２０５０ｔｄ、０、’
２５Ｍ　　ＴＥＳ（ｐｌ−１７，２）１００ｄ。 Ｃ８０３０ｇ／１０００＃Ｉ（！　　１００ｄ、５％ア
スパラギン酸１０ｓ＋ｅ）にそれぞれ塗布した後、ＲＨ
培地の寒天製電が０．５％のものをその上層に２ｉｉ！
ｆｆｉ層した。これと、２８℃で１８時間培養後向じＲ
１−１（ラフ１〜アが−０，５％）にチオストレプトン
を２０ｇｇ／ｄになる様に加えたものをさらに２ａｉｉ
！重層した。これを、１０〜２０日間、９０％に湿庶を
保持したチャンバー内で、２８℃で培養をつづ【プた。 プロトプラストから再生したＲ　ｌ−１寒天培地上の菌
を１％ＣＡ３１５μｇ４ｄＣｕＳＯ４・５Ｈ２０および
０．５１１１／ｒｄチロシンを含むニュートリエンドア
ガー培地に、市販の針を用いて移した。これを２８℃で
２日間培養に付した。その結梁、メラニン色素を産性す
るコロニーとメラニン色素を産性しないコロニーとがお
よそ１：１の割合で生じた。 ストレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡはベク
ターｐＴＪ７０２の生産にかかわるメラニン遺伝子上の
ＢＱＩＴ［サイトに組み込まれるわ番）であるから、連
結（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）時に外来のストレプトマイセス
・バイグロスコピカスＤＮＡを相込んだプラスミドが導
入したクローンはメラニンを産生しく２い。しかしスト
レプトマイバイグロスコピカスＤＮＡをｌｌｏｌｌ（ｊ
イトに組込まなかったプラスミド番よメラニン色素を産
性する。従って、メラニン色素をｆｒＩＩできイ「い、
−１０ニーは導入されｌこプラスミドににスト１ノブト
ンイ１！ス・バイグロス」ビカスのＯＮＡを相込んでい
ることが判定できるわＩＪである。 このうちメラニン色素を産生じないコロニーを市販のつ
まようじを用いて以下に示す組成のアが一ピース上にレ
プリカした。アガーピースとは０、４％グルコース、０
．３５％ホイート・ジャーｌい、０．２３％ＳＶＰ　（
ソルブル・ベジタブル・プロティン）０．０３％　ＫＨ
２ＰＯ４、ｏ．ｏｏｏｉ％　ＣＯＣＩ　　・６Ｈ２０、
２％アガー、ｐＨ７．０からなるものを直径７〜８ｗＲ
１高さ４〜５１１１１Ｉの円柱どなる様コルクポーラで
うちぬいたものである。 このアガーピースを２８℃／６日間の培養に付した。こ
れをＰｒｏｔｅｕｓ　　ｓｐ．　ＭＢ−８３８を検定菌
として、３２℃で■市内を作らせ、阻市内の直径が最大
の大きさのコロニー１株を得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性のストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスを前述と同様のシード培養を
行なったものから各々８０ＩＩ！のＭＹＧ培地（グリシ
ン２％添加）に接種し、２８℃で２４時間振媚した培養
菌体から、ハンセン等にＪ：る公知の方法（　Ｊ　、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１　３　５　。 ２２７　（１９７８）でプラスミドｐＭｓＢ１−２を抽
出した。これらのプラスミドによって、３６９−１Ｓ株
の形質転換を行ッｌ＝どこ／）、ｐＭＳＢｌ−２を含む
株の生産性が／１〜５倍向−１−していた。 これらの菌株がビアラホスをｆｆ　’ｌ−ｊ、でいるか
否かについては、文献［明治製菓研究（ｊ報Ｎ０２１．
４４〜５１（’１９８２）、１１こ示されるｊｉ　ｒ）
、で分析を行なった。つまり、各々の菌株培ＴＩ汀ｉ′
ｌＩをアーミノ酸アナライザーを用いて分析したどころ
、ＩＱ　、＋１１１中に産生きれる抗菌物質をクロマト
グラフ的にどアラホスであると同定できた。 火蒲１」」」ｙＳ　Ｂ　１−６の作成）ストレプトマイ
セス・バイグロスコピカス５Ｆ−１２９３をＳ−１培地
（２％ソルブルスターチ、１．０％ペプトン、０．３％
ミート　エキストラフｔ−，０，０５％Ｋ　　１−ＩＰ
Ｏ４、ｐＨ７，０＞１０’ｄに植菌し、２８℃で２４−
４８時間培養し、これを種菌としてＭＹＧ培地に５％植
菌量で植えついだ。Ｍ　Ｙ　Ｇ培地は、１％モルトエキ
ス、０、／１％イーストエキス、０．５％グルコース、
ｐＩ−１７’、　Ｏ（’８０　ａｒｅ　）にグリシン２
％を添加したものである。これを２８℃で２４時間振盪
培養にイ；１し、１００００×ｇ／１０分間の遠心分離
で集菌した。この菌体からスミス等の公知の方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　旦、５４
５　。 （１９６７））で全ＤＮＡを抽出精製し、ＴＦＳＣバッ
ファ　　（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−＋−１ｃ　１１）
Ｈ８，Ｏ１１’ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭＮａＣ１
）で透析して、供与体ＤＮＡとした。 この様にして得た供与体ＤＮＡ１０μグを総１２００μ
ｌの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−Ｉ−１ｃ　ｌ　　６Ｈ７
、４、５０ｍＭ　　　ＮａＣｌ　　、　１０ｍＭＭ０Ｃ
Ｉ、１０ｍ’Ｍ　　β−メルカプトエタノール組成の反
応液中で制限酵素ＢＧＩＴ［１０単位を加えて３７℃で
２時間反応させた。 プラスミドｐ　Ｔ　、’Ｊ　７０２　ＤＮ　Ａ　２　Ｉ
Ｉ　ｇを総崩４０ｔｔ　＋の２０　ｍＭ”　　Ｔ　ｒｉ
ｓ　−’Ｉ−Ｉ　Ｇ　ｌ　’　［）　ｌ−１７，４，１
０’ｍＭ’ＭｏＣｌ　　、”１０ｍＭ　　βメルカプト
エタノール組成の反応゛液中で制限酵素Ｒｏｌ’ｌｒ２
中位を加えて、３７℃で２時間〜応さゼた。 これを７０℃で１０分間加熱して酵素を失活ざ゛せてか
ら、１／１ＯＦＦ！の５６　（１ｍＭ”　　Ｎ’ｊ　Ｃ
，ｌを添加し、カーフ・インテスブン・アルカライン・
ホスフチターゼ（ｃ、ｉ、ａ、’ｐ、’）を１０中位加
えて、３７℃で６０分反応を行った□。 ゛供与体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮ’Ａの反応液′のそ
れぞれにＴ　Ｅ　Ｓ　Ｈバッファ”−’　（０、”！　
Ｍ’Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣＩ　　１−１８’、０．２’Ｏｍ
Ｍジチオスレイ１−−ル、５０ｍ’Ｍ’　　ＮａＣ１）
が飽和したフェノール溶液を等量ずつ加えて１分間振盪
し、両方の液を合併した。これを１１００００ｘ、１５
分間の遠、心分離後、上層（水層）をパスツールピペッ
トで取り出した。 ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテル抽出に付し
、フェノールを除去してから等量のエタノールを加え、
−８０℃に２時間放置後、１００００ｘｇ１５分゛間の
遠心□分離でＤＮＡを沈殿′させた。 この様にして得たＤＮＡを５００μｍのエタノールで洗
浄し、減圧下で乾燥してから、５０μｍの加熱滅菌した
純水に溶解した。このＤＮＡを７０℃で１０分間加熱処
理し、ついで室温゛まで除冷”し、バッフ？　−（０，
６６Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１−１ｃ　１１）’　Ｉ−ｌ　
７　’、　６．６６ｍＭ　　ＭＯＣＩ　　、０．１Ｍジ
チオスレイＩ・−ル、１０ｍＭ　　ＡＴＰ）５１１１と
−［４リガーゼ５ｆ１１（Ｉｔｌｉ位）とを加えて２２
℃で２一時間反応させて、ｐｌＪ７０２とストレプトマ
イセス・バイグロスコピカスＤＮＡとの組み換え体ＤＮ
Ａを調製した。 このＤ′Ｎ八による宿主菌ストレプトマイセス・バイグ
ロスコピカス３６９−１８株の形質転換は放線菌に通常
用いられるプロトプラストＰＥＧ法（例えばＣ１ｌｒｒ
、　　ＴＯｐｉＣ３Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　　ＩＩＩ
ＩＩＩｌｌＩｎｏ＋。 ９６．６９　（１９８１）等に示される）により行なっ
た。　すなわち、８０ｄのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン０．４％、イーストエキストラクト０．４％、Ｍ
ｏｎｏ４　・７Ｈ２００，０５％、ＫＨＰＯ４０，２％
、Ｋ、　ＨＰＯ４，０，４％、グリシン５％）にストレ
プトマイセス・バイグロスコピカス３６９−１８株を接
種して、２８℃で１８時間振盪培養を行ない、１０００
０ノｇの遠心分離で菌糸を集めて、０．５Ｍ蔗糖　溶液
で１回洗浄したのち、１０ｔｎＱのｐｓＳ培地ＮａＣ１
７０ｍＭ、蔗糖０．５Ｍ、ＭＯＣ１２−５ｍＭ。 ＣａＣｌ２５ｍＭ、２５ｍＭ　　ｒＥＳｐ＋−１７，２
）に懸濁させた。次いで、最終濃度１■／　ｒｕｅにな
る様に卵白リゾデーｌ＼ど０　、５　ｍｌ、／　ｍＱに
なる様にアクロモペプヂダ−＋２とを加え、３７℃に６
０分闇保温してプロトプラストを形成さけ、ブロー・プ
ラスト化しなかった菌糸は綿か過て除去しｌこ。 ε３００ｘｇ／１０分間の遠心分離によってプロトプラ
ス１−を集め、ｐｓＳ培地１回洗浄後、２　ａｒｅの１
−）Ｓ培地に懸濁さ１！たプロトプラス１〜液１００７
１１．３４Ｊ度に調整したＰ−マレイン酸バッファー（
２，５％蔗糖、１．４ｍＭ　　Ｋ　　ＳＯ４、１１５０
０吊微ｈ１元素溶液、１００ｍＭｃａｃ　ｌ　　、５０
＃ｌｌ！　　Ｔｒｉｓ　−’？レイン酸ｐＨ８，０）１
００７ノー、組み換えＤＮＡ溶液５０μｍ及び３７５　
Ｉｔ　ｌのボリエヂレングリコール溶液（ポリエチレン
グリコール＃１０００　３３％／Ｐ−マレイン酸バッフ
ァー）を混合し、１分間室温放置後、ｐｓＳ培地　ｍｅ
で稀釈し、８００Ｘ！？／１０分間の遠心分離でプロト
プラストを集め、２ｔｄのｐｓＳ培地懸濁さ１！た。こ
のプロトプラスト液を０．１ｄずつ２０枚の直径９０α
円形プラスチック製ぺ］−り■に。調整したＲ　Ｈ寒天
培地（１リツトル中、蔗糖１７１ｇ、ＫＣｌ１４．９ｇ
、グルコース１０ｇ、微量元素溶液２　ｍＱ、ＫＳＯ４
２，５％　１０ｍｅ、プロリン３ｇ、カザミノ′ＭＯ０
５ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキスト７ン０．０５ｇ、０
　、５　％Ｋ　Ｒ２Ｐ、０４１０＃Ｉｅ。 ＩＭ　　ＣａＣｌ　　　・２１−１２０　５０＃ｌｌ！
、０．２５Ｍ　　　ＴＦＳ　　（ｐＨ７，２）１００ａ
＋ｅ１　Ｃ８Ｃ３０ｇ、／１０００ｄ　　１００ｄ、５
％アスパラギン酸１０ｍ！りにそれぞれ塗布した後、Ｒ
］−１培地の寒天潤度が０，５％の−６のをその上層に
２−重層した。 これと、２８℃で１８時間、培養後向じＲ１−１（ソフ
トアーガ−０，５％）にヂオストレプｌ〜ンを２０μ９
　／　ｒｔｒ９になる様に加えたものをさらに２＃Ｉｌ
！車層した。これを、１０〜２０口間、９０％に湿磨を
保持したチャンバー内で、２８℃で培養をつづＧ−Ｊた
。プロトプラス１〜から再生したＲ１＋寒天培地１゛の
菌を１％Ｇ　Ａ　Ｓ　、　５　Ｉｔで１　／　ｔｎＱ　
　Ｃ４ｉ　Ｓ　０４　・５Ｈ２０および０．５ｍ９／ｍ
Ｑチ１１シンを含むニコートリエントアガー培地に、市
販の釦を用いて移した。これを２８℃で２日間培養に付
した。その結果、メラニン色素を産性する］ロニーとメ
ラニン色素を産性しないコロニーとがおＪ：そ１：１０
割合で生じた。 ストレプトマイレス・バイグロスコピカス−５６’− ＤＮＡはベクターｔ）ＩＪ７０２の生産にかかわるメラ
ニン遺伝子−にのＢＯＩＴｒサイトに組み込まれるわ【
ノであるから、連結（１ｉ（ｌａｔｉｏｎ）時に外来の
ストレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡを組込
ｌυだプラスミドが導入したクローンはメラニンを産生
じない。しかしストレプトマイセス・バイグロスコピカ
スＩ）ＮＡをＢ　ａ　ｌ、　ＴＩサイトに組込まなかっ
たプラスミドはメラニン色素を産性する。従って、メラ
ニン色素を産生できないコロニーは導入されたプラスミ
ド上にストレプトマイセス・バイグロスコピカスのＤＮ
Ａを組込んでいることが判定できるわけである。 このうノ５メラニン色素を産生じないコロニーを市販の
つまＪ、うじを用いて以下に示す組成のアガーピース十
にレプリカした。アガーピースとは０、／１％グル］−
ス、０．３５％ホイート・ジャーム、０．２３％ｓｖｐ
　＜ソルブル・ベジタプル・プロティン）０．０３％　
ＫＨ２ＰＯ４，０，０００１％　ＣＯＣｌ　　・６日２
０．２％アガー、ｌ’）ｌ−１７，０からなるものを直
径７〜８＃＋１高さ４〜５　ｔｒｒｍの円柱どなる様コ
ルクポーラで一″′ｌＩ５ぬいたちのである。 このアガーピースを２８℃／６日間の培養にイ・１した
。これをＰｒｏｔｅｕｓ　　ｓｐ、　ｔＶｌ−８３ｆｌ
を検定菌として、３２℃で阻１１−円を作らｌｊ　／ｊ
。イの結果、ホワイト・＝１１］ニー７００個のうＩ）
１株の非生産株を得た。 得られた１株のヂオストレブ１−ン銅竹ぐしか一６ビア
ラホス生産能をなくしたストレア１−マイ１？ス・バイ
グロスコピカスを前述と同様のシード培養を行なったも
のから各々８０　ｍｅ　１７）　Ｍ　Ｙ　Ｇ培地（グリ
シン２−％添加）に接種し、２８℃で２４時間振盪した
培養菌体から、ハンセン等による公知の方法（Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３５．２２７　（１９７Ｂ）で
プラスミドｐＭＳＢ１−６を抽出した。これらのプラス
ミドによって、再びストレプトマイセス・バイグロスコ
ピカス３６９−１Ｓ及び４６０−２株等のビアラホス生
産株を形質転換させた場合、いずれもビアラホスをごく
微量しかつくらなくなっていた。 ＬＩＪ６　（ｐＭｓＢ３−１の作成） ストレプトマイセス・バイグロスコピカス５Ｆ−１２９
３をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、１．０％ペプ
トン、０．３％ミート　エキストラフｔ−，０，０５％
に、、１−ＩＰＯ４、ｐｌ−１７，０）１０　ｍｅ　ｋ
：植菌し、２８℃で２４−４８時間培養し、これを種菌
としてＭ　Ｙ　Ｇ培地に５％植菌量で植えついだ。ＭＹ
Ｇ培地は、１％モルトエキス、０．４％イーストエキス
、０．５％グルコース、ｐｌ−１７，０（８０ａ＋ｅ）
にグリシン２％を添加したものである。これを２８℃で
２４時間振盪培養に付し、１１００００ｘ／１０分間の
遠心分離で集菌した。この菌体からスミス等の公知の方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｏＶ　
１２　、５４５　。 （１９６７））で全ＤＮＡを抽出精製し、ＴＥＳＣバッ
ファー（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１−１ｃｌＦＮ−１８
，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭＮａＣ１）で透
析して、供与体ＤＮＡとした。 この様にして得た供与体ＤＮＡ１０１１ｇを総量２００
　ｔｔ　Ｉの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ，Ｉ　　ｐ
＋７、４、５０ｍＭ　　　ＮａＣ１、１０ｍＭＭ０ＣＩ
　　、１０ｍＭ　　β−メルカプ１へ二［タノール組成
の反応液中ぐ制限酵素１１　ａ　ｌ　ＩＦ　１０甲（ｊ
／を加えて３７℃で２時間反応さｌｆｉた。 プラスミドｒ）ＩＪ７０２ｒ）ＮΔ２μりを総量４０μ
ｍの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ｔ−１ｃ　ｌ　　ｐｌ−
１７，４，１０ｍＭ　　ＭＯＣＩ　　、１０ｍＭ　　β
メルカプトエタノール組成の反応液中で制限酵素Ｂｑｌ
ｌＴ２単位を加えて、３７℃で２時間反応させた。 これを７０℃で１０分間加熱して酵素を失活させてから
、１／１０量の５００ｍＭ　　ＮａＣｌを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスファターゼ（ｃ
、ｉ、ａ、　ｐ、）を１０単位加えて、３７℃で６０分
反応を行った。 供与体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの反応液のそれぞれ
にＴＥＳＨバッファ　−（０，２ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　
　ｐＨ８，０，２０ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ
　　ＮａＣ１）が飽和したフェノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを１１０
０００Ｘ、１５分間の遠心分ｌｌ１ｌｌ後、上層（水層
）をパスツールピペットで取り出１ノだ。 ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテル抽出に付し
、フェノールを除去してから等量のエタノールを加え、
−８０℃に２時間放置後、１００００×ｇ１５分間の遠
心分離でＤＮＡを沈殿さＩた。 この様にして得たＤＮＡを５００μｍのエタノールで洗
浄し、減圧下で乾燥してから、５０μｍの加熱滅菌した
純水に溶解した。このＤＮＡを７０℃で１０分間加熱処
理し、ついで室温まで除冷し、バッファー（０，６６Ｍ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７，６，６６ｍＭ　　ＭＯ
ＣＩ　　、０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭ　　
ＡＴＰ）５μｌとＴ４リガーゼ５μｍ（１単位）とを加
えて２２℃で２時間反応させて、ｐＩＪ７０２とストレ
プトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡとの組み換え
体ＤＮＡを調製した。 このＤＮＡによる宿主菌ストレプトマイセス・バイグロ
スコピカスＮＰ５１の形質転換は放線菌に通常用いられ
るプロトプラストＰＥＧ法（例えばＣｕｒｒ、　　Ｔｏ
ｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　９６゜６９（１９８１）等に示される）により行なっ
た。 すなわち、８０ａ＋ｆｆのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン０．４％、イーストエキストラフ］へ０．４％、
Ｍｏｎｏ　　・７１−１２００．０５％、に＋−１２Ｐ
Ｏ４０，２％　、　　Ｋ　２　　トＩＰＯ４０，４％　
、グリシン５％）にストレプトマイセス・バイグロスコ
ピカスＮＰ５１を接種して、２８℃で１８時間振盪培養
を行ない、１１００００ｘの遠心分離で菌糸を集めて、
０．５Ｍ蔗糖　溶液で１回洗浄したのち、１０ｍｅのｐ
ｓＳ培地ＮａＣｌ　７０ｍＭ。 蔗糖０．５Ｍ、ＭｏＣｌ　　−５ｍＭ、ＣａＣｌ２５ｍ
Ｍ、２５ｍＭ　　ＴＥＳｐＨ７，２）に懸濁させた。次
いで、最終潤度１　＃ｌ！？　／　ＩＲ（！になる様に
卵白リゾチームと０．５ｒＲ９／ｕｄｌになる様にアク
ロモペプチダーゼとを加え、３７℃に６０分間保温して
プロトプラス１−を形成さ１！、プロトプラスｈ化しな
かった菌糸は綿ン濾過て除去した。８００ｘｈ／１０分
間の遠心分前によってプロトプラストを集め、ｐｓＳ培
地１回洗浄後、２　ｔａＱのｐｓＳ培地懸濁させたプロ
トプラスト液１００μ＋　、　３／２濃度に調整したＰ
−マレイン酸バッファー（２，５％蔗糖、１．４ｍＭ　
　Ｋ２ＳＯ３，１１５００ｆｆｌ微量元素溶液、１００
　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ＋　２．５０ｍ！！　　Ｔｒｉｓ
　−ｖレイン酸ｐＨ８，０）１００μｍ、組み換えＤＮ
Ａ溶液５０μｍ及び３７５μｍのポリエチレングリコー
ル溶液（ポリエチレングリコール＃１０００　３３％／
Ｐ−マレイン酸バッファー）を混合１ノ、１分間室温放
置後、ｐｓＳ培地　ｍｅで稀釈し、８００ｘｇ／ｌ　０
分間の遠心分離でプロトプラストを集め、２−のｐｓＳ
培地懸濁させた。このプロトプラスト液を０．１−ずつ
２０枚の直径９０１Ｊ円形プラスチック製ペトリ冊に調
整したＲ　ｌ−１寒木培地（１リツトル中、蔗糖１７１
ｇ、ＫＣｌ１４．９ｇ、グルコース１０ｇ、微量元素溶
液２ｉ１！、Ｋ　　８０４２．５％　１０ｗｅ。 プロリン３ｇ、カザミノ１９０．５９、ポリペプトン２
ｇ、デキストラン０．０５９．０．５％Ｋｌ１２　ＰＯ
４１０ｒｎＱ、ＩＭ　　ＣａＣｌ、、−２Ｈ２０５０ｍ
Ｑ、０．２５Ｍ　　ＴＥＳ　（ｐＬＩ７、　２）１００
ｍＱ、Ｃ８Ｃ３０ｇ／　１０００＃１１！１００ｍｅ、
５％アスパラギンＭｌ（’）ｍｅ）にそれぞれ塗布した
後、Ｒｌ−１培地の寒天ｍｌσが０．５％のものをその
上層に２　ａｉ！重層した。これと、２８℃で１８時間
培養後同じＲ＋−１（ソフトアガー０．１ノ％）にチオ
ストレプ１−ンを２０　Ｉｔ　９　／　ＩＲｅになる様
に加えたものをさらに２　ｓ＋ｅ重層した。これを、１
０〜２０日間、９０％に湿度を保持したチャンバー内で
、２８℃で培養をつづけた。プロトプラストから再生し
たＲ１−１寒天培地上の菌を１％ＣＡＳ、５μ９　／　
ｍｅ　　Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４・５Ｈ２０おにび０．５■／ｄ
チロシンを含むニュートリエンドアガー培地に、市販の
針を用いて移した。これを２８℃で２日間培養に付した
。その結果、メラニン色素を産性するコロニーとメラニ
ン色素を産性しないコロニーとがおよそ１：１の割合で
生じた。 ストレプトマイセス・バイグロスコピカスＤＮＡはベク
ターｐｌＪ７０２の生産にかかわるメラニン遺伝子上の
ＢｑｌＴサイトに組み込まれるわ・プであるから、連結
（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）時に外来のストレプトマイセス・
バイグロスコピカスＤＮＡを組込ｌυだプラスミドが導
入したクローンはメラニンを産生し４にい。しかしスト
レプトマイセス・バイグロスコピカスｌ’）ＮＡをＲｏ
ｌｌＴサイトに組込ｊ、なかったプラスミドはメラニン
色素を産性する。従って、メラニン色素を産生できない
コロニーは導入されたプラスミド」二にストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスのＩ）ＮＡを組込んでいるこ
とが判定できるわけである。 このうちメラニン色素を産生じないコロニーを市販のつ
まようじを用いて以下に示す組成のアガーピース上にレ
プリカした。アガーピースとは０．４％グルコース、０
．３５％ホイート・ジャーム、０．２３％ＳＶＰ　（ソ
ルブル・ベジタプル・プロティン）０．０３％　Ｋ）−
１２ＰＯ４，０，０００１％　ＣＯＣｌ　　・６Ｈ２０
，２％アガー、ｐＩ−１７，０からなるものを直径７〜
８　ｍ　。 高さ４〜５ｍの円柱どなる様コルクボーうでうちぬいた
ものである。 このアガーピースを２８℃／６日間の培養に付した。こ
れをＰｒ０ｔｅｌｌ’Ｓ　　ＳＤ、　ＭＢ−８３８を検
定菌として、３２℃で阻市内を作るアガーピースがある
か否かを調べた。その結果、ホワイト・コロニー１００
０個のうち１株の生産回復コロニーを得Ｉこ。 得られた１株のブＡストレプトン耐ｆ１でしかもビアラ
ホス生産能の回１ｕシたストレプトマイ１？ス・ハイク
ロスコピカスを前述と同様のシード１Ｆ＜養を行１．ｒ
　ツタち＋７）　／＋１ら各々８ｏ　ｍｅ　１７）　Ｍ
　Ｙ　Ｇ　Ｉｒｆ　ＩＩ！＋　＜グリシン２％添加）に
接種し、２８℃で２　／ｌ　Ｉｌ、ｊ間振盪した培養菌
体から、パン１？ン等にＪ、る公知の方法（Ｊ　、　Ｂ
　ａｃｔｅｒｉ＋山−１３Ｆｉ　、　２２７　（１９７
Ｂ）でプラスミドを抽出しＩこ。これらのプラスミドに
にって、再びストレプトマイ１？ス・ハイグ１］スニＩ
ビカスＮＰ５１を形質転換さ１！た場合、ビアラホスの
生産性を回復できた。 これらの菌株がビアラホスを産生じているか否かについ
ては、文献「明治シｌ菓研究年報Ｎｏ、　２１、＝　６
７− ４４〜５１（１９８２）」に示される方法で分析を行な
った。つまり、各々の菌株培養か液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生される抗菌
物質をクロマトグラフ的にビアラホスであると同定でき
た。

【図面の簡単な説明】

第１〜６図は、それぞれ、プラスミドｐＭＳＢ２−４．
１２−１．１３−３．１−２．１−６おにび３−１の制
限酵素切断地図である。 第７Ｎは、プラスミドＩ）ＭＳＢ２−４．１２−１おＪ
：び１３−３に組込まれている本発明ＤＮＡ鎖４１’ｌ
？７おＪ：びビアラホス生合成遺伝子との間の相η関係
を示１゛３１明図である。 第８図は、ビアラホス生合成経路を示す説明図である。 出願人代理人　　猪　　股　　　　清 ミー「　本Ａと　ン山　正　１）（方式）昭和６０年３
月２８［１ １事イ′１の表示 昭和５９年　特清願　第１８１１５１月　　　　　′２
　発明の名称 ビアラホス生産遺伝子 ３　補正をする者 事イ１どの関係　　特許出願人 （６０９）明治製菓株式会ネ１ ４代理人 昭和６０年２月６日 （発送［１昭和６０年２月２６日） ６　補正の対象 図面。 ７　補正の内容 願ｐ１に最初に添イ・１した図面の浄書・別紙の通り（
内容に変更イ’ｉし）。 −”ｒ−糸ｆｉ：　　ネ市　正　書 昭和６０年　７　月１２日 特Ｆ、Ｚｌ庁長官　宇賀道部殿 １１１′１の表示 昭１［目う９年　特Ｙ１願　第１８１１５１号２　発明
の名称 ビアラホス生産遺伝子 ３　補正を４る者 事件との関係　　特許出願人 （６０９）明治製菓株式会ネ１ ４　　代　　埋　　人 第８図を、別紙の通りに補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の群（１）〜（６）から選ばれた、ビアラホス
   生合成経路の少なくとも一部をコードする遺伝子を含む
   ＤＮＡ鎖。 （１）ビアラホスＤＮＡのＢａｍＨＩ消化フラグメント
   とｐＩＪ７０２プラスミドＤＮＡのＢｇ I II消化フラ
   グメントとからなる、第１図に示した制限酵素切断サイ
   トを有する分子量９．１５ｋｂのハイブリッドプラスミ
   ドｐＭＳＢ２−４中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡ
   フラグメントと等価のＤＮＡ鎖。 （２）ビアラホスＤＮＡのＳｓｔＩ消化フラグメントと
   ｐＩＪ７０２プラスミドＤＮＡのＳｓｔＩ消化フラグメ
   ントとかられる、第２図に示した制限酵素切断サイトを
   有する分子量１５．６ｋｂのハイブリッドプラスミドｐ
   ＭＳＢ１２−１中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡフ
   ラグメントと等価のＤＮＡ鎖。 （３）ビアラホスＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ消化フラグメン
   トとコスミドｐＨＣ７９ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化フラグ
   メントとからなる、第３図に示した制限酵素切断サイト
   を有する分子量４１ｋｂのハイブリッドプラスミドｐＭ
   ＳＢ１３−３中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡフラ
   グメントと等価のＤＮＡ鎖。 （４）ビアラホスＤＮＡのＢｇＩII消化フラグメントと
   ｐＩＪ７０２プラスミドＤＮＡのＢｇＩII消化フラグメ
   ントとからなる、第４図に示した制限酵素切断サイトを
   有する分子量１０．５ｋｂのハイブリッドプラスミドｐ
   ＭＳＢ１−２中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡフラ
   グメントと等価のＤＮＡ鎖。 （５）ビアラホスＤＮＡのＢｇＩII消化フラグメントと
   ｐ I Ｊ７０２プラスミドＤＮＡのＢｇＩII消化フラグ
   メントとからなる、第５図に示した制限酵素切断サイト
   を有する分子量６．６５ｋｂのハイブリッドプラスミド
   ｐＭＳＢ１−６中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡフ
   ラグメントと等価のＤＮＡ鎖。 （６）ビアラホスＤＮＡ（７）ＢｇＩII消化フラグメン
   トとＰＩＪ７０２プラスミドＤＮＡのＢｇＩII消化フラ
   グメントとからなる、第６図に示した制限酵素切断サイ
   トを有する分子量１４．７ｋｂのハイブリッドプラスミ
   ドＰＭＳＢ３−１中の、ビアラホスＤＮＡ由来のＤＮＡ
   フラグメントと等価のＤＮＡ鎖。