JPH0332358B2 - - Google Patents

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JPH0332358B2
JPH0332358B2 JP59181151A JP18115184A JPH0332358B2 JP H0332358 B2 JPH0332358 B2 JP H0332358B2 JP 59181151 A JP59181151 A JP 59181151A JP 18115184 A JP18115184 A JP 18115184A JP H0332358 B2 JPH0332358 B2 JP H0332358B2
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dna
medium
streptomyces hygroscopicus
bialaphos
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Takeshi Murakami
Satoshi Imai
Hiroyuki Anzai
Atsuyuki Sato
Kozo Nagaoka
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Meiji Seika Kaisha Ltd
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Publication of JPH0332358B2 publication Critical patent/JPH0332358B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

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  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
発明の効果 技術分野 本発明は、ビアラホス生産遺伝子に関する。さ
らに具体的には、本発明は、ビアラホス遺伝子の
ビアラホス生合成経路ステツプをコードする遺伝
子を含むDNA鎖に関する。 放線菌は、抗生物質をはじめとする有用物質の
生産菌として微生物工業において広く使用されて
いる最も重要な醗酵微生物である。 組替えDNA技術を放線菌の育種、その遺伝的
性質の解明域いは抗生物質の生産性向上に利用す
ることができれば、産業上極めて価値ある効果が
期待できるといえよう。 先行技術 放線菌の抗生物質生合成遺伝子（二次代謝産物
生合成遺伝子）のクラスターとしてのクローニン
グに関する発表は、抗生物質生産の生合成経路の
解明の困難さもあつて、本発明者らの知る限りで
は「ネイチヤー（Nature）」309、462（1984）に
記載のアクチノロージンに関してもののみであ
る。 ところで、ストレプトマイセス属に属する菌、
特にストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
SF1293株、の好気培養によつて生産される抗生
物質（特公昭51−639号公報）は「SF1293物質」
あるいは「ビアラホス」という名称で知られてい
て、農園芸用殺菌剤として（特開昭48−82028号
公報）および除草剤として（特公昭59−23282号
公報）有用なものである。特に、除草剤としての
用途に関しては低残留性という特色によつて広範
な使用が期待されている。 発明の概要 要 旨 本発明は、ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカスSF1293株のビアラホス生産遺伝子をクロ
ーニングすることによつて、二次代謝産物である
ビアラホス抗生物質の生産性向上に役立てようと
するものである。 すなわち、本発明は、ビアラホス生合成経路の
少なくとも一部をコードする遺伝子及びビアラホ
ス耐性遺伝子を含むDNA鎖を提供するものであ
り、しかしてこのDNA鎖はビアラホス生合成経
路の少なくとも一部をコードする遺伝子およびビ
アラホス耐性遺伝子を含むDNA鎖であつて、ス
トレプトミセス・ハイグロスコピカスDNAの
Sau3AI消化フラグメントとコスミド
pHC79DNAのBamHI消化フラグメントとから
なる第３図に示した制限酵素切断サイトを有する
分子量41KbのハイブリツドプラスミドpMSB13
−３を、BamHIまたはSau3AIで消化することに
よつて得ることができる、ストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスDNA由来のDNAフラグメン
ト、である。 本発明は前記したところをその要旨とするもの
であるが、本明細書においては、関連するビアラ
ホス生産遺伝子を含めて以下に説明するものとす
る。本明細書の開示にかかる関連DNA鎖とは、
ビアラホス生合成経路の少なくとも一部をコード
する遺伝子を含むDNA鎖であつて、下記の(1)〜
(5)から選ばれたもの、である。 (1) ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
DNAのBamHI消化フラグメントとpIJ702プラ
スミドDNAのBgl消化フラグメントとから
なる、第１図に示した制限酵素切断サイトを有
する分子量9.15kbのハイブリツドプラスミド
pMSB2−４中の、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスDNA由来のDNAフラグメントと
等価のDNA鎖。 (2) ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
DNAのSst消化フラグメントとpIJ702プラス
ミドDNAのSst消化フラグメントとからな
る、第２図に示した制限酵素切断サイトを有す
る分子量15.6kbのハイブリツドプラスミド
pMSB12−１中の、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスDNA由来のDNAフラグメントと
等価のDNA鎖。 (3) ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
DNAのBgl消化フラグメントとpIJ702プラ
スミドDNAのBgl消化フラグメントとから
なる、第４図に示した制限酵素切断サイトを有
する分子量10.5kbのハイブリツドプラスミド
pMSB1−２中の、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスDNA由来のDNAフラグメントと
等価のDNA鎖。 (4) ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
DNAのBgl消化フラグメントとpIJ702プラ
スミドDNAのBgl消化フラグメントとから
なる、第５図に示した制限酵素切断サイトを有
する分子量6.65kbのハイブリツドプラスミド
pMSB1−６中の、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスDNA由来のDNAフラグメントと
等価のDNA鎖。 (5) ストレプトミセス・ハイグロスコピカス
DNAのBgl消化フラグメントとPIJ702プラ
スミドDNAのBgl消化フラグメントとから
なる、第６図に示した制限酵素切断サイトを有
する分子量14.7kbのハイブリツドプラスミド
pMSB3−１中の、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカスDNA由来のDNAフラグメントと
等価のDNA鎖。 各ハイブリツドプラスミド中のストレプトミセ
ス・ハイグロスコピカスDNA由来のDNAフラグ
メントは、第１〜６図の各プラスミドのDNA鎖
の太い部分である。 効 果 ビアラホス生合成に関するDNA鎖を組換DNA
技術に利用することによつて、ビアラホス産生放
線菌の生産性向上に資することができる。 発明の具体的説明 本発明によるDNA鎖 定 義 本発明によるDNA鎖は、上記のように定義さ
れるものである。 本発明（特許請求の範囲を解釈する場合を含
む）において「DNA鎖」という用語は、非環状
のフラグメントとしての存在の外に、それを組込
んだ環状体、すなわちプラスミド、としての存在
を包含するものである。後者の場合の具体例は、
上記したようにpIJ702プラスミドまたはpHC79
コスミドとの組換体プラスミドである。また、ハ
イブリツドプラスミド中のストレプトミセス・ハ
イグロスコピカスDNA由来のDNAフラグメント
と等価のDNA鎖」ということは、該DNAフラグ
メントと同一の塩基配列のDNA鎖の外に、DNA
コードンの縮重により異なつた塩基配列を持つが
ジエノタイプにおいては同一であるDNA鎖をも
包含することを意味するものである。 なお、上記（および第１〜８図）において
BamH等が制限酵素を意味することはいうま
でもない。 DNA鎖の相互関係 第７図は、pMSB2−４、12−１および13−３
の各ハイブリツドプラスミド中のDNA鎖がビア
ラホス生合成遺伝子及び耐性遺伝子のどの部位に
相当するか、また相互関係はどのようであるか、
ならびに生合成ステツプがどの部位に存在する
か、を示したものである。 直線Ａは、ビアラホス生合成遺伝子を制限酵素
切断サイトと共に示すものである。直線Ｂ，
B′およびB″は、pMSB2−４、12−１および13−
１そのものではなくて、各プラスミド中の本発明
DNA鎖を示すものである。直線Ｃは生合成経路
のステツプａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈ
をコードする遺伝子のそれぞれの近似位置を示す
ものである。 ビアラホス／SF1293物質 化学的本体 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
SF1293菌（FERM BP−130、ATCC21705）の
産生する抗生物質がビアラホスあるいはSF1293
物質として公知であることは前記したところであ
る。 ビアラホスの分子式は、第８図に示した通りで
ある。 この明細書では、この抗生物質をビアラホスと
呼びあるいはSF1293物質と呼ぶこともあるが、
これらは同等のものとして理解するものとする。 生合成経路 ビアラホスの生合成経路は、第８図に示した通
りである（J.Antibioticに投稿中）。 この生合成経路において、ａ〜ｈは生合成の単
位ステツプであるが、各ステツプはそこに示され
ている出発物質から生成物質（たとえば、ステツ
プａについていえば、PEPとPnPY）への一段階
の反応を必ずしも意味するものではなく、多段階
の反応からなる場合をも包含するものとする。 なお、本発明に関連する微生物は必要な範囲に
おいて寄託されている（詳細は、後期の「関連微
生物の寄託」の項を参照されたい）。 ビアラホス生産遺伝子のクローニング クローニング ビアラホス生産遺伝子のクローニングに際して
は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
SF1293およびそれより誘導した変異株から常法
により、すなわちスミス等の方法（Methodin
Enzymology、12、545、（1967））によつて、ビ
アラホス生産遺伝子DNAを抽出・精製し、これ
をpIJ702プラスミド（John Innes研究所より入
手可能。J.General Mecrobiology、129、2703−
2714（1983））をベクターとするハイブリツドプラ
スミドによつてSF1293株の生合成欠損株（前記
生合成経路のステツプａ〜ｈの少なくとも一つを
コードする遺伝子が欠損しているもの）を形質転
換させて、該欠損株のビアラホス生産の回復の有
無を調べた。 すなわち、二種の異なるタイプの生合成欠損株
（ステツプａ欠損株NP−50およびステツプｆ欠
損株NP−52）をそれぞれ宿主として用い、
pIJ702をベクターとし、生産能を回復させる
DNA断片をシヨツトガンクローニングした。得
られたプラスミドpMSB2−４（9.15キロベース
（kb）、NP−50株を宿主として、寄託してある。
FERM Ｐ−7805）は、宿主株だけでなく、他の
生合成欠損株も巾広くビアラホスを生産回復させ
た。サブクローニングの結果、プラスミド
pMSB2−４には、生合成の初期反応に関与する
四種の遺伝子（ステツプａ、ｂ、ｃおよびｄに関
する遺伝子）が含まれ、pMSB12−１には、生合
成後半の四種の遺伝子（ステツプｅ、ｆ、ｇおよ
びｈに関する遺伝子）が含まれていることが判明
した（FERM Ｐ−7807）。さらに、エシエリキ
ア・コリLE392（FERM Ｐ−7477）を使つてスト
レプトマイセス・ハイグロスコピカスSF−1293
株のDNAのコスミドライブラリーを作り、これ
にpMSB2−４とpMSB12−１とプローブとして
それぞれハイブリダイズさせた。その結果、両プ
ローブとも同一のコスミドpMSB13−３にハイブ
リダイズした。ホスホエノールピルビン酸から十
数ステツプで生合成される除草活性物質ビアラホ
スの生合成遺伝子の大部分がpMSB13−３上にク
ローン化できたと考えられる。コスミドpMSB13
−３（41kb。）は、E.ColiLE392を宿主として寄託
してある（FERM Ｐ−7808）。 同様の実験を、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス369−1S株（FERM Ｐ−7809）を宿
主とし、プラスミドpMSB1−２（10.5kb。369−
1S株を宿主として寄託してある。FERM Ｐ−
7810）およびpMSB1−６（6.65kb。369−1S株を
宿主として寄託してある。FERM Ｐ−7811）を
用いて行つた。369−1S株は生合成欠損株ではな
いが、ビアラホス生産能の低い株であり、
pMSB1−２形質転換したことによつてビアラホ
ス生産性が向上した。一方、pMSB1−６で形質
転換した場合は生産株の力価抑制が認められた。 また、同様の実験を生合成欠損株NP−51
（FERM Ｐ−7812）についてプラスミドpMSB3
−１（14.7kb。NP51株を宿主として寄託してあ
る。FERM Ｐ−7813）を用いて行つた。NP51
株は生合成欠損株であるけれど生合成経路のどの
ステツプが欠損しているのかは不明であるが、形
質転換によつてNP51のビアラホス生産回復が認
められた。 上記の実験は、遺伝子組換えに慣用される常法
によつたものであり、その具体的な内容は後記実
験例に示した通りである。これらから、本発明の
実施は当業者にとつて可能であろう。 関連微生物の寄託 本発明に関連する微生物は、通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（微工研）に下記の通
りに寄託されている。
【表】
【表】 実験例 以下の実施例において使用したSF1293生合成
欠損株は、下記の欠損状態のものでなる。
【表】 実施例 １ （pMSB2−４の作成） ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF
−1293をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、
1.0％ペプトン、0.3％ミートエキストラクト、
0.05％K2HPO4、PH7.0）10mlに植菌し、28℃で24
−48時間培養し、これを種菌としてMYG培地に
５％植菌量で植えついだ。MYG培地は、１％モ
ルトエキス、0.4％イーストエキス、0.5％グルコ
ール、PH7.0（80ml）にグリシン２％を添加したも
のである。これを28℃で24時間振盪培養に付し、
10000×ｇ／10分間の遠心分離で集菌した。この
菌体からスミス等の公知の方法（Methods in
Enzymology12．545、（1967））で全DNAを抽出
精製し、TESCバツフアー（10ｍＭ Tris−HCl
PH8.0、１ｍＭ EDTA、2.5ｍＭ NaCl）で透
析して、供与体DNAとした。 この様にして得た供与体DNA10μｇを総量
200μlの20ｍＭ Tris−HCl PH量200μの20ｍ
Ｍ Tris−HCl PH7.4、50ｍＭ NaCl、10ｍＭ
MgCl2、10ｍＭ β−メルカプトエタノール組
成の反応液中で制限酵素BamH10単位を加え
て37℃で２時間反応させた。 プラスミドpIJ702DNA2μｇを総量40μの20
ｍＭ Tris−HCl PH7.4、10ｍＭ MgCl2、10
ｍＭ βメチルカプトエタノール組成の反応液中
で制限酵素Bgl２単位を加えて、37℃で２時間
反応させた。 これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させて
から、1/10量の500ｍＭ NaClを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスフアター
ゼ（c.i.a.p.）を10単位加えて、37℃で60分反応を
行つた。 供与体DNA及びプラスミドDNAの反応液のそ
れぞれにTESHバツフアー（0.2MTris−HCl
PH8.0、20ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
NaCl）が飽和したフエノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを
10000×ｇ／５分間の遠心分離後、上層（水層）
をパスツールピペツトで取り出した。 DNAを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フエノールを除去してから等量のエタ
ノールを加え、−80℃に２時間放置後、10000×
ｇ／５分間の遠心分離でDNAを沈殿させた。 この様にして得たDNAを500μのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、50μの加熱
滅菌した純水に溶解した。このDNAを70℃で10
分間加熱処理し、ついで室温まで除冷し、バツフ
アー（0.66M Tris−HClPH7.6、66ｍＭ MgCl2、
0.1Mジチオスレイトール、10ｍＭ ATP）5μ
とT4リガーゼ5μ（１単位）とを加えて22℃で
２時間反応させて、pIJ702とストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスDNAとの組み換え体
DNAを調製した。 このDNAによる宿主菌ストレプトマイセス・
ハイグロスコピカスNP50の形質転換は放線菌に
通常用いられるプロトプラストPEG法（例えば
Curr.Topics Microbiol.Immunol、96、69
（1981）等に示される）により行なつた。 すなわち、80mlのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン0.4％、イーストエキストラクト0.4％、
MgSO4・7H2O0.05％、KH2PO40.2％、
K2HPO40.4％、グリシン５％）にストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカスNP50を接種して、
28℃で18時間振盪培養を行ない、10000×ｇの遠
心分離で菌糸を集めて、0.5M蔗糖 溶液で１回
洗浄したのち、10mlのPs培地（NaCl70ｍＭ、蔗
糖0.5M、MgCl2・５ｍＭ、CaCl25ｍＭ、25ｍＭ
TESPH7.2）に懸濁させた。次いで、最終濃度
１mg／mlになる様に卵白リゾチームと0.5mg／ml
になる様にアクロモペプチダーゼとを加え、37℃
に60分間保温してプロトプラストを形成させ、プ
ロトプラスト化しなかつた菌糸は綿過で除去し
た。800×ｇ／10分間の遠心分離によつてプロト
プラストを集め、Ps培地で１回洗浄後、２mlの
Ps培地に懸濁させたプロトプラスト液100μ、
３／２濃度に調整したＰ−マレイン酸バツフアー
（2.5％蔗糖、1.4ｍＭ K2SO4、１／500量微量元
素溶液、100ｍＭ CaCl2、50ml Tris−マレイ
ン酸PH8.0）100μ、組み込えDNA溶液50μ及
び375μのポリエチレングリコール溶液（ポリ
エチレングリコール#1000 33％／Ｐ−マレイン
酸バツフアー）を混合し、１分間室温放置後、
Ps培地５mlで稀釈し、800×ｇ／10分間の遠心分
離でプロトプラストを集め、２mlのPs培地に懸
濁させた。このプロトプラスト液を0.1mlずつ20
枚の直径90cm円形プラスチツク製ペトリ皿に調製
したRH寒天培地（１リツトル中、蔗糖171ｇ、
KCl14.9ｇ、グルコース10ｇ、微量元素溶液２
ml、K2SO42.5％10ml、プロリン３ｇ、カザミノ
酸0.5ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストラン0.05
ｇ、0.5％KH2PO410ml、1M CaCl2・2H2O 50
ml、0.25M TES（PH7.2）100ml、CSC30ｇ／1000
ml100ml、５％アスパラギン酸10ml）にそれぞれ
塗布した後、RH培地の寒天濃度が0.5％のものを
そ上層に２ml重層した。これと、28℃で18時間培
養後同じRH（ソフトアガー0.5％）にチオストレ
プトンを20μｇ／mlになる様に加えたものをさら
に２ml重層した。これを、10〜20日間、90％に湿
度を保持したチヤンバー内で、28℃で培養をつづ
けた。プロトプラストから再生したRH寒天培地
上の菌を１％CAS、5μｇ／ml CuSO4・5H2Oお
よび0.5mg／mlチロシンを含むニユートリエント
アガー培地に、市販の針を用いて移した。これを
28℃で５日間培養に付した。その結果、メラニン
色素を産性するコロニーとメラニン色素を産性し
ないコロニーとがおよそ１：１の割合で生じた。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAはベクターpIJ702の生産にかかわるメラニ
ン遺伝子上のBglサイトに組み込まれるわけで
あるから、連結（ligation）時に外来のストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAを組込ん
だプラスミドが導入したクローンはメラニンを産
生しない。しかしストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカスDNAをBglサイトに組込まなかつ
たプラスミドはメラニン色素を産性する。従つ
て、メラニン色素を産生できないコロニーは導入
されたプラスミド上にストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカスのDNAを組込んでいることが判
定できるわけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを
市販のつまようじを用いて以下に示す組成のアガ
ーピース上にレプリカした。アガーピースとは
0.4％グルコース、0.35％ホイート・ジヤーム、
0.23％SVP（ソルブル・ベジタブル・プロテイン）
0.03％KH2PO4、0.0001％ CoCl2・6H2O、２％
アガー、PH7.0からなるものを直径７〜８mm、高
さ４〜５mmの円柱となる様コルクボーラでうちぬ
いたものである。 このアガーピースを28℃／６日間の培養に付し
た。これをProteus sp.MB−838を検定菌とし
て、32℃で阻止円を作るアガーピースがあるか否
かを調べた。その結果、ホワイト・コロニー2500
個のうち５株の生産回復コロニーを得た。 得られた５株のチオストレプトン耐性でしかも
ビアラホス生産能の回復したストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスを前述と同様のシード培
養を行なつたものから各々80mlのMYG培地（グ
リシン２％添加）に接種し、28℃で24時間振盪し
た培養菌体から、ハンセン等による公知の方法
（J.Bacteriol.135、227（1978）でプラスミドを抽
出した。これらのプラスミドによつて、再びスト
レプトマイセス・ハイグロスコピカスNP50及び
同じ生合成経路の欠損変異株であるストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカスNP47を形質転換さ
せた場合、いずれもビアラホスの生産性を回復で
きた。 これらの菌株がビアラホスを産生しているか否
かについては、文献「明治製菓研究年報No.21、44
〜51（1982）」に示される方法で分析を行なつた。
つまり、各々の菌株培養液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生され
る抗菌物質をクロマトグラフ的にビアラホスであ
ると同定できた。 また、この５株から得たプラスミドpMSB2−
３、２−４、２−５、２−７および２−８を制限
酵素BamHで切断し、１％アガロース電気泳
動により調べたところ、いずれも共通に1.32kbの
BamH断片を含んでいた。また、最小DNA断
片がコードされるプラスミドはpMSB2−７であ
るので、ビアラホス生合成のステツプａの反応を
行なう酵素遺伝子は1.32kbのBamHフラグメ
ントの中にコードされる。 このうち、一番挿入断片の大きい第１図に示
す、プラスミドpMSB2−４に他の遺伝子がコー
ドされていないかどうか調べるために、pMSB2
−４をビアラホス生合成欠損株NP33、NP46お
よびNP221株に導入したところ、いずれの欠損
株の生産性をも回復させることができた。 この事実は、pMSB2−４にはビアラホス生合
成に関与するステツプａ−ｄの酵素遺伝子がコー
ドされていることを示すものである。 実施例 ２ （pMSB12−１の作成） ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF
−1293をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、
1.0％ペプトン、0.3％ミートエキストラクト、
0.05％K2HPO4、PH7.0）10mlに植菌し、28℃で24
−48時間培養し、これを種菌としてMYG培地に
５％植菌量で植えついだ。MYG培地は、１％モ
ルトエキス、0.4％イーストエキス、0.5％グルコ
ース、PH7.0（80ml）にグリシン２％を添加したも
のである。これを28℃で24時間振盪培養に付し、
10000×ｇ／10分間の遠心分離で集菌した。この
菌体からスミス等の公知の方法（Methods in
Enzymology12．545、（1967））で全DNAを抽出
精製し、TESCバツフアー（100ｍＭ Tris−
HClPH8.0、１ｍＭ EDTA、2.5ｍＭ NaCl）で
透析して、供与体DNAとした。 この様にして得た供与体DNA10μｇを総量
200μの20ｍＭ Tris−HCl PH7.4、50ｍＭ
NaCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ β−メルカプ
トエタノール組成の反応液中で制限酵素Sst10
単位を加えて37℃で２時間反応させた。 プラスミドpIJ702DNA2μｇを総量40μの20
ｍＭ Tris−HCl PH7.4、10ｍＭ MgCl2、10
ｍＭ βメルカプトエタノール組成の反応液中で
制限酵素Sst２単位を加えて、37℃で２時間反
応させた。 これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させて
から、1/10量の500ｍＭ NaClを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスフアター
ゼ（c.i.a.p.）を10単位加えて、37℃で60分反応を
行つた。 供与体DNA及びプラスミドDNAの反応液のそ
れぞにTESHバツフアー（0.2MTris−HCl PH
8.0、20ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
NaCl）が飽和したフエノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを
10000×ｇ／５分間の遠心分離後、上層（水層）
をパスツールピペツトで取り出した。 DNAを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フエノールを除去してから等量のエタ
ノールを加え、−80℃に２時間放置後、10000×
ｇ／５分間の遠心分離でDNAを沈殿させた。 この様にして得たDNAを500μのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、50μ加熱滅
菌した純水に溶解した。このDNAを70℃で10分
間加熱処理し、ついで室温まで除冷し、バツフア
ー（0.66M Tris−HCl PHを7.6、66ｍＭ
MgCl2、0.1Mジチオスレイトール、10ｍＭ
ATP）5μとT4リガーゼ5μ（１単位）とを加
えて22℃で２時間反応させて、pIJ702とストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAとの組み
換え体DNAを調製した。 このDNAによる宿主菌ストレプトマイセス・
ハイグロスコピカスNP52の形質転換は放線菌に
通常用いられるプロトプラストPEG法（例えば
Curr.Topics Microbiol.Immunol、96、69
（1981）等に示される）により行なつた。 すなわち、80mlのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン0.4％、イーストエキストラクト0.4％、
MgSO4・7H2O0.05％、KH2PO40.2％、
K2HPO40.4％、グリシン５％）にストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカスNP52を接種して、
28℃で18時間振盪培養を行ない、10000×ｇの遠
心分離で菌糸を集めて、0.5M蔗糖溶液で１回洗
浄したのち、10mlのPs培地（NaCl70ｍＭ、蔗糖
0.5M、MgCl2・５ｍＭ、CaCl25ｍＭ、25ｍＭ
TESPH7.2）に懸濁させた。次いで、最終濃度１
mg／mlになる様に卵白リゾチームと0.5mg／mlに
なる様にアクロモペプチダーゼとを加え、37℃に
60分間保温してプロトプラストを形成させ、プロ
トプラスト化しなかつた菌糸は綿過で除去し
た。800×ｇ／10分間の遠心分離によつてプロト
プラストを集め、Ps培地で１回洗浄後、２mlの
Ps培地に懸濁させたプロトプラスト液100μ、
３／２濃度に調整したＰ−マレイン酸バツフアー
（2.5％蔗糖、1.4ｍＭ K2SO4、１／500量微量元
素溶液、100ｍＭ CaCl2、50ml、Tris−マレイ
ン酸PH8.0）100μ、組み換えDNA溶液50μ及
び375μのポリエチレングリコール溶液（ポリ
エチレングリコール#1000 33％／Ｐ−マレイン
酸バツフアー）を混合し、１分間室温放置後、
Ps培地５mlで稀釈し、800×ｇ／10分間の遠心分
離でプロトプラストを集め、２mlのPs培地に懸
濁させた。このプロトプラスト液を0.1mlずつ20
枚の直径90cm円形プラスチツク製ペトリ皿に調整
したRH寒天培地（１リツトル中、蔗糖171ｇ、
KCl14.9ｇ、グルコース10ｇ、微量元素溶液２
ml、K2SO42.5％ 10ml、プロリン３ｇ、カザミ
ノ酸0.5ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストラン
0.05ｇ、0.5％KH2PO410ml、1M CaCl2・2H2O
50ml、0.25M TES（PH7.2）100ml、CSC30ｇ／
1000ml100ml、５％アスパラギン酸10ml）にそれ
ぞれ塗布した後、RH培地の寒天濃度が0.5％のも
のをその上層に２ml重層した。これと、28℃で18
時間培養後同じRH（ソフトアガー0.5％）にチオ
ストレプトンを20μｇ／mlになる様に加えたもの
をさらに２ml重層した。これを、10〜20日間、90
％に湿度を保持したチヤンバー内で、28℃で培養
をつづけた。プロトプラストから再生したRH寒
天培地上の菌を１％CAS、5μｇ／ml CuSO4・
5H2Oおよび0.5mg／mlチロシンを含むニユートリ
エントアガー培地に、市販の針を用いて移した。
これを28℃で２日間培養に付した。その結果、メ
ラニン色素を産生するコロニーとメラニン色素を
産性しないコロニーとがおよそ１：１の割合で生
じた。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAはベクターpIJ702の生産にかかわるメラニ
ン遺伝子上のSstサイトに組み込まれるわけで
あるから、連結（ligation）時に外来のストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAを組込ん
だプラスミドが導入したクローンはメラニンを産
生しない。しかしストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカスDNAをSstサイトに組込まなかつた
プラスミドはメラニン色素を産性する。従つて、
メラニン色素を産生できないコロニーは導入され
たプラスミド上にストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカスのDNAを組込んでいることが判定で
きるわけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを
市販のつまようじを用いて以下に示す組成のアガ
ーピース上にレプリカした。アガーピースとは
0.4％グルコース、0.35％ホイート・ジヤーム、
0.23％SVP（ソルブル・ベジタブル・プロテイン）
0.03％ KH2PO4、0.0001％ CoCl2・6H2O、２
％アガー、PH7.0からなるものを直径７〜８mm、
高さ４〜５mmの円柱となる様コルクボーラでうち
ぬいたものである。 このアガーピースを28℃／６日間の培養に付し
た。これをProteus sp.MB−838を検定菌とし
て、32℃で阻止円を作るアガーピースがあるか否
かを調べた。その結果、ホワイト・コロニー1000
個のうち１株の生産回復コロニーを得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性でしかも
ビアラホス生産能の回復したストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスを前述と同様のシード培
養を行なつたものから各々80mlのMYG培地（グ
リシン２％添加）に接種し、28℃で24時間振盪し
た培養菌体から、ハンセン等による公知の方法
（J.Bacteriol.135、227（1978）で第２図に示すプ
ラスミドpMSB12−１を抽出した。これらのプラ
スミドによつて、再びストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカスNP52及び同じ生合成経路の欠損
変異株であるストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカスNP44を形質転換させた場合、いずれもビ
アラホスの生産性を回復できた。 これらの菌株がビアラホスを産生しているか否
かについては、文献「明治製菓研究年報No.21、44
〜51（1982）」に示される方法で分析を行なつた。
つまり、各々の菌株培養液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生され
る抗菌物質をクロマトグラフ的にビアラホスであ
ると同定できた。 また、この株から得たプラスミドを制限酵素
Sstで切断して１％アガロース電気泳動により
調べたところ（一般に行なわれる方法及び条件に
よる）、pIJ702のSstIサイトに9kbのストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカス由来のDNA断片が
含まれていた。 次にpMSB12−１にもNP52及びNP44の各生
合成欠損株の生産性を回復させる遺伝子以外にも
生合成の各ステツプに関与する遺伝子が含まれる
ことが推定されたので、他の生合成欠損株
NP213、NP8およびNP45にそれぞれpMSB12−
１を導入した。導入の方法は、前述の形質転換法
と同じである。その結果、トランスフオーマント
もビアラホスの生産能を回復することが明らかと
なつた。 次に、pMSB12−１をストレプトマイセス・リ
ビダンス66（昭和58年３月10日にFERM Ｐ−
6982として微工研に寄託されている。その菌学的
性質は、特願昭58−52277号明細書に記載されて
いる）に導入した。方法はCurr.Topics.
Microbiol.Immunol、96、69（1981）に示された
と同様の方法である。 pMSB2−１を導入されたストレプトマイセ
ス・リビダンス66の性質を調べるため、pMSB12
−１を含むS.リビダンス66と含まないS.リビダン
ス66とを各々R2YE培地にぬりつけて培養してス
ポアを形成させた。このスポアをあらかじめデイ
フコ社製地販ニユトリエントアガー培地にビアラ
ホスを1000μｇ／ml濃度になる様に調整した培地
にぬりつけて、37℃で３日間培養した。その結
果、pMSB12−１を含むS.リビダンスは生育した
が、野生株のS.リビダンスは生育できなかつた。
野生株は同様な条件で200μｇ／mlの培地では生
育できる。 このようにpMSB12−１を導入されたS.リビダ
ンスはpMSB12−１を含まない株に比較してビア
ラホスに対する耐性度が２倍から５倍以上に向上
していることが明らかになつた。この事実は、
pMSB12−１にはビアラホスに対する耐性遺伝子
が含まれることを示すもので、その位置は第７図
中のBamH−BamHにはさまれた領域であ
る。 この様に、pMSB12−１には下記の各遺伝子が
コードされるばかりでなく、ビアラホスに対する
耐性遺伝子もコードされていることがわかる。 NP52の生産能を回復させる遺伝子
（ステツプｆ） NP44の生産能を回復させる遺伝子
（ステツプｆ） NP8の生産能を回復させる遺伝子
（ステツプｆおよびｈ） NP45の生産能を回復させる遺伝子
（ステツプｇ） NP213の生産能を回復させる遺伝子
（ステツプｅ） 実施例 ３ （pMSB13−３の作成） ビアラホス生産菌ストレプトマイセス・ハイグ
ロスコピカスSF1293をＳ−１培地（ソルブル・
スターチ２％、ポリペプトン１％、ミート・エキ
ストラクト0.3％、K2HPO40.05％、PH7.0）10ml
に接種し、28℃／２日間の震盪培養を行ない、こ
のようにして得た前培養液４mlをMYG＋グリシ
ン培地（モルト・エキストラクト１％、イースト
エキストラクト0.4％、グルコース２％、グリシ
ン２％、PH7.0）80mlに接種して、28℃で一晩震
盪培養した。培養液を、10000×ｇ／10日間の遠
心分離に付して、集菌した。この菌体からスミス
等の公知の方法（M.G.Smith：Methods in
Enzymology、12、545（1967））で全DNAを抽出
精製し、TE緩衝液（10ｍＭ Tris HCl、PH8.0、
１ｍＭ EDTA）で透析して供与体DNAとし
た。 このようにして得た供与体DNA10mgに制限酵
素Sau3Aを２単位を加え、10ｍＭ Tris HCl、
PH7.2、10ｍＭジチオスレイトール、150ｍＭ
NaClの組成の緩衝液50μ中で10分間反応させ
た。反応液にTE緩衝液で飽和したフエノール
50μを加えて１分間震盪した後、10000×ｇ／
５分間の遠心分離を行ない、上層をパスツールピ
ペツトで取り出した。DNAを含むこの水層をエ
チルエーテルで２回抽出し、フエノールを除去し
てから10000×ｇ／５分間の遠心分離を行なつて、
DNAを沈澱物として回収した。回収したDNAを
エタノール500μで１回洗滌し、減圧下で乾燥
させてから、20μの加熱滅菌した純水に溶解し
て、供与体DNAとした。 一方、コスミツドベクターPHC79（Barbra
Hohn et al：Gene、11、291−298（1980）。市販
品）2μｇを10ｍＭ Tris HCl、PH7.2、10ｍＭジ
チオスレイトール、100ｍＭ NaClの組成の緩衝
液20μで制限酵素BamH４単位と37℃で２時
間反応させた。さらに75℃で10分間加熱した後、
市販の大腸菌由来のアルカリホスフアターゼ１単
位を加えて50℃で１時間反応させ、その後フエノ
ール処理、エタノール沈澱およびエタノール洗滌
してから、ベクターDNAとして10μの減菌水
に溶解した。 前記供与体DNA20μと上記ベクター
DNA10μとを混合し、70℃で10分間加熱処理
し、室温まで徐冷した後、緩衝液（0.66M Tris
HCl、PH10ｍＭ ATP）4μとT4DNAリガー
ゼ2μとを加えて22℃で14時間反応させて、PH
C79とストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAとの組換体DNAを作成した。 この組換体DNAで大腸菌LE392を形質転換す
る方法は、ホーン等の公知の方法によつた
（Methods in Enaymology、68、299−309
（1979））。すなわち、先に調製したpHC79とスト
レプトマイセス・ハイグロスコピカスDNAとの
組換体DNA36μにエタノール10μを加え、−
80℃で２時間放置後、10000×ｇ／５分間の遠心
分離を行なつて、組換体DNAを沈澱物として回
収する。これに加熱滅菌水20μを加えて溶解
し、この溶液10μをホーン等の方法により調製
されて市販されている試験管内フアージ粒子形成
溶液50μに加えて37℃で１時間反応させて、そ
の後10mg／μ DNase 、10ｍＭ Tris
HCl、PH7.4、10ｍＭ MgCl2、0.1M NaCl、
0.03％BSAの組成の緩衝液150μを加えて37℃
で10分間反応させる。次にこの溶液を10000×
ｇ／５分間の遠心分離に付して上清を取り、組換
体DNAをラムダフアージ粒子内に取り込ませる。 大腸菌Ｋ−12LE392への形質導入は、以下の様
にして行なつた。すなわち、LE392を0.1％マル
トースを含むＬ培地（１％ポリペプトン、0.5％
イーストエキス、0.5％NaCl）２mlに接種し、一
晩培養後、先の組換体を導入したフアージ粒子液
を加え、その後その0.1mlずつを1.5％寒天、50μ
ｇ／mlアンピシリンを含むＬ培地を入れたシヤー
レに塗布し、37℃で一晩培養してコロニーを形成
させ、組換体DNAをもつLE392をコロニーとし
て出現させた。このコロニーからのビアラホス生
合成遺伝子をもつ組換え体の選別は、公知のコロ
ニー交雑法（Grunstein、M.、Hogness、D.S.、
Proc.Natl.Acad.Sai（U.S.A.）72、3961−3965
（1975））により行なつた。その際のプローブとし
ては、32Pで識別したpMSB2−４及びpMSB12
−1DNAを使用し、ハイブリダイゼーシヨンは
Bibb等の条件により行なつた（Nature、284、
527−531（1980））。pMSB2−４及びpMSB12−１
両プローブに反応する組換え体DNAをもつコロ
ニーを選別して、第３図に示すpMSB13−３を取
得した。 実施例 ４ （pMSB1−２の作成） ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF
−1293をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、
1.0％ペプトン、0.3％ミートエキストラクト、
0.05％K2HPO4、PH7.0）10mlに植菌し、28℃で24
−48時間培養し、これを種菌としてMYG培地に
５％植菌量で植えついだ。MYG培地は、１％モ
ルトエキス、0.4％イーストエキス、0.5％グルコ
ース、PH7.0（80ml）にグリシン２％を添加したも
のである。これを28℃で24時間振盪培養に付し、
10000×ｇ／10分間の遠心分離で集菌した。この
菌体からスミス等の公知の方法（Methods in
Enzymology12．545、（1967））で全DNAを抽出
精製し、TESCバツフアー（10ｍＭ Tris−
HCl、PH8.0、１ｍＭ EDTA、2.5ｍＭ NaCL）
で透析して、供与体DNAとした。 この様にして得た供与体NDA10μｇを総量
200μの20ｍＭ Tris−HCl PH7.4、50ｍＭ
NaCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ β−メルカプ
トエタノール組成の反応液中で制限酵素Bgl10
単位を加えて37℃で２時間反応させた。 プラスミドpIJ702NDA2μｇを総量40μの20
ｍＭ Tris−HCl PH7.4、10ｍＭ MgCl2、10
ｍＭ βメルカプトエタノール組成の反応液中で
制限酵素Bgl２単位を加えて、37℃で２時間反
応させた。 これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させて
から、1/10量の500ｍＭ NaClを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスフアター
ゼ（c.i.a.p.）を10単位加えて、37℃で60分反応を
行つた。 供与体DNA及びプラスミドDNAの反応液のそ
れぞれにTESHバツフアー（0.2MTris−HCl
PH8.0、20ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
NaCl）が飽和したフエノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを
10000×ｇ／５分間の遠心分離後、上層（水層）
をパスツールピペツトで取り出した。 DNAを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フエノールを除去してから等量のエタ
ノールを加え、−80℃に２時間放置後、10000×
ｇ／５分間の遠心分離でDNAを沈殿させた。 この様にして得たDNAを500μのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、50μの加熱
滅菌した純水に溶解した。このDNAを70℃で10
分間加熱処理し、ついで室温まで除冷し、バツフ
アー（0.66M Tris−HCl PH7.6、66ｍＭ
MgCl2、0.1Mジチオスレイトール、10ｍＭ
ATP）5μとT4リガーゼ5μ（１単位）とを加
えて22℃で２時間反応させて、pIJ702とストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAとの組み
換え体DNAを調製した。 このDNAによる宿主菌ストレプトマイセス・
ハイグロスコピカス369−1S株の形質転換は放線
菌に通常用いられるプロトプラストPEG法（例
えばCurr.Topics Microbiol.Immunol、96、69
（1981）等に示される）により行なつた。 すなわち、80mlのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン0.4％、イーストエキストラクト0.4％、
MgSO4・7H2O0.05％、KH2PO40.2％、
K2HPO40.4％、グリシン５％）にストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカス369−1S株を接種し
て、28℃で18時間振盪培養を行ない、10000×ｇ
の遠心分離で菌糸を集めて、0.5M蔗糖 溶液で
１回洗浄したのち、10mlのPs培地（NaCl 70ｍ
Ｍ、蔗糖0.5M、MgCl2・５ｍＭ、CaCl25ｍＭ、
25ｍＭ TESPH7.2）に懸濁させた。次いで、最
終濃度１mg／mlになる様に卵白リゾチームと0.5
mg／mlになる様にアクロモペプチダーゼとを加
え、37℃に60分間保温してプロトプラストを形成
させ、プロトプラスト化しなかつた菌糸は綿過
で除去した。800×ｇ／10分間の遠心分離によつ
てプロトプラストを集め、Ps培地で１回洗浄後、
２mlのPs培地に懸濁させたプロトプラスト液
100μ、３／２濃度に調整したＰ−マレイン酸
バツフアー（2.5％蔗糖、1.4ｍＭ K2SO4、１／
500量微量元素溶液、100ｍＭ CaCl2、50ml
Tris−マレイン酸PH8.0）100μ、組み換えDNA
溶液50μ及び375μのポリエチレングリコール
溶液（ポリエチレングリコール#1000 33％／Ｐ
−マレイン酸バツフアー）を混合し、１分間室温
放置後、Ps培地５mlで稀釈し、800×ｇ／10分間
の遠心分離でプロトプラストを集め、２mlのPs
培地に懸濁させた。このプロトプラスト液を0.1
mlずつ20枚の直径90cm円形プラスチツク製ペトリ
皿に調整したRH寒天培地（１リツトル中、蔗糖
1711ｇ、KCl14.9ｇ、グルコース10ｇ、微量元素
溶液２ml、K2SO42.5％ 10ml、プロリン３ｇ、
カザミノ酸0.5ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキスト
ラン0.05ｇ、0.5％KH2PO410ml、1M CaCl2・
2H2O 50ml、0.25M TES（PH7.2）100ml、CSC30
ｇ／1000ml 100ml、５％アスパラギン酸10ml）
にそれぞれ塗布した後、RH培地の寒天濃度が0.5
％のものをその上層に２ml重層した。これと、28
℃で18時間培養後同じRH（ソフトアガー0.5％）
にチオストレプトンを20μｇ／mlになる様に加え
たものをさらに２ml重層した。これを、10〜20日
間、90％に湿度を保持したチヤンバー内で、28℃
で培養をつづけた。プロトプラストから再生した
RH寒天培地上の菌を１％CAS、5μｇ／ml
CuSO4・5H2Oおよび0.5mg／mlチロシンを含むニ
ユートリエントアガー培地に、市販の針を用いて
移した。これを28℃で２日間培養に付した。その
結果、メラニン色素を産性するコロニーとメラニ
ン色素を産性しないコロニーとがおよそ１：１の
割合で生じた。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAはベクターpIJ702の生産にかかわるメラニ
ン遺伝子上のBglサイトに組み込まれるわけで
あるから、連結（ligation）時に外来のストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAを組込ん
だプラスミドが導入したクローンはメラニンを産
生しない。しかしストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカスDNAをBglサイトに組込まなかつ
たプラスミドはメラニン色素を産性する。従つ
て、メラニン色素を産生できないコロニーは導入
されたプラスミド上にストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカスのDNAを組込んでいることが判
定できるわけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを
市販のつまようじを用いて以下に示す組成のアガ
ーピース上にレプリカした。アガーピースとは
0.4％グルコース、0.35％ホイート・ジヤーム、
0.23％SVP（ソルブル・ベジタブル・プロテイン）
0.03％ KH2PO4、0.0001％ CoCl2・6H2O、２
％アガー、PH7.0からなるものを直径７〜８mm、
高さ４〜５mmの円柱となる様コルクボーラでうち
ぬいたものである。 このアガーピースを28℃／６日間の培養に付し
た。これをProteus sp.MB−838を検定菌とし
て、32℃で阻止円を作らせ、阻止円の直径が最大
の大きさのコロニー１株を得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性のストレ
プトマイセス・ハイグロスコピカスを前述と同様
のシード培養を行なつたものから各々80mlの
MYG培地（グリシン２％添加）に接種し、28℃
で24時間振盪した培養菌体から、ハンセン等によ
る公知の方法（J.Bacteriol.135、227（1978）で第
４図に示すプラスミドpMSB1−２を抽出した。
これらのプラスミドによつて、369−1S株の形質
転換を行つたところ、pMSB1−２を含む株の生
産性が４〜５倍向上していた。 これらの菌株がビアラホスを産生しているか否
かについては、文献「明治製菓研究年報No.21、44
〜51（1982）」に示される方法で分析を行なつた。
つまり、各々の菌株培養液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生され
る抗菌物質をクロマトグラフ的にビアラホスであ
ると同定できた。 実施例 ５ （pMSB1−６の作成） ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF
−1293をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、
1.0％ペプトン、0.3％ミート エキストラクト、
0.05％K2HPO4、PH7.0）10mlに植菌し、28℃で24
−48時間培養し、これを種菌としてMYG培地に
５％植菌量で植えついだ。MYG培地は、１％モ
ルトエキス、0.4％イーストエキス、0.5％グルコ
ース、PH7.0（80ml）にグリシン２％を添加したも
のである。これを28℃で24時間振盪培養に付し、
10000×ｇ／10分間の遠心分離で集菌した。この
菌体からスミス等の公知の方法（Methods in
Enzymology12．545、（1967））で全DNAを抽出
精製し、TESCバツフアー（10ｍＭ Tris−HCl
PH8.0、１ｍＭ EDTA、2.5ｍＭ NaCl）で
透析して、供与体DNAとした。 この様にして得た供与体DNA10μｇを総量
200μの20ｍＭ Tris−HCl PH7.4、50ｍＭ
NaCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ β−メルカプ
トエタノール組成の反応液中で制限酵素Bgl10
単位を加えて37℃で２時間反応させた。 プラスミドpIJ702DNA2μｇを総量40μの20
ｍＭ Tris−HCl PH7.4、10ｍＭ MgCl2、10
ｍＭ βメルカプトエタノール組成の反応液中で
制限酵素Bgl２単位を加えて、37℃で２時間反
応させた。 これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させて
から、1/10量の500ｍＭ NaClを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスフアター
ゼ（c.i.a.p.）を10単位加えて、37℃で60分反応を
行つた。 供与体DNA及びプラスミドDNAの反応液のそ
れぞれにTESHバツフアー（0.2M Tris−HCl
PH8.0、20ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
NaCl）が飽和したフエノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを
10000×ｇ／５分間の遠心分離後、上層（水層）
をパスツールピペツトで取り出した。 DNAを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フエノールを除去してから等量のエタ
ノールを加え、−80℃に２時間放置後、10000×
ｇ／５分間の遠心分離でDNAを沈殿させた。 この様にして得たDNAを500μのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、50μの加熱
滅菌した純水に溶解した。このDNAを70℃で10
分間加熱処理し、ついで室温まで除冷し、バツフ
アー（0.66M Tris−HCl PH7.6、66ｍＭ
MgCl2、0.1Mジチオスレイトール、10ｍＭ
ATP）5μとT4リガーゼ5μ（１単位）とを加
えて22℃で２時間反応させて、pIJ702とストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAとの組み
換え体DNAを調製した。 このDNAによる宿主菌ストレプトマイセス・
ハイグロスコピカス369−1S株の形質転換は放線
菌に通常用いられるプロトプラストPEG法（例
えばCurr.Topics Microbiol.Immunol、96、69
（1981）等に示される）により行なつた。すなわ
ち、80mlのＳ培地（グルコース１％、ペプトン
0.4％、イーストエキストラクト0.4％、MgSO4・
7H2O0.05％、KH2PO40.2％、K2HPO40.4％、グ
リシン５％）にストレプトマイセス・ハイグロス
コピカス369−1S株を接種して、28℃で118時間
振盪培養を行ない、10000×ｇの遠心分離で菌糸
を集めて、0.5M蔗糖 溶液で１回洗浄したのち、
10mlのPs培地（NaCl70ｍＭ、蔗糖0.5M、
MgCl2・５ｍＭ、CaCl25ｍＭ、25ｍＭ TESPH
7.2）に懸濁させた。次いで、最終濃度１mg／ml
になる様に卵白リゾチームと0.5mg／mlになる様
にアクロモペプチダーゼとを加え、37℃に60分間
保温してプロトプラストを形成させ、プロトプラ
スト化しなかつた菌糸は綿過で除去した。 800×ｇ／10分間の遠心分離によつてプロトプ
ラストを集め、Ps培地で１回洗浄後、２mlのPs
培地に懸濁させたプロトプラスト液100μ、
３／２濃度に調整したＰ−マレイン酸バツフアー
（2.5％蔗糖、1.4ｍＭ K2SO4、１／500量微量元
素溶液、100ｍＭ CaCl2、50ml Tris−マレイ
ン酸PH8.0）100μ、組み換えDNA溶液50μ及
び375μのポリエチレングリコール溶液（ポリ
エチレングリコール#1000 33％／Ｐ−マレイン
酸バツフアー）を混合し、１分間室温放置後、
Ps培地５mlで稀釈し、800×ｇ／10分間の遠心分
離でプロトプラストを集め、２mlのPs培地に懸
濁させた。このプロトプラスト液を0.1mlずつ20
枚の直径90cm円形プラスチツク製ペトリ皿に調整
したRH寒天培地（１リツトル中、蔗糖171ｇ、
KCl14.9ｇ、グルコース10ｇ、微量元素溶液２
ml、K2SO42.5％ 10ml、プロリン３ｇ、カザミ
ノ酸0.5ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストラン
0.05ｇ、0.5％KH2PO410ml、1M CaCl2・2H2O
50ml、0.25M TES（PH7.2）100ml、CSC30ｇ／
1000ml 100ml、５％アスパラギン酸10ml）にそ
れぞれ塗布した後、RH培地の寒天濃度が0.5％の
ものをその上層に２ml重層した。これと、28℃で
18時間培養後同じRH（ソフトアガー0.5％）にチ
オストレプトンを20μｇ／mlになる様に加えたも
のをさらに２ml重層した。これを、10〜20日間、
90％に湿度を保持したチヤンバー内で、28℃で培
養をつづけた。プロトプラストから再生したRH
寒天培地上の菌を１％CAS、5μｇ／ml
CuSO4・5H2Oおよび0.5mg／mlチロシンを含むニ
ユートリエントアガー培地に、市販の針を用いて
移した。これを28℃で２日間培養に付した。その
結果、メラニン色素を産性するコロニーとメラニ
ン色素を産性しないコロニーとがおよそ１：１の
割合で生じた。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAはベクターpIJ702の生産にかかわるメラニ
ン遺伝子上のBglサイトに組み込まれるわけで
あるから、連結（ligation）時に外来のストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAを組込ん
だプラスミドが導入したクローンはメラニンを産
生しない。しかしストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカスDNAをBglサイトに組込まなかつ
たプラスミドはメラニン色素を産性する。従つ
て、メラニン色素を産生できないコロニーは導入
されたプラスミド上にストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカスのDNAを組込んでいることが判
定できるわけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを
市販のつまようじを用いて以下に示す組成のアガ
ーピース上にレプリカした。アガーピースとは
0.4％グルコース、0.35％ホイート・ジヤーム、
0.23％SVP（ソルブル・ベジタブル・プロテイン）
0.03％ KH2PO4、0.0001％ CoCl2・6H2O、２
％アガー、PH7.0からなるものを直径７〜８mm、
高さ４〜５mmの円柱となる様コルクボーラでうち
ぬいたものである。 このアガーピースを28℃／６日間の培養に付し
た。これをProteus sp.MB−838を検定菌とし
て、32℃で阻止円を作らせた。その結果、ホワイ
ト・コロニー700個のうち１株の非生産株を得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性でしかも
ビアラホス生産能をなくしたストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスを前述と同様のシード培
養を行なつたものから各々80mlのMYG培地（グ
リシン２％添加）に接種し、28℃で24時間振盪し
た培養菌体から、ハンセン等による公知の方法
（J.Bacteriol.135、227（1978）でプラスミド
pMSB1−６を抽出した。これらのプラスミドに
よつて、再びストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカス369−1S及び460−２株等のビアラホス生
産株を形質転換させた場合、いずれもビアラホス
をごく微量しかつくらなくなつていた。 実施例 ６ （pMSB3−１の作成） ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF
−1293をＳ−１培地（２％ソルブルスターチ、
1.0％ペプトン、0.3％ミート エキストラクト、
0.05％K2HPO4、PH7.0）10mlに植菌し、28℃で24
−48時間培養し、これを種菌としてMYG培地に
５％植菌量で植えついだ。MYG培地は、１％モ
ルトエキス、0.4％イーストエキス、0.5％グルコ
ース、PH7.0（80ml）にグリシン２％を添加したも
のである。これを28℃で24時間振盪培養に付し、
10000×ｇ／10分間の遠心分離で集菌した。この
菌体からスミス等の公知の方法（Methods in
Enzymology12．545、（1967））で全DNAを抽出
精製し、TESCバツフアー（10ｍＭ Tris−HCl
PH8.0、１ｍＭ EDTA、2.5ｍＭ NaCl）で
透析して、供与体DNAとした。 この様にして得た供与体DNA10μｇを総量
200μの20ｍＭ Tris−HCl PH7.4、50ｍＭ
NaCl、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ β−メルカプトエタノール組成の反応液中で制限
酵素Bgl10単位を加えて37℃で２時間反応させ
た。 プラスミドpIJ702DNA2μｇを総量40μの20
ｍＭ Tris−HCl PH7.4、10ｍＭ MgCl2、10
ｍＭ βメルカプトエタノール組成の反応液中で
制限酵素Bgl２単位を加えて、37℃で２時間反
応させた。 これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させて
から、1/10量の500ｍＭ NaClを添加し、カー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスフアター
ゼ（c.i.a.p.）を10単位加えて、37℃で60分反応を
行つた。 供与体DNA及びプラスミドDNAの反応液のそ
れぞれにTESHバツフアー（0.2M Tris−HCl
PH8.0、20ｍＭジチオスレイトール、50ｍＭ
NaCl）が飽和したフエノール溶液を等量ずつ加
えて１分間振盪し、両方の液を合併した。これを
10000×ｇ／５分間の遠心分離後、上層（水層）
をパスツールピペツトで取り出した。 DNAを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フエノールを除去してから等量のエタ
ノールを加え、−80℃に２時間放置後、10000×
ｇ／５分間の遠心分離でDNAを沈殿させた。 この様にして得たDNAを500μのエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、50μの加熱
滅菌した純水に溶解した。このDNAを70℃で10
分間加熱処理し、ついで室温まで除冷し、バツフ
アー（0.66M Tris−HCl PH7.6、66ｍＭ
MgCl2、0.1Mジチオスレイトール、10ｍＭ
ATP）5μとT4リガーゼ5μ（１単位）とを加
えて22℃で２時間反応させて、pIJ702とストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAとの組み
換え体DNA調製した。 このDNAによる宿主菌ストレプトマイセス・
ハイグロスコピカスNP51の形質転換は放線菌に
通常用いられるプロトプラストPEG法（例えば
Curr.Topics Microbiol.Immunol、96、69
（1981）等に示される）により行なつた。 すなわち、80mlのＳ培地（グルコース１％、ペ
プトン0.4％、イーストエキストラクト0.4％、
MgSO4・7H2O0.05％、KH2PO40.2％、
K2HPO40.4％、グリシン５％）にストレプトマ
イセス・ハイグロスコピカスNP51を接種して、
28℃で18時間振盪培養を行ない、10000×ｇの遠
心分離で菌糸を集めて、0.5M蔗糖 溶液で１回
洗浄したのち、10mlのPs培地（NaCl70ｍＭ、蔗
糖0.5M、MgCl2・５ｍＭ、CaCl25ｍＭ、25ｍＭ
TESPH7.2）に懸濁させた。次いで、最終濃度
１mg／mlになる様に卵白リゾチームと0.5mg／ml
になる様にアクロモペプチダーゼとを加え、37℃
に60分間保温してプロトプラストを形成させ、プ
ロトプラスト化しなかつた菌糸は綿過で除去し
た。800×ｇ／10分間の遠心分離によつてプロト
プラストを集め、Ps培地で１回洗浄後、２mlの
Ps培地に懸濁させたプロトプラスト液100μ、
３／２濃度に調整したＰ−マレイン酸バツフアー
（2.5％蔗糖、1.4ｍＭ K2SO4、１／500量微量元
素溶液、100ｍＭ CaCl2、50ml Tris−マレイ
ン酸PH8.0）100μ、組み換えDNA溶液50μ及
び375μのポリエチレングリコール溶液（ポリ
エチレングリコール#1000 33％／Ｐ−マレイン
酸バツフアー）を混合し、１分間室温放置後、
Ps培地５mlで稀釈し、800×ｇ／10分間の遠心分
離でプロトプラストを集め、２mlのPs培地に懸
濁させた。このプロトプラスト液を0.1mlずつ20
枚の直径90cm円形プラスチツク製ペトリ皿に調整
したRH寒天培地（１リツトル中、蔗糖171ｇ、
KCl14.9ｇ、グルコース10ｇ、微量元素溶液２
ml、K2SO42.5％ 10ml、プロリン３ｇ、カザミ
ノ酸0.5ｇ、ポリペプトン２ｇ、デキストラン
0.05ｇ、0.5％KH2PO410ml、1M CaCl2・2H2O
50ml、0.25M TES（PH7.2）100ml、CSC30ｇ／
1000ml 100ml、５％アスパラギン酸10ml）にそ
れぞれ塗布した後、RH培地の寒天濃度が0.5％の
ものをその上層に２ml重層した。これと、28℃で
18時間培養後同じRH（ソフトアガー0.5％）にチ
オストレプトンを20μｇ／mlになる様に加えたも
のをさらに２ml重層した。これを、10〜20日間、
90％に湿度を保持したチヤンバー内で、28℃で培
養をつづけた。プロトプラストから再生したRH
寒天培地上の菌を１％CAS、5μｇ／ml
CuSO4・5H2Oおよび0.5mg／mlチロシンを含むニ
ユートリエントアガー培地に、市販の針を用いて
移した。これを28℃で２日間培養に付した。その
結果、メラニン色素を産生するコロニーとメラニ
ン色素を産生しないコロニーとがおよそ１：１の
割合で生じた。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
DNAはベクターpIJ702の生産にかかわるメラニ
ン遺伝子上のBglサイトに組み込まれるわけで
あるから、連結（ligation）時に外来のストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカスDNAを組込ん
だプラスミドが導入したクローンはメラニンを産
生しない。ストレプトマイセス・ハイグロスコピ
カスDNAをBglサイトに組込まなかつたプラ
スミドはメラニン色素を産生する。従つて、メラ
ニン色素を産生できないコロニーは導入されたプ
ラスミド上にストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカスのDNAを組込んでいることが判定できる
わけである。 このうちメラニン色素を産生しないコロニーを
市販のつまようじを用いて以下に示す組成のアガ
ーピース上にレプリカした。アガーピースとは
0.4％グルコース、0.35％ホイート・ジヤーム、
0.23％SVP（ソルブル・ベジタブル・プロテイン）
0.03％ KH2PO4、0.0001％ CoCl2・6H2O、0.2
％アガー、PH7.0からなるものを直径７〜８mm、
高さ４〜５mmの円柱となる様コルクボーラでうち
ぬいたものである。 このアガーピースを28℃／６日間の培養に付し
た。これをProteus sp.MB−838を検定菌とし
て、32℃で阻止円を作るアガーピースがあるか否
かを調べた。その結果、ホワイト・コロニー1000
個のうち１株の生産回復コロニーを得た。 得られた１株のチオストレプトン耐性でしかも
ビアラホス生産能の回復したストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスを前述と同様のシード培
養を行なつたものから各々80mlのMYG培地（グ
リシン２％添加）に接種し、28℃で24時間振盪し
た培養菌体から、ハンセン等による公知の方法
（J.Bacteriol.135、227（1978）でプラスミドを抽
出した。こらのプラスミドによつて、再びストレ
プトマイセス・ハイグロスコピカスNP51を形質
転換させた場合、ビアラホスの生産生を回復でき
た。 これらの菌株がビアラホスを産生しているか否
かについては、文献「明治製菓研究年報No.21、44
〜51（1982）」に示される方法で分析を行なつた。
つまり、各々の菌株培養液をアミノ酸アナライ
ザーを用いて分析したところ、培地中に産生され
る抗菌物質をクロマトグラフ的にビアラホスであ
ると同定できた。
【図面の簡単な説明】
第１〜６図は、それぞれ、プラスミドpMSB2
−４、12−１、13−３、１−２、１−６および３
−１の制限酵素切断地図である。第７図は、プラ
スミドpMSB2−４、12−１および13−３に組込
まれているDNA鎖相互およびビアラホス生合成
遺伝子との間の相互関係を示す説明図である。第
８図は、ビアラホス生合成経路を示す説明図であ
る。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ビアラホス生合成経路の少なくとも一部をコ
    ードする遺伝子及びビアラホス耐性遺伝子を含む
    DNA鎖であつて、ストレプトミセス・ハイグロ
    スコピカスDNAのSu3AI消化フラグメントとコ
    スミドpHC79DNAのBamHI消化フラグメント
    とからなる下図に示した制限酵素切断サイトを有
    する分子量41Kbのハイブリツドプラスミド
    pMSB13−３を、BamHIまたはSau3AIで消化す
    ることによつて得ることができる、ストレプトミ
    セス・ハイグロスコピカスDNA由来のDNAフラ
    グメント。
JP59181151A 1984-08-30 1984-08-30 ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 Granted JPS6158589A (ja)

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DE8585110856T DE3584596D1 (de) 1984-08-30 1985-08-28 Bialaphos produzierendes gen.
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Publication number Publication date
EP0173327A3 (en) 1987-12-16
JPS6158589A (ja) 1986-03-25
EP0173327A2 (en) 1986-03-05
DE3584596D1 (de) 1991-12-12
EP0173327B1 (en) 1991-11-06

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