JPS62122585A - 宿主・ベクタ−系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プラスミドｐＩＪ　７０２　（Ｋａｔｇ　ｅｔ　ａｌ、
、７．Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１２９．２７０３　（１９８３
））は人工的に構築されたプラスミドであり、チロシナ
ーゼ遺伝子（メラニン産生能ンを含有している。

本発明者はプラスミドｐＩＪ７０２を用いた芙験中、本
プラスミドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ない
放線菌が存在することを見出した。このような放線菌は
変異処理したもの。

或いは変異処理しないものにも見出された。ここで変異
処理とは、放線菌の本来布する固有の１ラスミドを除去
処理することを意味する。

本発明はプラスミドＩ）１．７７０２の有するチロシナ
ーゼ遺伝子を発現し得ないか、または発現してもその程
度の弱い変異処理した。または変異処理しない放線菌宿
主、咳放線菌宿主に該チロシナーゼ遺伝子の発現を誘発
せしめる放線菌由来ＤｌｉＡ断片を組み込んだ組み換え
プラスミドおよび核組み換えプラスミドで形質転換した
放線菌宿主・ベクター系に関する。

さらに詳しくは■プラスミドベクター　０２を導入して
も該プラスミドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得
ないか、または発現してもその程度の弱い変異処理した
。または変異処理しない放線菌宿主において、各種放線
菌由来ＭＡの制限酵素ｓｐｈ　ｌによる切断断片をプラ
スミドＥＩＩＪ　７０２のＳｐｈ　Ｉ切断部位に挿入し
て成る組・み換えプラスミドを該放線菌宿主に含有せし
め、■該放線菌宿主においてチロシナーゼ遺伝子を発現
した形質転換株を得、■該形質転換株からチロシナーゼ
遺伝子を発現しうる種々の改良組み換えプラスミドベク
ターを採取する。これら改良組み換えプラスミドを含有
した放線菌宿主はチロシナーゼ遺伝子を発現し、メラニ
ン様色素を産生ずるようになる。

従って本発明は、上記のようにメラニン様色素を産生ず
るようになった宿主・ベクター系＃ζ鬼 おいて該チロシナーゼ遺伝子断片の特定制限酵素部位（
Ｂｇｌ　１１．　　ｓａｃ　Ｉ　）に外来性ＤＮＡを挿
入した試料をもって、該放線菌宿主を形質転換すると、
あらたに外来性ＤＮＡが挿入された組み換えプラスミド
を含有する形質転換株は挿入失活によりメラニン非産生
となり、このメラニン非産生を指標に外来性ＤＮＡをク
ローニングし得るという放線菌宿主・ベクター系にも利
用しつる。

また、もともとｐＩＪ７０２のチロシナーゼ遺伝子を発
現し得る放線菌に１本発明で得られた１プロモーターの
結合したチロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片１を挿入し
たプラス′ミドを導入した場合には、メラニン色素産生
能が増強されるとともに、該プラスミドに結合した外来
遺伝子の発ｉ＋ｂ、本プロモーターの作用により増強さ
れることが期待される。

本発明は本来のプラスミドル工、１ｒ７０２（外来性Ｄ
ＩＪＡ断片の挿入されていないプラスミドｐＩＪ１０２
ンの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ない放ｆ８１
ｍ宿主において、どのようにして該チロシナーゼの発現
を誘発させ、宿主・ベクター化するかという問題を解決
している点で利用価値が高い。

微生物を用いるＤＮＡ組み換え実験は特に大腸菌を中心
として枯草菌、酵母において発展してきた。なかでも大
腸菌のＤＮＡ組み換え実験の発展はめざましく１種々の
遺伝子の解析のみならずある種の有用ペプチドの工業生
産にまで応用されるに至っている。一方、放線菌は抗生
物質や生理活性物質などの二次代謝産物の生産に関して
多種多様な能力を有することから、醗酵工業の分野では
古くから重要視されてきている。

にもかかわらず放線菌の育種の手法は限られており、こ
の限られた手法の中で生産性向上などに成果をあげてき
た。このような状況のもとで放線菌の育種改良研究の１
つの手法として。

ＤＮＡ組み換え実験系の確立が望まれ、その手法を用い
ての生産性向上や新規物質の生産が期待されるようにな
ってきた。現在、放線菌の特定菌種（３，ｃｏｅｌｉｃ
ｏｌｏｒ　Ａ　（３１２、Ｓ、１ｉｖｉｄａｎａなど〕
では宿主・ベクター系が確立されね々の放線菌遺伝子が
クローニングされている。しかし、放線菌は多種多様な
能力を有するとはいえ、抗生物質や生理活性物質の生産
能力は、すべての放線菌が基本的に有しているものでは
なく、また特定の菌種が基本構造の異なる多種多様な物
質を生産する能力を有しているわけではないことから、
放線菌のＤＮＡ組み換え実験系では、目的とする生産物
の生産菌ごとに宿主・ベクター系を確立していかなけれ
ばならないと考えられている。

本発明に係る放線菌の変異株ストレプトミセス・ジュー
モンジネンシス［：１ｇ］−８・ＳＡＮＫ６１１ｇ５株
（以下、［１６］−８８ＡＮＫ　　６１１８５株という
）を用いた宿主・ベクター系は１例えば本来生産するセ
ファマイシンＣの生合成で律速となっている酵素をコー
ドする遺伝子をｐ工Ｊ７０２改良組み換えプラスミドに
組み込み宿主に導入しその生産性向上をはかる。または
ある変換酵素をコードする遺伝子をｐ工Ｊ７０２改良組
み換えプラスミドに組み込み宿主に導入し目的物質の変
換体を生産させるのに有用である。

また、異種生物由来の有用ペプチドをコードする遺伝子
をｐ工Ｊ７０２改良組み換えプラスミドに組み込み宿主
（１６１−８・５ＡＮＫ　　６１１８５株に導入するこ
とにより、そのペプチドを生産させるのに有用であり、
加えて放線菌のもつ蚤自分泌系によってこのペプチドが
培地中に分泌される可能性も大きい。

本発明において使用された放線菌の親株はセファマイシ
ンＣおよびクラバラン酸の生産放線菌ストレフトミセス
・ジューモンジネンシス５ＡＮＫ６６１６５株（工業技
術院微生物工業研究所寄託番号１５４５号）である。該
菌株はそれ自身、既に分子量の近似したプラスミドｐｓ
ｙ　ｔおよびプラスミドｐｓＪ　２の２つのプラスミド
を本来保持している。従って、該菌株をＤＮＡ組み換え
実験の宿主として用いる場合、これらのプラスミドの存
在は、のちにベクターとして導入するプラスミドの再分
離やこれを用いた遺伝子解析に不利である。そこで、該
５ＡＮＫ　８６１６５株をアクリフラビンで変異処理し
、さらにプロトプラスト再生することにより、プラスミ
ドｐｓＪ１およびプラスミドｐｓ、Ｔ　２の２つのプラ
スミドの脱落した変異株［１Ｂ］−８拳５ＡＮＫ　　６
１１８５株を得た。

本変異株（１Ｂ）−８・５ＡＮＫ　６１１８５株の形態
的諸性質及び生理的諸性質等は次の通りである。

なお各種寒天培地の調製１種培養１本培養及び結果の観
察等は工ＳＦ基準、応用微生物工業審査基準、ワックス
マンの勧告などに従った。各種培地上の生育色調は「色
の標準」（日本色彩研究所板］に従った。

１）形態学的％徴 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉ
ｓ　（１６：ｌ−８＠Ｓ　ＡＮＫ６１１８５株を２８℃
で１４日培養した場合、基生菌糸は一般に良く分岐し直
線もしくは曲線状に伸長する。しかしながら基生菌糸の
−Ｚｉｇ　−Ｚａｇ一様伸長や断裂（フラグメンテイシ
ョンノは観察されない。供試したいかなる寒天、液体培
養基上においても、気菌糸の形成は認められない。又、
集束菌糸（コレミア〕もしくは集束菌糸様の形態を示す
ものや胞子のう、菌核などの特殊器官も認められない。

２）培地上の諸性質 ｌ＠１表　各種平板培地上での性質（２８℃、１４日間
培養）イースト・麦芽寒天　Ｇ：非常に良好、隆起ない
ししわ状、薄黄（工８Ｐ　２）　　　　　　抹茶 へＭ：形成せず Ｒ：薄黄抹茶 ｓＰ二産生ぜず オートミール寒天　Ｇ：余り良くない、平坦、薄黄味橙
（ＩＭＰ　　３）　　　ＡＭ：形成せずＲ：薄黄味橙 ８Ｐ：：ｉｔ生せず 澱粉無機垣葺天　　Ｇ：非常に良好、しわ状、薄黄抹茶
（工ＳＦ　　４）　　ＡＭ：形成せず Ｒ：薄黄抹茶 ＳＰ＝腫生ぜず グリセリン・アス　　Ｇ；余り良くない、平坦、薄黄味
橙パラギン寒天　　　ＡＭ：形成せず （工ＳＰ　５）　　　Ｒ：薄黄味橙 ＳＰ：産生せず ペプトン・イース　　Ｇ：良好、平坦ないししわ状、薄
茶トエキス・鉄寒天　ＡＭ；形成せず （工ＳＰ　　６ン　　　Ｒ：薄黄抹茶 ＳＰ：産生せず チロシン寒天　　　Ｇ：良好、平坦、薄茶（ＩＭＰ　　
７）　　　　ＡＭ：形成せずＲ：薄黄抹茶 ＳＰ：産生せず シュクロース・　　　Ｇ：余り良くない、平坦、薄茶硝
酸塩寒天　　　ＡＭ：形成せす Ｒ：薄茶 ＳＰ：産生せず グルコースφアス　　Ｇ：余り良くない、平坦、博黄抹
茶パラギン寒天　　　ＡＭ：形成せず Ｒ：博黄体茶 ＳＰ二産生せず 栄養寒天　　　　　Ｇ：余り良くない、平坦、薄茶（Ｄ
ｉｒａｏ　）　　　Ａ　Ｍ　：形成せずＲ：薄黄抹茶 ＳＰ：産生せず ポテト　エキス・　　Ｇ：良好、平坦、＃茶人参エキス
寒天　ＡＭ：形成せず Ｒ：薄茶 ＢＰ＝産生ぜず 水球天　　　　　　Ｇ：余り良くない、平坦、薄黄味橙
ＡＭ：形成せず Ｒ：薄黄味橙 ＳＰ：産生せず Ｇ：饋、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ｓｐ：可鋳性色素３
）生理的性質 第２表　生理的性質 澱粉の氷解　　　　　　　　陽　性 ゼラチンの液化　　　　　　陽　性 硝酸塩の還元　　　　　　　隘　性 ミルクの凝固　　　　　　　陰　性 ミルクのペプトン化　　　　陽性 生育温度範囲（培地１）　　１０〜３２゜生育適正温度
（培地１）　　２５〜３０゜食塩耐性（培地１）　　　
　〉３％〜く５％基質の分解性 カゼイン　　　　　　　陽　注 チロシン　　　　　　　陽　性 キサンチン　　　　　　陰　性 メラニン様色累生＃注 培地　２　　　　　　　陰　注 培地　３　　　　　　　函　注 培地　４　　　　　　　陰　性 培地１　：イースト・麦芽寒天（ＸＢＰ　２）培地２　
ニドリブトン・イーストエキスブロス（工ＳＰ　１）培
地３：ペプトン・イーストエキス・鉄陣天（工ＳＰ　６
）培地４：チロシン寒天（工ＳＰ７） ４）炭素源の資化性 第３表　炭素源の資化性 （プリドハム・ゴトリーブ寒天（ＩＳＰ　９）培地を基
礎培地とし１表中の炭素源を１％加えた培地上に接種し
、２８℃、１４日間培養した。〕 丑；強く資化する。＋；資化する。±；弱く資化する。

−；資化しない ５ノ細胞化学的性状 細胞壁の主要構成物質としてＬＬ−ＤＡＰ　　およびグ
リシンを検出したが、ｍｅｓｏ−，３−０Ｈ−ＤＡＰ　
ｉｔいずれも認められなかった。このことは本菌株のａ
胞壁が■型であることを示す。

上述の如く５本変異株（１６，ｌ−８−８ＡＮＫ６１１
８５株は親株５ＡＮＫ　　６６１６５株に比べ気中菌糸
の着生能が著しく悪い点を除きほぼ同一の微生物学的諸
性状を示した。本変異株［：１Ｇ］−８・５ＡＮＫであ
る。変異株（１６：ｌ−８・５ＡＮＫ　６１１８５株の
宿主としての条件を検討した結果１本株は親株に比ベブ
ラスミドｐ工Ｊ７０２による形質転換株（チオストレプ
トン耐性株）の出現頻度が向上していることが判り、加
えて変異株（１６１−８・５ＡＮＫ　６１８５株のｐＩ
Ｊ７０２による形質転換株はメラニン様色素の産生がま
ったく観察されなかった。一般に本来のプラスミドｐＩ
Ｊ７０２はその分子内にチオストレプトン耐性遺伝子（
ｔｓｒ　ｇｅｎｅ）とチロシナーゼ遺伝子（ｍｌ！Ｌ’
＝ｇｅｎりを保持しているため、形質転換によってチオ
ストレプトン耐性とメラニン様色素産性という２つの形
質を放線菌宿主に付与するという特徴がある。そして１
％にチロシナーゼ遺伝子内にはＥｌａＱ　１（＝８８ｔ
　Ｉ）、　Ｂｇｌ　ｌ［および９ｐｈ　ｌの３種の制限
酵素による挿入失活部位を有し、これらの部位を用いて
、メラニン様色素非産生を指標とすることにより、外来
性ＤＮＡ断片を有する組み換えプラスミドを含有する株
を容易に選択できるという長所をもつ有用なりローニン
グベクターである。本プラスミドｐ工Ｊ７０２はスト親
株５ＡＮＫ　６６１６５株においてもプラスミドｐＩＪ
　７０２によって形質転換を行なうと形質転換株出現頻
度はかなり低いもののチオストレプトン耐性（我国では
、チオストレプトンが入手しにくい結果、変差耐性のあ
る同類の抗生物質チオベプチンを用いて形質転換株の検
出を行なっているので、以後チオペプチン耐注と表示す
る。）およびメラニン様色素産生を示す形質転換株が得
られる。しかし、変異株（１６３−８・５ＡＮＫ　６１
１８５株を宿主とした場合、形質転換株出現頻度は親株
に比べ約１００倍向上していたが得られた形質転換株は
前述の如くチオペプチン耐性のみを示しメラニン様色素
の産生はまったく示さなかった。そこで（１６）−８＠
５ＡＮＫ６１１８５　株のプラスミドｐＩＪ７０２によ
る形質転換株から、プラスミドＰ工Ｊ７０２を再分離し
。

次いで得られたプラスミドｐＩ、７７０２を各種制限＃
素で消化し、アガロース・ゲル電気泳動によって切断パ
ターン等を検討したが、本来のプラスミドｐＩＪ７０２
と差がなく該プラスミドは欠失を起こしていないこと、
また再分離したプラスミドｐＩＪ７０２を親株５ＡＮＫ
　６６１６５株へ導入するとチオペプチン耐性およびメ
ラニン様色素産生を再び示すことからも、変異株（１８
）＝８・５ＡＮＫ　６１１８５　　株の形質転換株が有
するメラニン非産生は導入したプラスミドｐＩＪ７０２
の欠失などによるものでな（、（１６）−８・５ＡＮＫ
６１１８５　株が何らかの原因で（例えばある種のＲＮ
Ａポリメラーゼの変異でクブラスミドｐ工Ｊ７０２のチ
ロシナーゼ遺伝子を発現できなくなったものと判明した
。

そこで１：１６）−８−８ＡＮＫ　６１１８５株でプラ
スミドｐ工Ｊ７０２のチロシナーゼ遺伝子の発現を相補
するようなりＮＡ　ｌｉ片が放稼菌種ＤＩＪＡから得ら
れれば、該菌株でメラニン様色素非腫生を指標としたク
ローニングが可能となり［１８］−８・５ＡＮＫ　６１
１８５株を宿主とする有用性の扁い宿主・ベクター系が
確立できると考えられる。

プラスミドｐｘ、７７０２のチロシナーゼ遺伝子の発現
を相補するＤＮＡ断片を分離するためのＤＮＡ供給源と
しては２例えば丁べてのストレプトミセス種がその対象
となりつるが１本発明ではストレプトミセス・ベネズエ
ラエ５ＡＮＫ８４４７７　　株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　ＢＡＮＫ６４４７７）、
ストレプトミセス・フラジアユ８ＡＮＫ６９２１０株（
８，ｆｒａｄｉａｅ　１３ＡＮＫ　６＄１２７０人スト
レプトミセス・カナミセチカス　５ＡＮＫ６　１　７７
４　　株（９、ｌ（ａｎａｍｙｏｅｔｉｏｕ８　５ＡＮ
Ｋ　　６１７７４］。

ストレプトミセス・ニベウス５ＡＮＫ　９２８７０　株
（Ｓ、ｎ１ｖｅｕａ　８ＡＮＫ　！１２８７す、ストレ
プトミセス・エリスレウス１３ＡＮＫ　６２２７１ｉ株
（９，８ｒ７ｆ、ｈｒｅｕａＢＡＮＫ　６２２７８）　
、ストレプトミセス・リモーサス５ＡＮＫ　６２１７１
株（Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓ　５ＡＮＫ　６２１７１　）。

ストレプトミセス・オーミャエンシス５ＡＮＫ６１２７
７株（Ｓ、０ｍ１ｙａｅｎθｉｓ　５ＡＮＫ　６１２７
７）、ストレプトミセス・グリセウス５ＡＮＫ　６１７
８４株（Ｓ、ｇｒｉｓｅｕａ　ＥＩＡＮＫ　６１７８４
）、ストレプトミセス・フラボビレンス５ＡＮＫ　６１
７８４株（Ｓ。

ｆ１４ｖｏｖｉｒｅｎｓ　５ＡＮＫ　　６１７８４）、
ストレプトミセス・ニスＯピーＡＮ−３５１５ＡＮＫ　
６１８８４株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｅｐ、ＡＮ
−３５１５ＡＮＫ　６１８８４バストレフトミセスΦジ
ユーモンジネンシスＢＢ。

７２７５ＡＮＫ　６６７８２株、同ＡＰ−１１４８ＡＮ
Ｋ８Ｈ１８２株、四〇６：ｌ−８＠５ＡＮＫ　６１１Ｂ
５株、同（Ｎ１３−９　５ｊｌＫ　１１１８２株、の１
１種１４株が用いられた。これらの菌株からの全ＤＮＡ
の採取は、公知のいかなる方法によっても可能であるが
、ここではＭＢｒｍｕｒ　法（ジエイ・マーマー。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、！、２０８（１９６１））に
準じて採取され、これらを供与体ＤＮＡとして用いた。

−刀ベクターＤＮＡとしてのプラスミドｐＩＪ７０２は
これを含有するストレプトミセス・リビダンスから０ｂ
ｐｔｅｒ　　らの方法（チェイタ−ら、ｃｕｒｒ。

Ｔｏｐｉａａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ工ｍｍｕｎｏｌ　、
　９８　、１目目（ｔ９８２））に準じて分離された。

プラスミドｐＩＪ７０２と５倍量の供与体ＤＮＡとを混
合し制限酵素日ａｃ　Ｉ　＊　Ｂｇｌ　ＩＩもしくは８
ｐｈ　Ｉのいずれか１種によって消化・切断した後、熱
処理あるいはフェノール処理によつ゛て用いた制限酵素
を失活させ１次いでＴ４　ＤＮＡ　　リガーゼによって
これらの１）ＨＡを連結させた。この試料を用いて［１
＠３−８−ＢＡＮＫ　６１１１１５株の形質転換を行な
った。形質転換の操作は次の通りである。

宿主（１６）−８・８ＡＮＫ　６１１８６株の培養は通
常のストレプトミセス属菌の培養法か用いられる。

培地としては資化しうる炭素源、窒素源、無機物などを
適当に含有していれば天然培地１合成培地のいずれでも
使用可能である。培養温度は１８℃〜３２℃であるが好
ましくは２４℃〜２８℃である。培養時間は２４〜４８
時間が好ましい。通常は十分量の薗糸体を得るために接
種に胞子を使用するよりも増殖細胞を使用した方が好ま
しく、従って保存形態の斜面培地より胞子の一部を栄養
培地に接種し、一定時間培養することで新鮮な増殖用細
胞接種物を得る。新鮮な増殖細胞の接種物が確保された
ならばこれを無菌的に次の大きな容器に入った培地にこ
の接種物を接種し適当時間培養した後、集菌する。

集菌した菌体は洗浄し蔗糖で高張条件に懸濁し。

リゾチームにて細胞壁を廖解しプロトプラストを調製す
る。一定濃度のプロトプラストが得られたならば、これ
に先に調製した外来Ｉ）ＮＡとプラスミド９１１７０２
％連結した試料を混合し。

次にポリエチレングリコール（Ｉ’］！ｉＧ）　ｉ加え
形質転換を行なわせる。形質転換後、高張条件を保った
培地で洗浄し、ＰＥＧ１除去しプロトプラスト再生用寒
天平板上に塗床し２８℃でプロトプラストを培養する。

２０時間後、形質転換株を選択的に生育させるためチオ
ペプチンを含有した軟寒天培地を該寒天平板に上層させ
て２８℃で培養を継続する。このようにして形質転換さ
れた（ｔＯ）−ａ・８ＡＮＫ　６１１８５株の形質転換
体はチオペプチン耐性の有無で選別される。更にチロシ
ナーゼ遺伝子の発現を相補するＤＮＡ断片が挿入された
組み換えプラスミドを含有する形質斬換体はメラニン様
色素を産生じ褐色から黒色のコロニーを生成するので本
来のプラスミドｐＩＪ７０２を含有する形質転換株コロ
ニーと区別される。

例示すれば、ストレプトミセス・ベネズエラエ５ＡＮＫ
　６４４７７株からのＤＮＡを供与体として本来のプラ
スミド１）１．７７０２％、　Ｓｐｈ　Ｉを用いて切断
連結した場合、形質転換によって生育した３０００株の
チオベブチン耐性株コロニーのうち、１７株のコロニー
がメラニン様色素を生成しているのが観察された。なお
、前述の他の制限酵素Ｂｇｌ　ＩｆまたはＥｌａｃ　Ｉ
を用いた場合にはほぼＩ［’の３４００〜４０００株の
チオベプチン耐性コロニーが得られたがメラニン産生株
はまったく観察されなかった。Ｂｇｌ　ＩＩまたはＳａ
Ｑ　Ｉを用いた場合の形質転換はそれぞれ数回にわたっ
て試みられたが、同じ結果であった。

得られたメラニン様色素産生形質転換株（ｘｉｅｘ　　
ａＪのプラスミドについて検討した結果第１図に示すよ
うに本来のプラスミドｐＩＪ　７０２の５Ｔｌｈ　Ｉ部
位にＤＮＡ断片が挿入されていることが判明した。しか
し、その挿入ＤＮＡ断片の大きさｊ！２４０ベース・ベ
ア（ｂｐ）から４１００　ｂｐまであり一定ではなかっ
た。結果を第４表に示す。

そこでこれらの組み候えプラスミドによって再度（１６
）−８・５ＡＮＫ　６１１８５株を宿主とし形質転換を
行なった。Ｍｅｌ　　株の出現が、プラスミドル工、Ｔ
７０２に含まれるチロシナーゼ遣云子の発現をＳｐｈ　
１部位に挿入されたＤＮＡ断片が誘導した結果であるな
らば、これら組み換えプラスミドによる（１Ｂ）−８・
５ＡＮＫ　６１１８５株の再形質転換によって得られる
形質転換株はすべてＭθ１＋株であるはすである一実際
、これら組み候えプラスミドによって形質転換された（
１６］−８・５ＡＮＫ　６１１８５株の形質転換株はす
べてＭθ１＋株であった。−力対前とした本来のプラス
ミドｐＩＪ７０２によって形質転換された［１６］−８
・５ＡＮＫ　６１１８５　株の形質転換株はチオペプチ
ン耐性のみを示し１１ｔ６１　　株はまったく観察され
なかった。

このようにプラスミドｐＩＪ７０２のチロシナーゼ遺伝
子の挿入失活部位の１つであるＳｐｈ　ｌ切断部位にス
トレプトミセス・ベネズエラ二由来ＤＮＡ　Ｑ）　ｓｐ
ｈ　ｌ切断断片を挿入することにより。

宿主［１６：］−８・５ＡＮＫ　６１１８５株にメラニ
ン様色素産生能を付与することのできる組み換えプラス
ミドが得られるということは、即ち本来のプラスミドｐ
ＩＪ７０２のチロシナーゼ遺伝子の構造遺伝子は完全な
形で残っており、挿入ＤＮＡ　Ｖｒ片の作用によってこ
の構造遺伝子の発現が誘発されたものと考えられる。し
かしｈ　”ｐｈＩ切断断片の挿入されたすべての組み換
えプラスミドがすべてチロシナーゼ遺伝子の発現を誘発
するものでないことを以下に述べる。本発明で重要な点
はチロシナーゼ遺伝子の発現誘発能をもったこれら組み
換えプラスミドのｓｐｈ　１部位挿入ＤＮＡ断片は、そ
の発現のためにＤＮＡ断片挿入の方向性が必要なことで
ある。例示すれば（１６］−８−５ＡＮＫ６１１８５株
に導入されチロシナーゼ遺伝子の発現を誘発しつる組み
換えプラスミドの１つであって２４０　ｂｐのｓｐｈ　
ｌ切断挿入ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＭＫＬ１６
．同じ＜ｔａ５ｏｂｐ　の挿入断片を有するプラスミド
ｐＭＥＬ　２において、これらの挿入ＤＮＡ断片をそれ
ぞれ逆向きにした組み換えプラスミドｐｓＬＦ　１６−
１およびｐｆ３ＬＦ２−２０を作成し、［１６］−４・
５ＡＮＫ　６１１ｇ５株の形質転換を行なった。得られ
た形質転換株はチオペプチン耐性は示すもののメラニン
様色素並生は示さなかった。なお、これらのプラスミド
ｐＳＬＦ１６−１およびｐＳＬＦ　２−２０の挿入ＤＮ
Ａ断片の挿入力向が逆向きになっていることはアガロー
ス・ゲル電気泳動によって確認した。その解析結果を第
２図ＡおよびＢに示す。

以上述べてきたように、１：１Ｂ）−８・５ＡＮＫ　６
１１８５株を形質転換した場合、プラスミドｐＸＪ７０
２が有するチロシナーゼ遺伝子の発現ｔＳ発しつるスト
レプトミセス・ベネズエラ二５ＡＮＫ　８４４７７株Ｄ
ＮＡ由米Ｓｐ由来ｌ切断ＤＮＡ断片は。

■　ｓｐｈ　ｌ切断部位（認識部位ＤＮＡ配列は。

ＧＯＡＴ■　である）を用いた時のみクローニングされ
、その頻度は約０．６チであり１通常の遺伝子の分離頻
度に比べ極めて高い。

■　クローニングされたチロシナーゼ遺伝子発現を誘発
するＤＮＡ断片の大きさは２４０１）１）から４１００
　ｂｐ　　まであり必ずしも一定でない。特に２４０　
ｂｐ程度の大きさはメラニン様色素産生の構造遺伝子を
コードするには小さすぎるにもかかわらず、メラニン様
色素産生能が発現する。

■　°これら挿入ＤＮＡ断片ではチロシナーゼ遺伝子の
発現誘発のために方向性が必要である。

以上の３点からクロモソームＤＮＡ　由来８１）ｈ　ｌ
切断ＤＮＡ断片はメラニン様色素産生の構造遺伝子を含
んでいるものではな（（１６］−８−８ＡＮＫ６１１８
５株が認識しつる。即ち発現調節機能をもったＤＮＡ配
列を含んでいるため１本来のプラスミドｐＩＪ１０２に
由来したチロシナーゼ遺伝子が発現したと考えられる。

このように発現調節機能をもち、方向性が必要なりＮＡ
配列としてプロモータなどが考えられる。分離頻度が高
いことからこのようなりＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は、
ストレプトミセス俸ベネズエラエ以外のストレプトミセ
ス種からも得られるであろうことは容易に想像される。

そこで前述したストレプトミセス・ベネズエラエを除く
メラニン非産生株を中心としたストレプトミ七ス種１０
種１３株からＭａｒｍｕｒ　法によって全ＤＮＡを抽出
し、チロシナーゼ遺伝子の発現を誘発しつるＤＮＡ断片
について検討した結果、前述と同じくそれぞれのＤＮＡ
のＳｐｈ　ｌ切断断片導ついてのみ、チロシナーゼ遺伝
子の発現を誘発しつるＤＮＡ断片が得られた。

その分離頻度は０．５チから２チと他めて高く。

これらの挿入ＤＮＡ断片も調べた限り１２０　ｂｐ〜ｓ
　ｏ　ｏ　ｏ　ｂｐ　　まで一定ではなかった（第４表
参照）。

これらのＤＮＡ断片を挿入した組み換えプラスミドの１
つでストレプトミセス・ニス俸ピーＡＮ−３５１５ＡＮ
Ｋ　６１８８４　　から得られた９　５０　ｂｐのＳｐ
ｈ■切断挿入ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＭＥＬ２
２について、その挿入ＤＮＡ断片が逆方向を向いたプラ
スミドｐＳＬＦ２２−１１％作成し、宿主（１６）−８
・５ＡＮＫ　６１１８５株を形質転換したが、先の結果
と同様逆方向を向いたＤＮＡ断片においてはやはりチロ
シナーゼ遺伝子の発現を誘発できなかった（第２図Ｃ）
。

ストレプトミセス・ベネズエラエを含めて１１種１４株
のストレプトミセス種から宿主１：１６）−８・５ＡＮ
Ｋ　６Ｎ８５　　採肉でチロシナーゼ遺伝子の発現を諺
発しうる。即ち発現調節機能を有するＤＮＡ配列を有す
るｓｐｈ　ｌ切断ＤＮＡ断片が高頻度で分離されるとい
うことは、このような機能を有するＤＮＡ断片は、スト
レプトミセス属では普遍的に存在しているという事実を
示すものとして重要である。

さらに重要なことは本来のプラスミド１）工Ｊ７０２　
を含有せしめても、その中のチロシナーゼ遺伝子を発現
し得ない放線菌宿主において、各種ストレプトミセス種
％　ＤＮＡ供給源として。

チロシナーゼ遺伝子を発現騨発し得るｓｐｈ　ｌ切断Ｄ
ＮＡ断片をプラスミドｐＩＪ７０２のＳｐｈ　ｉ部位に
一定力向をもって挿入して成るｐ工Ｊ７０２改良組み換
えプラスミドをベクターとした場合、メラニンの産生・
非産生のいわゆる挿入失活によって外米性ＤＮＡ　％も
った新しい組み換えプラスミドを有する株を容易に選択
できる。有用な宿主・ベクター系として使用しうること
である。

さらにチロシナーゼ遺伝子の発現の強弱を検討すること
によって該ｓｐｈ　ｌ切断ＤＮＡ断片に含まれる発現調
節機能を有するＤＮＡ配列の強弱が理解され、該ＤＮＡ
断片の下流にチロシナーゼ遺伝子に代って、有用ペプチ
ドをコードする遣云子を連結することで該有用ペプチド
が容易に発現されることも期待される。

本発明はこのように １）プラスミドｐＩＪ７０２ｉ含有しても、該プラスミ
ドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、また
は発現してもその程度の弱い変異処理した放線菌宿主 ２）りの変異処理した放線菌宿主がストレプトミセス・
ジューモンジネンシス［１Ｂ］−８・５ＡＮＫ［１１１
８５株 ３）プラスミドｐＩＪ７０２ｉ含有しても該プラスミド
の有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、または
発現してもその程度の弱い変異処理した。または変異処
理しない放線菌宿主に。

各種放線菌由来ＤＮＡの制限酵素Ｓｐｈ　■による切断
断片をプラスミドｐＩＪ７０２のｓｐｈ　■切断部位に
、ある方向性をもって挿入して成る組み換えプラスミド
を含有せしめ１次いで該放線菌宿主においてチロシナー
ゼ遺伝子を発現し得る形質転換株を得１次いで該形質転
換株より該組み換えプラスミドを採取するｐ工Ｊ７０２
の改良組み換えプラスミドの製法。

４）３）により得られたｐ工Ｊ７０２改良組み換えプラ
スミ　ド、 ５）プラスミドｐＩＪ７０２を含有しても該プラスミド
の有するチロシナーゼ遺伝子を発現しえないか、または
発現してもその程度の弱い変異処理した放線菌宿主、特
にストレプトミセス・ジューモンジネンシス［１８コー
８・５ＡＮＫ　８１１ｇ５株を宿主とし、ｐ工Ｊ７０２
改良組み換えプラスミドをベクターとした有用性の高い
宿主φベクター系。

６）Ｓｐｈｌで切断して得られる放線菌由来のプロモー
ターを、チロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ　１ｌｌｉｆｉ
片のｓｐｈ　Ｉ切断部位に挿入して成る。プロモーター
の結合したチロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片。

７ノ　チロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片が、ｐ工Ｊ７
０２プラスミドをＢＣｌｌで切断した断片である　　〜
　　　　第６項記載のプロモーターの結合したチロシナ
ーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片。

に関するものとしてまとめられる。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
本発明はこれによって限定されるものではない。

保存形態にある５ＡＮＫ　８６１６５　　株から胞子を
採取し、新鮮なＹＭ　Ｍ天平板（０，４係グルコース。

１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、２チ寒天。

ｐＨ７，２）に接遣し２８℃で１０〜１４日間培養し抱
子を十分に着生せしめた。この胞子をかきとり５ｄの滅
菌蒸留水にｉＭ！濁した。グラスフィルター（３Ｇ３）
にて該胞子懸濁液をろ過し、さらにそのろ液をろ紙（ワ
ットマン＆２）を通過させて連鎖状の胞子を除去した胞
子懸濁液を調製した。得られた胞子懸濁液を０．２μＷ
／１ｒｔｌ濃度のアクリフラビンを含有するＹＭ寒天平
板に塗沫し、２８℃にて培養しコロニーの生育をはかっ
た。生育したコロニーｉＹＭ９天斜面培地に植え継ぐと
同時にＧａｃ”ｔ　液体培地（０，４％グリセロール、
　０．１　％グリシン、０．４チカザミノ醗。

０．１％塩化マグネシウム、０．０１％塩化カルシウム
、０，１チ酵母エキス、微を金属塩溶液４ガｌ）に接種
し、２８℃３日間振盪培養した。菌体を集めＴＢＳ緩衝
液（５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（ト
リス）　、５０ｍＭ　１１１：ＤＴＡおよび５０　ｍＭ
食塩、ｐＨ＝７．５ンに懸濁しリゾチームにて廖菌した
。この浴菌液をｔｓ、ｏｏｏｒｐｍ。

６０分遠心し溶菌上清を採取した。通常プラスミドはこ
の溶菌上清をアガロース・ゲル電気泳動することで検出
可能であるが、該菌株のプラスミドｐＳＪ　１およびＩ
）Ｓ、Ｔ　２はそれぞれが１−２コピーと少ない。そこ
で該溶菌上清をＲＮａ８１５消化、　Ｐｒ０ｎａ８１３
消化後、ポリエチレングリコールを縫製ｒｇＬ１０％と
なるよう添加し４℃で１晩放置することでＤＮＡを沈澱
させた。次いで謎棺後ａ、ａｌのアガロース・ゲル電気
泳動によってプラスミド脱落の有無を検討した。この結
果プラスミドｐｓＪ　１　ｄＪ脱落しプラスミドｐｓ、
Ｔ　２のみもつＡＦＩ−９４株を得た。このＡＰ−９４
株からプラスミドｐ８Ｊ　２を脱落させるために、該菌
株のグロトプラス）ｆ調製し、高張榮件下で再生させ生
育したコロニーをａａｃ７液体培地で培養しプラスミド
の検出を行なった。このようにして得られた（１６）−
８−８ＡＮＫ　６１１８５株はプラスミド１）ＳＪｌお
よびＩ）ＳＪ　２がともに脱落していることが認められ
た。さらに本菌株におけるプラスミドの脱落はＤＮＡを
　Ｈ−チミジンでラベルし、塩化セシウム・エチジウム
・プロミド平衡密度勾配遠心によって分画した試料によ
っても確認された。

ｐＩＪ７０２ｆ用イタ［：１６］−８−８ＡＮＫ　６１
１８５株の形質転換はＢｉｔ）１）らの方法（Ｂｉｂ’
ｂ　ａｔ　ａｌ　、Ｎａｔｕｒｅ２７４．３９１１（目
■０））を改変して行なった。

即ち、Ｓｏｄ容枝つきフラスコにＧＧＣｙ培地２０ａｄ
を入れこれに（ｉｌｌ）−１１−８ＡＮＫ　６１１ｇ５
株の菌糸体を接種後、２４〜２８℃で７２時間、１２゜
ｒｐｍの往復振盪機上で培養した。これを種としＧＧｃ
ｙ培地１００Ｉｌｌが入っｒ、：５００ｔｄ容坂ロフラ
スコに５％量接誼し２４〜２８℃で２４時間往復振盪機
上で培養した。この培養液から低速遠心で菌糸体のペレ
ットを得、これを２０ｄのＰ培地（３２０ｍＭ蔗糖、２
６ｍＭＴＥ８　緩衝液。

１０ｍＭ食塩、　　１０　ｆｆ１Ｍ　Ｍｇ０Ｌ２　、２
０　ｍＭ　０ａＯ１２）に懸濁し洗浄後、遠心し得られ
た菌体ペレットを再び２０ａｌのＰ培地に懸濁した。こ
の菌体懸濁液に４０１１９７　ｍｌ濃度のリゾチーム溶
液を１ｄ加え、２８℃で１時間加温して（１６）−８−
５ＡＮＫ６１１８５株のプロトプラストが生成した。プ
ロトプラストと未溶解の菌糸体の混合物は、これをグラ
スフィルター（３Ｇ３）にて自然ろ過しプロトプラスト
を多量に含有したプロトプラスト液を得、これを低速遠
心しペレットを再びＰ培地に懸濁した。この操作を３回
繰返、し十分洗浄する。

ことにより所望のプロトプラスト数を含有するプロトプ
ラスト液を調製した。

得られたプロトプラスト液を遠心シてペレットを得た。

これにプラスミドｐＩＪ７Ｇ２ｉ含ムＰ培地１００μｌ
を加えおだや刀）に攪拌しプロトプラストを均一に分散
させた。これに２０％ポリエチレングリコール１０００
％含むＰ培地０．５　ｔｕｔをガロえ１分間静置した後
、更に４ｄのＰ培地を加えた。この形質転換操作はすべ
て室温で行なわれた。形質転換後、遠心してプロトプラ
ストペレットを得た。これに５ｄのＰ培地を加え十分攪
拌・洗浄し遠心した。この操作は少なくとも３回行ない
所望量のＰ培地に形質転換済のプロトプラストを懸濁し
再生培地（Ｒ２ＭＰ寒天平板〕上に塗沫した。１２ＭＰ
培地（蔗糖１２　Ｏｆ　、ｘ２ｓｏ４Ｇ、　２５　ｆ　
、　Ｋ２ＨＰＯ４０，０５ｆ　、　Ｍｇｃ１２−ｓａ２
ｏ　１０．１２　ｆ　。

０ａ（Ｊ２拳２Ｈ２０２，９５ｆ　、グ／ｌ／　：２−
ス４　ｆ　ｅカザミノＭｏ、１ｆ、Ｌ−プロリン３　ｆ
　、　ＤＬ−ノルロイシンＱ、　０５　ｆ　、チロシン
０．５Ｆ、酵母エキス２ｆ、麦芽エキス５　ｆ、　　２
５０ｍＭ　ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２，）１００ｄ、微
量金属塩浴液２ｄ、寒天２０ｙ％加え１０００ＷＬＪと
する）はメラニン様色素の産生を強調するために調製し
た培地である。

Ｒ２ＭＰ　寒天平板上に塗床後、２８℃で２０時間培養
したＲ２ＭＰ寒天平板上に最終濃度５０μクリとなるよ
うにチオペブチンを加えた軟寒天Ｒ３培地（Ｍ糖１２０
　Ｙ　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，２ｆ　、　ＭｇＯ１２・６
Ｈ２０８、１ｆ　、ＯａＣ！１２−２Ｈ２０２，２ｆ　
、２５０ｍＭ　ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）　１０　Ｏ
Ｎ、グルコース１０ｆ、酵母エキス４ｆ、ポリペプトン
４１．ＫＯＩＯ，５ｆ。

寒天５１を加え１０００＋ｔＡ’とする）を３ｄ重層し
た。重層後、該寒天平板を２８℃で培養を継続するとチ
オペブチンに耐性を示す形質転換株の生育がみられた。

形質転換株の出現頻度は１０−３〜１０　程度であった
。しかしながらチオペグチン耐ａを示したこれら形質転
換株のなかでメラニン産生を示すものは皆無であった。

これら形質転換株から再分離したプラスミドの各徨制限
酵素切断パターンは本来のプラスミドｐＩＪ７０２　と
まったく変化なかった。さらに再分離したプラスミドを
親株日ＡＮＫ　６６１６５　株に導入するとその形質転
換株はチオペプチン耐性と同時にメラニン様色素産生を
も示した。

ローニング 実施例１で述べたようにプラスミドｐＩＪ　７０２のチ
ロシナーゼ遺伝子は宿主（１６）−８・５ＡＮＫ６１１
！１５株では発現されない。そこでチロシナーゼ遺伝子
の発現を相補するＤＮＡ断片を、各種ストレプトミセス
（１１種１４株〕の培養囚糸体からＭａｒｍｕｒ　法に
よって抽出したＤＮＡ　ｉ外米性ＤＮＡとしてクローニ
ングに供試した。

１）ストレプトミセス−ベネズエラエ５ＡＩＪＫ６４４
７７株、（Ｄ　ＤＢＩＡ　５　ＩｎとプラスミドｐＩＪ
７０２ｍｌ　ＡＶを混合し、次いで４倍濃度の制限酵素
反応液１／３容蓋および制限酵素Ｂｐｈ　Ｉ　９　　を
加えた。

ＤＮＡを完全に切断するため３１℃で２時間培養した後
、Ｔ（１℃で１０分間加熱し制限酵素を失活させた。こ
の試料に１７１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え攪拌
し１次いで２５倍量の一２０℃で冷却したエタノールを
加えた後、−７０℃で１０〜２０分間冷却した。この試
料を微量遠心機にて遠心し上清を捨て、　ＤＮＡ沈澱を
一２０℃のエタノールで洗浄した。次いで真空中で乾燥
し、滅菌蒸留水に溶解した。次いで１０倍濃度に調製し
た連結酵素反応液（６６０ｍＭｉＪスＨＯＩ　、６８ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２　、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１．１ｍＭ　
ＡＴＰｐＨ＝７．６　）を１／９容量加えさらにＴ４　
ＤＮＡ　　リガーゼを加え１４℃で１６時間インキュベ
ート後。

６５℃で１０分間加熱しりガーゼを失活させた。

これを形質転換用試料として用いた。該形質転換用試料
を用いての（１６〕−８・５ＡＮＫ　６１１８５株の形
質転換は実施例１に準じて行なった。形質転換株として
３０００株のチオペブチン耐性株が得られたがそのなか
でメラニン様色素を産する株（Ｍｅｎ株〕が１７株認め
られた。これは形質転換株の０，６チに和尚した。同じ
ようにＢｇｌ　ＩＩまたはＳａｃ　ｌを用いた試料につ
いての形質転換はそれぞれ１度にわたって行なわれたが
形質転換株でメラニン産生を示す株の出現はまったく観
察されなかった。１７株のＭｅｌ　　株についてはＧｅ
Ｏ２培地で培養し、菌体ペレツトを得た。

ＴＥＳ緩衝液に懸濁しリゾチームにて各画した。

１０チザルコシルを加え溶菌を完全にした後。

遠心（、１５，Ｇｏｏ　ｒｌ）ｍ、　６０分〕で溶菌上
清を得。

これを０．８　％アガロース・ゲルにかけ電気泳動した
。その泳動度からこれら１Ｔ株のＭａｌ＋株はすべて挿
入ＤＮＡ断片を有する組み換えプラスミドと判断された
。対照としてチオペブチン耐性のみを示す形質転換株を
無作為に１６株選び。

溶菌し同じように１ラスミドを検索した結果。

本来のプラスミドｐＩＪ１０２を保持Ｔる株が１１株、
挿入Ｉ）ＮＡ断片を有する組み換えプラスミドを有する
株が５株であった。このことから５ｐｈｌ＋ｊＪＶｒ部
位にＤＮＡ断片が挿入されたものがすべてＭｅｌ　　を
示すもので（＝ないことが理解された。

２）ストレプトミセス・ベネズエラエ以外の１０９１３
株のストレストミセス種からのＤＮＡを供与体として実
施例２・１）に準じて形質転換を行ないＭｅｌ　　株の
分離を試みた結果、すべての株から８１）ｈ　Ｉ切断し
た試料のみに０．５〜２ｑ６の頻度でチオペプチン耐注
のほかにメラニン様色素産生を示す形質転換株Ｍａｌ　
　株が得られた。

これらのＭｅｌ＋株についてもＧＧＣ！７培地で培養し
爵菌し、プラスミドの検索を実施した結果、すべて組み
換えプラスミドであると判断された。

形質転換によりチオベプチン耐性と同時にメラニン様色
素産生能を示す［１６３−８・ＥＩＡＪｉＫ　６１１８
５株の形質転換株Ｍｅｌ＋株はアガロース・ゲル電気泳
動によって明らかに組み換えプラスミドを保持している
ことが判明した。これらＭｎＳ２　　株からの組み換え
プラスミドの分離は以下の通りにして行なった。

培地組成がグルコース０４％、麦芽エキス１．０％及び
酵母エキス０．４チである培地２０ａ１４５０ｔｔｔ１
ｇ枝つきフラスコに入れ、これにおのおののＭθ１＋株
の菌糸体を接種後、２４〜２８℃で約７２時間１２０　
ｒｌ）ｆｆｌの往復振盆機上で培養した。次に菌糸体回
収用培地組成がグリセロール０．４　％　、カザミノ酸
０．４％、酵母エキス０．０５％、麦芽エキス０．１チ
ｈ　ＭｇＳＯ４０，１％。

ＣａＣＯ３・２Ｈ２００，０１％　、　ＫＵ２ＰＯ４０
，２％及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２００，８％（ｐＨ
７，２ニ調整）　テｉｂ　６培地１００ｄを５０〇−容
坂ロフラスコに入れこれに上記種培養の懸濁液を培地の
１〜５チ相当量を接種し、２４〜２８℃で２４−４８時
間往復振盪機上で培養した。

この培養液から低速遠心（例えば１０，０００ｆ。

４℃、２０分）で相糸体を集菌し、上澄液を傾斜で除い
て菌糸体ペレットを得た。菌糸体ペレットを２０ｇ１の
ＴＢＳ緩衝液（２５二Ｍトリスヒドロキシメチル　アミ
ノメタン（トリス）、２５ｍＭＫＤＴＡおよび２５　ｍ
Ｍ食塩、　ｐＨ＝７．５　）に再懸濁し５次いでこの再
懸濁物に４０■／ｄの濃度のリゾチームｍ液をＩＩＩＬ
ｌ加え、この混合物を３７℃で５〜１５分緩く攪拌しな
がら加温し１次にこれに３ｄの１０％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）ｍ液を加え、緩く混合したのち３７℃
で５分間刀口温して溶菌した。

欠イＱコ０）各画ｅｌＪ’Ｅ−４０，００Ｏｆ　、　４
℃、３０分遠心することで粗製浴菌物を上澄として得、
これに１／４答量の５Ｍ食塩を加えて最終食塩濃度％Ｉ
Ｍとし、０℃で２〜３時間冷却すると先に加入たＳＤＳ
が沈澱してくるので、３，０ＯＯｆ、０℃、１５分の遠
心を行ない、ＳＤＳを除いた。この上澄液にリボヌクレ
アーゼを加えて３７℃で２０分吏にプロナーゼを加えて
３１℃で２０分消化を行なった。この消化液に４０％ポ
リエチレングリコール（ＰＫＧ）　６０００　ｉ液を最
終濃度１０％になるよう添加し、この混合物を０℃で１
晩保つと、　ＤＩＪＡが沈誠してくるので、緩い遠＋９
　（３，００（ｉｙ、　０℃、１５分）後上澄を捨て。

沈澱物を４．７　ｍｌのＴＫＳ緩衝液に懸濁して十分に
俗かし、　ＴＢＳ緩衝販中で透析し、　ＤＮＡ抽出サン
す゛ルを得た。

このようにして得たＤＮＡ抽出サンプルに塩化セシウム
を混合し、更に蛍光発色剤エチジウム・プロミド（ＥＴ
Ｂｒ　）　％加え、混合して１．６２０の密度の靜液を
調製した。この宕液は１５０．ＯＤＤり。

１８℃で４０時間平平衡度勾配遠心を行ない。

この遠心管に３２０ｎｍの紫外ｉｔ照射すると、遠心管
中で染色体由来の線状ＤＮＡの強い蛍光帯の下に、閉環
状のプラスミドＤＮＡが蛍光帯として分離しているのか
見いだせた。

閉環状のプラスミドＤＮＡの蛍光帯部分を採取し、これ
を等墓のｎ−ブチルアルコールで３回抽出してエチジウ
ム・プロミドを除去し１次に水Ｊ−を適轟な緩衝液（例
えば、１（１ｍＭ）！Ｊス。

１０ｍＭ食塩および１　ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝　７．５
　）で透析して純粋な組み換えプラスミドを得た。

このようにして得られた純粋な組み挨えプラスミドは紫
外線２６０ｎｍの吸光度から濃度が求められた。

組み換えプラスミドにおける挿入ＤＮＡ　＠片の大きさ
はアガロース・ゲル゛電気泳動によって算出された。即
ち１組み侠ンプラスミド０．５μ２を制限酵素ｓｐｈ　
Ｉで切ＦｒＴることにより、ペクタ−プラスミドとして
用いたｐ工Ｊ７０２の線状化した断片と挿入ＤＮＡ断片
の２本のバンドが生成した。分子量マーカーとしてラム
ダＤＮＡ　ＯＪ）　Ｈ１ｎｄ■切断断片またはφＸ１７
４ＤＮＡのＨａｅ■切断断片を用い、挿入ＤＮＡ断片の
大きさによってアガロース・ゲルの濃度を０．８％１１
．２％、２チと変えて電気泳動し分子量マーカーの移動
度から挿入ＤＮＡ断片の大きさを測定した。（第４表参
照り。

濃 ％’Ｍ例３で得られた純粋な組み換えプラスミドを用い
て［１Ｂ］−８・５ＡＮＫ　６１１８５株を再形質転換
した。もしこれらの挿入ＤＮＡ断片に（＋６）−８・５
ＡＮＫ　６１１８５　　株でチロシナーゼ遺伝子の発現
を誘発するＤＮＡ配列が含まれているとすれば、再形質
転換で得られる形質転換株はすべてチオベグチン耐性と
メラニン産生を示すＭｅｌ＋株となるはずである。再形
質転換は実施例１に準じて行なわれた。その結果、供試
したすべての組み換えプラスミドは形質転換株としてＭ
ｅｌ＋株を生成した。このことはこれらの組み換えプラ
スミドの挿入ＤＮＡ断片の大きさは一定ではないが（１
８１−８−８ＡＮＫ　６１１８５株のなかでｐ工Ｊ　７
０２のもつチロシナーゼ遺伝子の発現ヲ誘発するＤＮＡ
配列を共通に有していることになる。

３種の組み換えプラスミドｐＭＥＬ　１６　、　ｐＭＥ
Ｌ　２およびｐＭＫＬ　２２について例示する。

組み換えプラスミドｐＭＥＬ　１　Ｇの挿入ＤＮＡ断片
は約２４０ｂｐの大きさである。該プラスミド１μ２　
を制限酵素ｓｐｈ　ｌにて切断し、７０℃で１０分加熱
することによって該制限酵素を失活させた後、Ｔ４ＤＮ
Ａ　　リガーゼによって再結合させた。この再結合試料
は実施例１に準じて〔１６〕−８・５ＡＮＫ　８１１８
５株に形質転換した。形質転換株はＭｅｌ　　株の他に
多数のメラニン様色素非生産株（Ｍｅｌ−株〕が生育し
てきた。チロシナーゼ遺伝子の発現に挿入ＤＮＡ断片の
方向性が必要であれば、　Ｍｅｌ−株の中に挿入ＤＮＡ
断片が逆向きに連結された組み換えプラスミドを保持す
るものが存在することになる。そこでこれらのＭｅｌ−
株から無作為に３２株選択し、実施例２に準じてアガロ
ース・ゲル電気泳動によるプラスミド検索を行なった。

本来の組み換えプラスミドｐＭＥＬ１６と同じ泳動度の
プラスミドをもつ株が５ＬＦ１６−１をはじめ３株検出
された。該ＳＬＦ　１　Ｂ−１株から実施例３に準じて
純粋なプラスミドｐＳＬＦ　１６−１　　を分離した。

該プラスミドを制限酵素Ｓｐｈ　■で切断し５本来のプ
ラスミドｐＭＦ２Ｌ１６のＳｐｈ　ｌ切断試料とアガロ
ース・ゲル電気泳動にて比較した。その結果、プラスミ
ドｐｓＬ７１６−１は本来の１ラスミドルＭＫＬ　１　
Ｂ　トＦｌ−の２４０１）ｐの挿入ＤＮＡ断片を保持し
ていた。このプラスミドｐｓＬＦ　１６　１は［＋６］
−８舎５ＡＮＫ　６１１８５株に形質転換しても生育し
てくる形質転換株はすべてチオベグチン耐性のみを示す
Ｍａｌ−株であった。

プラスミドｐｓＬＦ　１６−１が本来の組み換んプラス
ミドｐＭＥＬ１Ｂと同じ挿入ＤＮＡ断片をＭしているに
もかかわらず、チロシナーゼ遺伝子の発現を誘発しない
ということは、該プラスミドｐｓＬＦ１６−１の挿入Ｄ
ＮＡ断片は組み換んブラスミ　ドｐＭＥＬ　１６の挿入
ＤＮＡ断片と逆向きに連結されているためにチロシナー
ゼ遺伝子が発現しなかったと考えられる。これはプラス
ミドｐｓＬＦ’１６−１およびｐＭＫＬ１６の制限酵素
ＳａＯｌ　、　Ｐｓｔの二重切断によって生じる１　０
４０　Ｊ）のそれぞれのＤＮＡ断片を制限酵素Ｐｖｕ　
Ｉで切断し、生じるＤＮＡ断片の大きさをポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動によって測定した結果からも確認
された。

組み換えプラスミドｐＭＥＬ　２の挿入ＤＮＡ断片は。

約１６５０　ｂｐ　　と比較的大きく、この断片中にＢ
ｇ１ｎ　＊　ＢａｍＨＩ　＋Ｋｐｎ　Ｉ　＊　Ｘｈｏ　
ｌおよびＳａｃ　Ｉの５種の制限酵素切断部位を有する
。しかもこれらの制限酵素はベクターとして用いたプラ
スミドル工：Ｊ　７０２をそれぞれ１ケ所で切断するこ
とが判っている。従ってこれらの制限酵素で切断し生成
するＤＮＡの大きさを比較することで容易に方向性が決
定できる。ｐＭＦｉＬ　２の挿入ＤＮＡ断片の逆向きプ
ラスミドの取得法は前項のｐＭＥＬ１８と同じ一力法で
行ない、　ｐＭＥＬ　２と同じ大きさで、かつチロシナ
ーゼ遺六子の発現能を有しないプラスミドｐＥｉＬＦ　
２−２０を保持する株を検出した。この株より純粋なプ
ラスミドｐｓＬＦ　２−２０を分離し、さらにこのプラ
スミドｐｓＬＦ　２−２０　　を用いて（１Ｂ）−８，
５ＡＮＫ　６１１８５株を形質転換してもＭｅｌ＋株は
得られなかった。このプラスミドｐｓＬＦ　２−２０と
ｐＭＩｌｉＬ　２を先に述べた５種の制限酵素で切断し
生成するＤＮＡ断片の大きさを１．２％アガロース・ゲ
ル電気泳動によって測定した結果。

そのパターンからプラスミドｐｓＬＦ　２−２０の挿入
ＤＮＡ　断片は本来の組み換えプラスミドｐＭＫＬ２の
挿入ＤＮＡ断片と逆向きで連結されていることが判明し
た。

組み換えプラスミドｐＭＥＬ２２の挿入ＤＮＡ断片は約
ｅｓｏｂｐであり、この断片中にＢｇｌｌ。

Ｂａｍ　ＨｌおよびＳａｃ　ｌの制限酵素切断部位を有
する。これらの酵素はベクターとして用いたｐ工Ｊ７０
２をそれぞれ１ケ所で切断することが判明している。従
ってこれらの制限酵素で切断し生成するＤＮＡの大きさ
を比較することで容易に方向性が決定される。

ｐＭＫＬ　２２の挿入ＤＮＡ断片の逆向きプラスミドの
取得法は前項のｐＭＦｉＬ　１　ＢおよびｐＭＥＬ２の
場合と同じである。その結果、ｐＭＥＬ２２と同じ大き
さで、チロシナーゼ遺伝子発現能を有さないプラスミド
ｐｓＬＦ　２２−１１を得た。このプラスミドｐｓＬＦ
２２−１１とｐＭＩｃＬ　２２１ｚ　Ｂｇｌ　ｌ　、　
　ＢａｍＨｌおよびＳａｃ　ｌでそれぞれ切断し生成す
るＤＮＡ断片の大きさを′Ｌ０％アガロース・ゲル電気
泳動によって測定した。その結果、プラスミドｐｓＬＦ
２２−１１の挿入ＤＮＡ断片は組み換えプラスミドｐＭ
ＦｉＬ２２の挿入ＤＮＡ断片と逆向きに連結されたもの
と判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は宿主［１８］−８−８ＡＮＫ　６１１ｇ５株に
メラニン産生能を付与するプラスミドｐＩＪ　７０２改
良組み換えプラスミドの模式図である。 模式図中。 １＠ｌ＠ｌ＠　：挿入ＤＮＡ断片 −：　ｐｚＪ？　０２由来断片 ←→；チオストレプトン耐注遺云子断片ＸＸＸＸ　：チ
ロシナーゼ遺伝子断片 トー：挿入失活可能部位 を示す。 ５ｐｈｌ挿入ＤＮＡ断片の大きさは第４表に示されてい
る。 第２図は組み換えフ“ラスミドの挿入ＤＮＡ　ｌ；ｆｌ
片とその近傍の制限酵素切断部位をあられす。Ａは組み
換んプラスミドｐＭＥＬ　１　ｆｌとその挿入ＤＮＡ断
片が逆向きに連結されたプラスミドｐｓＬＦ　１　Ｂ−
１である。 Ｂは組み換えプラスミドｐＭＥＬ　２とその挿入ＤＮＡ
断片が逆向きに連結されたプラスミドｐｓ　ＬＦ２−２
０である。 Ｃは組み換えプラスミドｐＭＫＬ　２２とその挿入ＤＮ
Ａ断片が逆向きに連結されたプラスミドｐｓＬＦ’２２
−’ｉｔである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プラスミドｐＩＪ７０２を導入しても該プラスミド
   の有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、または
   発現してもその程度の弱い変異処理した放線菌宿主。 ２、ストレプトミセス・ジューモンジネンシス（Ｓｔｒ
   ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉｓ）〔
   １６〕−８・ＳＡＮＫ６１１８５株である特許請求の範
   囲第１項記載の変異処理した放線菌宿主。 ３、プラスミドｐＪＩ７０２を導入しても該プラスミド
   の有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、または
   発現してもその程度の弱い変異処理した、または変異処
   理しない放線菌宿主に、該チロシナーゼ遺伝子の発現を
   誘発せしめる放線菌由来ＤＮＡ断片をプラスミドｐＩＪ
   ７０２に挿入した組み換えプラスミドを導入して該放線
   菌株を形質転換せしめ、該形質転換株から採取されたｐ
   ＩＪ７０２改良組み換えプラスミド。 ４、プラスミドｐＩＪ７０２を導入しても、該プラスミ
   ドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、また
   は発現してもその程度の弱い変異処理した、または変異
   処理しない放線菌宿主に、各種放線菌由来ＤＮＡの制限
   酵素Ｓｐｈ I による切断断片を、プラスミドｐＩＪ７
   ０２のＳｐｈ I 切断部位にある方向性をもつて挿入し
   て成る組み換えプラスミドを含有せしめ、次いで該放線
   菌宿主においてチロシナーゼ遺伝子を発現し得る形質転
   換株を得、次いで該形質転換株より該組み換えプラスミ
   ドを採取することを特徴とするｐＩＪ７０２改良組み換
   えプラスミドの製法。 ５、下記（１）の宿主および（２）のプラスミドよりな
   る宿主・ベクター系。 （１）プラスミドｐＩＪ７０２を導入しても該プラスミ
   ドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、また
   は発現してもその程度の弱い変異処理した、または変異
   処理しない放線菌宿主 （２）プラスミドｐＩＪ７０２を導入しても該プラスミ
   ドの有するチロシナーゼ遺伝子を発現し得ないか、また
   は発現してもその程度の弱い変異処理した、または変異
   処理しない放線菌宿主に該チロシナーゼ遺伝子の発現を
   誘発せしめる放線菌由来ＤＮＡ断片をプラスミドｐＩＪ
   ７０２に挿入した組み換えプラスミドを挿入して該放線
   菌株を形質転換せしめ、該形質転換株から採取されたｐ
   ＩＪ７０２改良組み換えプラスミド。 ６、ＳＰｈ I で切断して得られる放線菌由来のプロモ
   ーターを、チロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片のＳｐｈ
   I 切断部位に挿入して成る、プロモーターの結合した
   チロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片。 ７、チロシナーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片が、ｐＩＪ７０
   ２プラスミドをＢＣｌ I で切断した断片である特許請
   求の範囲第６項記載のプロモーターの結合したチロシナ
   ーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片。