JP2003503025A - キサンタンを生成するキサントモナス・カンペストリスの非病原性株 - Google Patents
キサンタンを生成するキサントモナス・カンペストリスの非病原性株Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、少なくとも一つの病原性遺伝子の不活性化により植物病原性を失っており且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保持している細菌株に関係する。
Description
【０００１】
この発明は、植物病原性を失っているが、エキソポリサッカリド特にキサンタ
ンガムを生成する能力を実質的に保存している新規な細菌株特にキサントモナス
株特にキサントモナス・カンペストリス株に関係する。
ンガムを生成する能力を実質的に保存している新規な細菌株特にキサントモナス
株特にキサントモナス・カンペストリス株に関係する。
【０００２】
キサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリスは、キサンタンガムの
工業的生産に利用されるアブラナ科の植物病原性のグラム陰性細菌である(Marti
n, 1994, Res.Microbiol.145:9 93-97)。
工業的生産に利用されるアブラナ科の植物病原性のグラム陰性細菌である(Marti
n, 1994, Res.Microbiol.145:9 93-97)。
【０００３】
このエキソポリサッカリドの経済的重要性は、この合成に関与する遺伝子に関
する多くの研究を生じさせている(Martin, 1994, 前記)。
する多くの研究を生じさせている(Martin, 1994, 前記)。
【０００４】
病原性の多くの決定因子が記載されてきた(Dow及びDaniels, 1994, In bacter
ial pathogenesis of plants and animals, JL Dangl編、Springer Verlag, Hei
delberg)。これらの内に、植物組織における加水分解活性を有する細胞外酵素が
ある。これらの酵素を輸出する原因となる分泌系を不活性化すると、Ｘ．カンペ
ストリス株は、植物における非常に低減された兆候と関係する植物病原性でない
表現型を有する(Dow及びDaniels, 1994, 前記)。記載された病原性の決定因子の
内には、エキソポリサッカリドがあり、これは、病気の初期段階において役割を
有するようである(Dow及びDaniels, 1994, 前記；Katzen等、1998, J.Bacteriol
.180:1607-1617)。同様に、Ｘ．カンペストリスｐｖ．カンペストリスにおいて
記載されたｈｒｐＸｃ遺伝子(Kamoun等、1992, Mol.Plant Microbe Interact.5:
22-33)は、この遺伝子の変異が特徴的な壊死反応(過敏反応、ＨＲ)へと導くので
、適合性宿主植物の防御応答の抑制に関与している。Ｘ．カンペストリスの様々
なパソバールにおいて記載された非病原性遺伝子も、ＨＲ反応に対応する及び該
反応へ導く耐性遺伝子を有する植物により認識されるので、この細菌の病原性に
関与している(Dow及びDaniels, 1994, 前記；Yang等、1995, Mol.Plant Microbe
Interact.8:627-631)。キサントモナスの病原性に関与する他の遺伝子の内で(D
ow及びDaniels, 1994, 前記)、２つの遺伝子が、Ｘ．カンペストリスｐｖカンペ
ストリスにおいて記載されており、それらの変異は、細胞外酵素及びエキソポリ
サッカリドの蓄積レベルの変化を伴わずに、低減された病原性へと導く(Osbourn
等、1990, Mol.Plant Microbe Interact.3:280-285)。病原性の他の決定因子は
、細胞外酵素及びエキソポリサッカリドの合成を調節する様々な独立の遺伝子の
組よりなり、それらの内には:ｒｐｆＡ〜Ｈ遺伝子(これらの変異は、エキソポリ
サッカリドの生成の減少へと導く)；ｒｐｆＮ遺伝子(これらの酵素及びエキソポ
リサッカリドの合成のリプレッサー)；ｃｌｐ遺伝子(これの変異は、低減された
病原性と減少したエキソポリサッカリドの生成へと導く)がある(Dow及びDaniels
, 1994, 前記)。最後に、病原性の他の決定因子は、ｈｒｐ遺伝子よりなる。
ial pathogenesis of plants and animals, JL Dangl編、Springer Verlag, Hei
delberg)。これらの内に、植物組織における加水分解活性を有する細胞外酵素が
ある。これらの酵素を輸出する原因となる分泌系を不活性化すると、Ｘ．カンペ
ストリス株は、植物における非常に低減された兆候と関係する植物病原性でない
表現型を有する(Dow及びDaniels, 1994, 前記)。記載された病原性の決定因子の
内には、エキソポリサッカリドがあり、これは、病気の初期段階において役割を
有するようである(Dow及びDaniels, 1994, 前記；Katzen等、1998, J.Bacteriol
.180:1607-1617)。同様に、Ｘ．カンペストリスｐｖ．カンペストリスにおいて
記載されたｈｒｐＸｃ遺伝子(Kamoun等、1992, Mol.Plant Microbe Interact.5:
22-33)は、この遺伝子の変異が特徴的な壊死反応(過敏反応、ＨＲ)へと導くので
、適合性宿主植物の防御応答の抑制に関与している。Ｘ．カンペストリスの様々
なパソバールにおいて記載された非病原性遺伝子も、ＨＲ反応に対応する及び該
反応へ導く耐性遺伝子を有する植物により認識されるので、この細菌の病原性に
関与している(Dow及びDaniels, 1994, 前記；Yang等、1995, Mol.Plant Microbe
Interact.8:627-631)。キサントモナスの病原性に関与する他の遺伝子の内で(D
ow及びDaniels, 1994, 前記)、２つの遺伝子が、Ｘ．カンペストリスｐｖカンペ
ストリスにおいて記載されており、それらの変異は、細胞外酵素及びエキソポリ
サッカリドの蓄積レベルの変化を伴わずに、低減された病原性へと導く(Osbourn
等、1990, Mol.Plant Microbe Interact.3:280-285)。病原性の他の決定因子は
、細胞外酵素及びエキソポリサッカリドの合成を調節する様々な独立の遺伝子の
組よりなり、それらの内には:ｒｐｆＡ〜Ｈ遺伝子(これらの変異は、エキソポリ
サッカリドの生成の減少へと導く)；ｒｐｆＮ遺伝子(これらの酵素及びエキソポ
リサッカリドの合成のリプレッサー)；ｃｌｐ遺伝子(これの変異は、低減された
病原性と減少したエキソポリサッカリドの生成へと導く)がある(Dow及びDaniels
, 1994, 前記)。最後に、病原性の他の決定因子は、ｈｒｐ遺伝子よりなる。
【０００５】
このｈｒｐ(過敏反応及び病原性)遺伝子は、適合性植物に関する病原性及び耐
性宿主に関する過敏反応に必須である(Alfano及びCollmer, 1997, J.Bacteriol.
179:5655-5662)。それらは、エルウィニア、シュードモナス、ラルストニア及び
キサントモナス・ゲネラの幾つかの植物病原性細菌において、様々な程度にクロ
ーン化され、特性決定されている。これらの細菌において、それらは、比較的保
存されており(Zurek及びBukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47:2
27-241；Alfano及びCollmer, 前記)、特に、Ｘ．カンペストリスｐｖ．ベシカト
リアにおいて保存されている(Huguet等、1998, Molec.Microbiol 29:1379-1390
；Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5:390-396；Bon
as, 1994, 前記)。その上、それらの内で最も保存されているのは、ｈｒｃ遺伝
子と改名されている(Bogdanove等、1996, Mol.Microbiol., 20:681-683)。今ま
で記載されたｈｒｐ遺伝子の機能の内には、それらの発現の調節、宿主の応答を
誘出させるタンパク質の生成、特異的な(「III型」)分泌系の構成及びペリプラ
スムのグルカンの合成がある(Zurek及びBukowski, 1998, Acta Microbiologica
Polonica, 47:227-241；Mudgett及びStaskawicz, 1998, Current Opinion in Mi
crobiology 1:109-114；Lindgren, 1997, Annu Rev.Phytopathol.35:129-152；A
lfano及びCollmer, 1997, 前記；Bonas, 1994, 前記)。一組のｈｒｐ遺伝子が、
Ｘ．カンペストリスｐｖ．カンペストリスにおいてクローン化された(Arlat等、
1991, Mol.Plant Microbe Interact 4:593-601)が、配列決定はされていない。
これらの遺伝子にトランスポゾンにより生じた突然変異を有する株は、ディッシ
ュ上での様子から、エキソポリサッカリドの正常な生成を有すると考えられると
いうことも報告されている。しかしながら、これらの株のキサンタン生産力の一
層正確な定量は、発表されていない。
性宿主に関する過敏反応に必須である(Alfano及びCollmer, 1997, J.Bacteriol.
179:5655-5662)。それらは、エルウィニア、シュードモナス、ラルストニア及び
キサントモナス・ゲネラの幾つかの植物病原性細菌において、様々な程度にクロ
ーン化され、特性決定されている。これらの細菌において、それらは、比較的保
存されており(Zurek及びBukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47:2
27-241；Alfano及びCollmer, 前記)、特に、Ｘ．カンペストリスｐｖ．ベシカト
リアにおいて保存されている(Huguet等、1998, Molec.Microbiol 29:1379-1390
；Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5:390-396；Bon
as, 1994, 前記)。その上、それらの内で最も保存されているのは、ｈｒｃ遺伝
子と改名されている(Bogdanove等、1996, Mol.Microbiol., 20:681-683)。今ま
で記載されたｈｒｐ遺伝子の機能の内には、それらの発現の調節、宿主の応答を
誘出させるタンパク質の生成、特異的な(「III型」)分泌系の構成及びペリプラ
スムのグルカンの合成がある(Zurek及びBukowski, 1998, Acta Microbiologica
Polonica, 47:227-241；Mudgett及びStaskawicz, 1998, Current Opinion in Mi
crobiology 1:109-114；Lindgren, 1997, Annu Rev.Phytopathol.35:129-152；A
lfano及びCollmer, 1997, 前記；Bonas, 1994, 前記)。一組のｈｒｐ遺伝子が、
Ｘ．カンペストリスｐｖ．カンペストリスにおいてクローン化された(Arlat等、
1991, Mol.Plant Microbe Interact 4:593-601)が、配列決定はされていない。
これらの遺伝子にトランスポゾンにより生じた突然変異を有する株は、ディッシ
ュ上での様子から、エキソポリサッカリドの正常な生成を有すると考えられると
いうことも報告されている。しかしながら、これらの株のキサンタン生産力の一
層正確な定量は、発表されていない。
【０００６】
加えて、これらの株に生じた突然変異は、性質がキサンタンガムの製造のため
の工業的利用に十分なだけ安定ではない。特に、用いられたトランスポゾンは、
トランスポザーゼをコードする遺伝子を含み(Simon等、1989, Gene 80:161-169)
、これは、世代当たり１０-6〜１０-3と見積もられ得る頻度でのそのトランスポ
ゾンの除去の事象を排除しない(Berg等、1989, Berg及びHowe編、Mobile DNA, A
merican Society for Microbiology, Washington D.C. ｐ879-926；Craig, Esch
erichia coli and Salmonella, Neidhardt編、ASM Press, Washington, D.C. p2
339-2362)。加えて、使用されたトランスポゾンは、抗生物質ネオマイシン及び
カナマイシンに対する耐性の遺伝子を含む。最後に、これらの株のゲノムに挿入
されたトランスポゾンは、用いた株のゲノムの自然のエレメントでないので、相
同でないＤＮＡエレメントを構成する。
の工業的利用に十分なだけ安定ではない。特に、用いられたトランスポゾンは、
トランスポザーゼをコードする遺伝子を含み(Simon等、1989, Gene 80:161-169)
、これは、世代当たり１０-6〜１０-3と見積もられ得る頻度でのそのトランスポ
ゾンの除去の事象を排除しない(Berg等、1989, Berg及びHowe編、Mobile DNA, A
merican Society for Microbiology, Washington D.C. ｐ879-926；Craig, Esch
erichia coli and Salmonella, Neidhardt編、ASM Press, Washington, D.C. p2
339-2362)。加えて、使用されたトランスポゾンは、抗生物質ネオマイシン及び
カナマイシンに対する耐性の遺伝子を含む。最後に、これらの株のゲノムに挿入
されたトランスポゾンは、用いた株のゲノムの自然のエレメントでないので、相
同でないＤＮＡエレメントを構成する。
【０００７】
現在、欧州では、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリスの植
物病原性により課せられる特別の規制はないが、環境に関する理由によって、そ
の部位に近い作物学的に関心のある培養物の汚染の可能なリスクを減らすために
キサントモナス・カンペストリスの非植物病原性の株を利用することは、大いに
望ましい。かかる株を、生産のために慣用のランダム突然変異誘発技術を用いて
選択することは、非植物病原性であるが生産性は保存している(即ち、第二次的
変異を有しない)株の単離のための高スループットスクリーニングを含まなけれ
ばならないので、長くて退屈な工程である。
物病原性により課せられる特別の規制はないが、環境に関する理由によって、そ
の部位に近い作物学的に関心のある培養物の汚染の可能なリスクを減らすために
キサントモナス・カンペストリスの非植物病原性の株を利用することは、大いに
望ましい。かかる株を、生産のために慣用のランダム突然変異誘発技術を用いて
選択することは、非植物病原性であるが生産性は保存している(即ち、第二次的
変異を有しない)株の単離のための高スループットスクリーニングを含まなけれ
ばならないので、長くて退屈な工程である。
【０００８】
その上、改変されたキサンタンガムを生成する遺伝的に改変された(米国５，
５１４，７９１号に記載)又は改良された生産力を有する株の利用は、厳密な調
節に対する主題である(Theilleux 1998, Dictionnaire permanent Bioethique e
t Biotechnologies [Permanent dictionary of bioethics and biotechnology],
ed Legislatives [legislative ed], p1595-1648)。後者は、特に、植物に対す
る危険を与える株において生成された構築物について、生産の部位における汚染
の厳密な測定の採用を課する。従って、この必要な出費は、負の経済的重要性を
有するであろう。
５１４，７９１号に記載)又は改良された生産力を有する株の利用は、厳密な調
節に対する主題である(Theilleux 1998, Dictionnaire permanent Bioethique e
t Biotechnologies [Permanent dictionary of bioethics and biotechnology],
ed Legislatives [legislative ed], p1595-1648)。後者は、特に、植物に対す
る危険を与える株において生成された構築物について、生産の部位における汚染
の厳密な測定の採用を課する。従って、この必要な出費は、負の経済的重要性を
有するであろう。
【０００９】
それ故、植物病原性を安定に欠くが、キサンタンガムの生産性を保持している
Ｘ．カンペストリスの工業用株に対する要求がある。加えて、バイオマスからの
キサンタンガムの分離に由来する廃物の処理の故に及び該処理を簡素化するため
に、その株が、抗生物質に対する耐性をコードする異種遺伝子を含まないことは
有用である。最後に、フランス及び欧州の法律に関して、得られた株が、自己ク
ローニング(その自然の遺伝物にとって外来の如何なるＤＮＡエレメントも含ま
ないことを意味する)によって構築されていることは好ましい。
Ｘ．カンペストリスの工業用株に対する要求がある。加えて、バイオマスからの
キサンタンガムの分離に由来する廃物の処理の故に及び該処理を簡素化するため
に、その株が、抗生物質に対する耐性をコードする異種遺伝子を含まないことは
有用である。最後に、フランス及び欧州の法律に関して、得られた株が、自己ク
ローニング(その自然の遺伝物にとって外来の如何なるＤＮＡエレメントも含ま
ないことを意味する)によって構築されていることは好ましい。
【００１０】
本願発明者による研究は、所望の特性を有するＸ．カンペストリスの株の構築
を可能にした。
を可能にした。
【００１１】
驚くべきことに、この発明により、病原性に関与する遺伝子の数キロベースに
影響を及ぼすかなりのサイズの断片の欠失により安定に非植物病原性となった細
菌が、それでも、キサンタンガムを生成することができるということが示された
。
影響を及ぼすかなりのサイズの断片の欠失により安定に非植物病原性となった細
菌が、それでも、キサンタンガムを生成することができるということが示された
。
【００１２】
尚一層驚くべきことには、この発明の改変された株は、すべての点において、
量及び質において、構築物を作製する元となった野生型株により生成されたもの
に匹敵した。
量及び質において、構築物を作製する元となった野生型株により生成されたもの
に匹敵した。
【００１３】
この発明の主題は、少なくとも一つの病原性遺伝子の不活性化により病原性を
失い且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保存している細菌株である。
失い且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保存している細菌株である。
【００１４】
この発明による細菌株は、有利に、ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群の少なくとも一
つの遺伝子の、有利には少なくとも２つの遺伝子の、好ましくは少なくとも３つ
の遺伝子の欠失により、好ましくはｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群の５〜９遺伝子の
欠失によって、安定に非植物病原性にされる。
つの遺伝子の、有利には少なくとも２つの遺伝子の、好ましくは少なくとも３つ
の遺伝子の欠失により、好ましくはｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群の５〜９遺伝子の
欠失によって、安定に非植物病原性にされる。
【００１５】
表現「植物病原性を安定に欠く」は、この特徴が、少なくとも２０世代の、有
利には少なくとも３０世代の、好ましくは少なくとも４０世代の細胞周期の後に
保存されていることを意味することを意図している。
利には少なくとも３０世代の、好ましくは少なくとも４０世代の細胞周期の後に
保存されていることを意味することを意図している。
【００１６】
植物病原性を失い且つ有利にエキソポリサッカリドの工業的製造に利用するこ
とのできる細菌の内で、次の属を特に挙げることができる：エルウィニア、シュ
ードモナス、ラルストニア及びキサントモナス。
とのできる細菌の内で、次の属を特に挙げることができる：エルウィニア、シュ
ードモナス、ラルストニア及びキサントモナス。
【００１７】
この発明の主題は、特に、植物病原性を本質的に安定に欠き且つエキソポリサ
ッカリドを生成する能力を実質的に保存しているキサントモナス株である。
ッカリドを生成する能力を実質的に保存しているキサントモナス株である。
【００１８】
表現「本質的に非植物病原性」は、宿主のアブラナ科の植物特にキャベツ(Bra
ssica oleracera)の葉において、 拡大する病変及び／又はしおれがないことを
意味することを意図している。
ssica oleracera)の葉において、 拡大する病変及び／又はしおれがないことを
意味することを意図している。
【００１９】
有利には、このキサントモナス株は、カンペストリス種であり、特に、ｐｖ．
カンペストリスである。
カンペストリスである。
【００２０】
上記の遺伝子の不活性化は、好ましくは、ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群中の少な
くとも１ｋｂの、好ましくは少なくとも３ｋｂの、有利には少なくとも５ｋｂの
欠失により、好ましくはｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群中の９ｋｂのそして可能であ
れば最大で４０ｋｂに及ぶ欠失により得られる。
くとも１ｋｂの、好ましくは少なくとも３ｋｂの、有利には少なくとも５ｋｂの
欠失により、好ましくはｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群中の９ｋｂのそして可能であ
れば最大で４０ｋｂに及ぶ欠失により得られる。
【００２１】
好適具体例において、本発明による本質的に非植物病原性のキサントモナス株
(特に、カンペストリス)は、キサントモナス・カンペストリスｐｖカンペストリ
スの植物病原性野生型株のｈｒｐＡ１〜ｈｒｐＣ２遺伝子の欠失により得られる
。
(特に、カンペストリス)は、キサントモナス・カンペストリスｐｖカンペストリ
スの植物病原性野生型株のｈｒｐＡ１〜ｈｒｐＣ２遺伝子の欠失により得られる
。
【００２２】
この発明のキサントモナス株により生成されたキサンタンガムは、野生型種に
より生成されたものと実質的に同一である(即ち、それは、実質的に同じ分子量
分布を有し、同程度の改変を、特にアセチル化及びピルベート化をも有する)。
より生成されたものと実質的に同一である(即ち、それは、実質的に同じ分子量
分布を有し、同程度の改変を、特にアセチル化及びピルベート化をも有する)。
【００２３】
この発明の主題は又、上記の株の調製方法であって、それがｈｒｐ又はｈｒｃ
遺伝子の全部又は部分の欠失を含むプラスミドとの相同組換えにより得られるこ
とを特徴とする当該調製方法でもある。
遺伝子の全部又は部分の欠失を含むプラスミドとの相同組換えにより得られるこ
とを特徴とする当該調製方法でもある。
【００２４】
この発明の主題は、細菌性エキソポリサッカリド特にキサンタンガムの製造方
法であって、上で規定した細菌株(適当なキサントモナス属、好ましくはキサン
トモナス・カンペストリス)を、発酵培地中でのエキソポリサッカリドの生成を
可能にする条件下で培養することを特徴とする当該製造方法でもある。
法であって、上で規定した細菌株(適当なキサントモナス属、好ましくはキサン
トモナス・カンペストリス)を、発酵培地中でのエキソポリサッカリドの生成を
可能にする条件下で培養することを特徴とする当該製造方法でもある。
【００２５】
下記の実施例は、この発明の特徴に対応するキサントモナス・カンペストリス
株の構築を説明するものである。
株の構築を説明するものである。
【００２６】
これらの実施例において、構築を、キサンタンガムのスクリーニングにより得
られたキサントモナス・カンペストリスｐｖカンペストリス株を用いて行った。
られたキサントモナス・カンペストリスｐｖカンペストリス株を用いて行った。
【００２７】
非植物病原性株を、当該技術分野の一般的知識及び以下に与える指示に従って
、特にその株がキサントモナス・カンペストリス種に属する場合には報告された
配列の部分を参照することによって製造する出発材料として、キサントモナスの
他の株を利用することができ、そして異なる属に属し当業者が接近することので
きるエキソポリサッカリド産生細菌株も又利用することができるということは、
いうまでもない。
、特にその株がキサントモナス・カンペストリス種に属する場合には報告された
配列の部分を参照することによって製造する出発材料として、キサントモナスの
他の株を利用することができ、そして異なる属に属し当業者が接近することので
きるエキソポリサッカリド産生細菌株も又利用することができるということは、
いうまでもない。
【００２８】
これらの実施例を理解するためには、添付の図面が参照される。
【００２９】
材料と方法
別途特定する場合を除いて、利用する技術は、当業者に公知の慣用の生物学及
び微生物学の技術であり、例えば、Ausubel等、1987(Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley and Sons, New York；Maniatis等、1982, Molecul
ar Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, New York)及びColigan等、1997(Current Protocols in Protein Sc
ience, John Wiley & Sons, Inc.)により記載されている。
び微生物学の技術であり、例えば、Ausubel等、1987(Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley and Sons, New York；Maniatis等、1982, Molecul
ar Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, New York)及びColigan等、1997(Current Protocols in Protein Sc
ience, John Wiley & Sons, Inc.)により記載されている。
【００３０】
１．出発株
このＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株は、Rhodia Chimie(Melle工場、RTAM)のコ
レクションに由来し、その通常の黄色い外観ではない白い形態学的外観について
選択した。これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１０１６、１０１７、１０１９及び１
０２１株をＣＢＳに、個別番号ＣＢＳ１０１９４０、ＣＢＳ１０１９４１、ＣＢ
Ｓ１０１９４２、ＣＢＳ１０１９４３及びＣＢＳ１０１９４４にて寄託した。
レクションに由来し、その通常の黄色い外観ではない白い形態学的外観について
選択した。これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ１０１６、１０１７、１０１９及び１
０２１株をＣＢＳに、個別番号ＣＢＳ１０１９４０、ＣＢＳ１０１９４１、ＣＢ
Ｓ１０１９４２、ＣＢＳ１０１９４３及びＣＢＳ１０１９４４にて寄託した。
【００３１】
２．ＭＳＸ培養培地
キサントモナスを培養するために用いたＭＳＸ培地は、０．２ｇ／ｌの酵母エ
キストラクト；１．２ｇ／ｌのＮＨ4ＮＯ3；７．３ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4；０．２
５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのグルコース及び１５ｇ／ｌのバクト
−アガー(寒天培地用)；１０ｇ／ｌのグルコース(液体培地用)を含む。硫酸マグ
ネシウム及びグルコースを別々に殺菌して即座に加える。この培地のｐＨを殺菌
前に、１０％に希釈した硫酸を用いてｐＨ７．２に平衡化させる。
キストラクト；１．２ｇ／ｌのＮＨ4ＮＯ3；７．３ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4；０．２
５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのグルコース及び１５ｇ／ｌのバクト
−アガー(寒天培地用)；１０ｇ／ｌのグルコース(液体培地用)を含む。硫酸マグ
ネシウム及びグルコースを別々に殺菌して即座に加える。この培地のｐＨを殺菌
前に、１０％に希釈した硫酸を用いてｐＨ７．２に平衡化させる。
【００３２】
ゲノムＤＮＡ調製物を、ＭＳＸ中の新鮮な液体培養物(０．４未満のＯＤ６６
０)から生成した。４０ｍｌの培養物の遠心分離後に、その細胞ペレットを、１
１．９ｍｌのＴＥ緩衝液(Current Protocols in Molecular Biology, John Wile
y and Sons, New York)中に取って、６３０μｌの１０％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナ
トリウム)を加えてから６３μｌのプロテイナーゼＫ(２０ｍｇ／ｍｌ)を加える
。１時間３７℃でのインキュベーションの後に、２．１ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを
加えてから、１．７ｍｌの１０％ＣＴＡＢ(０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液中)を加え、
そして全混合物を１０分間６５℃でインキュベートする。等容のクロロホルム／
イソアミルアルコール(２４：１)混合物を用いる第一の抽出と、続く、等容のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(２５：２４：１)混合物を用い
る第二の抽出の後に、その上清に０．６容のイソプロパノールを加える。遠心分
離(５分間、１００００ｒｐｍ)後に、得られたペレットを７０％エタノールにて
洗ってから乾燥し、その後、少なくとも２ｍｌのＴＥ中に取り、それに２５μｌ
の５ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼ溶液を加える。１時間３７℃でのインキュベーション
後に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールでの抽出を行い、その
上清からのＤＮＡを、０．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５容のエタノール
を加えることにより沈殿させる。５分間１４０００ｒｐｍでの遠心分離後に得ら
れたペレットを７０％エタノールで洗ってから乾燥させ、その後、少なくとも０
．５ｍｌのＴＥに再懸濁させる。
０)から生成した。４０ｍｌの培養物の遠心分離後に、その細胞ペレットを、１
１．９ｍｌのＴＥ緩衝液(Current Protocols in Molecular Biology, John Wile
y and Sons, New York)中に取って、６３０μｌの１０％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナ
トリウム)を加えてから６３μｌのプロテイナーゼＫ(２０ｍｇ／ｍｌ)を加える
。１時間３７℃でのインキュベーションの後に、２．１ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを
加えてから、１．７ｍｌの１０％ＣＴＡＢ(０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液中)を加え、
そして全混合物を１０分間６５℃でインキュベートする。等容のクロロホルム／
イソアミルアルコール(２４：１)混合物を用いる第一の抽出と、続く、等容のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(２５：２４：１)混合物を用い
る第二の抽出の後に、その上清に０．６容のイソプロパノールを加える。遠心分
離(５分間、１００００ｒｐｍ)後に、得られたペレットを７０％エタノールにて
洗ってから乾燥し、その後、少なくとも２ｍｌのＴＥ中に取り、それに２５μｌ
の５ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼ溶液を加える。１時間３７℃でのインキュベーション
後に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールでの抽出を行い、その
上清からのＤＮＡを、０．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５容のエタノール
を加えることにより沈殿させる。５分間１４０００ｒｐｍでの遠心分離後に得ら
れたペレットを７０％エタノールで洗ってから乾燥させ、その後、少なくとも０
．５ｍｌのＴＥに再懸濁させる。
【００３３】
実施例１：
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６のｈｒｐＣ２のクローニング
標的の領域を、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のゲノムＤＮＡから出発して、
プライマーＸｃＣ２．３(SEQ ID NO:１)及びＸｃＣ２．４(SEQ ID NO:２)を用い
るＰＣＲにより増幅した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のゲノムＤＮＡを抽出
して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、４０ｐモルの各プライマー、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を含むＰＣ
Ｒ反応物(この酵素用の緩衝液の最終容積５０μｌ中)にて利用した。５分間９５
℃でのインキュベーション後に、この混合物を先ず、９４℃で１分間のインキュ
ベーションとその後の６３〜４８℃に及ぶ温度(１サイクル当たり０．５℃のス
テップ)での１分間のインキュベーションと７２℃で１分間のインキュベーショ
ンを含む３０サイクルにかけ、次いで、９４℃で１分間のインキュベーションと
その後の４８℃で１分間のインキュベーションと７２℃で１分間のインキュベー
ションを含む１５サイクルにかけ、最後に７２℃で１０分間のインキュベーショ
ンにかける。１．２ｋｂに近いサイズの増幅生成物を、アガロースゲル上での移
動とその後のＱｉａｅｘキット(Quiagen)の利用により精製した。次いで、それ
を、ＥｃｏＲＶで開いたｐＺＥＲＯ−１ベクター(Invitrogen BV)中にクローン
化した。大腸菌株ＪＭ１１０のトランスフォーメーション後に、この１．２ｋｂ
断片を組み込んだプラスミドを有するクローンを選択した。このプラスミドを、
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９１と命名し、それが含むインサートを配列決定した(Genom
e Express, Grenoble, フランス国)。得られた配列(SEQ ID NO:３)を、Ｘ．カン
ペストリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＣ２遺伝子(Fenselau等、1992,Molecular
Plant Microbe Interactions, 5:390-396)の配列と整列させた。ｈｒｐＣ２遺伝
子の６１％を表す１１８８ｂｐにわたって８７％の同一性が見出された。このヌ
クレオチド配列から演繹されたアミノ酸配列は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカ
トリアのＨｒｐＣ２タンパク質の配列の同等部分と比較して９２％の同一性パー
センテージを示している。
プライマーＸｃＣ２．３(SEQ ID NO:１)及びＸｃＣ２．４(SEQ ID NO:２)を用い
るＰＣＲにより増幅した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のゲノムＤＮＡを抽出
して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、４０ｐモルの各プライマー、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を含むＰＣ
Ｒ反応物(この酵素用の緩衝液の最終容積５０μｌ中)にて利用した。５分間９５
℃でのインキュベーション後に、この混合物を先ず、９４℃で１分間のインキュ
ベーションとその後の６３〜４８℃に及ぶ温度(１サイクル当たり０．５℃のス
テップ)での１分間のインキュベーションと７２℃で１分間のインキュベーショ
ンを含む３０サイクルにかけ、次いで、９４℃で１分間のインキュベーションと
その後の４８℃で１分間のインキュベーションと７２℃で１分間のインキュベー
ションを含む１５サイクルにかけ、最後に７２℃で１０分間のインキュベーショ
ンにかける。１．２ｋｂに近いサイズの増幅生成物を、アガロースゲル上での移
動とその後のＱｉａｅｘキット(Quiagen)の利用により精製した。次いで、それ
を、ＥｃｏＲＶで開いたｐＺＥＲＯ−１ベクター(Invitrogen BV)中にクローン
化した。大腸菌株ＪＭ１１０のトランスフォーメーション後に、この１．２ｋｂ
断片を組み込んだプラスミドを有するクローンを選択した。このプラスミドを、
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９１と命名し、それが含むインサートを配列決定した(Genom
e Express, Grenoble, フランス国)。得られた配列(SEQ ID NO:３)を、Ｘ．カン
ペストリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＣ２遺伝子(Fenselau等、1992,Molecular
Plant Microbe Interactions, 5:390-396)の配列と整列させた。ｈｒｐＣ２遺伝
子の６１％を表す１１８８ｂｐにわたって８７％の同一性が見出された。このヌ
クレオチド配列から演繹されたアミノ酸配列は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカ
トリアのＨｒｐＣ２タンパク質の配列の同等部分と比較して９２％の同一性パー
センテージを示している。
【００３４】
実施例２：
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６のＨｒｐＡのクローニング
この領域を、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の部分ゲノムライブラリーをＸ．
カンペストリスｐｖベシカトリア株の同等な領域に対応するヌクレオチドプロー
ブを用いてスクリーニングすることによりクローン化した。この領域は、ｐＬ３
ｏと命名されたプラスミドにて入手可能であり、該プラスミドは、Ｘ．カンペス
トリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＢ８及びｈｒｐＡ１遺伝子を含む６．６ｋｂの
ＥｃｏＲＶインサートを含む(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Int
eractions,5:390-396)。
カンペストリスｐｖベシカトリア株の同等な領域に対応するヌクレオチドプロー
ブを用いてスクリーニングすることによりクローン化した。この領域は、ｐＬ３
ｏと命名されたプラスミドにて入手可能であり、該プラスミドは、Ｘ．カンペス
トリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＢ８及びｈｒｐＡ１遺伝子を含む６．６ｋｂの
ＥｃｏＲＶインサートを含む(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Int
eractions,5:390-396)。
【００３５】
ＨＲＰＡ１プローブを、プライマーＸｃｖＡ１５(SEQ ID NO:４)及びＸｃｖＡ
１８(SEQ ID NO:５)(各４０ｐモル)、ｐＬ３ｏプラスミドマトリクス(４０ｎｇ)
、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannh
eim)(この酵素用の緩衝液５０μｌの最終容積中)を用いるＰＣＲにより調製した
。９５℃で５分間のインキュベーション後に、この混合物を、９４℃で３０秒、
５５℃で１分及び７２℃で１．５分のシーケンスを含む３０サイクルにかけた。
７２℃で１０分の最終インキュベーション後に、６６４ｐｂの増幅生成物を、ア
ガロース上で精製し、次いでＱｕｉａｅｘキット(Quiagen)にて精製した。
１８(SEQ ID NO:５)(各４０ｐモル)、ｐＬ３ｏプラスミドマトリクス(４０ｎｇ)
、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannh
eim)(この酵素用の緩衝液５０μｌの最終容積中)を用いるＰＣＲにより調製した
。９５℃で５分間のインキュベーション後に、この混合物を、９４℃で３０秒、
５５℃で１分及び７２℃で１．５分のシーケンスを含む３０サイクルにかけた。
７２℃で１０分の最終インキュベーション後に、６６４ｐｂの増幅生成物を、ア
ガロース上で精製し、次いでＱｕｉａｅｘキット(Quiagen)にて精製した。
【００３６】
約１０μｇのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のゲノムＤＮＡを１００単位のＥ
ｃｏＲＩを用いて３７℃で１６時間消化した。次いで、上記のＨＲＰＡ１プロー
ブとハイブリダイズしたＥｃｏＲＩ断片のサイズを測定するために、慣用のサザ
ーンブロット技術を利用した。上記のＥｃｏＲＩ消化物のアガロースゲル上での
移動、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン(Amersham)上へのトランスファー{ハイブリ
ダイゼーション溶液(０．５％ ＳＤＳ；６％ ＳＳＣ；０．２５％の粉末スキム
ミルク)中での５５℃で１９時間にわたる、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏキット(Phar
macia Biotech)を用いて製造者の指示に従ってリン３２で標識したＨＲＰＡ１プ
ローブとのハイブリダイゼーションを利用}及び０．２ ＳＳＣと０．１％ ＳＤ
Ｓの溶液を用いる５５℃での洗浄の後に、このメンブレンを−８０℃で１９時間
にわたってオートラジオグラフィーにかけた。そのフィルムの現像は、７．３ｋ
ｂのサイズに近いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
ｃｏＲＩを用いて３７℃で１６時間消化した。次いで、上記のＨＲＰＡ１プロー
ブとハイブリダイズしたＥｃｏＲＩ断片のサイズを測定するために、慣用のサザ
ーンブロット技術を利用した。上記のＥｃｏＲＩ消化物のアガロースゲル上での
移動、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン(Amersham)上へのトランスファー{ハイブリ
ダイゼーション溶液(０．５％ ＳＤＳ；６％ ＳＳＣ；０．２５％の粉末スキム
ミルク)中での５５℃で１９時間にわたる、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏキット(Phar
macia Biotech)を用いて製造者の指示に従ってリン３２で標識したＨＲＰＡ１プ
ローブとのハイブリダイゼーションを利用}及び０．２ ＳＳＣと０．１％ ＳＤ
Ｓの溶液を用いる５５℃での洗浄の後に、このメンブレンを−８０℃で１９時間
にわたってオートラジオグラフィーにかけた。そのフィルムの現像は、７．３ｋ
ｂのサイズに近いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
【００３７】
それ故、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の部分的ゲノムライブラリーを、この
株の１００μｇのゲノムＤＮＡを１０００単位のＥｃｏＲＩ酵素で２０時間３７
℃で消化することにより生成した。アガロースゲル上での移動後に、７〜８ｋｂ
のサイズの断片に対応する領域を切り出して、ＤＮＡをゲルから透析バッグ(Spe
ctra/Porメンブレン、Medical Industries, Inc.製)中での泳動溶出により抽出
した。エタノールによる沈殿後に、このＤＮＡを、１０μｌの最終容積中で、前
以ってＥｃｏＲＩ酵素で開環してからエビジャコアルカリホスファターゼ(Unite
d States Biochemicals)で脱リン酸化してあるｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｓ
Ｋベクター(Stratagene)に連結した。連結用混合物を１４時間１６℃でインキュ
ベートした後に、その混合物の１０分の１を用いて、大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａ細
胞をエレクトロポレーションによりトランスフォームした。約３０００のトラン
スフォーマントを、ナイロン膜上にトランスファーしたコロニーのＨＲＰＡ１を
用いるハイブリダイゼーションにより分析した。陽性のハイブリダイゼーション
シグナルを与える１２コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地上で精製した。１２の精製したコロニーのプラスミドを抽出し、それら
のプラスミドのＥｃｏＲＩ消化物を、ＨＲＰＡ１プローブとハイブリダイズする
約７．３ｋｂの断片の存在を確認するために、該プローブを用いるサザーンブロ
ットにより分析した。種々の酵素を用いる制限分析の後に、２．７ｋｂのＳａｃ
ＩＩ断片と１．６ｋｂのＳａｃＩＩ断片を、ＳａｃＩＩにより開環したｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクター中にサブクローン化して、それぞれ、ｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ１３５及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３４ベクターを与えた。これらの
２つのベクターを部分的に配列決定し(Genome Express, Grenoble)、そしてこれ
は、１８１８ｂｐのオープンリーディングフレーム(SEQ ID NO:６)の存在を示し
たが、その演繹されたペプチド配列は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリアの
ＨｒｐＡ１タンパク質(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interacti
ons, 5:390-396)と８５％の同一性を示す。
株の１００μｇのゲノムＤＮＡを１０００単位のＥｃｏＲＩ酵素で２０時間３７
℃で消化することにより生成した。アガロースゲル上での移動後に、７〜８ｋｂ
のサイズの断片に対応する領域を切り出して、ＤＮＡをゲルから透析バッグ(Spe
ctra/Porメンブレン、Medical Industries, Inc.製)中での泳動溶出により抽出
した。エタノールによる沈殿後に、このＤＮＡを、１０μｌの最終容積中で、前
以ってＥｃｏＲＩ酵素で開環してからエビジャコアルカリホスファターゼ(Unite
d States Biochemicals)で脱リン酸化してあるｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｓ
Ｋベクター(Stratagene)に連結した。連結用混合物を１４時間１６℃でインキュ
ベートした後に、その混合物の１０分の１を用いて、大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａ細
胞をエレクトロポレーションによりトランスフォームした。約３０００のトラン
スフォーマントを、ナイロン膜上にトランスファーしたコロニーのＨＲＰＡ１を
用いるハイブリダイゼーションにより分析した。陽性のハイブリダイゼーション
シグナルを与える１２コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地上で精製した。１２の精製したコロニーのプラスミドを抽出し、それら
のプラスミドのＥｃｏＲＩ消化物を、ＨＲＰＡ１プローブとハイブリダイズする
約７．３ｋｂの断片の存在を確認するために、該プローブを用いるサザーンブロ
ットにより分析した。種々の酵素を用いる制限分析の後に、２．７ｋｂのＳａｃ
ＩＩ断片と１．６ｋｂのＳａｃＩＩ断片を、ＳａｃＩＩにより開環したｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクター中にサブクローン化して、それぞれ、ｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ１３５及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３４ベクターを与えた。これらの
２つのベクターを部分的に配列決定し(Genome Express, Grenoble)、そしてこれ
は、１８１８ｂｐのオープンリーディングフレーム(SEQ ID NO:６)の存在を示し
たが、その演繹されたペプチド配列は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリアの
ＨｒｐＡ１タンパク質(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interacti
ons, 5:390-396)と８５％の同一性を示す。
【００３８】
実施例３：
ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を含むＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６に由来する株の構
築 ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を、ｐＪＱ２００ＳＫプラスミド(Quandt及びHynes,
1993, Gene 127:15-21)中に、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３４の断片とｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９１の断片をクローン化することによりイン・ビトロで構築した(図１参
照)。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９１プラスミドをＮｃｏＩで開環してからポリメラー
ゼＩ(クレノー断片)により１５分間３０℃で２５μＭのｄＮＴＰの存在下で処理
した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより抽出してからエ
タノールで沈殿させた後に、その試料を、２０単位のＸｂａＩにより３７℃で処
理してから２０単位のＡｐｏＩにより５０℃で処理するために、４０μｌの水中
に取った。次いで、約１．２ｋｂの断片をゲルにより分離し、ＱｕｉｅｘＩＩキ
ット(Quiagen)により回収した。約１．３ｋｂのｐＢＣＡＴ１３４のＲｓａＩ−
ＳａｃＩＩ断片を、同じ方法で精製した。これらの２つの断片を、ＳａｃＩＩと
ＸｂａＩ酵素で開環したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクターに連結して
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３９プラスミドを与えた。次いで、ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠
失を有する約２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＸｂａＩ断片を、ＳａｃＩ及びＸｂａＩ酵
素で開環したｐＪＱ２００ＫＳプラスミド中にクローン化するために、このプラ
スミドから抽出することができた。その結果生成したプラスミドをｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１４０と命名した。それは、Ｘ．カンペストリス中で複製不能であり、こ
のプラスミドを相同組換えにより組み込んだＸ．カンペストリスクローンを選択
するためのゲンタマイシン耐性マーカーを有し且つ第二の相同組換え事象の後に
ゲンタマイシン耐性マーカーを排除したクローンを選択するための陽性選択マー
カーｓａｃＢを有するプラスミドである。
築 ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を、ｐＪＱ２００ＳＫプラスミド(Quandt及びHynes,
1993, Gene 127:15-21)中に、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３４の断片とｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９１の断片をクローン化することによりイン・ビトロで構築した(図１参
照)。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９１プラスミドをＮｃｏＩで開環してからポリメラー
ゼＩ(クレノー断片)により１５分間３０℃で２５μＭのｄＮＴＰの存在下で処理
した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより抽出してからエ
タノールで沈殿させた後に、その試料を、２０単位のＸｂａＩにより３７℃で処
理してから２０単位のＡｐｏＩにより５０℃で処理するために、４０μｌの水中
に取った。次いで、約１．２ｋｂの断片をゲルにより分離し、ＱｕｉｅｘＩＩキ
ット(Quiagen)により回収した。約１．３ｋｂのｐＢＣＡＴ１３４のＲｓａＩ−
ＳａｃＩＩ断片を、同じ方法で精製した。これらの２つの断片を、ＳａｃＩＩと
ＸｂａＩ酵素で開環したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクターに連結して
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３９プラスミドを与えた。次いで、ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠
失を有する約２．５ｋｂのＳａｃＩ−ＸｂａＩ断片を、ＳａｃＩ及びＸｂａＩ酵
素で開環したｐＪＱ２００ＫＳプラスミド中にクローン化するために、このプラ
スミドから抽出することができた。その結果生成したプラスミドをｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１４０と命名した。それは、Ｘ．カンペストリス中で複製不能であり、こ
のプラスミドを相同組換えにより組み込んだＸ．カンペストリスクローンを選択
するためのゲンタマイシン耐性マーカーを有し且つ第二の相同組換え事象の後に
ゲンタマイシン耐性マーカーを排除したクローンを選択するための陽性選択マー
カーｓａｃＢを有するプラスミドである。
【００３９】
このｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０プラスミドを、接合により、ＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ８２６株に導入した。これを行うために、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０を有す
るＤＨ５ａｌｐｈａ株の対数期培養物４０μｌ、ｐＲＫ２０１３プラスミドを有
するＨＢ１０１株(Ditta等、1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7347-7351)の対
数期培養物４０μｌ及びＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の対数期培養物４０μｌ
(ＭＳＸ培地中)をＭＳＸ寒天培地上で混合した。２４時間３０℃でのインキュベ
ーション後に、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０プラスミドを組み込んだＸ．カンペス
トリスのクローンを、１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＭＳＸ寒天培地上
で２回連続的に精製した。次いで、８つのクローンを、５％シュークロースを含
むＭＳＸ寒天培地上の約１ｃｍ2の面上にプレートした。７２時間３０℃でのイ
ンキュベーション後に、コロニーを、ＭＳＸ寒天培地上での２回の連続的精製に
より単離した。次いで、約３００コロニーを、１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
を含むＭＳＸ寒天培地上で、ゲンタマイシン感受性クローン(アッセイに依り、
これらのクローンの９０〜１００％)を同定するためにサブ培養した。これらの
クローンの約４０を、次いで、それらのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
消化物とＨＲＰＡ１プローブを用いるサザーンブロットにより分析した。これら
のクローンの約２５％が、野生型ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のものと異なり
且つΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失の組み込みと首尾一貫するシグナルを示した。次の
５つのクローンを、残りの実験のために選択した：ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０
１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２。
ＡＴ８２６株に導入した。これを行うために、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０を有す
るＤＨ５ａｌｐｈａ株の対数期培養物４０μｌ、ｐＲＫ２０１３プラスミドを有
するＨＢ１０１株(Ditta等、1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7347-7351)の対
数期培養物４０μｌ及びＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の対数期培養物４０μｌ
(ＭＳＸ培地中)をＭＳＸ寒天培地上で混合した。２４時間３０℃でのインキュベ
ーション後に、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０プラスミドを組み込んだＸ．カンペス
トリスのクローンを、１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＭＳＸ寒天培地上
で２回連続的に精製した。次いで、８つのクローンを、５％シュークロースを含
むＭＳＸ寒天培地上の約１ｃｍ2の面上にプレートした。７２時間３０℃でのイ
ンキュベーション後に、コロニーを、ＭＳＸ寒天培地上での２回の連続的精製に
より単離した。次いで、約３００コロニーを、１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
を含むＭＳＸ寒天培地上で、ゲンタマイシン感受性クローン(アッセイに依り、
これらのクローンの９０〜１００％)を同定するためにサブ培養した。これらの
クローンの約４０を、次いで、それらのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
消化物とＨＲＰＡ１プローブを用いるサザーンブロットにより分析した。これら
のクローンの約２５％が、野生型ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のものと異なり
且つΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失の組み込みと首尾一貫するシグナルを示した。次の
５つのクローンを、残りの実験のために選択した：ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０
１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２。
【００４０】
実施例４：
ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を含むＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６に由来する株のサ
ザーンブロットによる特性決定 これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及
び１０２２を、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ消化物のＨＲＰ３’Ａ１、ＨＲＰＢ５及びＨＲＰＣ２プローブとのハイブリ
ダイゼーションプロフィルを分析することにより特性決定した。
ザーンブロットによる特性決定 これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及
び１０２２を、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ消化物のＨＲＰ３’Ａ１、ＨＲＰＢ５及びＨＲＰＣ２プローブとのハイブリ
ダイゼーションプロフィルを分析することにより特性決定した。
【００４１】
このＨＲＰ３’Ａ１プローブは、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１３４プラスミドの１．
６ｋｂのＳａｃＩＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により
精製することにより得た。
６ｋｂのＳａｃＩＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により
精製することにより得た。
【００４２】
ＨＲＰＣ２プローブは、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９１プラスミドの１．２ＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｂａＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により精製す
ることにより得た。
Ｉ−ＸｂａＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により精製す
ることにより得た。
【００４３】
ＨＲＰＢ５プローブは、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２９プラスミドの１．５ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により精製する
ことにより得た。このインサートの配列決定は、特に、オープンリーディングフ
レーム(SEQ ID NO:７)を示したが、その演繹されたペプチド配列は、Ｘ．カンペ
ストリスｐｖベシカトリアのＨｒｐＢ５タンパク質(Fenselau等、1995, Mol.Pla
nt-Microbe Interactions, 8:845-854)と７７％の同一性を示す。ｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１２９プラスミドは、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のＢａｍＨＩゲノム
ＤＮＡ断片(１．３〜１．９ｋｂのサイズ)をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫベ
クター中にクローン化して、そのコロニーを実施例２に記載したのと同様の仕方
でＨＲＰＢプローブを用いてスクリーニングすることにより得た。ＨＲＰＢプロ
ーブを、プライマーＲＳＴ２及びＲＳＴ３(Leite等、1994, Appl.Environ.Micro
biol.60:1068-1077)とｐＢ１０ｇプラスミドマトリクス(U.Bonas, 私信)を用い
るＰＣＲにより得た。このｐＢ１０ｇプラスミドは、キサントモナス・カンペス
トリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＢ領域とｈｒｐＡ１遺伝子を含む７．３ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片(Fenselau等、1995, Mol.Plant-Microbe Interactions, 8:845-8
54)を内部にクローン化して有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳプラスミドに対
応する。ＰＣＲ反応を、４０ｐモルの各プライマー、５０ｎｇのｐＢ１０ｇ、０
．２ｍＭｄＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)
をこの酵素用の緩衝液の最終容積５０μｌ中で用いて行った。５分間９５℃での
インキュベーションの後に、その混合物を、先ず、９５℃で３０秒のインキュベ
ーションとその後の７０℃から６３℃に及ぶ温度での４０秒のインキュベーショ
ン(１サイクル当たり０．３℃のステップ)と７２℃で１分のインキュベーション
を含む２４サイクルにかけ、次いで、９５℃で３０秒のインキュベーションとそ
の後の６３℃で４０秒のインキュベーションと７２℃で１分のインキュベーショ
ンを含む６サイクルにかけ、そして最後に７２℃で５分のインキュベーションに
かけた。次いで、約８４０ｂｐの断片を、アガロースゲル上で及びＱｕｉａｅｘ
キット(Quiagen)の利用により精製した。
ＢａｍＨＩ断片をゲル上での移動及びＱｕｉａｅｘキットの利用により精製する
ことにより得た。このインサートの配列決定は、特に、オープンリーディングフ
レーム(SEQ ID NO:７)を示したが、その演繹されたペプチド配列は、Ｘ．カンペ
ストリスｐｖベシカトリアのＨｒｐＢ５タンパク質(Fenselau等、1995, Mol.Pla
nt-Microbe Interactions, 8:845-854)と７７％の同一性を示す。ｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１２９プラスミドは、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株のＢａｍＨＩゲノム
ＤＮＡ断片(１．３〜１．９ｋｂのサイズ)をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫベ
クター中にクローン化して、そのコロニーを実施例２に記載したのと同様の仕方
でＨＲＰＢプローブを用いてスクリーニングすることにより得た。ＨＲＰＢプロ
ーブを、プライマーＲＳＴ２及びＲＳＴ３(Leite等、1994, Appl.Environ.Micro
biol.60:1068-1077)とｐＢ１０ｇプラスミドマトリクス(U.Bonas, 私信)を用い
るＰＣＲにより得た。このｐＢ１０ｇプラスミドは、キサントモナス・カンペス
トリスｐｖベシカトリアのｈｒｐＢ領域とｈｒｐＡ１遺伝子を含む７．３ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片(Fenselau等、1995, Mol.Plant-Microbe Interactions, 8:845-8
54)を内部にクローン化して有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳプラスミドに対
応する。ＰＣＲ反応を、４０ｐモルの各プライマー、５０ｎｇのｐＢ１０ｇ、０
．２ｍＭｄＮＴＰ及び１．２５ＵのＰｗｏポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)
をこの酵素用の緩衝液の最終容積５０μｌ中で用いて行った。５分間９５℃での
インキュベーションの後に、その混合物を、先ず、９５℃で３０秒のインキュベ
ーションとその後の７０℃から６３℃に及ぶ温度での４０秒のインキュベーショ
ン(１サイクル当たり０．３℃のステップ)と７２℃で１分のインキュベーション
を含む２４サイクルにかけ、次いで、９５℃で３０秒のインキュベーションとそ
の後の６３℃で４０秒のインキュベーションと７２℃で１分のインキュベーショ
ンを含む６サイクルにかけ、そして最後に７２℃で５分のインキュベーションに
かけた。次いで、約８４０ｂｐの断片を、アガロースゲル上で及びＱｕｉａｅｘ
キット(Quiagen)の利用により精製した。
【００４４】
サザーンブロット分析を、「Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ラベリング」キット
(Amersham)を用いて、与えられた指示に従って、プローブを標識することにより
行った。アガロースゲル上での移動後に、ゲノムＤＮＡ消化物を、Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ＋メンブレン(Amersham)上に与えられた指示に従ってトランスファーしてから
、０．５Ｍ リン酸緩衝液及び７％ＳＤＳよりなるハイブリダイゼーション用溶
液(１１５ｍｌのＮａ2ＨＰＯ4、８４．６ｍｌの Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、２００ｍｌ
のＨ2Ｏ及び２８ｇのＳＤＳ)中でインキュベートした。標識したプローブを、５
分間１００℃でインキュベートしてから５分間室温に置いた後に、１２ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液にて希釈し、５分間１００℃でインキュベートする。
この混合物を、次いで、これらのメンブレンと、６〜２０時間、６５℃で接触さ
せる。次いで、後者を、１０〜１５分間、１％のＳＤＳを含む０．１Ｍ リン酸
緩衝液(４２．３ｍｌの１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、５７．７ｍｌの１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4
、９００ｍｌのＨ2Ｏ及び１０ｇのＳＤＳ)中で洗ってから露出させる。
(Amersham)を用いて、与えられた指示に従って、プローブを標識することにより
行った。アガロースゲル上での移動後に、ゲノムＤＮＡ消化物を、Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ＋メンブレン(Amersham)上に与えられた指示に従ってトランスファーしてから
、０．５Ｍ リン酸緩衝液及び７％ＳＤＳよりなるハイブリダイゼーション用溶
液(１１５ｍｌのＮａ2ＨＰＯ4、８４．６ｍｌの Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、２００ｍｌ
のＨ2Ｏ及び２８ｇのＳＤＳ)中でインキュベートした。標識したプローブを、５
分間１００℃でインキュベートしてから５分間室温に置いた後に、１２ｍｌのハ
イブリダイゼーション溶液にて希釈し、５分間１００℃でインキュベートする。
この混合物を、次いで、これらのメンブレンと、６〜２０時間、６５℃で接触さ
せる。次いで、後者を、１０〜１５分間、１％のＳＤＳを含む０．１Ｍ リン酸
緩衝液(４２．３ｍｌの１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、５７．７ｍｌの１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4
、９００ｍｌのＨ2Ｏ及び１０ｇのＳＤＳ)中で洗ってから露出させる。
【００４５】
ＨＲＰＢ５プローブを用いて選られた結果(図２)は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８
２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約４．８ｋｂ(ＥｃｏＲ
Ｉ消化物)と１．６ｋｂ(ＢａｍＨＩ消化物及びＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)
に示している。これらの結果は、Arlat等によるマッピング(Molecular Plant-Mi
crobe Interactions, 1991, 4:593-601)及び前記のｈｒｐＢ５遺伝子の位置と一
致する。調べた何れのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株も、ＨＲＰＢ５を用いては、ハイ
ブリダイゼーションシグナルを示さず、これは、これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ
株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２のゲノムへのΔｈｒｐ
Ａ１−Ｃ２欠失の組み込みと首尾一貫する(図２は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株を
用いて得られたハイブリダイゼーション結果のみを示している)。
２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約４．８ｋｂ(ＥｃｏＲ
Ｉ消化物)と１．６ｋｂ(ＢａｍＨＩ消化物及びＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)
に示している。これらの結果は、Arlat等によるマッピング(Molecular Plant-Mi
crobe Interactions, 1991, 4:593-601)及び前記のｈｒｐＢ５遺伝子の位置と一
致する。調べた何れのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株も、ＨＲＰＢ５を用いては、ハイ
ブリダイゼーションシグナルを示さず、これは、これらのＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ
株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２のゲノムへのΔｈｒｐ
Ａ１−Ｃ２欠失の組み込みと首尾一貫する(図２は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株を
用いて得られたハイブリダイゼーション結果のみを示している)。
【００４６】
ＨＲＰＣ２プローブを用いて得られた結果(図３)は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８
２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約５．５ｋｂ(ＥｃｏＲ
Ｉ消化物)に及び約２．６ｋｂ(ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)に示している。
これらの結果は、Arlat等によるマッピング(Molecular Plant-Microbe Interact
ions, 1991, 4:593-601)、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア中のｈｒｐ遺伝
子の構成(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5:390-3
96)及び上記のｈｒｐＢ５遺伝子の位置と一致する。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１
０１６、１０１７、１０１９及び１０２１を用いて得られた結果は、７〜８ｋｂ
(ＢａｍＨＩ消化物)に及び４．４ｋｂ(ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)にシグナ
ルを示している。図１に示したマッピングを前提として、これらの結果は、ＲＰ
Ａ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２のゲ
ノムへのΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失の組み込みと一致する。
２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約５．５ｋｂ(ＥｃｏＲ
Ｉ消化物)に及び約２．６ｋｂ(ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)に示している。
これらの結果は、Arlat等によるマッピング(Molecular Plant-Microbe Interact
ions, 1991, 4:593-601)、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア中のｈｒｐ遺伝
子の構成(Fenselau等、1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5:390-3
96)及び上記のｈｒｐＢ５遺伝子の位置と一致する。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１
０１６、１０１７、１０１９及び１０２１を用いて得られた結果は、７〜８ｋｂ
(ＢａｍＨＩ消化物)に及び４．４ｋｂ(ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)にシグナ
ルを示している。図１に示したマッピングを前提として、これらの結果は、ＲＰ
Ａ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６、１０１７、１０１９、１０２１及び１０２２のゲ
ノムへのΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失の組み込みと一致する。
【００４７】
最後に、ＨＲＰ３’Ａ１プローブを用いて得られた結果は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ８２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約７．３ｋｂ(Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)に示している。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６
、１０１７、１０１９及び１０２１を用いると、このハイブリダイゼーションシ
グナルは、４．４ｋｂにあり、これは、これらの株のゲノムへのΔｈｒｐＡ１−
Ｃ２欠失の組み込みと一致する。
ＡＴ８２６株について、ハイブリダイゼーションシグナルを、約７．３ｋｂ(Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化物)に示している。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ株１０１６
、１０１７、１０１９及び１０２１を用いると、このハイブリダイゼーションシ
グナルは、４．４ｋｂにあり、これは、これらの株のゲノムへのΔｈｒｐＡ１−
Ｃ２欠失の組み込みと一致する。
【００４８】
実施例５：
ＨｒｐＡ１−Ｃ２欠失を含むＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６に由来する株の病原
性 病原性試験をキャベツ植物(Brassica oleracera var. captiva cultivar Siri
a)において行った。これらの植物を、人工気候室内で、次のパラメーターに従っ
て栽培した：２５℃、５５％の湿度、飽和光度(４０００Ｗ／ｍ)で１４時間;２
５℃、６０％の湿度で１０時間。それらに、２−葉ステージに、即ち播種から約
１３日後に、感染させた。試験した各株につき、８つの植物を用い、第一の葉の
末端部の主脈を感染させたつま楊枝で刺した。つま楊枝を、調べる株のＭＳＸ培
地における２日培養物(約１０８細菌／ｍｌ)にその先端を浸すことにより汚染さ
せた。陰性対照は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア(Ｂ２２９ＲＩ株＝Ｒ
ＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８１そしてＢ２３０ＲＩ株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８２
)の参照株(これらは、コショウに対して植物病原性であり、Clause Semencesに
て分離された)の混合物よりなるものであった。陽性対照は、Ｘ．カンペストリ
スｐｖカンペストリス(２９６３株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３７９そして６３Ｃ
２ＡＭ株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８０)の参照株(これらは、キャベツに対して
植物病原性であり、Clause Semencesにて分離された)の混合物よりなるものであ
った。症状(Ｖ型の黄色い病変)が、感染後１２〜１４日で現われ、測定できた。
各植物について、次のように評点を与えた:０、症状なし、１、感染箇所に近い
位置の色素脱失；２、０．５ｃｍ2未満の壊死；３、０．５〜１．５ｃｍ2の壊死
；４、１．５ｃｍ2より大きい壊死；５、葉全体の壊死。同じ株を感染させた８
つの植物の評点の合計が、この株の病原性評点である(表１)。
性 病原性試験をキャベツ植物(Brassica oleracera var. captiva cultivar Siri
a)において行った。これらの植物を、人工気候室内で、次のパラメーターに従っ
て栽培した：２５℃、５５％の湿度、飽和光度(４０００Ｗ／ｍ)で１４時間;２
５℃、６０％の湿度で１０時間。それらに、２−葉ステージに、即ち播種から約
１３日後に、感染させた。試験した各株につき、８つの植物を用い、第一の葉の
末端部の主脈を感染させたつま楊枝で刺した。つま楊枝を、調べる株のＭＳＸ培
地における２日培養物(約１０８細菌／ｍｌ)にその先端を浸すことにより汚染さ
せた。陰性対照は、Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア(Ｂ２２９ＲＩ株＝Ｒ
ＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８１そしてＢ２３０ＲＩ株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８２
)の参照株(これらは、コショウに対して植物病原性であり、Clause Semencesに
て分離された)の混合物よりなるものであった。陽性対照は、Ｘ．カンペストリ
スｐｖカンペストリス(２９６３株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３７９そして６３Ｃ
２ＡＭ株＝ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ３８０)の参照株(これらは、キャベツに対して
植物病原性であり、Clause Semencesにて分離された)の混合物よりなるものであ
った。症状(Ｖ型の黄色い病変)が、感染後１２〜１４日で現われ、測定できた。
各植物について、次のように評点を与えた:０、症状なし、１、感染箇所に近い
位置の色素脱失；２、０．５ｃｍ2未満の壊死；３、０．５〜１．５ｃｍ2の壊死
；４、１．５ｃｍ2より大きい壊死；５、葉全体の壊死。同じ株を感染させた８
つの植物の評点の合計が、この株の病原性評点である(表１)。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株は、葉の進行性のしおれを引き起こすが、構築
した株は、せいぜい、局所的な壊死性のしおれを引き起こしただけであり、これ
は、病原性のないことを反映している。
した株は、せいぜい、局所的な壊死性のしおれを引き起こしただけであり、これ
は、病原性のないことを反映している。
【００５１】
実施例６：
ＨｒｐＡ１−Ｃ２欠失を含むＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６に由来する株による
キサンタンの生成 これらの株のキサンタン生産力を、イソプロパノールを用いて沈殿させること
のできる、培養物４０ｍｌ中に含まれる固形物を測定することにより評価した。
ＭＳＸ中で２４時間予備培養した後に、５００ｍｌの三角フラスコ内の１００ｍ
ｌのＭＳＸ培地に、ほぼ同数の細菌(０．４ｍｌのＯＤ６６０＝０．２５の予備
培養物)を接種した。６日間震盪(２００ｒｐｍ)しながら３０℃でのインキュベ
ーションの後に、４０グラムの培養物を取り出して、１５０ｍｌのイソプロパノ
ールを混合した。濾過後に、回収された繊維を、７０ｍｌのイソプロパノールで
２回洗ってから乾燥し、その後、オーブンから出したときに重量を測定した。こ
の操作は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の３つの独立の培養物にて行ったが、
約１０％の生産力の変動を示した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株とそのΔｈｒ
ｐＡ１−Ｃ２誘導体を用いて得られた結果を表２に与える。
キサンタンの生成 これらの株のキサンタン生産力を、イソプロパノールを用いて沈殿させること
のできる、培養物４０ｍｌ中に含まれる固形物を測定することにより評価した。
ＭＳＸ中で２４時間予備培養した後に、５００ｍｌの三角フラスコ内の１００ｍ
ｌのＭＳＸ培地に、ほぼ同数の細菌(０．４ｍｌのＯＤ６６０＝０．２５の予備
培養物)を接種した。６日間震盪(２００ｒｐｍ)しながら３０℃でのインキュベ
ーションの後に、４０グラムの培養物を取り出して、１５０ｍｌのイソプロパノ
ールを混合した。濾過後に、回収された繊維を、７０ｍｌのイソプロパノールで
２回洗ってから乾燥し、その後、オーブンから出したときに重量を測定した。こ
の操作は、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の３つの独立の培養物にて行ったが、
約１０％の生産力の変動を示した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株とそのΔｈｒ
ｐＡ１−Ｃ２誘導体を用いて得られた結果を表２に与える。
【００５２】
【表２】
【００５３】
この生産力は、イソプロパノールにより抽出可能な固形物の培養物１グラム当
たりのグラム数で表してある。
たりのグラム数で表してある。
【配列表】
【図１】
ｈｒｐ遺伝子欠失を有するＸ．カンペストリスＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株
の誘導体の構築のストラテジーを図式表示した図である。 Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア中のｈｒｐ遺伝子の構成は、Fenselau及
びBonas(1995,Mol.Plant Microbe Interact.8(6),845-854)により及びFenselau
等(1992,Mol.Plant Microbe Interact.5,390-396)により記載され、部分的に、
受理番号Ｕ３３５４８でＧｅｎｂａｎｋにて入手可能である。ＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ８２６株からクローン化された相同領域が表されているが、これは、それら
がクローン化されたプラスミドの名称である。Ｘ．カンペストリスｐｖカンペス
トリスのｈｒｐ領域の制限地図は、Arlat等、1991,Mol.Plant Microbe Interact
4:593-601により公開されたものであり、実施例１〜４に与えた結果により完成
される。実施例に記載したｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０プラスミドにより運ばれる
ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を、二重相同組換えによってゲノムに導入した。
の誘導体の構築のストラテジーを図式表示した図である。 Ｘ．カンペストリスｐｖベシカトリア中のｈｒｐ遺伝子の構成は、Fenselau及
びBonas(1995,Mol.Plant Microbe Interact.8(6),845-854)により及びFenselau
等(1992,Mol.Plant Microbe Interact.5,390-396)により記載され、部分的に、
受理番号Ｕ３３５４８でＧｅｎｂａｎｋにて入手可能である。ＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ８２６株からクローン化された相同領域が表されているが、これは、それら
がクローン化されたプラスミドの名称である。Ｘ．カンペストリスｐｖカンペス
トリスのｈｒｐ領域の制限地図は、Arlat等、1991,Mol.Plant Microbe Interact
4:593-601により公開されたものであり、実施例１〜４に与えた結果により完成
される。実施例に記載したｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４０プラスミドにより運ばれる
ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失を、二重相同組換えによってゲノムに導入した。
【図２】
ＨＲＰＢ５プローブとＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株及びこの株の２つの誘導
体(ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失が組み込まれている)のゲノムＤＮＡを用いたサザー
ンブロットにより得られたハイブリダイゼーションシグナルを表した図である。
サイズマーカーのバンドの位置は、トランスファー前にエチジウムブロミドで染
色したゲル上での移動距離の比較により記してある。これらのサイズは、キロベ
ースで表してある。
体(ΔｈｒｐＡ１−Ｃ２欠失が組み込まれている)のゲノムＤＮＡを用いたサザー
ンブロットにより得られたハイブリダイゼーションシグナルを表した図である。
サイズマーカーのバンドの位置は、トランスファー前にエチジウムブロミドで染
色したゲル上での移動距離の比較により記してある。これらのサイズは、キロベ
ースで表してある。
【図３】
下記のＨＲＰＣ２プローブと、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８２６株の及びΔｈｒｐ
Ａ１−Ｃ２欠失を組み込んだこの株の５つの誘導体のゲノムＤＮＡを用いたサザ
ーンブロットにより得られたハイブリダイゼーションシグナル表す図である。こ
れらのサイズマーカーバンドの位置は、トランスファー前にエチジウムブロミド
により染色したゲル上での移動距離との比較により記されたものである。これら
のサイズは、キロベースで表されている。
Ａ１−Ｃ２欠失を組み込んだこの株の５つの誘導体のゲノムＤＮＡを用いたサザ
ーンブロットにより得られたハイブリダイゼーションシグナル表す図である。こ
れらのサイズマーカーバンドの位置は、トランスファー前にエチジウムブロミド
により染色したゲル上での移動距離との比較により記されたものである。これら
のサイズは、キロベースで表されている。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月１０日（２００１．７．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 19/06
Ｃ１２Ｒ 1:64）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ポール シェヴァレルー
フランス国 エフ79500 メル、リュ エ
ルワ リカール
Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA80 CA09 DA05 GA11
HA03
4B064 AF16 CA02 CC24 DA10
4B065 AA56 AB01 AC14 BA02 CA22
CA41
Claims (19)
- 【請求項１】 少なくとも１つの病原性遺伝子の不活性化により植物病原性
を失っており且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保持している細菌株。 - 【請求項２】 ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子の有利
には少なくとも２つの遺伝子の好ましくは少なくとも３つの遺伝子の不活性化に
より安定に非植物病原性にされた、請求項１に記載の細菌株。 - 【請求項３】 ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群の５〜９遺伝子の不活性化により
安定に非植物病原性にされた、請求項１又は２に記載の細菌株。 - 【請求項４】 少なくとも１つの病原性遺伝子の不活性化により植物病原性
を失っており且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保持しているキサント
モナス株である、請求項１に記載の細菌株。 - 【請求項５】 キサントモナス・カンペストリス種である、請求項４に記載
のキサントモナス株。 - 【請求項６】 キサントモナス・カンペストリスｐｖカンペストリスである
、請求項５に記載のキサントモナス株。 - 【請求項７】 前記の遺伝子の不活性化が、ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群中の
少なくとも１ｋｂの、好ましくは少なくとも３ｋｂの、有利には少なくとも５ｋ
ｂのＤＮＡの領域の欠失により得られ且つエキソポリサッカリドを生成する能力
を保持している、前記の請求項の何れか１つに記載のキサントモナス株。 - 【請求項８】 最大で４０ｋｂのＤＮＡの領域の欠失を含む、前記の請求項
の何れか１つに記載のキサントモナス株。 - 【請求項９】 ｈｒｐＡ１〜ｈｒｐＣ２遺伝子の全部又は部分の欠失により
得られる、請求項８に記載のキサントモナス株。 - 【請求項１０】 ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子群中の少なくとも１ｋｂの、好ま
しくは少なくとも３ｋｂの、有利には少なくとも５ｋｂのＤＮＡの領域の欠失を
含み且つエキソポリサッカリドを生成する能力を保持している、本質的に非植物
病原性のキサントモナス株。 - 【請求項１１】 ｈｒｐＡ１〜Ｃ２遺伝子の全部又は部分の欠失により得ら
れる、本質的に非植物病原性のキサントモナス株。 - 【請求項１２】 ＢＩＯＣＡＴ １０１６、ＢＩＯＣＡＴ １０１７、ＢＩＯ
ＣＡＴ １０１９、ＢＩＯＣＡＴ １０２１及びＢＩＯＣＡＴ １０２２株、より
選択する、それぞれ番号ＣＢＳ １０１９４０、ＣＢＳ １０１９４１、ＣＢＳ
１０１９４２、ＣＢＳ １０１９４３及びＣＢＳ １０１９４４にてＣＢＳに寄託
された、本質的に非植物病原性のキサントモナス・カンペストリス株。 - 【請求項１３】 エキソポリサッカリドが、キサンタンガムである、請求項
４〜１３の１つに記載のキサントモナス株。 - 【請求項１４】 請求項９〜１３に記載の株の製造に利用されるｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１４０プラスミド。 - 【請求項１５】 ｈｒｐ又はｈｒｃ遺伝子の全部又は部分の欠失を含むプラ
スミドとの相同組換えによって株を得る、請求項７〜１３の何れか１つに記載の
株の製造方法。 - 【請求項１６】 請求項１〜１３の何れか１つに記載の適当なキサントモナ
ス属、好ましくはキサントモナス・カンペストリスを発酵培地中でのエキソポリ
サッカリドの生成を可能にする条件下で培養する、細菌性エキソポリサッカリド
特にキサンタンガムの製造方法。 - 【請求項１７】 ヌクレオチド配列SEQ ID NO:３を含む核酸。
- 【請求項１８】 ヌクレオチド配列SEQ ID NO:６を含む核酸。
- 【請求項１９】 ヌクレオチド配列SEQ ID NO:７を含む核酸。
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