CA2375791A1 - Souches avirulentes de xanthomonas campestris, produisant du xanthane - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne une souche bactérienne ayant perdu le caractère phytopathogène par inactivation d'au moins un gène de virulence et ayant conservé la capacité de production d'exopolysaccharide.

Description

SOUCHES AVIRULENTES DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS, PRODUISANT DU XANTHANE
L'invention a pour objet de nouvelles souches bactériennes, notamment de Xanthomonas, en particulier Xanthomonas campestris ayant perdu le caractère phytopathogène mais ayant sensiblement conservé la capacité de production d'exopolysaccharide, notamment de gomme xanthane.
s Xanfhomonas campestris pv. campestris est une bactérie Gram-négative phytopathogène des Crucifères utilisée pour la production industrielle de gomme xanthane (Martin, 1994, Res. Microbiol. 145 :9 93-97).
L'importance économique de cet exopolysaccharide a suscité de nombreuses études sur les gènes impliqués dans cette synthèse (Martin, io 1994, précité).
De nombreux déterminants de la pathogénicité ont été décrits (Dow et Daniels, 1994, In Bacterial pathogenesis of plants and animais, JL
Dangl, ed. Springer Verlag, Heidelberg). Parmi eux, se trouvent des enzymes extracellulaires à activité hydrolytique sur les tissus végétaux. Lorsque le is système de sécrétion responsable de l'export de ces enzymes est inactivé, les souchès de X. campestris ont un phénotype non phytopathogène associé à
des symptômes des plantes très réduits (Dow et Daniels, 1994, précité). Parmi les déterminants de la pathogénicité décrits se trouve l'exopolysaccharide, qui semble avoir un rôle dans la phase précoce de la maladie (Dow et Daniels, 20 1994, précité ; Katzen et al., 1998, J. Bacteriol. 180 : 1607-1617). De même, un gène hrpXc, décrit chez X. campestris pv. campestris (Kamoun et al., 1992, Mol. Plant Microbe Interact. 5 : 22-33), est impliqué dans la suppression des réponses de défense de la plante hôte compatible, puisque sa mutation entraîne une réaction nécrotique caractéristique (réponse d'hypersensibilité, 2s HR). Les gènes d'avirulence décrits chez les différents pathovars de X.
campestris sont aussi impliqués dans la pathogénicité de la bactérie puisqu'ils sont reconnus par la plante possédant le gène de résistance correspondant et conduisent à une réaction HR (Dow et Daniels, 1994, précité ; Yang et al., 1995, Mol. Plant Microbe Interact. 8 : 627-631 ). Parmi les autres gènes 3o impliqués dans la pathogénicité des Xanthomonas (Dow et Daniels, 1994, précité), ont été décrits deux gènes chez X. campestris pv campestris dont des mutations conduisent à une pathogénicité réduite sans modifications des niveaux d'accumulation d'enzymes extracellulaires et d'exopolysaccharides

2 (Osbourn et ai., 1990, Mol. Plant Microbe Interact. 3 : 280-285). D'autres déterminants de la pathogénicité sont constitués par différents jeux indépendants de gènes régulateurs de la synthèse des enzymes extracellulaires et de l'exopolysaccharide parmi lesquels on trouve : les gènes s rpfA à H, dont des mutations conduisent à une réduction de la production d'exopolysaccharide ; rpfN, un represseur de la synthèse de ces enzymes et de l'exopolysaccharide ; cip, dont des mutations conduisent à une pathogénicité réduite et à une moindre production d'exopolysaccharides (Dow et Daniels, 1994, précité). Enfin, d'autres déterminants de la pathogénicité
io sont constitué par les gènes hrp.
Les gène hrp (réaction d'hypersensibilité et pathogénicité) sont essentiels pour la pathogénicité sur plante compatible et pour la réaction d'hypersensibilité sur les hôtes résistants (Alfano et Collmer, 1997, J.
Bacteriol.
179 : 5655-5662 ). Ils ont été clonés et caractérisés à des degrés divers chez is plusieurs bactéries phytopathogènes des genres Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia et Xanthomonas où ils sont relativement conservés (Zurek et Bukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47 : 227-241 ; Alfano et Collmer, précité), en particulier chez X. campestris pv. vesicatoria (Huguet et al., 1998, Molec. Microbiol 29 : 1379-1390 ; Fenselau et al., 1992, Molecular 2o Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396 ; Bonas, 1994, précité). Les plus conservés d'entre eux ont d'ailleurs été renommés gènes hrc (Bogdanove et al., 1996, Mol. Microbiol., 20 : 681-683). Parmi les fonctions des gènes hrp décrites à ce jour se trouvent la régulation de leur expression, la production de protéines élicitrices de la réponse de l'hôte, la constitution d'un système de 2s sécrétion spécifique (dit de type III) et la synthèse de glucanes periplasmiques (Zurek et Bukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47 : 227-241 ;
Mudgett et Staskawicz, 1998, Current Opinion in Microbiology 1 : 109-114 ;
Lindgren, 1997, Annu Rev. Phytopathol. 35 :129-152 ; Alfano et Collmer, 1997, précité ; Bonas, 1994, précité). Un ensemble de gènes hrp a été cloné chez X.
3o campestris pv. campestris (Arlat et al., 1991, Mol. Plant Microbe Interact 593-601 ) mais non séquencé. II est aussi rapporté que les souches porteuses de mutations dans ces gènes réalisées à l'aide d'un transposon auraient une production normale d'exopolysaccharide d'après l'aspect des colonies sur

3 boite. Aucune quantification plus précise de la productivité de xanthane de ces souches n'a toutefois été publiée.
En outre, les mutations réalisées chez ces souches ne possèdent pas un caractère de stabilité suffisant pour une utilisation industrielle pour la s production de gomme xanthane. En effet, le transposon utilisé contient le gène codant pour la transposase (Simon et al., 1989, Gene 80 : 161-169) ce qui n'exclue pas un événement d'excision du transposon à une fréquence pouvant être estimée entre 10-6 et 10-3 par génération (Berg et al., 1989, In Berg and Howe ed., Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
1o pp 879-926 ; Craig, In Escherichia coli and Salmonelle, Neidhardt ed., ASM
Press, Washington, D.C. pp 2339-2362). De plus, le transposon utilisé
contient un gène de résistance aux antibiotiques néomycine et kanamycine.
Enfin, le transposon inséré dans le génome de ces souches constitue un élément d'ADN non homologue puisque celui-ci n'est pas un élément naturel is du génome de la souche utilisée.
Bien qu'il n'existe pas de réglementation spécifique à l'heure actuelle en Europe imposée par le caractère phytopathogène de Xanthomonas campestris pv. campestris, il est hautement souhaitable, pour des raisons liées à l'environnement, d'utiliser des souches de Xanthomonas campestris non 2o phytopathogènes, afin de diminuer le risque éventuel de contamination de cultures d'intérêt agronomique à proximité du site. La sélection d'une telle souche par les techniques classiques de mutagenèse aléatoire de production est un processus long et fastidieux puisqu'il doit faire intervenir un criblage à
haute capacité permettant d'isoler une souche non phytopathogène mais ayant 2s conservé ses caractéristiques de productivité, c'est-à-dire sans mutations secondaires.
Par ailleurs, l'utilisation d'une souche génétiquement modifiée produisant une gomme xanthane modifiée (telle que décrite dans US
5,514,791 ) ou ayant une productivité améliorée est soumise à une 3o réglementation stricte (Theilleux 1998, Dictionnaire permanent Bioéthique et Biotechnologies, ed Législatives, pp 1595-1648). Celle-ci impose notamment pour une construction réalisée dans une souche présentant un danger pour les plantes, d'adopter des mesures de confinement sévères sur le site de

4 production. Les investissements nécessaires auraient alors des conséquences économiques négatives.
II existe par conséquent un besoin de disposer d'une souche industrielle de X. campestris stablement dépourvue de caractère s phytopathogène mais ayant retenu ses propriétés de productivité de gomme xanthane. De plus, pour des raisons réglementaires et afin de simplifier le traitement des déchets issus de la séparation de la gomme xanthane de la biomasse, il est utile que la souche ne contienne pas de gène hétérologue codant pour une résistance à un antibiotique. Enfin, au regard des législations 1o française et européenne, il est préférable que la souche obtenue ait été
construite par autoclonage, ce qui signifie qu'elle ne contienne pas d'éléments d'ADN étranger à son patrimoine génétique naturel.
Les travaux des inventeurs ont permis la construction d'une souche de X. campestris possédant les propriétés requises.
is De manière surprenante, il a été montré grâce à l'invention qu'une bactérie devenue non phytopathogène de manière stable, par délétion d'un fragment de taille importante affectant plusieurs kilobases de gènes impliqués dans la virulence, était néanmoins capable de produire de la gomme xanthane.
2o De manière plus surprenante encore, la souche modifiée de l'invention produit de la gomme xanthane en une quantité et une qualité en tous points comparables à celle produite par la souche sauvage à partir de laquelle la construction a été réalisée.
L'invention a pour objet une souche bactérienne ayant perdu le 2s caractère phytopathogène par inactivation d'au moins un gène de virulence et ayant conservé la capacité de production d'exopolysaccharide.
La souche bactérienne selon l'invention est avantageusement rendue stablement non phytopathogène par délétion d'au moins un gène, avantageusement au moins deux gènes, de préférence au moins trois gènes 3o du groupe de gènes hrp ou hrc, et de préférence 5 à 9 gènes du groupe de gènes hrp ou hrc.
Par "stablement dépourvue de caractère phytopathogène", on entend que ce caractère est conservé après un nombre de cycles cellulaires d'au moins 20 générations, avantageusement d'au moins 30 générations, de préférence d'au moins 40 générations.
Parmi les bactéries ayant perdu leur caractère phytopathogène et avantageusement utilisables pour une production industrielle s d'exopolysaccharide, on peut citer en particulier les genres suivants :
Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia et Xanthomonas.
L'invention a notamment pour objet une souche Xanthomonas essentiellement dépourvue de caractère phytopathogène de manière stable et io ayant conservé sensiblement la capacité de production d'exopolysaccharide.
Par "essentiellement non phytopathogène", on entend l'absence de lésions et/ou flétrissures envahissantes sur des feuilles de plantes hôtes crucifères, notamment le chou (Brassica oleracera), après au moins 15 jours suivant l'inoculation de la feuille par blessure de la nervure centrale.
1s Avantageusement, la souche Xanthomonas est de l'espèce campestris, en particulier pv campestris.
L'inactivation du(des)dit(s) gènes) est obtenue de préférence par une délétion d'au moins 1 kb, de préférence au moins 3 kb, avantageusement au moins 5 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc, de préférence 9 kb et 2o pouvant aller jusqu'à 40 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc.
Dans un mode de réalisation préféré, la souche de Xanthomonas, notamment campestris essentiellement non phytopathogène selon l'invention est obtenue par délétion des gènes hrpA1 à hrpC2 d'une souche sauvage phytopathogène de Xanthomonas campestris pv campestris.
2s La gomme xanthane produit par les souches de Xanthomonas de l'invention est une gomme xanthane sensiblement identique à celle produite par l'espèce sauvage, à savoir qu'elle présente sensiblement la même distribution de poids moléculaire, ainsi que le méme degré de modifications, notamment des degrés d'acétylation et de pyruvylation.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une souche telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'elle est obtenue par recombinaison homologue avec un plasmide comprenant une délétion de tout ou partie des gènes hrp ou hrc.
L'invention a en outre pour objet un procédé de préparation s d'exopolysaccharide bactérien, notamment de gomme xanthane, caractérisé
en ce que l'on cultive une souche bactérienne, le cas échéant, du genre Xanthomonas, de préférence de l'espèce Xanthomonas campestris telle que définie ci-dessus, dans des conditions permettant la production d'exopolysaccharide dans le milieu de fermentation.
io Les exemples qui suivent illustrent la construction de souches de Xanthomonas campestris répondant aux caractéristiques de l'invention.
is Dans ces exemples, la construction a été réalisée à partir d'une souche de Xanthomonas campesfris pv campestris obtenue par criblage de gomme xanthane.
II va de soi qui d'autres souches de Xanthomonas et également de bactéries productrices d'exopolysaccharide appartenant à un genre différent 2o accessibles à l'homme du métier peuvent être utilisées comme matière première de départ pour réaliser des souches non phytopathogènes, conformément aux connaissances générales du domaine technique en question et aux indications données ci-après, notamment en se référant aux parties de séquences rapportées dans le cas où la souche appartient à
2s l'espèce Xanthomonas campestris.
Pour leur compréhension, on se reportera aux figures annexées sur lesquelles - la figure 1 schématise la stratégie de construction de dérivés de 30 la souche de X. campestris RPA-BIOCAT826 porteurs d'une délétion de gènes hrp.
L'organisation des gènes hrp chez X. campestris pv vesicatoria est décrite par Fenselau et Bonas (1995, Mol. Plant Microbe Interact. 8 (6), 845-854 ) et par Fenselau et al., (1992, Mol. Plant Microbe Interact. 5, 390-396) et est disponible en partie dans Genebank sous le numéro d'accès U
33548. Les régions homologues clonées à partir de la souche RPA-BIOCAT826 sont représentées ainsi que le nom des plasmides dans lesquels s elles ont été clonées. La carte de restriction de la région hrp de X, campestris pv campestris est publiée par Arlat et al., 1991, Mol. Plant Microbe Interact 4:593-601, et est complétée par les résultats présentés dans les exemples 1 à
4. La délétion dhrpA1-C2 portée par le plasmide pRPA-BCAT140 décrit dans les exemples a été introduite dans le génome par double recombinaison 1o homologue ;
- la figure 2 représente les signaux d'hybridation obtenus en Southern Blot avec la sonde HRPB5 décrite ci-dessous et les ADN génomique de la souche RPA-BIOCAT826 et de deux dérivés de cette souche ayant intégré la délétion dhrpA1-C2. La position des bandes du marqueur de taille a is été rapportée par comparaison avec la distance de migration sur le gel coloré
au bromure d'éthidium avant transfert. Ces tailles sont exprimées en kilobases.
- la figure 3 représente les signaux d'hybridation obtenus en Southern Blot avec la sonde HRPC2 décrite ci-dessous et tes ADN
génomiques de la souche RPA-BIOCAT826 et de 5 dérivés de cette souche 2o ayant intégré la délétion dhrpAl-C2. La position des bandes du marqueur de taille a été rapportée par comparaison avec la distance de migration sur le gel coloré au bromure d'éthidium avant transfert. Ces tailles sont exprimées en kilobases.
2s Matériels et méthodes Sauf autres précisions, les techniques mises en oeuvre sont des techniques classiques de biologie moléculaire et de microbiologie, connues de l'homme de l'art telles que décrites par exemple par Ausubel et al., 1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York ;
3o Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York), Coligan et al., 1997 (Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc)..

1. Souche de départ La souche RPA-BIOCAT826 est issue de la collection de Rhodia Chimie (Usine de Melle, RTAM) et a été sélectionnée pour son aspect morphologique blanc au lieu de l'habituel aspect jaune. Les souches RPA-s BIOCAT1016, 1017, 1019 et 1021 ont été déposées à la CBS sous les numéros respectifs CBS 101940, CBS 101941, CBS 101942, CBS 101943 et CBS 101944.
2. Milieu de culture MSX
io Le milieu MSX employé pour la culture des Xanthomonas contient : 0,2 g/1 d'extrait de levure; 1,2 g/1 de NH4N03; 7,3 g/1 de KZHP04 ;
0,25 g/1 de MgS04, 7H20; 1 g/1 de glucose et 15 g/1 de Bacto-Agar pour le milieu gélosé ; 10 g/1 de glucose pour le milieu liquide. Le sulfate de magnésium et 1s le glucose sont stérilisés à part et ajoutés extemporanément. Le pH du milieu est équilibré à pH 7,2 avant stérilisation avec de l'acide sulfurique dilué à
10 %.
Les préparation d'ADN génomique ont été réalisées à partir de jeunes cultures liquides en MSX (0D660 inférieure à 0,4). Après centrifugation 2o de 40 ml de culture, le culot cellulaire est repris dans 11,9 ml de tampon TE
(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York) et 630 p1 de SDS 10 % (Sodium Dodecyl Sulfate) puis 63 NI de Protéinase K à 20 mg/ml sont ajoutés. Après incubation de 1 h à 37°C, 2,1 ml de NaCI 5M
sont ajoutés, suivis par 1,7 ml de 10% CTAB dans une solution de NaCI 0,7M et le 2s tout est incubé 10 min à 65°C. Après une première extraction avec un volume équivalent d'un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24 :1 ) suivie d'une deuxième extraction par un volume équivalent d'un mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 :24 :1 ), le surnageant est ajouté à
0,6 volume d'isopropanol. Après centrifugation (5 min à 10 000 tourslmin), le 3o culot obtenu est lavé dans de l'éthanol à 70% puis séché avant d'être repris dans au moins 2 ml de TE auxquels est ajouté 25 NI d'une solution de RNAse à 5 mg/ml. Après une incubation de 1 h à 37°C, une extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique est réalisée et l'ADN du surnageant est précipité par ajout de 0,1 volume d'Acetate de sodium 3 M et de 2,5 volume d'éthanol. Le culot obtenu après centrifugation de 5 minutes à 14 000 tours/min est lavé à l'éthanol 70%, séché, puis resuspendu dans au moins 0,5 ml de TE.

Clonage de la région hrpC2 de RPA-BIOCAT826 io La région visée a été amplifié par PCR à partir de l'ADN
génomique de la souche RPA-BIOCAT826 en utilisant les amorces XcC2.3 (SEQ ID N°1) et XcC2.4 (SEQ ID N°2). L'ADN génomique de la souche RPA-BIOCAT826 a été extrait et utilisé dans une réaction de PCR contenant 100 ng d'ADN génomique, 40 pmole de chaque amorce, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de is polymérase Pwo (Boehringer Mannheim) dans un volume final de 50 u1 du tampon de cette enzyme. Après une incubation de 5 min à 95°C, le mélange a d'abord subi 30 cycles comprenant une incubation de 1 min à 94°C, puis 1 min à une température allant de 63°C à 48°C (par pas de 0,5°C
par cycle) et 1 min à 72°C, puis 15 cycles comprenant une incubation de 1 min à
94°C, suivie de 1 2o min à 48°C et d'une minute à 72°C, et enfin 10 min à
72°C. Le produit d'amplification de taille voisine de 1,2 kb a été purifié par migration sur gel d'agarose puis à l'aide du kit Qiaex (Quiagen). II a ensuite été cloné dans le vecteur pZERO-1 (Invitrogen BV) ouvert par EcoRV. Après transformation de la souche E. coli JM110, un clone hébergeant un plasmide ayant intégré le 2s fragment de 1,2 kb a été retenu. Ce plasmide a été appelé pRPA-BCAT91 et l'insert qu'il contenait a été séquencé (Genome Express, Grenoble, France).
La séquence obtenue (SEQ ID N°3) a été alignée avec la séquence du gène hrpC2 de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396). Une identité de 87% a été trouvée sur les 30 1188 bp représentant 61 % du gène hrpC2. La séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique montre un pourcentage d'identité de 92% par rapport à la portion équivalente de la séquence de la protéine HrpC2 de X. campestris pv vesicatoria.

Clonage de la région HrpA de RPA-BIOCAT826 s Cette région a été clonée en criblant une banque partielle génomique de la souche RPA-BIOCAT826 à l'aide d'une sonde nucléotidique correspondant à la région équivalente de la souche X. campestris pv vesicatoria. Cette région est disponible dans un plasmide dénommé pL3o qui 1o contient un insert de 6,6 kb EcoRV englobant les gènes hrpB8 et hrpA1 de X.
campesfris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396).
La sonde HRPA1 a été préparée par PCR en utilisant les amorces XcvA15 (SEQ ID N°4) et XcvA18 (SEQ ID N°5) à raison de 40 pmole is chacune, la matrice plasmidique pL3o (40 ng), 0,2 mM dNTP, 1,25 U de polymérase Pwo (Boehringer Mannheim) dans un volume final de 50 NI du tampon de cette enzyme. Après une incubation de 5 min à 95°C, le mélange a subi 30 cycles comprenant une séquence de 30 secondes à 94°C, 1 min à
55°C et 1,5 min à 72°C. Après une dernière incubation de 10 min à 72°C, le 2o produit d'amplification de 664 bp a été purifié sur gel d'agarose puis par le kit Quiaex (Quiagen).
Environ 10pg d'ADN génomique de la souche RPA-BIOCAT826 ont été digéré par 100 unités d'EcoRl pendant 16h à 37°C. La technique classique de Southern Blot a ensuite été employée afin de déterminer la taille 2s du fragment EcoRl hybridant avec la sonde HRPA1 décrite ci-dessus. Après migration sur gel d'agarose de la digestion EcoRl ci-dessus, transfert sur une membrane Hybond N+ (Amersham) par hybridation à 55°C pendant 19h dans une solution aqueuse d'hybridation (0,5 % SDS ; 6% SSC ; 0,25% de lait écrémé en poudre) avec la sonde HRPA1 marquée au phosphore 32 grâce au 3o kit Ready-To-Go (Pharmacia Biotech) selon les indications du fabriquant et lavage à 55°C par une solution de 0,2 SSC et 0,1% SDS, la membrane a été
mise en autoradiographie pendant 19 h à -80°C. Le développement du film a révélé un signal d'hybridation de taille voisine de 7,3 kb.

Une banque partielle génomique de la souche RPA-BIOCAT826 a donc été réalisée en digérant 100 Ng d'ADN génomique de cette souche par 1000 unités de l'enzyme EcoRl pendant 20 h à 37°C. Après migration sur gel d'agarose, la zone correspondante aux fragments de taille comprise entre 7 et s 8 kb a été découpée et l'ADN extrait du gel par éléctroélution dans un boudin de dialyse (membranes Spectra/Por de Spectrum Medical Industries, Inc).
Après précipitation à l'éthanol, l'ADN a été ligaturé dans un volume final de NI au vecteur pBIueScript II SK (Stratagene) préalablement ouvert par l'enzyme EcoRl puis dephosphorylé avec la phosphatase alcaline de crevette (United 1o States Biochemicals). Après incubation du mélange de ligation 14h à
16°C, un dixième du mélange a été utilisé pour transformer par électroporation des cellules d'E. coli DHSalpha. Environ 3000 transformants ont été analysés par hybridation de colonies transférées sur membrane de nylon en utilisant la sonde HRPA1. Douze colonies donnant un signal d'hybridation positif ont été
is purifiées sur milieu gélosé LB contenant 100 trglml d'ampicilline. Les plasmides de douze colonies purifiées ont été extraits et des digestions EcoRl des ces plasmides ont été analysées par Southern blot avec la sonde HRPA1 pour confirmer la présence d'un fragment d'environ 7,3 kb hybridant avec cette sonde. Après une analyse de restriction avec diverses enzymes, un fragment 2o de 2,7 kb Sacl I et un fragment de 1,6 kb Sacl I ont été sous-clonés dans le vecteur pBIueScript II SK ouvert par Sacll pour donner respectivement les vecteurs pRPA-BCAT135 et pRPA-BCAT134. Le séquençage partiel de ces deux vecteurs a été réalisé (Genome Express, Grenoble) et a révélé la présence d'une phase ouverte de lecture de 1818 bp (SEQ ID N°6) dont la 2s séquence peptidique déduite présente 85% d'identité avec la protéine HrpA1 de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396).
3o EXEMPLE 3 Construction de souches dérivées de RPA-BIOCAT826 contenant une délétion dhrpA1-C2 La délétion dhrpA1-C2 a été construite in vifro en clonant dans le plasmide pJQ200SK (Quandt et Hynes, 1993, Gene 127 : 15-21 ) un fragment de pRPA-BCAT134 et un fragment de pRPA-BCAT91 (cf figure 1 ). Le plasmide pRPA-BCAT91 a été ouvert par Ncol puis traité à la polymérase I
s (fragment de Klenow) pendant 15 min à 30°C en présence de 25pM de dNTP.
Après extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique puis précipitation à
l'éthanol, l'échantillon a été repris dans 40 p1 d'eau pour étre traité par 20 unités de Xbal à 37°C puis et 20 unités d'Apol à 50°C. Le fragment d'environ 1,2 kb a alors été séparé sur gel et récupéré avec le kit Quiex II (Quiagen).
Le io fragment d'environ 1,3 kb Rsal-Sacll de pBCAT134 a été purifié de façon identique. Ces deux fragments ont été ligaturés au vecteur pBIueScript II SK
ouvert par les enzymes Sacll et Xbal pour donner le plasmide pRPA-BCAT139. Un fragment Sacl-Xbal d'environ 2,5 kb porteur de la délétion d hrpA1-C2 a alors pu être extrait de ce plasmide pour être cloné dans le is plasmide pJQ200KS ouvert par les enzymes Sacl et Xbal. Le plasmide résultant a été nommé pRPA-BCAT140. C'est un plasmide non réplicatif chez X. campestris, porteur du marqueur de résistance à la gentamycine permettant de sélectionner les clones de X. campestris ayant intégré le plasmide par recombinaison homologue et porteur du marqueur de sélection positive sacB
2o qui permet de sélectionner les clones ayant éliminé le marqueur de résistance à la gentamycine suite à un deuxième événement de recombinaison homologue.
Le plasmide pRPA-BCAT140 a été introduit dans la souche RPA-BIOCAT826 par conjugaison. Pour ce faire, ont été mélangés sur milieu 2s gélosé MSX 40 p1 d'une culture en phase exponentielle de la souche DHSalpha hébergeant pRPA-BCAT140, 40 NI d'une culture en phase exponentielle de la souche HB101 hébergeant le plasmide pRK2013 (Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 7347-7351 ) et 40 p1 d'une culture de la souche RPA-BIOCAT826 en phase exponentielle dans un milieu MSX.
3o Après incubation pendant 24h à 30°C, les clones de X. campestris ayant intégré le plasmide pRPA-BCAT140 ont été purifiés deux fois de suite sur un milieu gélosé MSX contenant 15 Ng/ml de gentamycine. Huit clones ont ensuite été étalés sur une surface d'environ 1 cmz sur un milieu gélosé MSX

contenant 5% de sucrose. Après une incubation de 72h à 30°C, des colonies ont été isolées par deux purifications successives sur milieu gélosé MSX.
Environ 300 colonies ont ensuite été repiquées sur milieu gelosé MSX
contenant 15 Ng/ml de gentamycine afin d'identifier les clones sensibles à la s gentamycine (de 90 à 100 % des clones en fonction des essais). Une quarantaine de ces clones ont ensuite été analysés par Southern Blot en utilisant une digestion EcoRl-BamHl de leur ADN génomique et la sonde HRPA1. Environ 25 % des clones présentaient un signal différent de celui de la souche sauvage RPA-BIOCAT826 et cohérent avec l'intégration de la io délétion dhrpA1-C2. Cinq clones ont été retenus pour la suite des expériences : souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021, 1022.

1s Caractérisation par Southern Blot des souches dérivées de RPA-BIOCAT826 contenant une délétion dhrpA~-C2 Les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022 ont été caractérisées en analysant les profils d'hybridation de digestions d'ADN
2o génomique EcoRl, BamHl et EcoRl-BamHl avec les sondes HRP3'A1, HRPBS
et HRPC2.
La sonde HRP3'A1 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,6 kb Sacll du plasmide pRPA-BCAT134 par migration sur gel et utilisation du kit Quiaex.
2s La sonde HRPC2 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,2 kb EcoRl-Xbal du plasmide pRPA-BCAT91 par migration sur gel et utilisation du kit Quiaex.
La sonde HRPB5 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,5 kb BamHl du plasmide pRPA-BCAT129 par migration sur gel et utilisation du kit 3o Quiaex. Le séquençage de cet insert a révélé notamment une phase ouverte de lecture (SEQ ID n°7) dont la séquence peptidique déduite présente 77%
d'identité avec la protéine HrpBS de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interactions, 8 : 845-854). Le plasmide pRPA-BCAT129 a été obtenu en clonant les fragments BamHl d'ADN génomique de la souche RPA-BIOCAT826 de taille comprise entre 1,3 et 1,9 kb dans le vecteur pBIueScriptIISK et en criblant les colonies avec une sonde HRPB de manière analogue à celle décrite dans l'exemple 2. La sonde HRPB a été
s obtenue par PCR en utilisant les amorces RST2 et RST3 (Leite et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60 : 1068-1077) et la matrice plasmidique pB10g (U.
Bonis, communication personnelle). Le plasmide pB10g correspond au plasmide pBluescriptKS dans lequel est cloné le fragment de 7,3 kb BamHl contenant la région hrp8 et le gène hrpA9 de Xanthomonas campestris pv io vesicaforia (Fenselau et al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interactions, 8 :

854). La réaction de PCR a été réalisée avec 40 pmole de chaque amorce, 50 ng de pB10g, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de polymérise Pwo (Boehringer Mannheim) dans un volume final de 50 NI du tampon de cette enzyme. Après une incubation de 5 min à 95°C, le mélange a d'abord subi 24 cycles is comprenant une incubation de 30 secondes à 95°C, puis 40 secondes à
une température allant de 70°C à 63°C (par pas de 0,3°C par cycle) et 1 min à
72°C, puis 6 cycles comprenant une incubation de 30 secondes à
95°C, suivie de 40 secondes à 63°C et d'une minute à 72°C, et enfin 5 min à
72°C. Le fragment d'environ 840 bp a ensuite été purifié sur gel d'agarose et à l'aide du 2o kit Quiaex (Quiagen).
L'analyse en Southern Blot a été réalisée en marquant les sondes à l'aide du kit « Megaprime DNA labelling system » (Amersham) selon les instructions fournies. Après migration sur gel d'agarose, les digestions d'ADN génomiques ont été transférées sur membranes Hybond N+
2s (Amersham) selon les indications fournies, puis incubées dans la solution d'hybridation composée d'un tampon phosphate 0,5M et de SDS 7% (115 ml de NazHP04 1 M, 84,6 ml de NaH2P04 M, 200 ml H20, 28 g SDS). Les sondes marquées sont incubées 5 min à 100 °C, puis 5 min à température ambiante avant d'être diluées dans 12 ml de solution d'hybridation et incubées 30 5 min à 100°C. Ce mélange est alors mis au contact des membranes pendant 6 à 20 h à 65°C. Celles-ci sont ensuite lavées 10 à 15 minutes dans un tampon phosphate 0,1 M contenant 1 % de SDS (42,3 ml Na2HP04 1 M, 57,7 ml NaHzP04 1 M, 900 ml H20, 10 g SDS) puis mis en exposition.

Les résultats obtenus avec la sonde HRPBS (figure 2) montrent, pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à environ 4,8 kb avec la digestion EcoRl et un signal à 1,6 kb avec la digestion BamHl et la digestion EcoRl-BamHl. Ces résultats sont en accord avec la cartographie de Arlat et al.
s (Molecular Plant-Microbe Interactions, 1991, 4 : 593-601) et la localisation du gène hrp85 décrit ci-dessus. Aucune des souches RPA-BIOCAT étudiées ne montre de signal d'hybridation avec HRPBS, ce qui est cohérent avec l'intégration de la délétion dhrpAl-C2 dans le génome de ces souches RPA
BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022 (La figure 2 ne montre que le résultat 1o d'hybridation obtenu avec les souches RPA-BIOCAT).
Les résultats obtenus avec la sonde HRPC2 (figure 3) montrent, pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à environ 5,5 kb avec les digestions EcoRl et un signal à environ 2,6 kb avec la digestion EcoRl-BamHl. Ces résultats sont en accord avec la cartographie de Arlat et al.
1s (Molecular Plant-Microbe Interactions, 1991, 4: 593-601), l'organisation des gènes hrp chez X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396) et la localisation du gène hrp85 décrit ci-dessus. Les résultats obtenus avec les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 montrent un signal entre 7 et 8 kb avec les digestions BamHl et un 2o signal à 4,4 kb avec les digestions EcoRl-BamHl. Compte tenu de la cartographie présentée dans la figure 1, ces résultats sont cohérents avec l'intégration de la délétion dhrpAl-C2 dans le génome des souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022.
Enfin, les résultats obtenus avec la sonde HRP3'A1 montrent, 2s pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à 7,3 kb environ pour la digestion EcoRl-BamHl. Avec les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021, ce signal d'hybridation est à 4,4 kb, ce qui est cohérent avec l'intégration de la délétion dhrpA1-C2 dans le génome des ces souches.

Virulence des souches dérivées de RPA-BIOCAT826 contenant une délétion HrpA1-C2 s Les tests de virulence ont été effectués sur des plants de choux (8rassica oleracera var. captiva cultivar Siria) dont les semences ont été
obtenues auprès de Clause Semences (av. Lucien Clause, 91221 Brétigny-sur-Orge, France). Les plantes ont été cultivées en cellule climatique selon les io paramètres suivants : 14 heures à 25°C, 55% d'humidité, intensité
lumineuse saturante (4000 W/m) ; 10 heures à 25°C, 60% d'humidité. Elles ont été
infectées au stade 2 feuilles soit environ 13 jours après semis. Pour chaque souche testée, 8 plants ont été utilisés en perçant la première feuille dans la nervure centrale de la partie terminale à l'aide d'un cure-dent infecté. La is contamination du cure-dent a été réalisée en immergeant sa pointe dans une culture de la souche étudiée de 2 jours en milieu MSX (environ 108 bactéries/ml). Les contrôles négatifs étaient constitués par un mélange de souches de X. campestris pv vesicatoria (souche B229R1 = RPA-BIOCAT381 et souche B230R11 = RPA-BIOCAT382 ), phytopathogènes de référence sur 2o piments isolées chez Clause Semences. Les contrôles positifs étaient constitués par un mélange de souches de X. campestris pv campestris (souche 2963 = RPA-BIOCAT379 et souche 63C2AM = RPA-BIOCAT380), phytopathogènes de référence sur choux isolées chez Clause Semences. Les symptômes (lésions jaunes en forme de V) ont été lus et mesurés 12 et 14 2s jours après infection. Pour chaque plante, une note a été donnée selon la correspondance suivante : 0, aucun symptôme ; 1, dépigmentation localisée à
proximité du point d'infection ; 2, nécrose inférieure à 0,5 cmz ; 3, nécrose de 0,5 à 1,5 cm2 ; 4, nécrose supérieure à 1,5 cm2 ; 5, nécrose généralisée de la feuille. La somme des notes des 8 plantes infectées avec la même souche est 30 la note de pathogénicité de cette souche (Tableau 1 ).

Tableau 1 : Phytopatogénicité des souches de Xanthomonas SOUCHES J + J + 14 Alors que la souche RPA-BIOCAT826 provoque le flétrissement progressif de la feuille, les souches construites provoquent au maximum un flétrissement nécrotique. localisé, ce qui traduit une absence de pathogénicité.
1o Production de xanthane par les souches dérivées de RPA-BIOCAT826 contenant une délétion HrpA1-C2 La productivité de xanthane des souches a été évaluée en mesurant la matière sèche précipitable à l'isopropanol contenu dans 40 ml de culture. Après 24 heures de préculture en MSX, 100 ml de milieu MSX en fioles erlenmeyers de 500 ml ont été inoculés avec approximativement le 2o même nombre de bactéries (0,4 ml de préculture de OD660 = 0,25). Après 6 jours d'incubation à 30°C sous agitation (200 tours/min), 40 grammes de cultures ont été prélevés et mélangés à 150 ml d'isopropanol. Après filtration, les fibres récupérées ont été lavées deux fois par 70 ml d'isopropanol avant d'être séchées puis pesées en sortie d'étuve. L'opération réalisée sur trois cultures indépendantes de la souche RPA-BIOCAT826 a montré une variabilité
de la productivité de l'ordre de 10 %. Les résultats obtenus avec la souche RPA-BIOCAT826 et ses dérivées OhrpA1-C2 sont regroupés dans le tableau 2.
Tableau 2 : Productivité de xanthane de RPA-BIOCAT826 et de s ses dérivés dhrpA1-C2.
SOUCHE POIDS SEC Xt PRODUCTIVITE /

BIOCAT826 0,323 8,1 x 10-3 BIOCAT 1016 0,362 9,0 x 10-3 BIOCAT 1017 0,366 9,1 x 10-3 BIOCAT 1019 0,371 9,3 x 10-3 BIOCAT 10_21 0,334 8,4 x 10-3 L BIOCAT 1022 ~ 0,329 8,2 x 10-3 Les productivités sont exprimées en grammes de 1o matière sèche extractible à l'isopropanol par grammes de culture.

LISTE DE SEQUENCES
<110> RHODIA CHIMIE
<120> Nouvelles souches bactériennes, notamment de Xanthomonas, en particulier Xanthomonas campestris <130> BFF 99/0315 <140> FR 9907963 <141> 1999-06-22 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN
<213> Séauence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 1 aaattcgtca agggtgatgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 2 gttccacctg gtcgacaagc 20 <210> 3 <211> 1189 <212> ADN
<213> Xanthomonas campestris <400> 3 aaattcgtca agggtgatgc gatcgccggc ctggtgatca ccatggtcaa catcttggcc 60 ggcatcgtgg taggcgtgac ctaccacggc atgagcgcgg gcgaggccgc caaccgcttt 120 gcgatcctgt cggtaggcga tgcgatggtg tcgcagatcg cctcgctgct gatctcggtg 180 gcggccggcg tcatgatcac ccgcgtcgcc aacgagaatg aaaccaagat cagctcgctc 240 gggctcgaca tcggccgcca gctcaccagc aacgcacgtg ccttgatggc agcgagtgtg 300 ctgctggcct gctttgcgtt cgtgccggga tttccggcgc tgctgttcct gctgctggca 360 gcggcggtcg gtgccggggg ctatacgatc tggcgcaagc aacgcgacac cagcgggagc 420 gatcagcccg cactgccatc aaccagccgc aaaggtgcca aaggcgatgc gccgcacatc 480 cgcaagagcg ccccggattt cgcctcgccc ttgtcgatgc ggctttcgcc gcaactggct 540 gcacggctcg acccggcgct gctggatcag gcgatcgaaa gcgagcggag gcaattggtc 600 gagctgctgg gattgccgtt cccggggatc gcgatatggc agagcgaatc cctgcagggc 660 ctgcagtacg aagtgttgat ccacgatgtg ccggaaaccc gcagcgcgtt gagcgatacg 720 gcggacatgc agaaagcgct ggcccaacaa gccatcgcac cgttgcatgc acgcgcgcat 780 ctgttcgtcg gcatccagga gacgcagtgg atgctggaac aggtgggcgc ggactatccc 840 gggctggttg cagaggtcaa caaggccatg ccagcccaac gcatcgccga tgtgttgcgg 900 cgactgctgg aagaacgcat cccggtgcgc aacatcaaga gcatcctgga gagcctggtg 960 gtgtggggac cgaaggaaaa ggatctgctg atgctgaccg agtatgtgcg ctgcgatctc 1020 ggccgctatc ttgcgcacac cgcgaccgca ggcaccggac agctgcctgc ggtgatgctc 1080 gaccacgccg tggaacagtt gatccggcag tcgattcgcg ccacaccggc cggcaatttc 1140 ctggcgctgc caccggagca ggccaatcag cttgtcgacc aggtggaaa 1189 <210> 4 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 4 gatccaacag ctggacaacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce <400> 5 aacggaatct tcgacaggcc 20 <210> 6 <211> 1818 <212> ADN
<213> Xanthomonas campestris <400> 6 atggcatacg cctgtcctcc agttcaccgc catcgacgcg cgccgttggc cgctgccttg 60 ttgcttggct tgctgccgct gctgccgccg catgccaacg ccgcgtcggt gccgtggcac 120 tcgcgcagct tcaaatacgt tgccgaccgc aaggatctca aggaggtgct gcgcgacctg 180 tccgccagcc aatccatcac cacctggatt tcaccggagg tgaccggcac gctcagtggc 240 aaattcgaag ccactccgca gaagtttctc gacgatctat cgggcacgtt cggttttgtc 300 tggtattacg atggctcggt gctcagaatc tggggcgcga acgagaccaa gaatgcgacc 360 ttgagtttgg gcgctgcatc gacgagtgcg ctgcgcgatg cgcttgcgcg catgcggctg 420 gacgatccgc gctttccggt ccgttatgac gagacagcgc acctggcggt ggtgtcgggc 480 ccgccgggtt atgtggatac cgtcgcggcg atcgccaagc aggtcgagca ggtcgcgcgc 540 caacgcgacg ccaccgaagt gcaggtgttt cagctgcatt atgcgcaggc ggccgaccac 600 accacccgca tcggtggtca agacatccag gtgccgggca tggccagcct gttgcgcaac 660 atatacggcg tgcgtggcgc gcccactgcg gcgctgcccg ggccaggcgc gaatttcggg 720 cgtgtgcaac cgatcggcgg tggctcgtcc aataccttcg gcaacagcgg tcagcgccag 780 agtggcggca gcggcattct cggtttgcct gcgtcgtggt tcggcgctgg gtcgccgtcc 840 gagcgggtgc cggtcagtcc gccgttgccg ggcagtggca atagcgccaa tgcgccggcc 900 agcgtgtggc cggagatgag ccaggccaga cgcgatgcgc cgctggcggt ggacgccggc 960 agcggcggtg agctggcatc cgacgcgccg gtgatcgaag ccgacccgcg caccaacggc 1020 attctcattc gcgaccgccc cgagcggatg gccgcctatg gcacgttgat ccagcagctc 1080 gacaaccgtc ccaagctgct gcagatcgat gccaccatca tcgagatccg cgacggcgcc 1140 ctgcaggatc tcggcgtgga ctggcggttc cacagccggc gtgtggatgt gcagaccggc 1200 gacgggcgtg gtggccagct tggctacgat ggcagcttga gcggtgcagc agccgccggt 1260 gcagccgcgc cgttgggcgg gacgttgacc gctgtcctgg gcgatgcagg gcgttacctg 1320 atgacgcgcg tctcggcgct cgagcagacc aacaaggcca agatcgtctc caccccgcag 1380 gtggcgacgc tggacaacgt ggaagcggtg atggaccaca agcaacaggc attcgtgcgt 1440 gtcagcggtt atgcatccgc cgacctctac aacctgtccg cgggtgtatc gctacgcgta 1500 ttgccaagtg tggtgccggg gtcgccaaat ggtcagatgc gcctggatgt gcgtatcgaa 1560 gacgggcagt tgggcgccaa taccgtcgat ggcattcccg tcatcacctc cagcgagatc 1620 accacgcagg ccttcgtcaa cgagggccag agcctgctga tcgccggtta tgcttccgac 1680 accgatcaga cagatctgaa caacgtcccc gggctgtcca ggattccatt ggtcggcaac 1740 ctgttcaagc atcgccagca gagcgggtcg cggttgcagc ggttgttcct gctgaccccg 1800 catatcgtct cgccctga 1818 <210> 7 <211> 702 <212> ADN
<213> Xanthomonas campestris <400> 7 atgcgtcttt ggctgaggtc cacaccggaa gcggtcggcc ttgactgcga ggtcatccca 60 cgcgaggcat tggcctgtgt gctggaactg gacgcagcgg gtgcacaggt gcacgcgcgt 120 tgcgcgcagg cgctggcgga cgcccagacg cgtgcgcagg cgctgctcga cgctgcccaa 180 cggcaggccg aggccatcct tcaggatgcc cacgacaggg ccgagcgcag tgcacgcctg 240 ggctatgccg ccgggctgcg ccgtcagctc gacgcgtgga acgagcgcgg cgtgcggcat 300 gccttcgcgg cccaggacgc cgcacggcgc gcccgcgagc gcctggccga gatcgtcgcg 360 cacgcctgcg agcaggttct gcacgggcac gatcctgcgg cgctgtacgc gcgcgccgca 420 caggcgctgg acggcgccct ggacgaggcg aacgccctgc aggtgagcgt gcatcccgat 480 gcgctggacg atgcacggcg cgccttcgat gcggccgcag cggccggcgg atggagcatg 540 ccggtggaac tgtgcggtga tacgactctg gccttgggtg cctgcgtgtg cgaatgggat 600 accggcgtgt tcgagaccga tctgcgtgat cagctgcgca gtctccggcg cgtcattcgc 660 cgcgtgttgg ccacgccgca ggcggtgccg gatgcttgct ga 702

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Souche bactérienne ayant perdu le caractère phytopathogène par inactivation d'au moins un gène de virulence et ayant conserve la capacité
de production d'exopolysaccharide et ne contenant pas d'ADN étranger à son patrimoine génétique naturel.

2. Souche bactérienne selon la revendication 1, caractérisée en ce, qu'elle a été rendue stablement non phytopathogène par inactivation d'au moins un gène, avantageusement au moins deux gènes, de préférence au moins trois gènes du groupe de gènes hrp ou hrc.

3. Souche bactérienne selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle a été rendue stablement non phytopathogène par inactivation de 5 à 9 gènes du groupe de gènes hrp ou hrc.

4. Souche bactérienne selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche Xanthomonas ayant perdu te caractère phytopathogène par inactivation d'au moins un gène de virulence et ayant conservé la capacité de production d'exopolysaccharide.

5. Souche Xanthomonas selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est de l'espèce Xanthomonas campestris.

6. Souche Xanthomonas selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit de Xanthomonas campestris pv campestris.

7. Souche Xanthomonas selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'inactivation du ou desdit(s) gène(s) est obtenue par délétion d'une région d'ADN d'au moins 1 kb, de préférence au moins 3 kb, avantageusement au moins 5 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc, et en ce qu'elle conserve la capacité de produire de l'exopolysaccharide

8. Souche Xanthomonas selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend une délétion d'une région d'ADN d'au plus 40 kb.

9. Souche Xanthomonas selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par délétion de tout ou partie des gènes hrp A1 à
hrpC2.

10. Souche Xanthomonas essentiellement non phytopathogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une délétion d'une région d'ADN d'au moins 1 kb, de préférence au moins 3 kb, avantageusement au moins 5 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc, et en ce qu'elle conserve la capacité de produire de l'exopolysaccharide.

11. Souche Xanthomonas essentiellement non phytopathogène, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par délétion de tout ou partie des gènes hrp A1-C2.

12. Souches Xanthomonas campestris essentiellement non phytopathogènes choisies parmi les souches BIOCAT 1016, BIOCAT 1017, BIOCAT 1019, BIOCAT 1021 et BIOCAT 1022, déposées à la CBS
respectivement sous les numéros CBS 101940, CBS 101941, CBS 101942, CBS 101943 et CBS 101944.

13. Souche Xanthomonas selon l'une des revendications 4 à 13, caractérisée en ce que l'exopolysaccharide est une gomme xanthane.

14. Plasmide pRPA-BCAT 140 utilisé pour la fabrication de la souche selon les revendications 9 à 13.

15. Procédé de préparation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce qu'elle est obtenue par recombinaison homologue avec un plasmide comprenant une délétion de tout ou partie des gènes hrp ou hrc.

16. Procédé de préparation d'exopolysaccharide bactérien, notamment de gomme xanthane, caractérisé en ce que l'on cultive une souche bactérienne, le cas échéant, du genre Xanthomonas, de préférence l'espèce Xanthomonas campestris selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans des conditions permettant la production d'exopolysaccharide dans le milieu de fermentation.

17. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID n o 3.

18. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID n o 6.

19. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID n o 7.