NO822490L - Plasmid p svh 1 og dets anvendelse. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens gjenstand er plasmidet p SVH 1 og dets anvendelse til fremstilling av en hybridvektor hvorved Streptomyceter-DNA kan overføres til andre mikroorganismer, spesielt til andre Streptomycet-arter.

Det er fra tysk Offenlegungsschrift 30 05 226 kjent at av en kultur av Streptomyces espinosus kan det utvinnes plasmidet pUC 6. Det er videre fra PCT-søknad 79/01169 kjent at av Streptomyces lividans kan det utvinnes et plasmid som synes egnet som vektor for innføring av DNA i noen Streptomyces-arter.

Herav sees at anvendelsen av genteknologiske metoder på anti-biotikadannende Streptomyces-arter tildeles spesiell betydning. Imidlertid er de fleste hittil kjente plasmider forblitt av mindre interesse for den praktiske anvendelse, da på den ene side ikke lar seg fremstille i større mengder. På den annen side er det for genteknologisk arbeide meget viktig å ha til disposisjon plasmider som foreligger i mange kopier pr. celle

(= multikopi-plasmid), når de skal finne hensiktsmessig anvendelse som vektorer for amplifisering av klonerte gener.

Den genetiske forbedring av de for antibiotika-fremstilling anvedte Streptomycet-stammer med formålet en økning av mengden av dannet antibiotikum er en viktig oppgave. Den

lar seg imidlertid bare løse med resultat med gentekologiske metoder, når det står til disposisjon et plasmid som ikke:.med en gang igjen elimineres fra den som vertscelle anvendte Streptomyces-art slik det hyppig iakttas ved med hverandre

ikke beslektede arter.

Det forelå derfor den oppgave å finne et lett isole-rbart og stabilt i cellene foreliggende multikopi-plasmid som er

egnet som vektor til genetisk forbedring av Streptomyces-stammer. Det ligger for hånden at denne oppgave tidligst kan løses når det lykkes i en annen Streptomyces-art å identifisere et egnet plasmid.

Det har nå vist seg at denne oppgave løses ved plasmidet p SVH 1 som utvinnes av en kultur av Streptomyces venezuelae DSM 40 755, har en molekylvekt på 8,4 megadalton, en konturlengde på 4,1 ym og omfatter 1,6 kilobaser (= kb).

Den her anvendte stamme av Streptomyces venezuelae er i detalj omtalt av L. Ettlinger, R. Corbatz og R. Hiitter, Arch. Mikro-biol. 31, 326-358 (1958) , spesielt fra side 352. En ytterligere omtale finnes hos R. Hiitter "Systematik der Streptomyceten", Karger-Verlag, Basel/New York, 1967, side 60.

Streptomyces venezuelae DSM 40755 er fremfor alt å anse en fortynnlig leverant av plasmider fordi her i hver celle foreligger meget mer enn 20 plasmider som ved deres lave molekylvekt på 8,4 megadalton egner seg spesielt godt for gjennom-føring av genteknologiske arbeider.

Isoleringen av plasmidene fra Streptomyces venezuelae DSM

40755 foregår etter i og for seg kjente fremgangsmåter. I første rekke virker stammen i et egnet, glycinholdige medium. Etter høsting, vasking og homogenisering av myzelet fjernes celleveggene med lysozym. Etter behandling av cellene med proteinase K og natriumdodecylsulfat lyserer cellene, således at cellerester samt kromosomale.DNA deretter kan adskilles ved sentrifugering. Deretter felles plasmidene med polyetylenglykol og for etterfølgende hurtigundersøkelser opparbeides etter en av H.C- Birnboim og J. Doly, J. Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1975) omtalte fremgangsmåter. Det således anrikede plasmid p SVH 1 kan uten videre anvendes for analytiske undersøkelser og underkastes behandling med restriksjonsendonukleaser. En preparativ renfremstilling lykkes ved to på hverandre følgende kalsiumklorid-tettgradient-sentrifugeringer.

Det således utvunnede plasmid p SVH 1 lar seg karakterisere

ved endonukleolytisk spalting med restriksjonsenzymer på agarosegeler. Dermed fremtrer tall og størrelse av de even-

tuelle p SVH 1-fragmenter. Karakteriserende for plasmid p SVH 1 er at for restriksjonsendonukleaser Eco R I, Hind III, Xba 1, Hpa 1 ikke har snittsteder, av restriksjonsendonukleaser Pst 1 og Bel I bare snittes en gang, av Xho I spaltes i to fragmenter med lengder 7,6 og 4,9 kb, av Cia I spaltes i to fragmenter med lengder 11,8 og 0,8 kb, av Bgl II spaltes i tre fragmenter med lengdene 7,5, 2,8 og 2,4 kb og av Bam H I spaltes i fire fragmenter med lengdene 7,7, 2,0, 1,8 og 1,2 kb. Snittstedene av noen av disse enzymer ble dessuten utmålt mot hverandre på det ringformede plasmidmolekyl (se figuren). Dessuten oppstår ved endonukleolytisk spalting med Pvu II og Kpn I 4,

med Nru I, Pvu I og Sma I 5, med Sst II og Sac II 7, med Sst I 8 og med Sal I mer enn 10 fragmenter.

Konturmålinger på et flertall av plasmider ga en størrelse på 4,1 ym resp. en herav avledet molekylvekt på 8,23 megadalton. Denne verdi står i god overensstemmelse med molekylvekter

som ble beregnet av addisjonen av restriksjonsfragmentvekter etter gelelektroforetisk oppdeling (= 8,4 megadalton). Iden-tiske eller tilsvarende plasmider er hittil ikke blitt funnet i noen andre Streptomyces venezuelae biotyper [sammenlign V.S. Malik og F. Reuser, plasmid 2, 627-31 (1979)].

Plasmidet p SVH 1 er meget egnet til fremstilling av en

vektor av flere grunner. Fremfor alt er det overordentlig høye kopitall på meget mer enn 20 plasmider pr. celle og en stabilitet en meget viktig forutsetning for anvendelse av p SVH 1 for genteknologiske arbeider. Tidligere ble plasmid-frie stammer hos Streptomyces venezuelae DSM 40755 på tross av omfangsrike undersøkelser ikke iakttatt. Ved plasmid-isoleringer ble det alltid oppnådd utbytter på mer enn 200 yg beregnet på en liter av opprinnelig Streptomycet-kultur.

Plasmidet p SVH 1 egner seg fremfor alt til dannelse av en hybridvektor som kan innføres i andre Streptomycet-arter.

Det har nemlig vist seg at alle hittil kjente plasmider bare lar seg etablere i relativt få vertsceller. Således er det f.eks. kjent at mellom grampositive og gramnegative bakterier består barrierer for en formering av fremmed DNA (sammenlign P. Courvaling og M. Fiandt, Gene 8, 247-269 (1989)). Den største sjanse for en resultatrik kloning består alltid når hybridvektoren innbringes i en nær beslektet vertscelle. Alle hittil publiserte dataer over Streptomycet-plasmider og -fager tyder sågar dithen at disse bare kan innbringes stabilt i et meget begrenset tall andre Streptomyceter. En kloning av Streptomycet-DNA i Streptomyceter vil alltid være nødvendig når det ikke bare dreier seg om en eller få gener som skal klones, men om en rekke gener som f.eks. er del-aktig i syntesen av et antibiotikum.

En kloning av genene for en helt stoffskiftevei er i det minste en voldsom arbeidsoppgave, når den ikke sågar betinget ved en eventuell spredning av genene over det hele Strepto-mycetengenom blir til et praktisk talt uløst problem. Ved et Streptomycet-kloningssystem kan det her f.eks. når det foreligger en stoffskiftepassering, allerede under tiden være tilstrekkelig med amplifikasjon av et enkelt gen for å oppnå vesentlig høyere utbytter. Også ved tilveiebringelse av hybride antibiotika som de er tenkbare ved kombinasjon av snevert beslektede stoffskifteveier, f.eks. ved innbringelse av et antibiotikum modifiserende enzym, er av samme grunner bare et Streptomycet-vertsvektor-system lovende for resultat. Plasmidet p SVH 1 er av disse grunner fremragende egnet til fremstilling av en hybridvektor for å muliggjøre en økning av utbytte av antibiotika.

For fremstilling av hybridvektoren anvendes derved de samme genteknologiske metoder som allerede tidligere ble anvendt ved Escherichiacoli-plasmider og også ved Streptomyceter av M. Bibb, J.C. Schottel, S.N. Cohen, Nature 284, 526-531

(1980), og C.J. Thompson, J.M. Ward, D.A. Hopwood, Nature 286, 525-527 (1980) . Etter disse kjente fremgangsmåter kan det i plasmidet p SVH 1 i noen av de med de ovennevnte restriksjonsendonukleaser dannede snittsteder ikke bare innføres gener som har antibiotika-resistenser, men også gener som bevirker en økning av antibiotika-produksjonen. De således dannede hybridplasmider er etter alle hittil foreliggende iakttagelser likeså leve-og formeringsdyktige i Streptomyces-celler som også utgangs-plasmidet.

Oppfinnelsen skal forklares videre ved hjelp av følgende eksemple, hvori prosentangivelsen refererer seg til vekt hvis intet annet er angitt.

Eksempel

1. Oppdrett og protoplastiering av Streptomyces venezuelae DSM_40755

Oppdrettet foregikk i egnede kar, f.eks. 300 ml Erlenmeyer-kolber i 50 ml medium, f.eks. Luria Broth eller 2 YT (sammenlign J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) eller i andre medier med utnyttbare nitrogen- og karbonkilder. Alle medier inneholder i tillegg 0,5 vekt-% glycin. Det podes enten med en spore-suspensjon eller en ring av fulle sporer. Inkubasjonen foregikk ved 32°C i en rystemaskin, utstyring 4 cm ved 220 omdreiinger pr. minutt i 2-3 dager inntil den tidlige stasjo-nære fase. Deretter festes cellene ved en 10 minutters sentrifugering ved 6000 g og 4°C. For protoplastering til etterfølgende transformasjon med plasmider ble disse og de følgende trinn foretatt under sterile betingelser. Mycel-pellet vaskes en gang med vann og opptas deretter i 5 ml egnet hypertonisk puffer, eksempelvis bestående av 25% saccharose, 50 mM etylendiamintetraeddiksyre (= EDTA) og 50 ml mM tris(hydroksymetylamino)metan(tris) ved en pH 8. Deretter oppbrytes mycelet ved 2-4 slag i glasshomogenisator. Herved lettes lysozymet tilgangen til dets virkested. En fordøyelse etter tilsetning av 1 ml lysozym (inneholdende 10 mg/ml i 50 ml mM tris ved en pH 8) ved værelsestemperatur i 60 minutter er tilstrekkelig til å oppnå en praktisk talt fullstendig protoplastering.

2^__Lyse_av_cellene

For preparering av plasmid-DNA behandles protoplastene videre en halv time ved værelsestemperatur med 1 ml proteinase K (inneholdende lmg/ml i 50 mM tris ved en pH 8). Deretter blandes cellesuspensjonen med natriumdodecylsulfat inntil en sluttkonsentrasjon på 0,1%, deretter inkuberes en ytterligere halv time ved værelsestemperatur. Deretter tilsettes 7 ml av en oppløsning på 2 mM EDTA, 2 M natriumklorid, 50 mM tris ved en pH 8 og den høyviskose blanding inkuberes minst 1 time på is. Cellerester samt en overveiende mengde av krom<p>salt DNA frasentrifugeres deretter ved 1 time sentrifugering ved 20.000 g og 4°C og opparbeides under forskjellige betingelser, alt etter om det tilstrebes en analytisk eller preparativ plasmidisolering.

3 • §i_ AD5lYti§lS_Ei5Smidisolerin2

Det ovenstående fra sentrifugeringen avhelles forsiktig, og plasmid-DNA utfelles ved tilsetting av polyetylenglykol 6000 inntil en sluttkonsentrasjon på 10%. Etter 1 times inkubasjon på is samles fellingen ved hjelp av en 20 minutters sentrifugering ved 20.000 g og 4°C, pettetet opptas i 500 yl 0,2 N NaOH og inkuberes en halv time ved 0°C. Detteretter nøytraliseres den alkaliske suspensjon ved tilsetting av 375 yl 3 molar natriumacetatopp-løsning av en pH på 4,8. Derved overføres det ved alkali-behandling delvis i enkeltstrengede denaturerte kromosale DNA i regioner av partiell homologi igjen i dobbeltstrenget DNA, og det oppstår ved tverrnettdannelse av de kromosale DNA-fragmenter et produkt av en kjempemolekylvekt, som lett lar seg fjerne ved 5 minutters sentrifugering ved 15.000 g og 4°C [sammenlign H.C. Birnboium og J. Doly, Nucleic Acids Research 7, 1513-23 (1979)]. Det overstående blandes deretter med 2,5 ganger volumet etanol og etter

. inkubasjon ved -18°C i 4 timer samles det felte. plasmid-DNA

ved sentrifugering (15.000 g, 4°C, 20 minutter) og vaskes en gang med 78%-ig etanol. Det anrikede plasmid-DNA kan deretter opptas i 0,1 mM EDTA, 20 mM tris ved en pH 8 og anvendes for den hurtige analyse av plasmidet med restriksjonsenzymer.

Etter den allerede ved den analytiske plasmidisolering omtalte polyetylenglykolutfelling opptas de ved hjelp av en 20 minutters sentrifugering ved 20.000 g og 4°C samlede plasmid-DNA i 6 ml 10 mM EDTA,. 50 mM tris ved en pH 8. Volumet av den dannede suspensjon måles med en pipette og pr. ml suspensjon tilsettes 1 g cæsiumklorid. Deretter tilsettes 200 yl etidiumbromid (10 mg/ml) og suspensjonen sentrifugeres ved 80.000 g og 15°C i 60 timer i ultrasentrifuge. De tettere bånd synliggjøres ved UV-lys, fjernes ved sideveis punktering med en injeksjonsnål og blandes igjen med 5 ml av en oppløsning av 10 mM EDTA, 50 mM tris og en pH 8, som i tillegg dessuten inneholder

5 g cæsiumklorid. Resentrifugering i ultrasentrifuge

foregår under samme betingelser som også den etterfølg-ende isolering av båndet. Den samlede DNA ekstraheres deretter flere ganger for å fjerne etidiumbromid med

cæsiumkloridmettet n-butanol og den vandige fase dialy-seres mot 10 mM EDTA, 50 mM tris ved en pH 8 minst 6 timer. Dialysatet blandes deretter med 2,5 ganger volumet etanol og etter 4 timer ved -18°C kan utfelt plasmid-DNA pelleteres ved 20 minutters sentrifugering ved 15.000 g

og 4°C. Utfellingen vaskes deretter en gang med 78%-ig etanol og oppbevares i 0,1 mM EDTA, 20 mM tris ved en pH 8 og 4°C.

4 • 5§£§IS£erisering_av_p_lasmid-DNA

En elektronemikroskopiske undersøkelse foregikk etter standard fremgangsmåter [A.K. Kleinschmidt, Monolayer Techniques, i Electron Microscopy of Nucleic Acid Mole-cules, i Methods of Enzymology, S.P. Colowick og N.O. Kaplan, Verlag Academic Press, bind 25, 361-377 (1968)]. Deretter bestemmes konturlengden med 4,1 ym. Fra konturlengden av plasmidet kunne det bestemmes en molekylvekt på 8,4 megadalton. Karakteriseringen av plasmidet p SVH 1 ble gjennomført med et stort antall forskjellige restriksjonsenzymer. Det fordøyede DNA ble deretter oppdelt på 0,7%-ig horisontale agarosegeler (2 mM EDTA, 40 mM natrium-acetat, 80 mM tris, pH 8,3) i en voltgradient på 5 V/cm i 4 timer elektroforetisk. Ved hjelp av medelektroforerte markerfragmenter av kjent størrelse kan det i tillegg ved en sammenligning av vandringsstrekningen i det elektriske felt bestemmes molekylvekten av de ukjente fragmenter. Snittstedene av 6 restriksjonsenzymer ble utmålt mot hverandre nøyaktig på det ringformede p SVH 1-molekyl (sammenlign tegningen).

Det eneste Pst I-snittsted på plasmidet ble derved vilkår-lig satt som nullpunkt. Stillingen av snittstedene av et enzym, f.eks. av Bam H I på fragmenter, slik de oppstår ved behandling med en annen restriksjonsendonuklease ble bestemt ved to sukessive fordøyelser. Etter restrik-sjon med enzymet Bam H I påføres en aliquot direkte på gelen, en annen aliquot ble ekstrahert to ganger med fenol som ble mettet med 100 mM trispuffer av en pH 8,

og den vandige fase for fjerning av fenol ektrahert tre ganger med eter. Deretter utfelles DNA med 2,5 ganger volumet etanol og kan deretter suspendert i fordøyelses-pufferen, utsettes for innvirkning av annet enzym. Den dobbelt fordøyede DNA påføres nå på gelen, likeledes som også en plasmidprøve som bare er blitt behandlet med annet enzym. På denne måte kan det bestemmes fragmentet på hvilket det annet enzym har et restriksjonssted.

Antallet av kopier av p SVH 1 med vesentlig mer enn 20 kopier pr. celle ble bestemt på følgende måte: Til cellene av Streptomyces venezuelae DSM 40755 ble det i rystekultur tilbudt karbon-14-markert Thymidin-molekyler som innbygges i cellen jevnt i den kromosale og i plasmid-DNA. Etter lyse av cellene og oppdeling av rålysatene uten foregående adskillelse av kromosalt DNA ved hjelp av cæsiumklorid-tetthetsgradienter i nærvær et etidiumbromid spaltes gradienten deretter i ca. 50 fraksjoner og radioaktiviteten av de enkelte fraksjoner bestemmes. Av forholdet mellom aktiviteten av det tettere plasmid- og de lettere kromosale bånd kan det ved kjennskap til plasmidets molekylvekt og kromosonets vurderte molekylvekt beregnes kopitallet av

plasmidet pr. celle [sammenlign R. Radloff, W. Bauer og J. Vinograd, Prod. Nat. Acad. Sei U.S., 57, 1514-1520

(1967)]. 5. Transformasjon_av_stregtomycete Det ble anvendt det av Hopwood og medarbeidere utviklede transformasjonssystem['M.J. Bibb, J.M. Ward og D.A. Hopwood, Nature 274, 398-400 (1978)]. Protoplastene frem-stilles som omtalt under punkt 1) og frasentrifugeres (6000 g, 4°C, 5 minutter) og opptas i et protoplastmedium (25% sukrose, 1,5 mM K2S04, 10 mM MgCl2, 0,36 mM KH2P04, 25 mM CaCl2, 25 mM NaCl, 25 mM tris, pH 7,2).

Etter 30 minutters inkubasjon ved 4°C pelleteres igjen protoplastene og peiletet suspenderes i 1 ml frisk protoplastmedium ved forsiktig opp- og avpipettering. Deretter tilsettes plasmid p SVH 1 og suspensjonen blandes med 3 ml 30%-ig polyetylenglykol 1000, blandes og videre inkuberes i 4 minutter ved 0°C. Deretter tilsettes 8 ml protoplastmedium og den dannede suspensjon avsentrifugeres igjen. Pettetet overhelles deretter med et modifisert regenerasjonsmedium (25% sukrose. 30% glukose, 1,5 mM K2S04, 10 mM MgCl2, 0,1% kasaminosyrer, 0,5% gjærekstrakt, 0,36 mM KH2P04, 20 mM CaCl2, 0,3 mM L-prolin, 25 mM NaCl, 25 mM tris, pH 7,2) og inkuberes 2 timer i ryste-vannbad ved 37°C. Den dannede cellesuspensjon utplatteres deretter for isolering av enkeltkolonier på agarplater inneholdende egnede selektive medier og tranformater kan analyseres med den under punkt 3 (a) omtalte hurtig-oppløsningsfremgangsmåten og de deri inneholdte plasmid-DNA karakteriseres med restrisjonsenzymer.

6 • 5l22iD2_§Y_£l!l!2m§^_5NA_i_2las

Plasmidet p SVH 1 åpnes med et restriksjonsenzym. Samtidig snittes det kromosomale DNA som skal innbygges i plasmidet, således at det oppstår snittsteder med like, dvs. med hverandre ligerbare ender. Etter 3 minutters oppvarming til 70°C blandes begge blandinger, ekstraheres med fenol og utfelles med etanol som omtalt under punkt 4. Deretter opptas DNA i ligasepuffer (etter fremstillerens forholds-regel), blandes med T4-DNA-ligase og inkuberes ved 16°C 1 time og under fremadskridende avkjøling til 4°C natten over. Det således ligerte plasmid innføres deretter som omtalt under punkt 5, deretter i en egnet streptomycet.

Claims (3)

1. Plasmid p SVH 1, karakterisert ved at det er oppnåelig fra en kultur av Streptomyces venezuelae DSM 40755 og har en molekylvekt på 8,4 megadalton, en konturlengde på 4,1 ym og en molekylstørrelse på 12,6 kilobaser (= kb).

2. Plasmid p SVH 1, karakterisert ved at det overhodet ikke snittes av restriksjonsendonukleaser EcoR I, Hind III, Hpa I og Xba I, snittes bare en gang av Pst I og Bel I, av Xho I spaltes i to fragmenter med lengder 7,6 og 4,9 kb, av Cia I i to fragmenter med lengdene 11,8 og 0,8 kb, av Bgl II i tre fragmenter med lengdene 7,5, 2,8 og 2,4 kb og av Bam H I i fire fragmenter med lengdene 7,7, 2,0, 1,8 og 1,2 kb.

3. Anvendelse av plasmidet p SVH 1 til konstruksjon av en vektor og til kloning av fremmed DNA i egnede vertsorganismer .