DK160999B - Plasmid p svh 1 og dets anvendelse - Google Patents

Description

DK 160999 B

Opfindelsen angår det hidtil ukendte plasmid p SVH 1 og dets anvendelse til konstruktion af en hybridvektor og til kloning af fremmed DNA i Streptomyces-værtsorganismer.

Det er kendt fra DE offentliggørelsesskrift nr.

5 3.005.226, at plasmidet pUC 6 kan udvindes ud fra en kultur af Streptomyces espinosus. Plasmidet pUC 6 udviser kun ét enkelt singulært restriktionsenzym-overskæringssted, nemlig for enzymet Bgl II. I modsætning hertil har plasmidet p SVH 1 ifølge opfindelsen, jfr. det følgende, to singulære over-10 skæringssteder, nemlig for Pst I og Bel I.

Det er endvidere kendt fra international patentansøgning nr. PCT/GB79/00095 (WO 79/01169), at der ud fra Streptomyces lividans kan udvindes et plasmid, der synes egnet som vektor til indføring af fremmed DNA i nogle Streptomyces-15 -arter. Det således kendte plasmid foreligger i et kopiantal på 4-5 i cellen, jfr. M. Bibb et al., Nature 284. 526-531 (1980), se især side 527, venstre spalte. Endvidere har dette plasmid et snævert værtsområde.

I litteraturstedet Plasmid 2 (4), 627-631 (1979) er 20 der tale om et Streptomycet-plasmid pUC3, men der findes i dette litteratursted ingen henvisning til en deponering af en stamme, ud fra hvilken plasmidet isoleres, hvorfor dette litteratursted ikke henhører under kendt teknik, der kan efterafprøves. I øvrigt er plasmidet med en molekylvægt på 25 20 MD meget stort og dermed, især efter indkloning af DNA- -segmenter, vanskeligt isolerbart. Desuden har det kun ét enkelt singulært overskæringssted for restriktionsenzymer.

Det fremgår heraf, at anvendelsen af genteknologiske metoder i forbindelse med antibiotica-dannende Streptomyces-30 -arter tillægges særlig betydning. Imidlertid har de kendte plasmider, jfr. ovenfor, været af ringe interesse for den praktiske anvendelse, eftersom de for det første ikke let lader sig fremstille i større mængder. For det andet er det for genteknologiske arbejder meget vigtigt at have plasmider 35 til rådighed, der foreligger i mange kopier pr. celle 2 "i

DK 160999 B

(= "multicopy-plasmider"), når de skal finde fornuftig anvendelse som vektorer til amplificering af klonede gener.

Den genetiske forbedring af de til antibiotica-fremstillingen anvendte Streptomyces-stammer med det formål at 5 opnå en forøgelse af mængden af det dannede antibioticum er en vigtig opgave. Den lader sig imidlertid kun løse med godt resultat ved hjælp af genteknologiske metoder, når der står et plasmid til rådighed, som ikke straks igen elimineres fra den som værtscelle anvendte Streptomyces-art, således 10 som det hyppigt iagttages ved med hverandre ikke beslægtede arter.

Der har således foreligget den opgave at finde et let isolerbart og stabilt i cellen foreliggende multicopy--plasmid, der er egnet som hybridvektor til genetisk forbed-15 ring af Streptomyces-stammer. Det er åbenbart, at denne opgave først da kan løses, når det lykkes at identificere et egnet plasmid i en anden Streptomyces-art.

Det har nu vist sig, at den nævnte opgave løses ved hjælp af plasmidet p SVH 1 ifølge opfindelsen, der er ejen-20 dommeligt ved, at det kan fremstilles ud fra en kultur af Streptomyces venezuelae DSM 40.755, har en molekylvægt på

8.4 megadalton, en konturlængde på 4,1 μιη og udviser en molekylstørrelse på 12,6 kilobaser (=kb), og at det overhovedet ikke overskæres af restriktionsendonucleaserne EcoR

25 I, Hind III, Hpa I og Xba I, kun overskæres én gang af Pst I og Bel I, sønderdeles i to fragmenter med længderne 7,6 og 4,9 kb af Xho I, i to fragmenter med længderne 11,8 og 0,8 kb af Cla I, i tre fragmenter med længderne 7,5, 2,8 og 2.4 kb af Bgl II, og i fire fragmenter med længderne 7,7, 30 2,0, 1,8 og 1,2 kb af Barn Η I.

Den her anvendte stamme af Streptomyces venezuelae er beskrevet i enkeltheder af L. Ettlinger, R. Corbatz og R. Hiitter i Arch. Mikrobiol. 3JL, 326-358 (1958), især fra side 352. En yderligere beskrivelse findes i R. Hiitter, 35 "Systematik der Streptomyceten", Karger-Verlag, Basel/New York, 1967, side 60.

DK 160999 B

3

Streptomyces venezuelae DSM 40.755 er således først og fremmest at betragte som en fortrinlig leverandør af plasmidet, eftersom der her i hver celle foreligger langt mere end 20 kopier af plasmidet, der på grund af dets lave 5 molekylvægt på 8,4 megadalton egner sig særlig godt til gennemførelse af genteknologiske arbejder.

Isoleringen af plasmiderne fra Streptomyces venezuelae DSM 40.755 sker efter i og for sig kendte metoder. Stammen dyrkes først i et egnet, glycinholdigt medium. Efter ind-10 høstning, vaskning og homogenisering af myceliet fjernes cellevæggene med lysozym. Efter behandling af cellerne med proteinase K og natriumdodecylsulfat lyserer cellerne således, at cellerester såvel som chromosomal DNA derefter kan skilles fra ved centrifugering. Dernæst fældes plasmiderne 15 med polyethylenglycol og oparbejdes til efterfølgende hurtigundersøgelser efter en af H.C. Birnboim og J. Doly, J.

Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 (1975) beskrevet metode. Det således berigede plasmid p SVH 1 kan uden videre anvendes til analytiske undersøgelser og underkastes behandling med 20 restriktionsendonucleaser. En præparativ renfremstilling lykkes ved hjælp af to på hinanden følgende cesiumchlorid--massefyldegradient-centrifugeringer.

Det således udvundne plasmid p SVH 1 kan karakteriseres ved endonucleolytisk spaltning med restriktionsenzymer 25 på agarose-geler. Herved kan man fastlægge antallet og størrelsen af de i hvert enkelt tilfælde foreliggende p SVH 1--fragmenter. Det er som allerede nævnt karakteristisk for plasmidet p SVH 1, at det ikke har nogen overskæringssteder for restriktionsendonucleaserne Eco R I, Hind III, Xba 1 og 30 Hpa 1, kun overskæres én gang af restriktionsendonucleaserne Pst I og Bel I, sønderdeles af Xho I i to fragmenter med længderne 7,6 og 4,9 kb, sønderdeles af Cla I i to fragmenter med længderne 11,8 og 0,8 kb, sønderdeles af Bgl II i tre fragmenter med længderne 7,5, 2,8 og 2,4 kb og sønderdeles 35 af Bam Η I i fire fragmenter med længderne 7,7, 2,0, 1,8 og 1,2 kb. Overskæringsstederne for nogle af disse enzymer er

DK 160999 B

4 desuden udmålt i forhold til hinanden på det ringformede plasmidmolekyle, jfr. tegningen. Desuden dannes der ved endonucleolytisk spaltning med Pvu II og Κρη I fire, med Nru I, Pvu I og Sma I fem, med Sst II og Sac II syv, med 5 Sst I otte og med Sal I langt mere end 10 fragmenter.

Konturmålinger på et stort antal kopier af plasmidet giver en størrelse på 4,1 jitm eller en deraf afledt molekylvægt på 8,23 megadalton. Denne værdi er i god overensstemmelse med molekylvægte, der beregnes med addition af restrik-10 tionsfragmentvægte efter gelelektroforetisk opdeling (= 8,4 megadalton). Identiske eller lignende plasmider er hidtil ikke blevet fundet i nogen anden Streptomyces venezuelae--biotype, jfr. V.S. Malik og F. Reuser, Plasmid 2, 627-631 (1979), og de er ej heller blevet fundet andre steder.

15 Plasmidet p SVH 1 er af flere grunde særdeles velegnet til fremstilling af en vektor. Først og fremmest er det overordentligt høje kopital på langt mere end 20 kopier af plasmidet pr. celle og dets stabilitet en meget vigtig forudsætning for anvendelsen af p SVH 1 til genteknologiske arbej-20 der. Trods omfangsrige undersøgelser er der hidtil ikke blevet iagttaget plasmidfri celler hos Streptomyces venezue-lae DSM 40.755. Ved plasmidisoleringer er der stedse blevet opnået udbytter på mere end 200 /xg, beregnet på 1 liter oprindelig Streptomycet-kultur.

25 Plasmidet p SVH 1 egner sig først og fremmest til dannelse af en hybridvektor, som kan indføres i andre Strep-tomycet-arter. Det har nemlig vist sig, at alle hidtil kendte plasmider kun lader sig etablere i forholdsvis få værtsceller. Således er det f.eks. kendt, at der mellem grampositive 30 og gramnegative bakterier findes barrierer for en formering af fremmed DNA, jfr. P. Courvalin og M. Fiandt, Gene 8, 247-269 (1980). De største chancer for en heldig kloning er altid til stede i det tilfælde, hvor hybridvektoren indbringes i en nært beslægtet værtscelle. Alle hidtil publicerede 35 data vedrørende Streptomycet-plasmider og -phager tyder endog på, at disse kun kan indbringes stabilt i et meget

DK 160999B

5 begrænset antal andre Streptomyceter. En kloning af Strep-tomyeet-fremmed DNA i Streptomyceter vil altid være nødvendig i det tilfælde, hvor der ikke blot er tale om ét eller nogle få gener, der skal klones, men om en hel række gener, der 5 muligvis er involveret i syntesen af et antibiotieum.

En kloning af generne for en hel stofskiftevej udgør i det mindste en enorm arbejdsopgave, såfremt den da ikke endog - betinget af en eventuel spredning af generne over hele Streptomycetgenomet - bliver til et i praksis uløseligt 10 problem. Ved et Streptomycet-kloningssystem kan her, f.eks. når der foreligger en stofskifte-"flaskehals", allerede efter omstændighederne en amplifikation af et enkelt gen være tilstrækkelig til opnåelse af væsentligt højere udbytter. Også ved fremskaffelsen af hybride antibiotica, således 15 som de kan tænkes ved kombination af nært beslægtede stofskifteveje, f.eks. ved indføring af et enzym, der modificerer et antibiotieum, er af de samme grunde kun et Streptomycet--værtsvektor-system lovende. Plasmidet p SVH 1 er af disse grunde fremragende egnet til fremstilling af en hybridvektor 20 til muliggørelse af en forøgelse af udbyttet af antibiotica.

Til fremstilling af hybridvektoren anvendes der herved de samme genteknologiske metoder, som tidligere er blevet anvendt ved Escherichia coli-plasmider, og også ved Streptomyceter af M. Bibb, J.C. Schottel og S.N. Cohen, Nature 25 284. 526-531 (1980), og C. J. Thompson, J.M. Ward og D.A.

Hopwood, Nature 286. 525-527 (1980).

Efter disse kendte metoder kan der i plasmidet p SVH 1 i nogle af de med de ovennævnte restriktionsendonucleaser opnåede overskæringssteder ikke blot indføres gener, der 30 bærer antibiotica-resistenser, men også gener, der bevirker en forøgelse af antibiotica-produktionen. De således fremkomne hybrid-plasmider er ifølge alle hidtil foreliggende iagttagelser lige så livs- og formeringsdygtige i Strep-tomyces-celler som udgangsplasmidet. Data vedrørende disse 35 iagttagelser findes i DK patentansøgning nr. 1449/85, jfr. f.eks. tabellerne II og V.

6

DK 160999 B

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende eksempel, hvori procentangivelserne er baseret på vægt, såfremt andet ikke er anført.

5 Eksempel 1. Dyrkning oa protoplasterinq af Streotomvces venezuelae DMS 40.755

Dyrkningen finder sted i egnede beholdere, f.eks.

300 ml Erlenmeyerkolber, i 50 ml medium, f.eks. Luria Broth 10 eller 2 YT (jfr. J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) eller i andre medier med udnyttelig nitrogen- og carbonkilde. Alle medier indeholder yderligere 0,5 vægtprocent glycin. Der podes enten med en sporesuspension eller med et øsken fuld af 15 sporer. Inkuber ingen sker ved 32° C i en rystemaskine med sidedrejning 4 cm og ved 220 o/min. i 2-3 dage til den tidlige stationære fase. Dernæst indhøstes cellerne ved en 10 minutters centrifugering ved 6000 G og 4°C. Til protopla-stering til den efterfølgende isolering af eller transforma-20 tion med plasmider udføres dette og de følgende trin under sterile betingelser. Den fremkomne mycelium-pellet vaskes én gang med vand og optages derefter i 5 ml egnet hypertonisk puffer, f.eks. bestående af 25% saccharose, 50 mM ethylen-diamintetraeddikesyre (=EDTA) og 50 mM tris-(hydroxymethyl-25 amino)-methan (=Tris), ved en pH-værdi på 8. Derpå opbrydes myceliet ved hjælp af to til fire slag i en glashomogenisa-tor. Herved lettes lysozymets adgang til det sted, hvor det skal virke. En fordøjelse efter tilsætning af 1 ml lysozym (indeholdende 10 mg/ml i 50 mM tris ved en pH-værdi på 8) 30 ved stuetemperatur i 60 minutter er tilstrækkelig til opnåelse af en praktisk taget fuldstændig protoplastering.

2. Lyse af cellerne

Til fremstilling af plasmid-DNA behandles protopla-35 sterne i yderligere en halv time ved stuetemperatur med 1 ml proteinase K (indeholdende 1 mg/ml i 50 mM Tris ved en

DK 160999 B

7 pH-værdi på 8) . Dernæst sættes der til cellesuspensionerne natriumdodecylsulfat til en slutkoncentration på 0,1%, hvorpå der inkuberes i yderligere en halv time ved stuetemperatur. Derefter tilsættes der 7 ml af en opløsning af 2 mM EDTA, 5 2 M natriumchlorid, 50 mM tris ved en pH-værdi på 8, og den højviskose blanding inkuberes i mindst én time på is. Cellerester samt den overvejende mængde af den chromosomale DNA skilles derpå fra ved 1 times centrifugering ved 20.000 G og 4°C, og der oparbejdes under forskellige betingelser, 10 alt efter, om der tilstræbes en analytisk eller en præparativ plasmid-isolering.

3. a) Analytisk plasmid-isolering

Den ovenstående væske fra centrifugeringen afhældes 15 forsigtigt, og plasmid-DNA og resterende chromosomal DNA udfældes ved tilsætning af polyethylenglycol 6000 til en slutkoncentration på 10%. Efter én times inkubering på is samles fældningen ved en 20 minutters centrifugering ved 20.000 G og 4°C, og den dannede pellet optages i 500 μΐ 20 0,2 N NaOH og inkuberes i en halv time ved 0°C. Derpå neutra liseres den alkaliske suspension ved tilsætning af 375 μΐ 3 molær natriumacetatopløsning med en pH-værdi på 4,8. Herved overføres den ved alkalibehandlingen delvis i enkeltstrenget denatureret chromosomal DNA i områder med partiel homologi 25 igen til dobbeltstrenget DNA, og der dannes ved krydstværbinding af de chromosomale DNA-fragmenter et produkt med en meget høj molekylvægt, som let lader sig fjerne ved 5 minutters centrifugering ved 15.000 G og 4'C, jfr. H.C. Birnboim und J. Doly, Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979).

30 Til den ovenstående væske sættes der derpå et 2,5 gange så stort rumfang ethanol, og efter inkubering ved -18°C i 4 timer samles den fældede plasmid-DNA ved centrifugering (15.000 G, 4°C, 20 minutter) og vaskes med 78%1 s ethanol.

Den berigede plasmid-DNA kan derpå optages i 0,1 mM EDTA, 35 20 mM Tris ved en pH-værdi på 8 og anvendes til hurtig ana lyse af plasmidet med restriktionsenzymer.

DK 160999 B

8

Præparativ plasmid-isolerina

Efter den allerede ved den analytiske plasmid-isole-ring beskrevne polyethylenglycolfældning optages den ved en 20 minutters centrifugering ved 20.000 G og 4°C opsamlede 5 plasmid-DNA i 6 ml 10 mM EDTA, 50 mM Tris ved en pH-værdi på 8. Rumfanget af den dannede suspension måles med en pipette, og der tilsættes 1 g cesiumchlorid pr. ml suspension. Derefter tilsættes der 200 μΐ ethidiumbromid (10 mg/ml), og suspensionen centrifugeres ved 80.000 G og 15°C i 60 timer 10 i en ultracentrifuge. Den tættere rand gøres synlig ved hjælp af UV-lys, af trækkes ved punktering på siden med en injektionsnål, og der tilsættes på ny 5 ml af en opløsning af 10 mM EDTA, 50 mM Tris med en pH-værdi på 8, der yderligere indeholder 5 g cesiumchlorid. Gencentrifugeringen i 15 ultracentrifugen sker under de samme betingelser, og dette gælder også den påfølgende isolering af randen. Den opsamlede DNA ekstraheres derpå flere gange med cesiumchlorid-mættet n-butanol til fjernelse af ethidiumbromid, og den vandige fase dialyseres mod 10 mM EDTA, 50 mM Tris ved en pH-værdi 20 på 8 i mindst 6 timer. Til dialysatet sættes der derefter et 2,5 gange så stort rumfang ethanol, og efter 4 timer ved -18®C kan udfældet plasmid-DNA pelletteres ved 20 minutters centrifugering ved 15.000 G og 4®C. Fældningen vaskes derpå én gang med 78%'s ethanol og opbevares i 0,1 mM EDTA, 20 mM 25 Tris ved en pH-værdi på 8 og ved 4®C.

4. Karakterisering af plasmid-DNA

Den elektronmikroskopiske undersøgelse udføres efter standardmetoder (A. K. Kleinschmidt, Monolayer Techniques, 30 i Electron Microscopy of Nucleic Acid Molecules, i Methods of Enzymology, S. P. Colowick og N. 0. Kaplan, Verlag Academic Press, Bd. 25, 361-377 (1968)). Derefter bestemmes konturlængden til 4,1 μιη. Ud fra plasmidets konturlængde kan der bestemmes en molekylvægt på 8,4 megadalton. Karakterise-35 ringen af plasmidet p SVH 1 gennemføres med et stort antal forskellige restriktionsenzymer. Den fordøjede DNA opdeles

DK 160999 B

9 derefter elektroforetisk på O,7%'s horisontale agarose-geler (2 mM EDTA, 40 mM natriumacetat, 80 mM Tris, pH 8,3) i en voltgradient på 5 V/cm i 4 timer. Ved hjælp af medelektrofo-rerede markeringsfragmenter af kendt størrelse kan tilmed 5 molekylvægten af de ubekendte fragmenter bestemmes ved en sammenligning af vandringslængderne i det elektriske felt. Overskæringsstederne for 6 restriktionsenzymer udmåles nøjagtigt i forhold til hinanden på det ringformige p SVH 1 -molekyle, jfr. tegningens figur.

10 Det eneste Pst I-overskæringssted på plasmidet sættes herved vilkårligt som nulpunkt. Beliggenheden af overskæringsstedet for et enzym, f.eks. for Bam Η I, på fragmenter, således som de dannes ved behandling med en anden restrik-tionsendonuclease, bestemmes ved to efter hinanden følgende 15 fordøjeiser. Efter restriktion med enzymet Bam Η I påføres en aliquot direkte på gelen, en anden aliquot ekstraheres to gange med phenol, der er mættet med 100 mM Tris-puffer med en pH-værdi på 8, og den vandige fase ekstraheres tre gange med ether til fjernelse af phenolen. Dernæst fældes 20 DNA med et 2,5 gange så stort rumfang ethanol og kan derpå, suspenderet i fordøjelsespuffer, udsættes for indvirkning af det andet enzym. Den dobbelt fordøjhede DNA påføres derpå på gelen ligesom også en plasmidprøve, der kun er blevet behandlet med det andet enzym. På denne måde kan man bestemme 25 det fragment, på hvilket det andet enzym har et restriktionssted.

Antallet af kopier af p SVH 1 i celler med væsentligt mere end 20 kopier pr. celle bestemmes på følgende måde: cellerne af Streptomyces venezuelae DSM 40.755 tilbydes i 30 rystekultur carbon-14-mærkede thymidin-molekyler, som indbygges ensartet i cellen i den chromosomale DNA og i plasmid--DNA'en. Efter lyse af cellerne og opdeling af rålysaterne uden forudgående adskillelse af den chromosomale DNA ved hjælp af cesiumchlorid-tæthedsgradienter i nærværelse af 35 ethidiumbromid opdeles gradienterne dernæst i ca. 50 fraktioner, og radioaktiviteten af de enkelte fraktioner bestem- 10

DK 160999 B

mes. Ud fra forholdet mellem aktiviteten af de tættere plas-midrande og de lettere chromosomale rande kan man med kendskab til plasmidets molekylvægt og chromosomets anslåede molekylvægt beregne plasmidets kopiantal, jfr. R. Radioff, 5 W. Bauer und J. Vinograd, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S., 57, 1514-1520 (1967).

5. Transformation af Streptomyceter med plasmidet p SVH 1

Der anvendes det af Hopwood og medarbejdere udviklede 10 transformationssystem, jfr. M. J. Bibb, J. M. Ward und D. A. Hpowood, Nature 274. 398-400 (1978) . Protoplasteme fremstilles som beskrevet under (1) og skilles fra ved centrifugering (6.000 G, 4“C, 5 minutter) og optages i et protoplaster-medium (25% sucrose, 1,5 mM K2SO4, 10 mJ MgCl2, 0,36 mM 15 KH2P04, 25 mM CaCl2, 25 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,2).

Efter 30 minutters inkubering ved 4°c pelletteres protoplasteme påny, og den fremkomne pellet suspenderes i 1 ml frisk protoplastermedium ved forsigtig på- og afpipet-tering. Derefter tilsættes plasmidet p SVH 1, og der sættes 20 3 ml 30%'s polyethylenglycol 1000 til suspensionen, blandes og inkuberes i yderligere 4 minutter ved 0°C. Derpå tilsættes der 8 ml protoplastermedium, og den fremkomne suspension fracentrifugeres igen. Den dannede pellet overhældes dernæst med et modificeret regenereringsmedium (25% sucrose, 30% 25 glucose, 1,5 mM K2S04, 10 mM MgCl2, 0,1% casaminosyrer, 0,5% gærekstrakt, 0,36 mM KH2P04, 20 nM CaCl2, 0,3 mM L--prolin, 25 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,2), og der inkuberes i 2 timer i rystevandbad ved 37°C. Den fremkomne cellesuspension anbringes derpå til isolering af enkeltkolonier på 30 agarplader indeholdende egnede selektive medier, og transformater kan analyseres ved hjælp af den under 3(a) beskrevne hurtig-opløsningsmetode, og den deri indeholdte plasmid-DNA kan karakteriseres med restriktionsenzymer.

35

DK 160999 B

11 6. Kloning af fremmed DNA i plasmidet p SVH 1

Plasmidet p SVH 1 åbnes med et restriktionsenzym. Samtidig overskæres den chromosomale DNA, der skal indbygges i plasmidet, således, at overskæringsstederne modsvarer 5 overskæringsstederne i det åbnede plasmid p SVH 1, dvs. med hverandre ligérbare ender. Efter 3 minutters opvarmning til 70°c blandes begge udgangsmaterialer, ekstraheres med phenol og fældes med ethanol som beskrevet under (4). Derefter optages det udfældede DNA i ligase-puffer (efter fremstil-10 lerens anvisninger), der tilsættes T4-DNA-ligase, og der inkuberes ved 16°C i én time og under gradvis afkøling til 4°C natten over. Det således ligérede plasmid indføres derpå som beskrevet under (5) i en egnet Streptomycet.

Claims (2)

1. Plasmid p SVH lf kendetegnet ved, at det kan fremstilles ud fra en kultur af Streptomyces vene-zuelae DSM 40.755, har en molekylvægt på 8,4 megadalton, en 5 konturlængde på 4,1 /m og udviser en molekylstørrelse på 12,6 kilobaser (=kb), og at det overhovedet ikke overskæres af restriktionsendonucleaserne EcoR I, Hind III, Hpa I og Xba I, kun overskæres én gang af Pst I og Bel I, sønderdeles i to fragmenter med længderne 7,6 og 4,9 kb af Xho I, i to 10 fragmenter med længderne 11,8 og 0,8 kb af Cla I, i tre fragmenter med længderne 7,5, 2,8 og 2,4 kb af Bgl II, og i fire fragmenter med længderne 7,7, 2,0, 1,8 og 1,2 kb af Barn Η I.

2. Anvendelse af plasmidet p SVH 1 ifølge krav 1 til 15 konstruktion af en hybridvektor og til kloning af fremmed DNA i Streptomycesværtsorganismer.