KR20050093757A - 플라즈미드가 없는 대장균 ｄｓｍ 6601 균주의 클론 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라즈미드가 없는 대장균 DSM 6601 균주의 클론, 상기 균주의 제조 방법 및 상기 균주의 클로닝 운반체로서의 용도에 관한 것이다.

Description

플라즈미드가 없는 대장균 ＤＳＭ 6601 균주의 클론{PLASMID-FREE CLONE OF E. COLI STRAIN DSM 6601}

본 발명은 플라즈미드가 없는 대장균 DSM 6601 균주의 클론, 상기 균주의 제조 방법 및 제조된 상기 균주의 클로닝 운반체로서의 용도에 관한 것이다.

자연, 특히 인간 및 동물의 장 내에 존재하는 대장균은 이미 오래전부터 미생물학 및 유전자 기술과 관련한 연구들의 대상이 되어왔으며, 유전자 공학에서는 특히 특정 유전자 내지는 단백질의 복제 및/또는 추출에 사용된다.

대부분의 Escherichia속 균주는 장 내 외부에서 병원성을 가지며, 일반적으로 발병 지점에 감염을 유발한다. 비병원성 대장균 균주로는 독일 미생물 수집기관(German Collection for Microorganisms)에 기탁된 DSM 6601 균주가 있으며, 이 균주는 나머지 다른 대장균 균주들과 몇몇 유전적 특징에서 차이가 있다. 상기 균주는 매우 까다로운 환경에서만 유전자 조작이 가능하고, 부분적으로는 유전자 조작이 전혀 불가능하기 때문에 간단한 복제 수단으로 사용되지는 않는다.

대장균 균주 DSM 6601은 본질적으로 3177kb 및 5552kb의 크기를 갖는 2개의 플라즈미드를 가지며, 상기 플라즈미드는 각각 pMUT1 또는 pMUT2로 표기된다. 상기 플라즈미드 및 이들의 DNA 서열은 예컨대 US-6,391,631에 기술되어 있다.

도 1은 플라즈미드가 없는 DSM 6601 균주의 클론을 제조하는 방법의 개략도이다.

도 2는 pMut1-Tc 플라즈미드의 유전자 지도이다.

도 3은 pMut2-Kn 플라즈미드의 유전자 지도이다.

본 발명의 토대가 된 장기간에 걸친 연구 결과, 일반적인 유전자 공학 기법으로는 플라즈미드가 없는 DSM 6601 균주의 클론을 결코 제조할 수 없거나 제조하기가 매우 어렵기 때문에, 그러한 클론을 생성하기 위해서는 특별한 방법을 사용해야 한다는 것을 알게 되었다. 야생형 균주는 게놈 DNA 외에도 크기가 상이한 2개의 플라즈미드를 갖기 때문에, 상기 균주의 제거는 여러 단계에 걸쳐서, 일부 단계는 병행하여, 실시되어야 한다.

본 발명에 따른 클론을 제조하기 위해, 본 발명이 제안하는 방법에 따라 제 1단계에서 대장균 DSM 6601 균주 내에 자연적으로 존재하는 플라즈미드(pMut1 및 pMut2)에 각각 항생제 내성이 마킹된다. 이를 위해 종래의 방법에 따라 플라즈미드가 분리되고, 필요한 위치에 내성 유전자가 도입된다. 한 바람직한 실시예에 따르면, 내성 유전자가 상시 발현성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터를 포함하는 발현 카세트(expression cassette)와 함께 각각의 플라즈미드 내로 도입된다.

그렇게 하여 얻은 플라즈미드는 종래의 방법, 예컨대 CaCl₂ 법 또는 전기천공법(electroporation)에 따라 적절한 숙주 내에 도입되어 그곳에서 복제되며, 이때 각각의 플라즈미드 내로 도입된 내성 유전자에 의해 플라즈미드를 운반하는 숙주 세포의 선택이 간편해진다. 내성 유전자를 운반하는 플라즈미드의 복제에 적절한 숙주는 예컨대 대장균 DH5α균주 또는 대장균 HB101 균주이다.

내성 유전자를 운반하는 플라즈미드가 분리된 다음, 또 다른 마커를 제공하기 위해 상기 플라즈미드 내로 sacB 유전자가 도입된다.

그렇게 하여 얻은 또는 마킹된 -플라즈미드가 대장균 DSM 6601 균주 내로 도입된다.

대장균 DSM 6601 균주는 형질전환된 후, 선행 단계에서 플라즈미드 내로 도입되었던 내성 유전자에 의해 내성을 부여받은 항생제(들)를 함유한 배지로 증식한다.

이와 같이 항생제를 함유한 배지로 증식함에 따라, 상기 배지 내에 함유되어 있는 항생제에 내성을 갖는 클론만 배양된다. 또한, 상기 세균의 배양을 위해 최초의 플라즈미드(pMut1 및 pMut2)는 더 이상 필요하지 않기 때문에 상기 세균에서 과잉 유전 물질이 제거되고, 그 결과 상기 세균은 (내성 유전자(들) 및 sacB 유전자를 함유하는) 변형된 플라즈미드(pMut1 및 pMut2)만 갖게 된다.

다음 단계에서는 증식한 세균이 sacB를 함유한 세균의 배양을 억제하는 배지 내로 전이되고, 이때 실질적으로 sacB 유전자를 상실한 세균의 배양만을 허용하는 선택압이 가해진다. 이는 30℃에서 10%의 수크로오스의 존재 하에 균주의 증식을 통해 이루어질 수 있는데, 그 이유는 상기 조건에서 sacB 유전자를 운반하는 플라즈미드를 상실한 클론만 복제될 수 있기 때문이다.

위의 결과로 플라즈미드를 갖지 않은 DSM 6601 균주의 유전체가 얻어진다.

이제, 플라즈미드의 소실을 전제로 할 때 본 발명에 따른 클론이 게놈 DNA의 변화를 전혀 겪지 않았고, 놀랍게도 클로닝 운반체로서의 역할을 원활하게 수행할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

따라서 본 발명에 따른 클론은 실험에서 다수의 유전자 및 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 숙주 세포로서 안전하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 DSM 6601 균주(ΔpMut1/2)를 사용한 실험에서, 외래 DNA가 분리된 형태로 존재하는 자기 고유의 플라즈미드 내로 통합되는 경우, 즉 상기 고유의 플라즈미드가 외래 DNA의 클로닝 벡터로 작용하는 경우, 본 발명에 따른 DSM 6601 균주가 상기 외래 DNA의 매우 우수한 수용체가 된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 상기 외래 DNA는 비병원성 균주로부터 유도되기 때문에, 동물 및 인간의 위장관 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이를 위해 상기 외래 DNA는, 원하는 경우, 점막에의 세균 유착을 촉진하는 외래 유전자들에 의해 형질전환될 수 있으며, 그러한 외래 유전자는 숙주 동물 특유의 성질에 따라 예컨대 소 및/또는 돼지의 점막에의 세균 유착을 촉진함으로써 다른 병원성 미생물의 배양을 방해한다.

본 발명은 실시예를 참고로 하여 하기에 더 상세히 설명된다.

본 발명의 목적은, 플라즈미드가 없는 것을 제외하고는 게놈 DNA에 있어서 원 균주와 유전적으로 완전히 동일한 대장균 균주를 개발하는 것이며, 이는 대장균의 병원성 및 비병원성은 공지되어 있는 것처럼 부분적으로 상기 대장균의 플라즈미드에 의해 제어된다는 고찰 및 부분적으로 발생하는 대장균 균주의 "유전자 내성" 또한 상기 대장균 균주의 잠재 플라즈미드와 관련될 수 있다는 고찰을 토대로 한다.

상기 목적은 플라즈미드가 없는 대장균 DSM 6601 균주의 클론의 제조 및 상기 클론의 제조 방법을 통해 달성된다.

실시예 1

pMut1의 변형

야생형 DSM 6601의 자연적으로 존재하는 2개의 플라즈미드 pMut1과 pMut2가 퀴아젠사의 플라즈미드-미디프렙-프로토콜(QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002, 16-20p.)에 따라 분리된다.

pMut1 플라즈미드의 마킹을 위해 pBR322 벡터에 의해 유도된 테트라사이클린 내성 카세트를 선택하였다. pASK75 플라즈미드로부터 관련 프로모터를 추출하였다. 상기 클로닝의 결과로 얻어진 플라즈미드를 pKS-tetA^tetp/o라고 명명하였다. tetA^tetp/o 인서트(인서트 크기: 1.5 kb)를 제한 효소 XbaI 및 HindIII로 절단하였다. 상기 XbaI/HindIII 단편을 pMut1 플라즈미드의, NdeI 제한효소에 의해 절단된 부위에 삽입하였다.

적절한 효소에 의한 플라즈미드의 제한적 절단 이후에, 절단된 상기 플라즈미드를 컬럼(Quiagen, PCR Purification Kit)을 통해 정제하고, 평활 말단(blunt end)을 만들기 위해 클레나우(Klenow) 처리를 하였다. pMut1 플라즈미드의 재결합을 막기 위해, NdeI 제한효소로 선형화하여 클레나우 효소로 처리한 플라즈미드의 탈인산화(dephosphorization)를 실시하였다. 이어서 pMut1 벡터 및 tetA^tetp/o 인서트를 결합함으로써, 대장균 K-12 균주를 DH5α로 형질전환시켰다.

컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하기 위해, 150ml LB 배지(Luria-Bertani medium)에 1.5ml의 배양균(overnight culture)을 접종하여 하룻밤 동안 배양하고, 37℃에서 OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 교반시켰다. 그런 다음 상기 세균 배양물을 얼음 상에서 20분간 인큐베이션한 후, 4℃에서 10분간 4000rpm으로 원심 분리하였다. 상기 세균 펠릿을 무균 상태인 10% 빙냉 글리세린에서 배양하였는데, 먼저 처음 부피의 100%를, 그 다음에는 50%를, 마지막으로 10%를 배양하였다. 배양된 펠릿을 200㎕의 10% 글리세린에 재현탁하여, 분취한 후(40 ㎕) -80℃에서 보관하였다. 세균 세포의 형질전환을 위해, 1 내지 2㎕의 플라즈미드 DNA(1 내지 100 ng)를 얼음 상에서 해동된 40㎕의 컴피턴트 세포와 혼합하고, 5분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 사전 냉각된 무균 상태의 2mm 전기천공 큐벳의 2개의 전극 사이에서 상기 혼합물을 기포 없이 피펫팅하였다. 상기 큐벳은 건조가 잘 되며, 전극 홀더 내에 설치된다. 2.5kV, 200Ω및 25㎌에서 전기충격을 실시한 후, 1ml의 LB 배지로 세균 현탁액을 큐벳으로부터 세척하고, 교반기 내에서 1 내지 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 상기 세균을 원심분리하고, 상청액을 100㎕까지 제거하였다. 침전물을 남은 100㎕에 재현탁하여, Tc를 함유한 선택 평판 위에 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.

개별 세균 클론의 각각의 플라즈미드를 소량 제조(mini-prep)하여, 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. 테트라사이클린 카세트로 마킹한 플라즈미드 pMut1을 pMut1-Tc라고 명명하였다. 도 2에 상기 pMut1-Tc 플라즈미드의 유전자 지도가 도시되어 있다. 테트라사이클린 내성을 전달하는 DNA 단편의 삽입 부위(최초의 단일 NdeI 부위)가 표시되어 있다. 상기 DNA 단편은 클로닝에 적합한 단일 EcoRI 서열도 갖고 있다. 또한, PCR을 이용한 상기 플라즈미드의 특수 검출에 적합한 프라이머 Muta 5 및 Muta 6의 연결 부위도 표시되어 있다.

실시예 2

pMut2의 변형

pMut2 플라즈미드의 마킹을 위해 pACYC177 벡터에 의해 유도된 카나마이신(kanamycin) 내성 카세트를 선택하였다. 이를 위해 상기 벡터로부터 내성 카세트(크기: 1.34kb)를 제한 효소 StuI로 절단하여, pMut2 플라즈미드의, BglII 제한효소에 의해 절단된 부위에 삽입하였다. 적절한 효소에 의한 플라즈미드의 제한적 절단 이후, 절단한 상기 플라즈미드를 컬럼(Quiagen, PCR Fraction Kit)을 통해 정제하고, 클로닝을 위한 평활 말단을 만들기 위해 상기 pMut2 플라즈미드를 클레나우 처리하였다. pMut2 플라즈미드의 재결합을 막기 위해, BglII 제한효소로 선형화하여 클레나우 효소로 처리한 플라즈미드의 탈인산화를 실시하였다. 이어서 pMut2 벡터와 카나마이신 카세트를 결합함으로써, 대장균 K-12 균주를 예컨대 실시예 1에서 언급한 DH5α로 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 Kn을 함유한 LB 한천 평판 위에 플레이팅하였다. 개별 세균 클론의 각각의 플라즈미드 DNA를 소량 제조하여, 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. 카나마이신 카세트로 마킹한 플라즈미드 pMut2를 pMut2-Kn이라고 명명하였다.

도 3에 상기 pMut2-Kn 플라즈미드의 유전자 지도가 도시되어 있다. 카나마이신 내성 카세트 및 클로닝 부위로서 적합한 단일 EcoRI 서열의 삽입 부위(최초의 단일 BglII 부위)가 표시되어 있다. 상기 DNA 단편은 클로닝에 적합한 단일 EcoRI 서열도 갖고 있다. 또한 PCR을 이용한 상기 플라즈미드의 특수 검출에 적합한 프라이머의 서열에 대해 상보적인 영역들이 Muta 7 내지 Muta 10으로 표시되어 있다.

실시예 3

sacB 유전자의 도입

내성 카세트에 의해 마킹된 pMut1-Tc 및 pMut2-Kn 플라즈미드 내에 sacB 유전자를 도입하기 위해, 상기 두 플라즈미드에서 각각 단일 EcoRI 제한효소에 의한 절단 부위를 선택하였다. pCVD442 플라즈미드로부터 PstI 제한효소를 이용하여 sacB 유전자(크기: 2.6kb)를 분리하였다. pMut1-Tc 및 pMut2-Kn 벡터를 제조하기 위해 상기 플라즈미드를 EcoRI로 선형화한 후, 평활 말단을 형성하기 위해 클레나우 처리하고 탈인산화하였다. 제한적 절단 이후 sacB 인서트를 PstI로 정제하고, 클레나우 효소로 처리하였다. 선형화된 벡터와 인서트를 결합함으로써 대장균 K-12 균주를 예컨대 실시예 1에서 언급한 것처럼 수용 능력(competence)을 갖도록 만들어진 DH5α로 형질전환시켰다. 개별 세균 클론의 플라즈미드 DNA를 소량 제조한 후 제한효소 분석(restriction analysis)을 실시하여, 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. sacB 유전자로 마킹한 플라즈미드 pMut1-Tc 및 pMut2-Kn을 pMut1-TcSac 및 pMut2-KnSac라고 명명하였다.

실시예 4

대장균 균주 DSM 6601의, 플라즈미드가 없는 클론의 제조

먼저 pMut1-TcSac 플라즈미드를, 실시예 1에 기술한 것처럼, 전기천공법을 통해 상기 균주로 형질전환하였다. 전기천공 후, pMut1-TcSac 플라즈미드를 DSM 6601 균주 내로 전이시키기 위해 상기 혼합물을 Tc(50 ㎍/ml)를 함유한 LB 평판 위에 플레이팅하였다. 그 결과 얻어진 테트라사이클린 내성 세균 클론이 pMut1-TcSac 플라즈미드를 갖고 있는지, 그리고 그와 결부하여 본래 존재했던 pMut1 플라즈미드가 소실되었는지를 검사하였다. 플라즈미드 DNA를 제조하고, EcoRI 제한효소를 이용하여 절단한 후, 선형화된 플라즈미드를 전기영동으로 분리하여 pMut1을 나타내는 DNA 밴드의 부재를 확인함으로써 pMut1 플라즈미드가 소실되었음을 증명하였다.

이어서 상기 클론들 중 하나를 30℃에서 하룻밤 동안 10%의 수크로오스를 함유한 LB 배지에 흡수시킨 후, 10%의 수크로오스를 함유한 LB 평판 위에 플레이팅하였다(상기 LB 배지는 1ℓ의 증류수에 녹인, 카세인으로 이루어진 10g의 펩톤, 5g의 효모 추출물 및 5g의 염화나트륨으로 형성됨). 수크로오스를 함유한 LB 배지는, 살균 여과된 50%(중량/부피)의 수크로오스 모액을 45℃까지 냉각시킨 후 최종 농도가 10%가 될 때까지의 양을 멸균한 배지에 첨가함으로써 제조하였다. 상기 평판을 30℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 조건 하에서는 sacB를 더 이상 발현시키지 않는 클론, 즉 sacB 유전자를 운반하는 플라즈미드를 상실한 클론만 복제될 수 있다. 그렇게 하여 얻은 DSM 6601ΔpMut1 균주가 pMut1-TcSac 플라즈미드를 상실하였는지에 대해 검사하였다.

그런 다음 전기천공을 통해 pMut2-KnSac 플라즈미드를 DSM 6601ΔpMut1 균주 내에 도입하였다.

전기천공 후, pMut2-KnSac 플라즈미드를 DSM 6601ΔpMut1 균주 내로 전이시키기 위해 상기 혼합물을 Kn(50㎍/ml)를 함유한 LB 평판 위에 플레이팅하였다. 그 결과 얻어진 카나마이신 내성 세균 클론이 pMut2-KnSac 플라즈미드를 갖고 있는지, 그리고 그와 결부하여 본래 존재했던 pMut2 플라즈미드가 소실되었는지를 검사하였다. 이어서 상기 클론들 중 하나를 30℃에서 하룻밤 동안 10%의 수크로오스를 함유한 LB 배지에 흡수시킨 후, 10%의 수크로오스를 함유한 LB 평판 위에 플레이팅하였다. 상기 평판을 30℃에서 인큐베이션하였다. 그렇게 하여 얻은 DSM 6601ΔpMut1/2 균주가 pMut2-KnSac 플라즈미드를 상실하였는지에 대해 검사하였다.

또한, 플라즈미드를 갖지 않은 DSM 6601ΔpMut1/2 균주의 염색체 변화를 예방하기 위해, 펄스 필드 겔 전기영동을 실시하였다. 어떠한 변화도 없음을 증명할 수 있었으며, 추가의 검사들을 통해 플라즈미드가 없는 클론이 형태학적, 생화학적 또는 발효에 의한 변화를 전혀 보이지 않는다는 사실을 알아내었다.

Claims (8)

1. 플라즈미드가 없는 대장균 DSM 6601 균주의 클론.
2. 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론을 제조하는 방법으로서,

   a) pMut1 및 pMut2 플라즈미드 내에 내성 유전자를 도입하는 단계,

   b) 상기 단계 a)에서 얻은 플라즈미드 내에 sacB 유전자를 도입하는 단계,

   c) 상기 단계 b)에서 얻은 플라즈미드를 대장균 DSM 6601 균주 내에 도입하고, 본래 존재하는 pMut1 및 pMut2 플라즈미드가 상기 단계 b)에서 얻은 플라즈미드로 대체되는 조건 하에서 상기 균주를 증식시키는 단계, 및

   d) 상기 단계 c)에서 얻은 클론들을, sacB 유전자가 결핍된 세균만 배양시키는 조건 하에서 증식시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 플라즈미드가 없는 클론 제조 방법.
3. 제 2항에 있어서,

   상기 내성 유전자는 발현 카세트 내에 들어있는 것을 특징으로 하는, 플라즈미드가 없는 클론 제조 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,

   상기 내성 유전자는 테트라사이클린 내성 또는 카나마이신 내성 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는, 플라즈미드가 없는 클론 제조 방법.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 pMut1 플라즈미드는 테트라사이클린 내성 카세트 및 sacB 유전자로 마킹하고, 상기 최초의 pMut2 플라즈미드는 카나마이신 내성 카세트 및 sacB 유전자로 마킹하는 것을 특징으로 하는, 플라즈미드가 없는 클론 제조 방법.
6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,

   테트라사이클린 내성 카세트 및 sacB 유전자로 마킹된 pMut1 플라즈미드에 의해 형질전환된 세균들을 테트라사이클린을 함유한 평판 위에서 증식시킨 다음, 수크로오스를 함유한 평판 위에서 증식시키고, 제 1단계에서 pMut1 플라즈미드를 제거한 후, (상기 세균들을) 카나마이신 평판에서 증식시키고 계속해서 수크로오스 평판에서 배양시킴으로써 pMut2 플라즈미드를 제거하는, 플라즈미드가 없는 클론 제조 방법.
7. 클로닝 균주로서 사용되는, 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론.
8. 동물의 위장관을 치료하기 위한 수단의 제조에 사용되는, 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론.