CN111850026A - 一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体(2)整合自杀载体的筛选与转化(3)细菌的第一轮筛选(4)细菌的第二轮筛选。本发明所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法不影响细菌本身基因组的稳定性，方法在多种菌种中得到验证，且24kbp至340kbp大小的质粒都能做到质粒的高效敲除，方法简单有效，清除率高达100％。

Description

一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法
技术领域
本发明属于基因编辑领域，尤其是涉及一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法。
背景技术
质粒广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。细菌中含有的质粒为独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。质粒对宿主生存并不是必需的，但是，质粒往往为宿主提供了环境抗性。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属的抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
对质粒进行遗传学与功能研究时，常希望得到其消除质粒的衍生菌株，这样可以方便比较观察质粒的遗传功能，同时完全消除质粒的菌株还可以用于基因工程菌，这在分子生物学研究领域被广泛应用。质粒的消除可以减弱细菌的毒性，还可应用于细菌疫苗的研究与开发。质粒在工程菌种中有时是无用的，增加了细菌的代谢副产物，因此，质粒的消除还可在生物工程领域减少副产物的产生，降低产物纯化成本。
质粒可自发的从细胞中丢失，但是自然丢失的概率很低，仅为10-2-10-8，另外，质粒丢失菌的生长速度与野生菌一般差异不大，这决定了很难将自然丢失质粒的细菌筛选出来。目前多采用物理或化学方法干扰质粒复制，人为地提高质粒丢失的频率，以达到质粒消除的目的。已经报道的质粒清除案例：1.Leavitt等使用比最适温度高5℃培养Klebsiellapneumoniae菌株，消除了其内源质粒；2.Heery等用高压电穿孔法消除了Escherichia coliDH1的内源质粒puG2；3.Spengler等研究了吩噻嗪及其衍生物对Escherichia coli K12的质粒消除作用；4.Mathem等利用EB成功消除了肠杆菌(Enterobacter)内源质粒；5.文良柱等使用SDS提高培养温度相结合的方法，有效地消除大肠杆菌中的抗生素抗性质粒。
物理或化学方法消除质粒存在清除效率低，效果不稳定，化学试剂毒性较大，以及可能对基因组造成不可预料的突变。因此，分子生物学手段消除质粒的方法更有优势。
分子生物学手段消除质粒的方法包括：1.利用质粒的不相容性原理，将亲缘关系密切的质粒转化到细胞内，由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中，使得细胞在增值过程中将其中一个质粒丢失，也可达到消除目标质粒的目的。2.郝明巨等报道的CRISPR/Cas9酶切蛋白特异性切除的手段去除质粒。
但是，质粒在细菌内部往往是多拷贝，CRISPR/Cas9酶切很难将每个质粒都切除，而且细菌本身含有DNA连接酶，会将切断的质粒重新连接，不能保证质粒的消除效率。质粒的不相容性方法需要精准克隆复制起点，且对于含有多个复制起点的大型质粒往往无效。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，包括如下步骤：
(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；
(2)整合自杀载体的筛选与转化：将所述的整合自杀载体转化到大肠杆菌感受态中，并利用抗生素筛选大肠杆菌转化子，然后将整合自杀载体从大肠杆菌转移到含有拟清除质粒的细菌中；
(3)细菌的第一轮筛选：通过抗生素筛选出整合自杀载体与拟清除质粒发生质粒整合的细菌；并且由于抗生素压力和质粒不兼容性，细菌内整合后的质粒将取代内生的拟消除质粒；
(4)细菌的第二轮筛选：将步骤(3)中筛选出的细菌在无抗性培养基中培养，使整合后的质粒发生自然的清除，然后将细菌转移到含有自杀载体所带有的自杀基因的底物的培养基中，使含有整合后的质粒的细菌生长被抑制或被杀死，不含有整合后的质粒的细菌正常生长。
进一步，所述的步骤(2)中的转移步骤通过细菌接合或电转化的方法将整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。
进一步，所述的步骤(2)中的转移步骤通过热激的方法将提取纯化后的整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。
进一步，所述的大肠杆菌含有λpir。细菌含有λpir自杀载体才能在内部复制。其他细菌没有λpir，导入后自杀载体如果不能整合到基因组或者内生质粒上，自杀载体就无法进入子代细菌。
进一步，所述的大肠杆菌为DH5αλpir、S17-1λpir或SM10λpir中的一种。
进一步，所述的拟清除质粒的细菌为痢疾福氏志贺氏菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌或弗氏柠檬酸杆菌中的一种。
进一步，所述的拟清除质粒的大小为24-340kbp。
所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备质粒消除药物或质粒消除试剂盒中的应用。
所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备抑菌药物、杀菌药物或疫苗中的应用。
所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在发酵生产领域或环保领域中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法不影响细菌本身基因组的稳定性，方法在多种菌种中得到验证，且24kbp至340kbp大小的质粒都能做到质粒的高效敲除，方法简单有效，清除率高达100％。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的构建的质粒示意图；
图2为本发明实施例1所述的分子生物学手段高效特异性清除细菌中质粒的示意图；
图3为本发明实施例1所述的pESA3质粒特异性DNA片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4为本发明实施例1所述的线性化自杀载体pCVD442 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图5为本发明实施例1所述的阪崎肠杆菌的第一轮筛选琼脂糖凝胶电泳结果图；
图6为本发明实施例1所述的阪崎肠杆菌质粒清除的确认琼脂糖凝胶电泳结果图；
图7为本发明实施例1所述的幼鼠生存曲线；
图8为本发明实施例2所述的分子生物学手段高效特异性清除细菌中质粒的示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中S17-1λpir大肠杆菌购买自上海唯地生物技术有限公司；阪崎肠杆菌(ATCC BAA894)购买自美国菌种保藏中心；沙门氏菌(Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhi)购买自宁波明舟生物科技有限公司；痢疾福氏志贺氏菌(Shigella flexneri strain M2901)购买自宁波明舟生物科技有限公司；阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii GZcsf-1)购买自宁波明舟生物科技有限公司；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii strain Iona 4)购买自北京北纳创联生物技术研究院；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae strain 555)购买自宁波明舟生物科技有限公司。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，载体pCs-ΔpESA3显示了pESA3特异性片段和氨苄西林抗性基因bla、复制起始子oriR6K、蔗糖敏感标记sacB和广泛宿主范围可移动区mobRP4的定位。pCVD442经PCR线性化，与pESA3特异性DNA片段连接，得到质粒pCS-ΔpESA3。
从S17-1λpir大肠杆菌中提取质粒pCS-ΔpESA3，转化为阪崎肠杆菌BAA-894。通过基因重组pCS-ΔpESA3质粒与BAA-894的内源质粒pESA3整合，经过氨苄青霉素筛选得到含整合质粒的阪崎肠杆菌BAA-894，无抗性培养基中培养使得部分细菌的整合质粒自发丢失，蔗糖暴露可选择性杀死含有蔗糖敏感标记sacB的整合质粒的细菌，通过氨苄西林敏感性试验和质粒特异性PCR鉴定存活的丢失质粒细菌。
具体包括如下步骤：
(1)扩增pESA3质粒特异性片段：以阪崎肠杆菌ATCC BAA894热裂解液为底物，
上游引物：
GAAAAAGGAAGAGTATCTGCGTGCGTCTGCCGCAGGAGGATATG，
下游引物：
GTTAGCAGGCAGTTCCAGGAGAACAATCATAGACCATTACCG，
DNA聚合酶扩增得到pESA3质粒特异性的DNA片段，结果见图3，成功扩增得到pESA3质粒特异性片段；
(2)线性化自杀载体：以自杀载体pCVD442的纯化后产物为底物，
上游引物：
GGCTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTG，
下游引物：
GCAGATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTG，
DNA聚合酶扩增得到pESA3质粒特异性的DNA片段，结果见图4，成功通过PCR得到线性化自杀载体；
(3)载体的构建：利用重组酶试剂盒将扩增的pESA3质粒特异性片段与线性化自杀载体拼接到一起，并且热激法转化到λpir大肠杆菌感受态，并利用pCVD442带有的氨苄抗性使用50mg/L氨苄青霉素筛选大肠杆菌转化子；
(4)转化阪崎肠杆菌：从大肠杆菌转化子中的质粒纯化，然后电转到阪崎肠杆菌中，电转条件为：2.5k，0.2cm，电转化后的阪崎肠杆菌在无抗性培养基中静置孵育3小时，然后涂布在氨苄青霉素抗性平板用于筛选重组子；
(5)阪崎肠杆菌的第一轮筛选：挑选在氨苄青霉素抗性平板上生长的阪崎肠杆菌，使用自杀载体pCVD442特异性引物，上游引物：ATTACGGCAAACAAACACTG、下游引物CTTTCACCAGCGTTTCTGGGTG和DNA聚合酶进行菌落PCR，有1800bp确认载体存在于阪崎肠杆菌中，结果见图5，挑选的14个单克隆中有13个为目标菌株；
(6)自杀载体的自发清除：经过上一步筛选，pESA3质粒与自杀载体pCVD442发生了重组的阪崎肠杆菌被筛选出来，然后将筛选出的阪崎肠杆菌置于无抗性培养基中培养过夜，使得自杀质粒有机会发生自发的清除；
(7)阪崎肠杆菌的第二轮筛选：本轮筛选是利用自杀载体pCVD442上带有的sacB蔗糖致死基因实现的。将细菌转移到含有20％蔗糖的琼脂平板，使得细菌内含有自杀载体pCVD442与拟清除质粒整合体的细菌生长被杀死。步骤(6)中自发产生的质粒清除菌由于不含有sacB基因，可以在含有蔗糖的培养基中正常生长，从而达到特异性筛选pESA3质粒清除阪崎肠杆菌的目的；
(8)阪崎肠杆菌质粒清除的确认：将上一步得到的单克隆进行菌落PCR。使用pESA3质粒特异性引物上游引物GTGAGCGGCGGCAATGACAATG和下游引物CGACACTGAACGCGATTTTACCGAC，DNA聚合酶进行扩增，并用野生型阪崎肠杆菌作为阳性对照。阳性对照有条带而单克隆无条带视为pESA3消除菌株，结果见图6，挑选的20个单克隆被验证全部是pESA3质粒消除菌株，成功率达到100％；
(9)阪崎肠杆菌质粒清除细菌的表型验证：将阪崎肠杆菌的pESA3质粒消除菌与野生菌进行幼鼠感染实验，发现pESA3质粒消除菌具有显著的更弱的毒性，结果见图7.
实施例2
为了验证了方法的通用性，构建了另一种整合自杀载体，试图敲除多种细菌中的导致多重耐药的质粒。
阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii GZcsf-1)、痢疾福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri strain M2901)、沙门氏菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovarTyphi strain)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii strain Iona 4)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae strain555)都存在抗生素耐药，而他们的耐药性被认为与其携带的质粒有关，分别为阪崎肠杆菌的pGW1质粒(340kbp)、沙门氏菌的pB4878质粒(55kbp)、痢疾福氏志贺氏菌的pM2901质粒(81kbp)、弗氏柠檬酸杆菌的pCFI-2质粒(24kbp)和肺炎克雷伯菌的pSCKLB555-1质粒(247kbp)。这5种质粒存在同源区段，可能这5种质粒有共同的起源。利用这5种质粒存在同源区段，将同源区段克隆至自杀载体中，构建出一种同时用于5种不同细菌质粒敲除的整合自杀载体。下面是该种整合自杀载体的构建步骤(以敲除沙门氏菌pB4878质粒为例)。
一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，载体pCVD442E与实施例1中pCVD442的区别在于pCVD442的氨苄抗性基因bla被红霉素基因ermC替换。pSe-ΔpB8478显示了pB8478特异性片段(该片段同时存在于阪崎肠杆菌的pGW1质粒、痢疾福氏志贺氏菌的pM2901质粒、弗氏柠檬酸杆菌的pCFI-2质粒和肺炎克雷伯菌的pSCKLB555-1质粒中)和红霉素基因ermC、复制起始子oriR6K、蔗糖敏感标记sacB和广泛宿主范围可移动区mobRP4的位置。pCVD442E经PCR线性化，与pB4878特异性DNA片段连接，得到质粒pSeΔpB4878。
从S17-1λpir大肠杆菌中提取质粒pSeΔpB4878，转化到沙门氏菌Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhi。通过基因重组pSeΔpB4878质粒与沙门氏菌的内源质粒pB4878整合，经过红霉素筛选得到含整合质粒的沙门氏菌。无抗性培养基中培养使得部分细菌的整合质粒自发丢失。蔗糖暴露可选择性杀死含有蔗糖敏感标记sacB的整合质粒的细菌，通过红霉素敏感性试验和质粒特异性PCR鉴定存活的丢失质粒细菌。从S17-1λpir大肠杆菌中提取质粒pCsE-ΔpGW1，转化为阪崎肠杆菌BAA-894，通过基因重组pCsE-ΔpGW1质粒与Cronobacter sakazakii GZcsf-1的内源质粒pGW1整合，经过红霉素筛选得到含整合质粒的阪崎肠杆菌，无抗性培养基中培养使得部分细菌的整合质粒自发丢失。蔗糖暴露可选择性杀死含有蔗糖敏感标记sacB的整合质粒的细菌，通过红霉素敏感性试验和质粒特异性PCR鉴定存活的丢失质粒细菌。
具体包括如下步骤：
(1)扩增pB4878质粒特异性片段：以Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhi热裂解液为底物，
上游引物：
GAAAAAGGAAGAGTATCTGCGTGCGTCTGCCGCAGGAGGATAT，
下游引物：
GTTAGCAGGCAGTTCCAGGAGAACAATCATAGACCATTACCG，
DNA聚合酶扩增得到pB4878质粒特异性的DNA片段；
(2)线性化自杀载体：以自杀载体pCVD442的纯化后产物为底物，
上游引物：
GGCTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTG，
下游引物：
GCAGATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTG，
DNA聚合酶扩增得到线性化载体DNA；
(3)扩增ermC基因：以商品化的pUC57-ermC的纯化后产物为底物，
上游引物：
GCTAGCCTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTA，
下游引物：
GTAAACTTGGTCTGACAGCCCTTAACTTACTTATTAAATAATTTATAGC，
DNA聚合酶扩增得到ermC。
(4)载体的构建：利用重组酶试剂盒将扩增的pB4878质粒特异性片段与线性化自杀载体、ermC基因拼接到一起，并且热激法转化到λpir大肠杆菌感受态，并利用pCVD442E带有的红霉素抗性使用300mg/L红霉素筛选大肠杆菌转化子；
(5)转化沙门氏菌：从上一步得到的大肠杆菌转化子中的质粒纯化，然后电转到沙门氏菌中，电转条件为：2.5kv，0.2cm，电转化后的沙门氏菌在无抗性培养基中静置孵育3小时，然后涂布在红霉素抗性平板用于筛选重组子；
(6)沙门氏菌的第一轮筛选：挑选在红霉素抗性平板上生长的单克隆；
(7)自杀载体的自发清除：经过步骤(6)的筛选，pB4878质粒与自杀载体发生了重组的沙门氏菌被筛选出来，然后将筛选出的沙门氏菌置于无抗性培养基中培养过夜，使得自杀质粒有机会发生自发的清除；
(8)沙门氏菌的第二轮筛选：利用自杀载体上带有的sacB蔗糖致死基因实现的。将细菌转移到含有20％蔗糖的琼脂平板，使得细菌内含有自杀载体与拟清除质粒整合体的细菌生长被杀死。而步骤(6)中自发产生的质粒清除菌由于不含有sacB基因，可以在含有蔗糖的培养基中正常生长，从而达到特异性筛选pB4878质粒清除沙门氏菌的目的；
(9)沙门氏菌质粒清除的确认：将步骤(8)得到的单克隆进行菌落PCR。使用pB4878质粒特异性引物，
上游引物TGGCTGTTTTACGCGTATGA，
下游引物GGCGGATTTCCACACAGCAC，
DNA聚合酶进行扩增，并用野生型阪崎肠杆菌作为阳性对照，阳性对照有条带而单克隆无条带视为pGW1消除菌株，挑选的100个克隆，经过验证全部是质粒消除菌株；
(10)因为敲除痢疾福氏志贺氏菌(Shigella flexneri strain M2901)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii GZcsf-1)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii strainIona 4)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae strain 555)内部的质粒与沙门氏菌pB4878质粒敲除整合自杀载体存在同源序列(即从pB4878克隆的区段)，因此，pB4878质粒敲除整合自杀载体也应该能够用于这4种细菌的质粒敲除，为了验证我们的猜想，同时，为了进一步验证我们方法可以用于多种细菌的质粒敲除，我们将pB4878质粒敲除整合自杀载体分别电转入痢疾福氏志贺氏菌(Shigella flexneri strain M2901)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii GZcsf-1)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii strainIona 4)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae strain555)，接来下的实验步骤与沙门氏菌的敲除步骤类似，最后，使用不同的引物验证质粒的敲除。
(11)使用pGW1质粒特异性引物foward引物CCGATCAGCGTTACCGGTGC和reverse引物TGGACGTTCTGCGTTTTATC，验证pGW1在Cronobacter sakazakii GZcsf-1中的消除。挑选的100个克隆，经过验证全部是质粒消除菌株。
(12)使用pM2901质粒特异性引物foward引物GGCCGGTTACGGGGACACTA和reverse引物ATTTAGCCCCAAAGCGCAGT，验证pM2901在Shigella flexneri strain M2901中的消除。挑选的100个克隆，经过验证全部是质粒消除菌株。
(13)使用pCFI-2质粒特异性引物foward引物CGAATGTCGTAACCGCTGCG和reverse引物GTTCGGTCAAGGTTCTGGAC，验证pCFI-2在Citrobacter freundii strain Iona 4中的消除。挑选的100个克隆，经过验证全部是质粒消除菌株。
(14)使用pSCKLB555-1质粒特异性引物foward引物CAATGAATTTCAACGACGAG和reverse引物CAGTTCGGGAGCCAGACTGC，验证pSCKLB555-1在Klebsiella pneumoniae strain555中的消除。挑选的100个克隆，经过验证全部是质粒消除菌株。
(15)以上说明我们的实验可以用于多种细菌的质粒敲除，同时验证了我们是基于整合自杀载体与内源质粒同源重组的原理。
(16)阪崎肠杆菌pGW1被认为与多重耐药相关，为了进一步验证质粒敲除的成功，我们对Cronobacter sakazakii GZcsf-1质粒清除细菌进行了抗生素耐药的表型验证，质粒消除菌与野生菌的药物最低抑菌浓度(MIC)被测试。结果见下表1。实验结果表明我们成功得到质粒消除菌株，并且质粒的消除导致了细菌从多重耐药变成抗生素敏感。
表1不同抗生素对pGW1的质粒消除菌与野生菌的最低抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0002622654870000151
Figure BDA0002622654870000161
*基于MIC数据对细菌耐药的解释(敏感，S；中间，I；和耐受，R)是根据CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)机构作出的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建靶向拟敲除质粒的整合自杀载体：扩增拟清除质粒的特异性DNA片段，并将所述的特异性DNA片段克隆到自杀载体上，得到整合自杀载体；
(2)整合自杀载体的筛选与转化：将所述的整合自杀载体转化到大肠杆菌感受态中，并利用抗生素筛选大肠杆菌转化子，然后将整合自杀载体从大肠杆菌转移到含有拟清除质粒的细菌中；
(3)细菌的第一轮筛选：通过抗生素筛选出整合自杀载体与拟清除质粒发生质粒整合的细菌；
(4)细菌的第二轮筛选：将步骤(3)中筛选出的细菌在无抗性培养基中培养，使整合后的质粒发生自然的清除，然后将细菌转移到含有自杀载体所带有的自杀基因的底物的培养基中，使含有整合后的质粒的细菌生长被抑制或被杀死，不含有整合后的质粒的细菌正常生长。
2.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过细菌接合或电转化的方法将整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。
3.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的转移步骤通过热激的方法将提取纯化后的整合自杀载体转化到拟清除质粒的细菌中。
4.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌含有λpir。
5.根据权利要求4所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌为DH5αλpir、S17-1λpir或SM10λpir中的一种。
6.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的拟清除质粒的细菌为痢疾福氏志贺氏菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌或弗氏柠檬酸杆菌中的一种。
7.根据权利要求1所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，其特征在于：所述的拟清除质粒的大小为24-340kbp。
8.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备质粒消除药物或质粒消除试剂盒中的应用。
9.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在制备抑菌药物、杀菌药物或疫苗中的应用。
10.权利要求1-7中任一项所述的利用整合自杀载体高效特异性清除细菌中质粒的方法，在发酵生产领域或环保领域中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094117A1 (en) * 2003-06-26 2006-05-04 Pharma-Zentrale Gmbh Plasmid-free clone of e. coli strain dsm 6601
CN103740747A (zh) * 2014-02-08 2014-04-23 扬州大学 一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法
CN106967744A (zh) * 2017-04-28 2017-07-21 扬州大学 一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094117A1 (en) * 2003-06-26 2006-05-04 Pharma-Zentrale Gmbh Plasmid-free clone of e. coli strain dsm 6601
CN103740747A (zh) * 2014-02-08 2014-04-23 扬州大学 一种使用自杀性载体去除大肠杆菌Nissle菌内隐秘质粒的方法
CN106967744A (zh) * 2017-04-28 2017-07-21 扬州大学 一种利用自杀载体消除沙门菌中多拷贝质粒的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郑浚源等: "鱼类致病性迟钝爱德华氏菌中多药抗性质粒pEIB202的消除", 《安徽农业科学》 *

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