NO832116L - Fremgangsmaate til fremstilling av obligat metylotropen fremmed-dna eksprimerende bakterier og dertil egnede plasmider og vertsorganismer - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører den genetiske manipulasjon av metylotrope mikroorganismer, spesielt fremgangsmåter til fremstilling av obligat metylotropen bakterier som eksprimerer inneholdte fremmed-DNA, plasmider til innføring av fremmed-DNA og vertsorganismer. Én av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat a) et fra en obligat metylotropen bakterium stammende plasmid isoleres, b) herav og av et plasmid med seleksjonsmarkerere fremstilles et hybridplasmid med en til den obligat metylotropene

bakterium egnede replicon,

c) dette hybridplasmid innbringes ved transformasjon i en vertsorganisme og amplifiseres der, d) etter seleksjon behandles klonen med et egnet konjugativt plasmid og mobiliserbarhetseffekten av hybridplasmidet

kreves,

e) de således dannede kloner konjugeres med obligat metylotropene bakterier som rezipient og

f) de ønskede kloner seleksjoneres.

De i fremgangsmåtetrinn a) anvendte plasmid isoleres fortrinnsvis fra en bakterium av slekten metylomonas, spesielt typen metylmonas clara. Spesielt foretrukket er plasmidet pBE 3 fra metylomonas clara-stammen som er deponert ved den tyske samling av mikroorganismer under nummer DSM 2397 samt tilsvarende plasmider med samme replikon.

Det i fremgangsmåtetrinn b) anvendte plasmid med seleksjonsmarkerere kan være plasmid pBR 322, som er omtalt i Gene 2 (197<*>7) 95 - 113. Det således dannede hybridplasmid betegnes i det følgende som pRMx

Som plasmid med seleksjonsmarkerere som kan anvendes i fremgangsmåtetrinn b) egner det seg også et hybridplasmid som inneholder den genetiske informasjon for ekspressjon av insulin, slik det er omtalt i den europeiske søknad nr.

0 032 675.

Det etter fremgangsmåtetrinn b) dannede hybridplasmid innbringes deretter ved transformasjon i en egnet vertsorganisme, fortrinnsvis Escherichia coli og amplifiseres der. 1 f remgangsmåtetrinn d); innføres i denne vertsorganisme som inneholder hybridplasmidet et egnet konjugativt plasmid, fortrinnsvis RP 4. I tillegg komplementeres ved innføring av egnede plasmider som Col K og Col V mobiliserbarhetsdefekten.

Den således forberedte vertsorganisme kan deretter i:.fremgangsmåtetrinn e) overføre det i fremgangsmåtetrinn.c) inn-bragte hybridplasmid ved konjugasjon på en fortrinnsvis plasmid-fri obligat metylotrop bakterium som resipient. Som resipient er det foretrukket bakterier av slekten metylomonas, spesielt av typen metylomonas clara, fremfor alt av stammen ATCC 31 226. Denne stamme er eksempelvis omtalt i tysk patent 26 33 451 og

i US patent 4 166 004.

Avsluttende seleksjoneres i fremgangsmåtetrinn f) de ønskede kloner ved dyrking i et medium som inneholder metanol som karbonkilde samt på grunn av den overførte resistens respektiv følsomhet overfor antibiotika. De således dannede obligat metylotrope bakterier er i stand til å eksprimere det inneholdte fremmed-DNA, altså eksempelvis å produsere insulin.

Detaljer ved disse fremgangsmåtetrinn anføres nærmere innen rammen av eksemplene.

Oppfinnelsen vedrører videre en variant av overnevnte fremgangsmåte, hvor fremgangsmåtetrinnene d) og e) forenkles som følger: I trinnet d) isoleres etter seleksjon hybridplasmidet og i trinn e) innføres det isolerte plasmid ved transformasjon

i sfæroplaster av obligat metylotrop bakterium.

Oppfinnelsen vedrører således også sfæroplaster av metylotrope bakterier, fremfor alt av obligat metylotrope bakterier, spesielt av bakterier av slekten metylomonas, fortrinnsvis av typen metylomonas clara. Spesielt foretrukket er stammenjmetylomonas clara ATCC 31226.

<Sfæroplasten ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved at man dyrker bakteriene i et glycinrikt medium, som inneholder en osmotisk stabilisator. Fortrinnsvis er dette medium svakt hypotonisk, Ytterligere foretrukkede utførelser av denne fremstillingsfremgangsmåte forklares nærmere i det følgende.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelsen av de nye sfæroplaster til innbringning av ekstern DNA i disse, bakterier. Denne eksterne DNA innføres i første rekke i form av et plasmid. Som plasmider kommer det i betraktning de overnevnte hybridplasmider.

For dannelse av sfæroplastene dyrkes de metylotrope bakterier i et egnet medium, fortrinnsvis i en minimalmedium, inntil

en egnet celletetthet. Egnede celletettheter ligger i et om-råde av ODgQQpå fortrinnsvis 0,5 til 1,8, spesielt 0,9

til 1,4. Et definert volum av denne kultur innføres deretter omtrent frem ganger mengden av nevnte medium som dessuten er rikt på glycin og inneholder en osmotisk stabilisator. Inneholdet av glycin kan gå inntil metningskonsentrasjon, foretrukket er et innhold på 2 til 4 vekt-%.

Som osmotiske stabilisatorer kommer det i betraktning sukkere som saccharose, sukkeralkoholer som sorbit og polyglykoler som polyetylenglykol 6000. Mediet er fortrinnsvis svakt hypotonisk, hvilket innstilles egnede konsentrasjoner av osmotisk stabilisator.Egnet er eksempelvis saccharose-konsentrasjon på 10 vekt-% eller en-molar sorbit.

I dette medium rystes bakteriene så lenge inntil det under fase-kontrastmikroskop i det vesentlige ikke er synlig noen småstavformede metylotrope bakterier. Vanligvis kan det etter ca. en times rystning (100 - 180 omdreininger/minutt)

ved ca. 37°C iakttas dannelsen av sfæroplaster som ubeveglige kuleaktige strukturer. Denne prosess er vanligvis avsluttet etter ca. 4 timer.

De dannede sfæroplaster avsentrifugeres forsiktig, eksempelvis ved 4°C 10 minutter ved 2600 g, og resuspenderes i egnede medier. Til stabilisering av sfæroplastene inneholdes dette resuspenderingsmedium likeledes en osmotisk stabilisator i egnet konsentrasjon, eksempelvis 15 vekt-% polyetylenglykol og molvekt 6000.

Denne suspensjon blandes i et omtrenglig volumforhold på

5 : 1 i en blanding som til like deler består av det til resuspensjon av sfæroplastene benyttede medium og bærere av DNA som skal innføres i en egnet puffer. Som DNA-bærer kommer det som anført ovenfor i første rekke i betraktning et hybridplasmid. En egnet puffer hertil består av en vandig oppløsning som pr. liter inneholder 10 mmol TRIS (tris-hydroksymetyl)-aminometan) og 1 mmol natrium-etylendiamin-tetraacetat (TE-puffer). Til denne blanding settes en osmotisk stabilisator (eksmpelvis tre ganger vokum av sfæroplast-suspensjonen av 4 vekt-%-ig polyetylenglykol 6000-oppløsning) og gjennomblandes forsiktig. Etter kort henstand ved værelse-temperatur tilsettes omtrent 10 ganger volum av sfæroplast-suspensjonen. av resuspensjonsmediet og blandingen sentrifug-eres forsiktig,. (3600 g) .

Utfellingen opptas deretter i det dobbelte volum av sfæro-plastsuspensjohen av resuspensjonsmediet og utstrykes på agarplater for å undersøke om transformasjonen har funnet sted. Disse agarplater tilsvarer deres sammensetning re-suspens jonsmediet og inneholder ved siden av 1,5 vekt-% bacto-agar dessuten et til seleksjon egnet antibiotikum, eksempelvis 50 yg/ml ampicillin og 10 yg/ml tetracyclin, hvis de anvendte hybridplasmider inneholder de tilsvarende resis-tensgener. Platene dyrkes deretter ved 37°C i 1 til 3 dager og resistente kolonier undersøkes etter dyrkning i nevnte væskemedium som inneholder et egnet antibiotikum på nærvær av plasmid-DNA (Humphfreys et al. BA 383 (1975) 457-463). Herved kunne de for transformasjon anvendte plasmider isoleres fra de metylotrope bakterier.

Oppfinnelsens gjenstand er videre plasmider av metylomonas clara-stammen DSM 2397 samt hybridplasmidene med til en obligat metylotrop bakterium egen replikon, alså plasmider som repliseres i bakterier av slekten metylomonas, fortrinnsvis typen metylomonas clara, spesielt stammen ATCC 31226, hvori det er integrert prokaryotisk ellereukaryotisk DNA, spesielt de for ekspressjon av insulin.

Oppfinnelsens gjenstand er videre vertsorganismene som inneholder nevnte plasmider, samt vertsorganismene som i tillegg inneholder det konjugative plasmid og videre slike som i tillegg inneholder ekstraplasmider til opphevelse av mobiliser-ingseffekten. Foretrukkede vertsorganismer inneholder som konjugativt plasmid RP 4 og som plasmider til opphevelse av mobiliseringsdefekten Col K eller Col V.

Fordelen ved oppfinnelsen ligger deri at det gjøres bruk

av et replikon av et plasmid av en obligat metylotrop bakterium, altså med meget snevert vertsområde. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utmerker seg således med høy sikkerhet således at den er anvendbar på rekombinante DNA som inneholder risikorike informasjoner.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler. Prosentangivelser refererer seg herved til vekt, hvis intet annet er angitt.

I eksemplene anvendes følgende forkortelser:

ATP = adenosintrifosfat

EDTA = etylendiamin-tetraeddiksyre respektiv -acetat (Na) 0D,nr. = optisk tetthet (optical density) ved 600 nm

b U U .

TE-

puffer = vandig oppløsning inneholdende pr. liter 10 m mol tris-HCl innstilt på pH 8 og 1 m mol EDTA, likeledes

innstilt på pH 8,0.

Tris

(-HC1) = tris-hydroksymetyl-aminometan (-hydroklorid)

Eksempler

1. Plasmid- isolering av M. clara DSM 2397

Plasmid-isoleringen foregikk i det vesentlige etter metoden av Humphfreys et al. (BBA 383 (1975) 457 - 463). Hertil ble bakteriene fra 1 liter kulturmedium ved en ODgQQ på ca. 1,0 frasentrifugert og bakterieutfellingen resuspendert i 5 ml sucrose-oppløsning (25% sucrose i 50 mmol/liter tris-HCl oppløsning av pH 8,0). Under isavkjøling ble det tilsatt 1 ml lysozym-oppløsning (5 mg/ml lysozym i 2 50 mmol/ liter tris-HCl oppløsning, pH 8,0) samt 2 ml 0,2 molar EDTA-oppløsning av pH 8,0. Under omsvingning under tiden

ble blandingen inkubert 5 minutter på is. Deretter ble lysis tilveiebragt ved tilsetning av 8 ml av en blanding bestående av 50 mmol/liter tris-HCl, 75,5 mmol/liter EDTA

og 0,2% av en ikke-ionisk tensid ("triton X-100") av pH

8,0. Den høyviskose blanding ble sentrifugert i 30 minutter ved 48 000 g, idet som overstående ble dannet et klart lysat. Pr. -10 ml overstående ble det tilsatt 1,1 ml 5-molar koke-saltoppløsning samt 1,1 g polyetylenglykol av midlere molvekt 6000. Blandingen ble inkubert ved 4°C natten over. Den fnokkede utfelling ble samlet ved 5-minutters sentrifugering ved 1500 g og oppløst i 3,5 ml pufferoppløsning (50 mmol/ liter tris-HCl, 5 mmol/liter EDTA, 50 mmol/liter NaCl, pH 8,0) og' oppløsningens volum målt. Etter tilsetning av 1 g CsCl

pr. ml oppløsning samt av 1/15 ml av en 1%-ig vandig ethidium-bromid-oppløsning ble det sentrifugert i 10 minutter ved 16000 g. Det overstående fra denne sentrifugering sentri-fugeres i likevekt (20 timer ved 47000 omdreininger/minutt, 18°C i vertikalrotor) og har også uten bestråling med UV-lys to tydelige synlige, omtrent 1 cm fra hverandre liggende bånd. Ved innstråling av UV-lys av bølgelengde 36 6 nm ble det frem-hevet de fluoreserende bånd og de nedre plasmidbånd høstet sideveis innstikning av gradienter med nål og etterfølgende ommtrekning av båndene i en sprøyte, Ethidiumbromidét ble fjernet ved hjelp av utrustning med en CsCl mettet iropropan-01. Etter 3 gangers dialyse mot 2 liter TE-puffer for hver gang minst 2 timer ble det dannet plasmid-DNA i en renhet som tillot anvendelse i. følgende fremgangsmåtétrinn.

Viste det seg i DNA-oppløsningen ennu forurensninger så ble denne ekstrahert to ganger med like volum med 0,1 molar tris-HCl-oppløsning av pH 8,0 mettet fenol og deretter 3 ganger med absolutt eter. Den overskytende eter ble blåst av, oppløsningen blandet med 1/9 av volumet av tremolar natriumacetat-oppløsning og DNA felt ved tilsetning av like volumer av isopropanol. Etter henstand natten over ble blandingen sentrifugert 30 minutter ved 12000 g og DNA-utfellingen vasket med 90% etanol. Deretter ble DNA lyofilisert og opp-tatt med TE-puffer.

2. DNA- isolering fra agarose

I den følgende fremgangsmåte fant det anvendelse den av Langridge et al (Analytical Biochemistry 103 (1980) 264 - 271) omtalte metode.

DNA ble påført på en horisontal 0,5%-ig agarose-gel (lavt-smeltende agarose, type VII, nr. A-4018, Sigma).; Etter elektroforesen ble båndene gjort synlig ved ethidium-bromid-fargning utskåret fra gelen. Agarose-skrivene som inneholdt DNA ble smeltet ved 70°C i et lite glassrør, volumet målt og avkjølt i 37°C. Derpå ble det tilsatt samme volummengder av de nedenfor omtalte butanol- og vannfaser.

150 ml n-butanol ble rystet med 150 ml vann.i skilletrakt og etter adskillelse av fasene oppløst i 100 ml av den vann-mettede butanolfase 1 g heksadecyl-trimetylammoniumbromid. Denne oppløsning ble utrystet med 100 ml av vannfasen, idet det kan tilsettes en skumdemper (50yl Antifoam A, Sigma). Etter adskillelse av fasene natten over ble disse oppfanget adskilt.

Den etter tilsetning av disse butanol- og vannfaser dannede blanding ble grundig gjennomblandet ved forsiktig dreiing av rørene og fasenes adskillelse'avventet ved 37°C. Den øvre DNA-holdige butanolfase adskilles og den gjenblivende vandige fase ennu ekstrahert to ganger på den omtalte måte med butanol. De forenede butanolfaser blandes med 1/4 av volumet av en 0,2 molar NaCl-oppløsning og igjen grundig gjennomblandet. Etter adskillelse av den vandige fase foregikk en ny saltekstrahering og de forenede vandige faser ble blandet dråpevis med samme volum av kloroform (som var renset over en aluminiumoksydsøyle) Etter en halv-times henstand på is ble den nedre klororformfase kassert og gjenblivende kloroform utblåst med luft. DNA ble utfelt med isopropanol og resuspendert i TE-puffer etter adskill-elsen.

3. Elektroforese av polyacrylamid- gel

Tilsyneliggjøring av karakteriseringen av DNA-fragmenter under 0,3 MD fant anvendelse 8 - 15%-ig polyacrylamid-(PAA)-geler. Gelene var 1 mm tykke, 30 cm lange og 14 cm brede. Som puffer tjente en blanding som pr. liter inneholdt 89 mmol borsyre, 89 mmol tris-HCl og 2,5 mmol EDTA

og har pH 8,2.

For fremstilling av en 8 %ig PAA-gel ble det ført sammen

33 ml av en 24 %-ig PAA-stokkoppløsning (23,22 g acrylamid og 0,78 g N,N<1->betylenbisacrylamid i 100 g vandig oppløsning), 10 ml av nevnte elektroforesepuffer som imidlertid inneholdt alle komponenter i 10 ganger konsentrasjon, 6,25 ml av en 6,4 %-ig 3-etylamino-pfopionitril-oppløsning og 50,75 ml vann. Blandingen ble avvannet på vannstrålepumpe og polymerisasjonen startet med fast ammoniumperoksyddisulfat. Med en gang deretter ble gelen støpt og ventet til begynnelsen av elektroforesen minst to timer. Før påføring av prøvene ble det på gelen for fjerning av resterende ammoniumperoksodisulfat anlagt omtrent en time en spenning på 100 V.

Elektroforesen ble gjennomført ved 100 V og en strømning på

12 mA.

4. Karakterisering av plasmidet pBE 3 fra metylomonas

clara- stammen DSM 2 39 7

Plasmidet pBE 3 ble fordøyet med de i tabell 1 nevnte restriksjonsendonukleaser og de dannede fragmenter oppdelt gelelektroforetisk. Ved dobbeltfordøyning og ved karakterisering av enkelte i pBR 322 klonerte fragmenter - som. beskrevet nedenfor - ble det oppnådd de i tabell 2 og figur 1 viste resultater.

Plasmid pBE 3 er en delesjonsmutant fra et større plasmid. Dertil eksisterer dessuten mindre plasmider. Alle disse plasmider er ekvivalente innen oppfinnelsens ramme hvis de inneholder det metylomonas-egne replikon.

5. Restriksjonsfordøyinger

Enkeltfordøyninger ble gjennomført i et samlet volum på

50 til 100 yl med de av fremstilleren anbefalte puffere.

For å sikre en fullstendig fordøyning av DNA ble prøvene inkubert natten over.

Ved dobbelt- og fleregangerfordøyelse ble de tilsvarende enzymer for det meste tilsatt samtidig til DNA. Pufferen består i dette tilfelle av en oppløsning som pr. liter inneholdt 50 mmol kokesalt, 50 mmol tris-HCl (innstilt på pH 7,5), 6. mmol magnesiumklorid, 6 mmol 2-merkaptoetanol og 100 mg storfeserumalubin. Konstrollforsøk viste at enzymene i denne puffer gir samme resultater som de av. fremstilleren anbefalte. Unntak danner enzymer som har et overgjennomsnittlig høyt saltbehov. I disse tilfeller ble det i første rekke fordøyet ved mindre saltkonsentra-sjoner med det ene enzym og først etter økning av salt-konsentrasjonen tilsatte annet enzym.

6. Partiell fordøyelse med Eco R I

2 yg plasmid-DNA ble inkubert med 1 U av restriksjonsenzymet i et saltet volum på 50 yl ved 37°C. Samme blandinger ble inkubert forskjellig lenge og reaksjonen stoppet i de for-skjellige tider ved 10 minutters oppvarmning av blandingen ved 70°C. En gelelektroforetisk analyse av båndmønsteret hver gang viste hvor langt fordøyelsen var skredet frem etter de definerte tider.

7. Vekstbetingelser

Alle anvendte escherichia coli-stammer ble dyrket i L-broth (10 g bactro trypton, 5 g gjærekstrakt og 5 kokesalt pr.

1 liter vann). Metylomonas elara-stammene ble dyrket i et av de to følgende minimal-medier.

8. Konstruksjon av hybridvektorene

Plasmidet pBE 3 ble fordøyet partielt med restriksjonsenzymet Eco R I således at plasmidets hoveddel bare ble snittet en gang og forelå i den lineæriserte form. pBR 32 2-DNA ble totalt fordøyd med Eco R I og deretter under-kastet en behandling med alkalisk fosfatase. De således forberedte DNA'er ble hatt sammen og inkubert med T4-DNA-ligase ved 14°C natten over. 50 yg av denne ligerte j ■

blanding tjente deretter til transformasjon i den ved hjelp av CaCl2-behandling kompetentgjorte E. coli-stamme HB 101.

Bakteriene ble strøket ut på L-broth plater med 20 yg/ml tetracyklin og dyrket natten over. Resistente kolonier ble overpodet på friske plater og godt utvaskede kloner undersøkt ved hjelp av "single colony lysis" på nærvær av plasmid-DNA med høyere molekylvekt enn pBR 322. Kloner som inneholdt et slikt plasmid-DNA ble endelig dyrket i 100 ml L-broth med eller yten tetracyklin og etter kloramfenikol-stimulering av bakteriene utvunnet plasmid-DNA.

Restriksjonsfordøyelse med enzymene Eco R I og Ava I viste at på fig. 2 viste hybridplasmid pRM 21 og det på fig. 3 viste hybridplasmid pRM 54 var blitt dannet.

Dessuten kunne det identifiseres hybridplasmider som inneholdt fraksjoner av pBE 3.

9. Ligase- reaksjon

Ligase-reaksjoner ble utført i 50 yl volum ved en samlet DNA-konsentrasjon på 20 yg/ml. Pufferen inneholdt pr.

liter 3 mmol tris-HCl (innstilt på pH 7,5), 4 mmol magnesiumklorid, 10 mmol ditioerytrit og 0,2 mmol ATP. Til disse blandinger ble det satt Luyl T4-ligase tilsvarende.400 U

(1 U tilsvarer her enzymmengden som er nødvendig til å ligere 50% av en Hind III-fordøyet lambda-DNA i løpet av 30 minutter ved -16°C i et volum på 20 { jtl. Konsentrasjonen av DNA i denne blanding utgjør derved ca. 330 yg/ml). Det forutbestemte ligase-eksperiment optimale forhold av de to DNA til hverandre ble beregnet etter fremgangsmåten av Dugaiczyk et al., JMB 9_6_ (1975) 171. Det ble inkubert ved 14°C i minst 16 timer.

10. Konjugasjon

Resipient og donor ble dyrket natten over til en OD^^^

på 1,0 - 1,2 (resipient) respektiv 1,4 - 1,6 (donor) og like volum av resipient og donor satt sammen således at det for blandingen sto til disposisjon en stor overflate. Blandingen ble inkubert i 2 timer uten å rystes ved 3 7°C og deretter utstrøket 200 yl herav på agarplater hvis sammensetning muliggjorde en seleksjon mot donor og for den med en nye ved hjelp av det plasmid som skal overføres fastslått egenskap utrustet reseptor. Ved konjugasjon mellom E. coli HB 101

og M clara DSM 2397 var dette metanol-minimalmedium-platene tilsetning av et (ved hjelp av typen av plasmider som skal overføres bestemt) antibiotikum.

I andre eksperimenter ble resipient og donor inkubert som angitt ovenfor og 200 yl av denne blanding utstrøket på metanol-minimalmedium-plater uten antibiotikum. Disse plater ble dyrket natten over ved 37°C og den dannede bakteriemasse oppsvømmet med 2 ml metanol-minimalmedium.

200 yl av denne suspensjon kom deretter igjen til utstrykning på metanol-minimalmedium-plater med tilsvarende antibiotikum. Kloner viste seg etter 48 - 72 timers dyrkning av platene ved 37°C.

11. Ekspressjon eukaryotisk DNA i M. clara

a) Plasmidet pBE 3 ble klonet respektiv omklonet etter den omtalte fremgangsmåte i derivater av pBR 32 2 som som c-DNA-sekvens inneholdt eukaryotisk gen av apeinsulin.

Apeinsulin-c-DNA er blitt innbygget i Pst I-snittstedet av pBR 322 således at denne fremmede informasjon ble eksprimert under kontroll av 3-laktamase-promotoren i E. coli. Derved oppsto et fusjonsprotein som kunne påvises med antiinsulin-anitlegeme (europeisk søknad nr 0 032 675).

Apeinsulin-c-DNA inneholdt to interne Pst I-snittsteder.

Den koderende informasjon kan derved ved Pst I-fordøyelse ikke fjernes i intakt form fra plasmidet. For å muliggjøre en replikasjon av dette plasmid i M.clara ble det derfor gått frem således at DNA-sekvensene fra M. clara-plasmid pBE 3 ble innbygget i denne insulinformerende pBR 32 2-derivat. DeneksperimentelTe gjennomføring foregikk som omtalt ovenfor. Herved kunne det fåes en rekke av hybride plasmider som adskiller seg i deres struktur bare ved den i pBR 322-delen innbyggede apeinsulin-c-DNA fra de tidligere omtalte hybridvektorer. Anordning av insulingenet i pBRD 322-delen av disse vektorer forblir derved uendret i fase således at også disse klone insulin-antigen determinanter eksprimerer i E. coli. En av disse kloner som inneholder den samlede pBE 3-sekvens får betegnelsen plnMc 68.

Den fastlagte mobiliserbarhetsdefekt av pBR 32 2 kan komplementeres ved plasmider som Col K og Col V (Young og Poulis,

Gene 4 (1978) 175 - 179). Derfor ble i den ovenfor omtalte ved kalsiumkloridbehandling kompetentgjorte donorstamme ved det konjugative plasmid RP 4 og hybridvektorene av pRM-rekken dessuten i tillegg innført plasmid Col K ved transformasjon. Som indikatorstamme til påvisning av plasmid Col K ble det anvendt colicin-følsom stamme AN 1157 (Warren et al. MGG 170

(1979) 103 - 107). For i konjugasjoneksperimentene å selek-sjonere mellom E.coli-donorstammene HM 101 (RP 4, Col K, pRM 54) respektiv HB 101 (RP 4, Col K, pRM 21) og resipienten M. clara ATCC 31226 på kloner som inneholdt hybridvektoren ble det seleksjonert i nærvær av høye doser tetracyklin (50 yg/ml) på metanol-minimalmedium (M 36).

En analyse av tallrike M. clåra-klone viste at i ca. 10% av tilfellene var blitt dannet kloner som bare ikkeholdt hybridvektoren. I et konjugasjonseksperiment mellom E. coli-donorstammen HB 101 (RP 4, Col K, plnMc 68) og M. clara resipienten ATCC 31226 kunne det på samme måte fåes M. clara-kloner som baré inneholdt plasmidet plnMc 68.

c) Den dannede M.. clara-klone med plasmid plnMc 68 ble dyrket deretter og over en radioimmunprøve respektiv en fettcelle-prøve undersøkt på dens insulininnhold. Tilsvarende de i europeisk søknad 0 032 675 med E. coli-g.jorte iakttagelser kunne det også i tilfelle av M. clara ATCC 31226 måles insulin-verdier mellom 1 og 5 IE pr. liter. Således blir altså den i pBR 322-delen av hybridvektoren plnMc 68 inneholdte insulin-informasjon også korrekt-og effektivt eksprimert i M. clara.

12. Stammen metylomonas clara ATCC 31226 dyrkes i minimal-dedium M 36 inntil en OD,,.,- fra 0,9 til 1,4. 20 ml av disse

b U U

kulturer innføres i 100 ml M 36-medium som dessuten inneholder 4% glycin og 10% saccharose. I dette medium rystes bakteriene 4 timer ved 37°C og 100 til 180 omdreininger/minutt.

Under fasekontrastmikroskop ses da ingen avlange bevegelige bakterier mer.

De dannede sfæroplaster avsentrifugeres ved 4°C i 10 minutter ved 2 60 0 g og resuspenderes i 1 ml M 36-medium som i tillegg inneholder 10% saccharose.

De nevnte medier kan isteden for de 10% saccharose også inne-holde 1 mol/liter sorbit eller 15% polyetylenglykol av midlere molekylvekt,60 00.

Adskillelse av sfæroplastene kan også foregå ved 10 minutters sentrifugering ved 4°C og 3600 g. 13. 0,5 imi av den ifølge eksempel 12 dannede suspensjon blandes med 0,1 ml av en blanding som til like deler består av resuspensjonsmediet og TE-puffer hvori inneholdt plasmid pRM 21. Til denne blanding setter man 1,5 ml 4%-ig polyetylen-glyk<q>l-6000-oppløsning og gjenommblander forsiktig. Denne blanding lar man stå 2 minutter ved værelsetemperåtur, tilsetter 5 ml resuspensjonsmedium og sentrifugerer ved 3600 g.

Utfellingen opptas i 1 ml resuspensjonsmedium og utstrykes

på agarplater som i deres sammensetning tilsvarer resuspensjonsmediet og i tillegg inneholder 1,5% bakto-agar og 50 yg/ ml ampicillin. Platene dyrkes ved 37°C i 3 dager og koloniene

dyrkes i M 3 6-medium som inneholder 50 yg/ml ampicillin. Av de således dannede bakterier kunne det isoleres det til transformasjon anvendte plasmid pRM 21.

Isteden for ampicillin kan det ved denne fremgangsmåte også hver gang anvendes tetracyklin i en konsentrasjon på 10 yg/ml.

Samme resultat får man også når man isteden for det nevnte plasmid anvender plasmidet pRM 54. 14. Arbeider man ifølge eksempel 13/anvender imidlertid som plasmid pINMc 68, og seleksjonerer med 50 yg/ml tetracyklin, så får man metylomonas clara-klone med dette plasmid som produserer insulin.

Claims (15)

1. Hybridplasmider med et til et obligat metylotropt bakterium egnet replikon.

2. Plasmid ifølge krav 1, som repliseres i et bakterium av slekten metylomonas, fortrinnsvis arten metylomonas clara, spesielt av stammen ATCC 31226.

3. Plasmid ifølge krav 1 eller 2 med integrert eukaryotisk DNA, spesielt for ekspressjon av insulin.

4. Plasmid ifølge krav 1 eller 2, med integrert prokaryotisk DNA.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av obligat metylotrope bakterier som eksprimerér inneholdt fremmed-DNA, karakterisert ved at a) fra et obligat metylotropt bakterium isoleres et plasmid, b) herav og av et plasmid med seleksjonsmarkere fremstilles et hybridplasmid med et til det obligat metylotrope bakterium eget replikon, c) dette hybridplasmid innføres ved transformasjon i en vertsorganisme og amplifiseres der, d) etter seleksjon behandles klonen med egnet konjugativt plasmid og mobiliserbarhetsdefekten oppheves, e) de således dannede kloner konjugeres med fortrinnsvis plasmidfritt obligat metylotrope bakterier som resipient, °g f) de ønskede kloner seleksjoneres.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det obligat metylotrope bakterium er et av slekten metylomonas, fortrinnsvis av arten metylomonas clara, spesielt av stammen ATCC 31226.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at bakteriet hvorav plasmidet isoleres er av stammen DSM 2397.

8. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 5-7, karakterisert ved at plasmidet med seleksjonsmarkere er pBR 322 og/eller inneholder den genetiske informasjon for ekspressjon av insulin.

9. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 5-8, karakterisert ved at verts organismen er Escherichia coli, det konjugative plasmid er RP 4 og mobiliserbarhetsdefekten oppheves ved innføring av plasmidet Col K eller Col V.

10. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 5-8, karakterisert ved at istedenfor fremgangsmåtetrinn d) og e) overføres det som resipient tjenende obligat metylotrope bakterium i sfæroplastene og hybridplasmid innføres ved transformasjon.

11. Fremgangsmåte til fremstilling av de i krav 10 nevnte sfæroplaster fra metylotrope bakterier, karakterisert ved at man dyrker bakterier i et glycinrikt medium som inneholder en osmotisk stabilisator, idet mediet fortrinnsvis er svakt hypotonisk og inneholder 2 til 4 vekt-% glycin.

12. Plasmider av DSM 2397.

13. Vertsorganisme inneholdende et plasmid ifølge et eller flere av kravene 1-5, samt eventuelt et konjugativt plasmid og eventuelt et plasmid som opphever mobiliserbarhetsdefekten.

14. Organisme ifølge krav 13, som som konjugativt plasmid inneholder RP 4 samt eventuelt plasmidet Col K eller Col V.

15. Sfæroplaster av metylotrope, fortrinnsvis obligat metylotrope bakterier, spesielt av slekten metylomonas, fremfor alt av arten metylomonas clara, spesielt stammen metylomonas clara ATCC 31226.