JPS63502636A - ポリケチド抗生物質生合成用遺伝子の単離 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリケチド抗生物質生合成用遺伝子の単離１里皇公団 本発明はポリケチド抗生物質（以下に定義）の生合成に関わる酵素をコードする 遺伝子の同定と操作、そのように同定あるいは操作された遺伝子のポリケチド抗 生物質製造における使用、およびそのように操作された遺伝子を含む微生物に関 する。

ｌ凱■青景 ポリケチドは、特別な構造上の類似性よりむしろその生合成における類似性によ り関係づけられるような、構造的にも機能的にも種々雑多な群の天然産物である 。ポリケチド天然産物は、ポリ−β−ケトメチレンｔＪｆ（−（ＣＨＲＯ）ゎ− 、ここでｎは約４から２０の範囲であり得る）から成る類似した基本構造に広い 意味で由来する構造を有する。ポリケチドは、この基本構造が合成される機構に より他の天然産物と区別される。

ポリケチド径路の概略図を第１図に示す。ポリ−β−ケトメチレン鎖は“出発” 単位であるアシル−ＣｏＡエステルから合成され、それはマロニル−ＣｏＡ単位 の段階的縮合とそれに伴う脱カルボキシル化段階による。アシル−ＣｏＡエステ ルの１マロニル単位もまたポリケチドにより変わり、それはメチルマロニル基、 エチルマロニル基および他のアルキルマロニル基であり得る。

ポリケチドの生合成においては、アシル単位とマロニル単位とは多酵素複合体に より会合すると考えられる。この複合体は一般にポリケチドシンターゼと呼ばれ 、前駆体単位を受け取り、縮合、および最終的な安定したポリケチドが形成され 遊離されるまで酵素が結合したままの中間体の他の副反応を行うものである。は んのわずかのポリケチドシンターゼの特徴がわかっているにすぎないが、ポリケ チドシンターゼはアシル−ＣｏＡ　“出発”分子の結合部位を組み込んでおり、 また縮合を行うというトランスアシラーゼ機能を有する点で類似していると考え られている。ポリケチドシンターゼは関係がある限り９合成される特別なポリケ チドに特異的である。

ポリケチドシンターゼは異なるアシル−ＣｏＡ　“出発”分子に対するその特異 性、異なるマロニル−ＣｏＡ単位に対する特異性、マロニル単位が鎖に付加され る特別な順序に対する特異性、そして基本的なポリケチド鎖の形成に関連して生 じる副反応、特に還元、置換および環化を含む副反応の存在に対する特異性にお いて、かなりの相違を示し得る。

このような相違は１個々のポリケチドの基本的なポリケチド構造の形成に関係の ある酵素（およびそれをコードする遺伝子）の機能上および構造上の相違に反映 するようである。

このように、ポリケチド生合成にはい（つかの共通な機械論的特徴があるが、関 係のある特別な酵素が構造的に関連しているという証拠はない。

放線菌のメンバー、特にストレプトミセス属（８μｍゆｊμ狙）の細菌により産 生される抗生物質のいくつかのファミリーは天然産物であるポリケチド群に属す る。ポリケチド抗生物質には、テトラサイクリン類（例えば、オキシテトラサイ クリン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン）。

マクロリド類（例えば７エリスロマイシン）、ポリエン頚（例えば、アンホテリ シンＢ）、ポリエーテル類（例えば、モネンシン）、アンサマイシン類（例えば 、リファマイシン）。

イソクロマネキノン類（例えば、アクチノルホジン）、アベルメクチン類および ミルベマイシン類がある（“ＥｃｏｎｏｍｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ″、　 Ｖｏｗ、　３．　”５ｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｔａｂ ｏｌｉｓｍ”。

Ｅｄ、Ｒｏｓｅ＋　Ａ、Ｈ１＋１９７９＋　八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　 ｐａｇｅｓ　３５５−３８２　；　Ｃａｎｅ＋Ｄ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｌｉａｎｇ、 　Ｔ−Ｃ，、（１９８３）　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０５　： 　４１１０−４１１２　、およびＨｏｐｗｏｏｄ、　Ｄ、八、、　Ｍａｌｐａｒ ｔｉｄａ、　Ｆ、、　Ｋｅｉｓｅｒ、　Ｈ，Ｍ、。

Ｉｋｅｄａ、　Ｈ，、Ｄｕｎｃａｎ＋　Ｊ、＋　Ｆｕｊｉｉ、　１．、　Ｒｕｄ ｄ、　Ｂ、Ａ、Ｍ、、　Ｆｌｏｓｓ。

Ｈ，Ｇ、　ａｎｄ　Ｏｍｕｒａ、　Ｓ、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１４ 　：　６４２−６４４）　、第２図は異なるファミリーのい（つかのポリケチド 抗生物質の構造を示しているが、これかられかるように、ポリケチド抗生物質は 構造的に種々雑多である。ポリケチド抗生物質は殺菌薬、殺真菌薬、抗線虫薬、 殺虫薬および細胞毒性薬を含む機能的に異なる群を意味する。これらの抗生物質 はポリケチド径路（上記参照、第１図）により合成されると考えられる。

ボリケチド抗生物質の生合成では共通なあるいは構造上関連のある前駆体が使用 されるが、酵素あるいは共通の中間体の同定からはその生合成が共通の径路をと ることは詳細にはわかっていない。

このようなポリケチド抗生物質のｉｎ　ｖｉｖｏでの合成には多くの段階があり 、各段階は１酵素により行われる。特定の抗生物質の生合成に関わる酵素をコー ドする遺伝子をその抗生物質に対する生合成遺伝子と称する。生合成遺伝子には また。

特定の生合成段階を担う酵素をコードしないが他の生合成遺伝子の発現の制御に 何らかの形で関係のある酵素も含まれる。

抗生物質をｉｎ　ｖｉｖｏで合成するには、生合成酵素をコードする遺伝子の他 にこれら制御遺伝子が必要である。

生合成径路における酵素段階の順序を確かめるために一般にとられている方法は “共同合成（ｃｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”として知られている。抗生物質の合成 に適用されるこの方法には１問題の抗生物質を通常産生ずる微生物の多くの抗生 物質非産生変異体を単離することが含まれる。

段階の順序は、径路の異なる段階でブロックされた変異体を配列することにより 決定する。ブロックされた変異体の順序は交叉相補性検定により決めるが、ここ では径路の後期でブロックされた変異体は初期でブロックされた変異体に生合成 の前駆体を供給し、こうして初期でブロックされた変異体の抗生物質産生を補充 する。

段階の順序が一端確立すれば、遺伝地図作成技術を用いて生合成径路に関係のあ る遺伝子の位置決めを行うことができる。次いで組換えＤＮＡ技術により遺伝子 を単離することができる。

しかし、生合成径路を調べるこれらの方法は非常に時間がかかり、また径路の明 白な説明あるいは遺伝子の正確な位置が得られない可能性がある。

ポリケチド抗生物質の生合成径路の説明の１例はＲｕｄｄおよびＨｏｐｗｏｏｄ 　（Ｒｕｄｄ、　Ｂ、Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ、　Ｄ、Ａ、＋　（１ ９７９）　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１４　：　３５−４３）によりなされてい るが、彼らはストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　ｃ ｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３　（２）におけるアクチノルホジン生合成の遺伝学を 解説している。

この参考文献はまた。アクチノルホジン合成のための遺伝子が細菌の染色体ＤＮ Ａ上で群を成していることを示している。

また、他の抗生物質の生合成のための遺伝子も群を成していることが２例えば、 　Ｇｈｉｓａｌｂａ等によりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉａｌＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、　Ｅｄ、　Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ、　Ｅｊ、　Ｄ ｅｋｋｅｒ、　Ｎ、Ｙ、　１９８４で（ノルカーブイア（Ｎｏｒｃａｒｄ　ｉａ ）におけるリフ７フイシン）　、　Ｒｈｏｄｅｓｅｔ　ａｌ、（１９８４）、　 Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２４　：　３２９で（ストレプトミ セス　リモサム（Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓ）におけるオキシテトラサイクリン）　、 　Ｒｕｄｄ　ａｎｄ　）！ｏｐｗｏｏｄ　（１９８０）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ。

計、　ｖｅｒｂａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　６ｔｈ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 　ｏｆ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　１９８５で（ストレプトミセス　ベヌツ ェラエ（Ｓ、ｖｅｎｕｚｕｅｌａｅ）におけるクロラムフェニコール）、示され ている。

抗生物質の生合成に関わる遺伝子を単離するためにいくつかの方法が提案されて いる。１法には“相補性”として知られる技術があり、これには野生型ＤＮＡの 断片をとりこれら断片を用いてブロックされた変異体におけるポリヶチド抗生物 質の合成を回復させる試みが含まれる。この方法には、抗生物質非産生変異体の 単離が必要である。

この方法はＭａｌｐａｒｔｉｄａとＨｏｐｗｏｏｄ　（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ　 ａｎｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ。

Ｄ、Ａ、、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　：　４６２−４６４）によ り例証されており。

彼らは、単純な一次代謝物から抗生物質アクチノルボジンを合成するのに必要な 完全な遺伝情報を有する。ストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃ ｏｌｏｒ）　ＤＮＡの巨大（３３ｋｂ）隣接区分の単離について報告しており、 ＤＮＡのこのような区分を抗生物質生合成遺伝子群と呼んでいる。

抗生物質の生合成に関わる遺伝子を単離するための他の方法には、ポリケチド抗 生物質を産生ずる微生物がらその微生物にポリケチド抗生物質耐性を付与する遺 伝子をクローニングすることが含まれる。このような耐性遺伝子は、ポリヶチド 抗生物質がそれを産生ずる微生物にとって他の方法で致死的である場合に存在す るにちがいない。この方法は、いくつかの場合において抗生物質耐性遺伝子が染 色体上で生合成遺伝子に密接に位置付けられている（連関している）ことがゎか っているという知識に基づいている。従って、耐性遺伝子周辺の領域をクローニ ングすることにより９群を成している抗生物質生合成遺伝子をクローン化するこ とができる。この方法は、　５ｔａｎｚａｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４　：　２２９−２３２により、ストレプトミセス 　エリスレウス（Ｓ、肛エサμ匹」−からのエリスロマイシン生合成群のクロー ニングで例証されている。

抗生物質の生合成をコードする遺伝子（生合成群）が一端同定されクローン化さ れれば、天然には抗生物質を産生じないストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　 ｃｅｓ）の適当な菌株にこれら遺伝子を導入し２通常非産生の細菌でこの生合成 遺伝子を発現させて抗生物質を産生ずることができる。これはＭａｌｐａｒｔｉ ｄａとＨｏｐｗｏｏｄ　（１９８４）により報告されているが、彼らは通常はア クチノルホジンを産生しないストレプトミセス　パルプラス（針匹■竺圧照　匹 ■蛙旦）のある菌株においてこの抗生物質を産生させている。さらに、様々な産 生性のストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）菌株をアクチノルホジン の生合成に関わる遺伝千金であるいはそのいくつかを用いて形質転換することに より、メデルマイシン、グラナタシンおよびアクチノルホジンのハイブリッド抗 生物質を産生できることが報告されている。

発囲■且斐 本発明の目的はポリケチド抗生物質の生合成に関係のある遺伝子を単離するため の新規な方法を提供することにある。

この方法は個々の生合成遺伝子の単離あるいはポリケチド抗生物質生合成遺伝子 群の単離に適用できる。本性は特に、ポリケチド抗生物質の生合成の初期段階に 関わる遺伝子の単離に適している。

本発明の他の目的は、ここで述べる方法で単離される生合成遺伝子や遺伝子群を 用いて、天然にはポリケチド抗生物質を産生じないストレプトミセス属（鉦匹■ 姐匹弦）のある菌株においてポリケチド抗生物質を産生ずる方法を提供すること にある。この方法には、単離した遺伝子または遺伝子群を含むＤＮＡ断片を適当 な非産生性のストレプトミセス（旦尿■と肚並旦宿主株に導入することが含まれ 、ここで導入された生合成遺伝子が発現され、所望のポリケチド抗生物質が産生 される。

本発明のさらに他の目的は、単離されたポリケチド抗生物質生合成遺伝子や遺伝 子群を含むＤＮＡ断片、これら断片と遺伝子を含むＤＮＡベクター、およびこれ らベクターとＤＮＡ断片を含む菌株を提供することにある。

従って本発明は第一の観点では、第一のポリケチド抗生物質の生合成に関係のあ る遺伝子を単離する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：ａ）各ク ローンが該第−のポリケチド抗生物質を産生ずる微生物由来のＤＮＡ断片を含む ようなりローンライブラリーを調製すること；ｂ）該クローンライブラリーを、 第二のポリケチド抗生物質の生合成に関係のある遺伝子の少なくとも一部の核酸 配列を有する核酸プローブ分子とのハイブリダイゼーションで選別すること；お よびＣ）該核酸プローブ分子とハイブリダイズするクローンを選択することによ り、該第−のポリケチド抗生物質の生合成に関係のある該遺伝子を含有するＤＮ Ａ断片を含むクローンを単離すること。

抗生物質生合成遺伝子のハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズする ことがわかっているクローンに含まれるＤＮＡ断片は２次に、このクローンライ ブラリーをさらにプロービングするために、あるいは第二のクローンライブラリ ーをプロービングするために使用することができる。このように単離されたハイ ブリダイズするクローン由来のＤＮＡ断片。

あるいはこのような単離断片の組合せは１次に、正常にはポリケチド抗生物質を 産生じないストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）株において所望のポ リケチド抗生物質を直接合成する能力について試験することができる。このよう な手順に従って、非産生の菌株でポリケチド抗生物質を合成するために必要な全 ての遺伝子を単離しクローン化することができる。

第一のポリケチド抗生物質を産生ずる微生物由来のＤＮＡを含む単離ＤＮＡの断 片はまた。他のポリケチド抗生物質について本発明の方法を実施するのに使用で きる。これらの断片は特に、第一のポリケチド抗生物質と構造上類似しているポ リケチド抗生物質に対する生合成遺伝子や遺伝子群を単離するクローンライブラ リーまたはクローンバンクは、好ましくはバクテリオファージ、プラスミド、あ るいは最も好ましくはコスミソドのクローンのライブラリーを含む。クローンラ イブラリー用のＤＮＡ源は、第一のポリケチド抗生物質の産生株である微生物に 由来する染色体、プラスミドまたはプロファージのＤＮＡを含むであろう。

クローンライブラリーを構築する微生物は、第一のポリケチド抗生物質産生用の 生合成遺伝子を保持するものである。

微生物は真菌あるいは細菌が可能であり、好ましくは放線菌。

特に好ましくはストレプトミセス属（Ｓ二狙順ジｔｃｅｓ　）の細菌である。

本性で用いるハイブリダイゼーションプローブは核酸配列を含有し、そして好ま しくはＤＮＡを含有する。

本発明の単離法を行う際、特にコスミフドライブラリーを選別する場合、多（の かなり大きな染色体断片が同定されるであろう。これら巨大断片はある場合には 、ポリケチド抗生物質の合成に関係のある遺伝子ばかりではな（、抗生物質の合 成に必須でない遺伝子や他のＤＮＡ配列をも含む可能性がある。このような場合 、この巨大なりローン化断片から抗生物質の合成に必須でない領域を欠失させる ことが望ましいであろう。生合成遺伝子群の単離においては、ポリケチド抗生物 質の合成に必要な遺伝子は染色体の隣接領域にわたる２つ以上のＤＮＡ断片上に 見い出されるのが実情であろう。この場合。

隣接断片を互いに連結して、必要な生合成遺伝子の全てを含む単一のＤＮＡ断片 を構築することが望ましいであろう。また。

このような混成りＮＡ断片から必須でない領域を欠失させることが望ましいであ ろう。

１つの特別な実施態様では２本発明の単離法は、第二のポリケチド抗生物質の初 期の生合成段階に関係のある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を含有するハイ ブリダイゼーションプローブを使用する。

他の特別な実施態様では２本発明の単離法は、アクチノルホジンの生合成に関係 のある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を含有するハイブリダイゼーションプ ローブ、特にアクチノルホジン遺伝子Ｉまたはアクチノルホジン遺伝子Ｈの少な くとも一部の核酸配列を含有するプローブを使用する。

さらに他の特別な実施態様では１本発明の単離法は、ミルベマイシンの生合成に 関係のある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を含有するハイブリダイゼーショ ンプローブ、特にミルベマイシン遺伝子Ｉまたはミルベマイシン遺伝子■の少な くとも一部の核酸配列を含有するプローブを使用する。

本発明はまた。第二の観点として、天然では非産生性のストレプトミセス属（鉦 匹且亜Ｌｅｓ）のある菌株において第一のポリケチド抗生物質を産生ずる方法を 提供し、この方法は以下の工程ａおよびｂを包含する： ａ、該第−のポリケチド抗生物質を産生ずるストレプトミセスＩＸ　（Ｓｔｒｅ 　ｔｏｍ　ｃｅｓ）のある菌株から、該第−のポリケチド抗生物質の群を成して いる生合成遺伝子を含有するＤＮＡ断片を単離する工程であって、以下の工程１ ＝ｖｉを包含する工程： ｉ、各クローンが該第−のポリケチド抗生物質を産生ずる微生物由来のＤＮＡ断 片を含むようなりローンライブラリーを８周製すること； ｉｉ、該クローンライブラリーを２％二のポリケチド抗生物質の生合成に関係の ある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を有する核酸プローブ分子とのハイブリ ダイゼーションで選選択することにより、該第−のポリケチド抗生物質の生合成 遺伝子群の少なくとも一部を有する第一のＤＮＡ断片を含むクローンを単離する こと； ｉｖ、該第−のポリケチド抗生物質の生合成遺伝子群の少なくとも一部を有する 該第−の選択されたＤＮＡ断片を、該非産生性のストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　 ｔｏｍ　ｃｅｓ）株において該第−のポリケチド抗生物質を直接合成する能力に ついて試験すること； ■、該第−の選択されたＤＮＡ断片の右末端あるいは左末端の領域を有する核酸 プローブを用いて、該クローンライブラリーあるいは第二のクローンライブラリ ーを再選別すること；ｖｉ、該第−の選択されたＤＮＡ断片の右末端あるいは左 末端の領域とハイブリダイズするクローンを選択して、該第−の選択されたクロ ーンの右側あるいは左側の染色体ＤＮＡ配列を有する第二のＤＮＡ断片を含むク ローンを単離すること；ｖｉｉ、Ｆｊ第二の選択されたＤＮＡ断片およびそれに 続いて選択されるＤＮＡ断片を用いて該試験、再選別および選択の工程を繰り返 し、該試験工程で該非産生性のストレプトミセス（鉦匹■虹Ｉｅ　ｓ　）株にお ける該第−のポリケチド抗生物質の産生により確認されるような、該第−のポリ ケチド抗生物質の群を成す生合成遺伝子を有する該ＤＮＡ断片が単離されるまで 行うこと；および す、該生合成遺伝子群を含む該クローン化断片を該非産生性のストレプトミセス （Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃ、ｅｓ）菌株に導入して、該非産生性のストレプトミセ ス（里匹匹叩圧照）株において該ポリケチド抗生物質を産生ずる工程。

本性は９本発明の単離法で得られる生合成遺伝子や遺伝子群を含むＤＮＡ断片を 使用する。本発明の繰り返し技法を適用することにより、ポリケチド抗生物質の 完全な生合成遺伝子群を含むＤＮＡ断片を単離し非産生性の特に琢大して、ポリ ケチド抗生物質の合成を行うことができる。

本性での使用に適切な細菌宿主は、天然には所望のポリケチド抗生物質を産生じ ないストレプトミセス属（鉦匹肛姐践且）の菌株である。適切な宿主株は、ポリ ケチド抗生物質合成に必要な生化学的前駆体１例えば、適当なアシル−ＣｏＡ前 駆体およびマロニル−ＣｏＡ前駆体を合成し、しかも形質転換可能なものである 。本性では特に、ストレプトミセス　リビダンス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　 １ｉｖｉｄａｎｓ）　、ストレプトミセス　アンボファシエンス（倶り狙頴ジニ 牡　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）　、　ストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓｔｒ ｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　、ストレプトミセス　アベルミ チリス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｓ）およびストレプト ミセス　パルプラス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　Ｈ■旦旦）の株が有用である と思われる。合成しようとする特別なポリケチド抗生物質に従って２本法では異 なるストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ五ｅｓ）宿主株が多少好んで使用され よう。

本発明のポリケチド抗生物質産生法の１つの特別な実施態様にはミルベマイシン の産生が含まれ、これは特に、ミルベマイシン生合成遺伝子群を、より特別には ＤＮＡ断片ＭＣまたは断片ＭＣに機能的に等価なりＮＡ断片をストレプトミセス （旦■■虹ｍｙｃｅｓ）のミルベマイシン非産生株に導入することによる。この 実施態　様ではストレプトミセス　リビダンス（鉦匹配ｙ１ｉｖｉｄａｎｓ）が 適当な宿主株と考えられる。

本抗生物質産生法の他の特別な実施態様には、適当な宿主細菌におけるアベルメ クチンの産生がある。

本発明は他の観点では、ポリケチド抗生物質の産生に十分な生合成遺伝子を含み ポリケチド抗生物質生合成アクチベーター遺伝子を欠くようなストレプトミセス 属（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）のある菌株においてポリケチド抗生物質生合成 遺伝子群の発現を活性化する方法を提供し、この方法は該菌株にミルベマイシン 遺伝子■を含有するＤＮＡ断片を導入することを包含する。

特に、特別な１実施態様においては、ポリケチド抗生物質合成の発現を活性化す るこの方法は、アクチノルホジン、ミルベマイシンおよびアベルメクチンの合成 、特にストレプトミセス　リビダンス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　１ｉｖｉｄ ａｎｓ）　＋　ストレプトミセス　コエリカラー（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびストレプトミセス　アベルミチリス（Ｓｔｒｅ　 ｔｏｍ　ｃｅｓ　ａｖｅｒ−ｍｉｔｉｌｓ）の株におけるこれら抗生物質の１つ の生合成に適用できると考えられる。

また２本法は、天然にポリケチド抗生物質を産生ずる株にミルベマイシン遺伝子 ■を導入することによりポリケチド抗生物質の産生レベルを増強するためにも使 用することができると考えられる。

本発明はさらに他の観点では１本発明の方法で有用なりＮＡ断片およびこれら断 片を含むベクターを提供する。特に、ベクターとしては、実質的にミルベマイシ ン生合成遺伝子群から成るＤＮＡ断片を含有するものが提供され、好ましくは該 ＤＮＡ断片は断片ＭＣである。ミルベマイシン生合成遺伝子をコードするＤＮＡ 配列から実質的に成るＤＮＡ分子を含有するベクターもまた提供され、これには ミルベマイシン遺伝子Ｉ、ミルベマイシン遺伝子■およびミルベマイシン遺伝子 ■をコードするものが含まれる。ＤＮＡの断片１．断片２．断片３．断片４゜断 片５．断片６．断片７．断片８ａ、断片８ｂ、断片１０．断片１２．断片１４． 断片１６．断片６２および断片６４であるＤＮＡ分子を含有するベクターも提供 される。ここで提供されるベクターおよびＤＮＡ断片はハイブリダイゼーション プローブとじて有用であり、あるいはある場合には適当な宿主細菌に導入してポ リケチド抗生物質の合成を行うかまたは宿主株で天然に産生されるポリケチド抗 生物質の修飾を行うために有用である。

本発明で提供されるハイブリダイゼーションプローブに関しては、同定された特 異断片に加えて、ハイブリダイゼーションプローブとしてこの同定された特異Ｄ ＮＡ断片と機能的に等価な断片もまた本発明の一部であるとする。これには、実 質的にここで同定される断片の配列から成るハイブリダイゼーションプローブ、 およびその配列がここで同定される断片の配列に由来するハイブリダイゼーショ ンプローブが含まれる。

本発明はまた。第一のポリケチド抗生物質合成のための遺伝子群の構造を研究す る方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する： ａ）ポリケチド抗生物質を合成できる微生物に、未形質転換微生物にとって致死 的な抗生物質に対する耐性のような選択可能なマーカーを有し、付着部位を持た ないファージベクターを感染させる工程であって、該ファージベクターがその抗 生物質耐性遺伝子に隣接して挿入された形で第一のポリケチド抗生物質の生合成 に関係があると思われる遺伝子断片を有する工程； ｂ）このような形成された溶源菌を、致死抗生物質を含む培地で反復増殖させる ことにより選択する工程；およびＣ）選択された微生物を第一のポリケチド抗生 物質産生で選別する工程。

これに似た方法はすでにＣｈａｔｅｒおよびＢｒｕｔｏｎ　（Ｃｈａｔｅｒ、　 Ｋ。

Ｆ、　ａｎｄ　Ｂｒｕｔｏｎ、　Ｃ，Ｊ、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２６　： 　６７−７８）により記載されている。しかし７本研究方法で得た結果はＣｈａ 　ｔｅｒとＢｒｕｔｏｎが示した結果と意外にも驚くほど異なっている。

Ｃｈａ　ｔｅｒとＢｒｕｔｏｎにより示されるような予期した結果は、ファージ に挿入される遺伝子断片の位置に依存するものである。

断片が染色体の転写単位内にあれば、相同組み換えによりファージＤＮＡが染色 体ＤＮＡに組み込まれるような形質転換体において、転写の破壊が生じ、よ７っ て抗生物質の産生は観察されないであろうと予期された。反対に、断片が完全な 転写単位を含み、ただし他の転写単位の他の部分は含まないような場合は、転写 の破壊は考えられなかった。

上記研究方法を行うことにより、驚くべきことに、遺伝子断片が完全な転写単位 を含有するしないにかかわらず抗生物質の産生は停止される可能性があることが わかった。さらに。

ある場合では、抗生物質の産生が停止されるか否かは染色体ＤＮＡにおける挿入 ファージＤＮＡの方向性に依る。このことは。

ＣｈａｔｅｒとＢｒｕ　ｔｏｎが行った研究から予期されたことではない。

この予期に反した結果となって研究は、致死抗生物質を含む培地での増殖中、抗 生物質耐性遺伝子の下流のＤＮＡの欠失が生じることを示している。この欠失に より、ファージＤＮＡと挿入遺伝子断片の二重コピーばかりでなく、染色体ＤＮ Ａのいくつかもまた除去される。

遺伝子断片が抗生物質生合成遺伝子群の中心近くに位置する場合は、いずれの方 向の欠失でも抗生物質の合成が破壊されるようであり、従って大部分の形質転換 体で抗生物質の産生は観察されないであろう。遺伝子断片が断片群の外側に位置 する場合は、いずれの方向の欠失も抗生物質の産生に影響をおよぼすことはない ようである。

遺伝子断片が遺伝子群の末端近くに位置する場合は、ある１方向の欠失を有する 形質転換体は抗生物質の産生に影響しないようであり、これは欠失が遺伝子群の 外側で生じるからであろう。しかし、他方向の欠失を有する形質転換体では遺伝 子群内で生じる欠失により抗生物質の産生が破壊されるかもしれない。

従って、上記研究方法は、クローン化遺伝子断片が所望の遺伝子群内に実際に存 在するか否かを決定するために、また遺伝子群の範囲を限定するために使用する ことができる。

本発明はまたそのあらゆる観点において、当業者にとって以下のことを可能にす る：抗生物質の産生の改善をもたらすであろう、あらゆる特別なポリケチド抗生 物質の生合成の研究を行うこと；ある微生物の遺伝子の使用が他の微生物におけ るポリケチド抗生物質の生合成におよぼす効果を研究すること；あるいは異なる 微生物から単離した遺伝子または遺伝子の部分の組合せをある微生物に挿入する ことにより新規なポリケチド抗生物質を産生ずること。あるいはまた、新規なボ リケヂド抗生物質は、従来のＤＮＡ技術を用いて単離遺伝子に変異を生じること によりあるいは様々な遺伝子の部分を組み換えることにより、そして操作した遺 伝子を微生物に挿入して産生ずることができよう。

Ｅ−面９１浬ス裁馴− 第１図はポリケチド径路の概略図である。

第２図は４つの代表的なポリケチド抗生物質の構造式を示す。

第３図はプラスミドｐＩＪ２３０３．　ｐＩＪ２３０５およびｐｌＪ２３０８に 挿入されたストレプトミセス　アベルミチリス（ＳＬａｖｅｒｍｉｔｉｌｓ）Ｄ ＮＡ断片の制限酵素地図を示す。これら挿入物におけるあるアクチノホジン遺伝 子の位置もまた示す（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ　ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ、　１９８ ６）。

ストレプトミセス（鉦匹匹亜匹見）肚、　Ｂ４１−１４６の全染色体ＤＮＡのＰ ｓｔｌ消化物のプローブとしてｐＩＪ２３０５断片を用いたサザンハイブリダイ ゼーション実験の結果を示す。

第５図はベクターｐｌＪ６１０の制限地図を示す。

第６図は断片８ａ、　８ｂおよび１０の制限地図と相対的な配列を示す。断片１ ，２，３．４，５，６．７．１４および１６の位置も示す。

第７図はベクターｐｌＪ９２２にクローン８３挿入物を移す概要を示す。

第８図は断片８ａ、　６２および６４の制限地図と相対的な配列を示す。

第９図はファージベクターｐＰＯＤ９の制限地図を示す。

第１０図はストレプトミセス（鉦匹匹竺バ亜）　ｓｐ、　Ｂ４１−１４６染色体 へのｐＰＯＤｌｌの理論上の挿入を、実際の１挿入例の構造と比較して示す。

第１１図はストレプトミセス（銹ｍ■）　ｓｐ、　Ｂ４１−１４６染色体へのｐ ＰＯＤ１２の理論上の挿入を、実際の１挿入例の構造と比較して示す。

第１２図はストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　ｓｐ、　Ｂ４１− １４６染色体へのｐＰＯＤ１０７１の理論上の挿入を、実際の１挿入例の構造と 比較して示す。

第１３図はストレプトミセス（針匹匹聾践競）　ｓｐ、　Ｂ４１−１４６染色体 へのｐＰＯＤ１０７２の理論上の挿入を、実際の１挿入例の構造と比較して示す 。

主班■鎧且ｆ止匪 本発明は、構造的に類似している縮合酵素がポリケチド抗生物質の生合成の少な くとも初期段階に関わっているという仮定、および個々のポリケチド抗生物質の 生合成に必要ないくつかの遺伝子はそのポリケチド抗生物質を産生ずる微生物の ＤＮＡにおいて群を成しているという仮定に基づいている。

ポリケチド天然産物の群はそれらが−ｉｎ　ｖｉｖｏで合成される生合成径路に おける全体的な類似性により定義され、また類似の前駆体が基本的なポリケチド 鎖の合成に関わっているらしい。しかし、一般にポリケチド類間には、特に様々 なポリケチド抗生物質問には、かなり構造上の多様性がある。ポリケチド抗生物 質のこの構造上の多様性はその生合成径路における相違を反映している。安定化 したポリケチド核の主な構造上の変化は、基本的なポリケチド鎖のその後の酵素 的修飾によるばかりでなく、はとんどの場合また。基本的なポリケチド鎖の合成 に直接関係のある様々な酵素活性にもよって生じる。

どんなポリケチド抗生物質でもその生合成に関係のある酵素のどれかが他のポリ ケチド抗生物質の生合成に関わる酵素と機能的あるいは構造的に類似していると いうことは実証されていない。異なるポリケチド抗生物質の生合成に関連する酵 素のタンパク配列あるいは遺伝子コード配列に何らかの構造的類似性があること は、　ＴＩｉかにまだ示されていない。

さらに、他のポリケチド天然産物の生合成で働く縮合酵素や他の酵素がポリケチ ド抗生物質合成の酵素に機能的にも類似していることがわかっており、これは例 えば、脂肪酸の生合成の場合を含め多くのポリケチド類の生合成の初期段階が機 能的に従って可能性として構造的にも類似した酵素により行われるであろうこと を示唆している。

本研究の重要な観点は、あるポリケチド抗生物質の生合成に関係のある遺伝子（ または遺伝子の部分）をコードするＤＮＡ断片が第二のポリケチド抗生物質の生 合成に関係のある遺伝子（または遺伝子の部分）をコードするＤＮＡとハイブリ ダイズすることを実証することにある。ここでは、構造的に類似しておらず、ま たポリケチド抗生物質の２種の異なるファミリーの代表である２つのポリケチド について、このことを実証している。特に、アクチノルホジン生合成遺伝子を含 むＤＮＡ断片が抗線虫薬ポリケチド抗生物質であるミルベマイシンを産生ずるス トレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｎ　ｃｅｓ）株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ）　肚、　Ｂ４１−１４６のＤＮＡ断片に特異的にハイブリダ イズすることを実証する（第４図）。アクチノルホジン生合成遺伝子である遺伝 子■および遺伝子■と、ミルベマイシンの生合成に関係のある遺伝子を含むこと がわかっているストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　■、　Ｂ４１ −１４６のＤＮＡ断片とのＤＮＡハイブリダイゼーションを示す。

上述の理由により、あるポリケチド抗生物質の生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を 、それと構造的に関連のないポリケチド抗生物質の生合成遺伝子を含むプローブ とのハイブリダイゼーションにより同定できるという事実は驚くべきことであり しかも予期されないことである。ハイブリダイズする配列は同定されないであろ う、あるいはより可能性があることとして、そのように同定されるハイブリダイ ズする配列があったとしてもそれは所望のポリケチド抗生物質の生合成に特異的 に関連しないであろうと予期されたであろう。

アクチノルホジン遺伝子Ｉおよび遺伝子■はアクチノルホジンの生合成径路の最 も初期の段階でブロックされることがわかっている（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａおよ びＨｏｐｗｏｏｄ、　１９８６）　、これらの遺伝子はアクチノルホジンポリケ チドシンターゼに関連し類似性から、ａｃｔ遺伝子Ｉとハイブリダイズする特別 なストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　丘、　Ｂ４１−１４６　Ｄ ＮＡをミルベマイシン遺伝子Ｉと称し、またａｃｔ遺伝子■とハイブリダイズす るものをミルベマイシン遺伝子■と呼ぶ。またこれらアクチノルホジン遺伝子と の類似性から、ミルベマイシン遺伝子Ｉおよびミルベマイシン遺伝子■はミルベ マイシンの生合成の初期段階に関連し、おそらくミルベマイシンポリケチドシン ターゼに関連すると考えられる。

アクチノルホジン遺伝子は実際に、ストレプトミセス（鉦匹旦虹−匹旦の−ｕ、 Ｂ４１−１４６クローン化ＤＮＡのライブラリーのハイブリダイゼーションスク リーンにおいてプローブとして用いた。ａｃｔ遺伝遺伝子リプローブいたハイブ リダイゼーションスクリーンによりいくつかのＤＮＡ断片（断片８ａ、　８ｂお よび１０゜第６図）が単離された。制限酵素地図作成により、これらＢ４１−１ ４６　ＤＮＡ断片は互いに重なり合っており、約４８ｋｂの長い連続領域にわた っていることが示された。この領域内でのａｃｔ遺伝子■プローブハイブリダイ ゼーションは、断片４の番号を付けた１、６ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片に局在し た。ａｃｔ遺伝遺伝子リプローブた断片１，２および３にもハイブリダイズし、 これら断片はいずれも断片４の配列を含んでいる。同様の技法により＋　ａｃｔ 遺伝子■プローブハイブリダイゼーションはクローン化Ｂ４１−１４６　ＤＮＡ 内において断片８ａ、　８ｂ、５．　６および７に局在した。断片１０はａｃｔ 遺伝遺伝子列配列イブリダイズしなかった。両方のａｃｔプローブにハイブリダ イズする領域は断片８ａ上に含まれている。

表１は相補性実験の結果を示しており、ここではａｃｔ遺伝子■とａｃｔ遺伝子 ■の配列にハイブリダイズした配列を含むＢ４１−１４６断片が、ａｃｔ遺伝子 ■がブロックされたストレプトミセス　コエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ ｒ）変異体（ＴＭ０１）あるいはａｃｔ遺伝子■がブロックされたストレプトミ セス　コエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）変異体（ＴＭ０１）に導入さ れた。

表１かられかるように、　Ｂ４１−１４６断片は、ａｃｔ遺伝子Ｉとａｃｔ遺伝 子■の両方を機能的に相補するらしいＤＮＡ配列、およびアクチノルホジン遺伝 子プローブとのハイブリダイゼーションを示すそれら領域に対応する相補配列を 含む。しかし、　ＴＫ１７変異体の表現型は漏出型であることから２表１の結果 の解釈は複雑である。

ハイブリダイゼーション実験で単離されたＢ４１−１４６断片の特徴付けの一部 として、単離ＤＮＡの副断片をストレプトミセス　リビダンス（３エ　１ｉｖｉ ｄａｎｓ）に導入した。このストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）種 はアクチノルホジン産生のための遺伝子を含むが２通常はこのポリヶチド抗生物 質を産生じない。ストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）　Ｄ ＮＡにおけるアクチノルホジン遺伝子の存在は、アクチノルホジンを産生ずる個 々のものの小さな（通常１％より少ない）ストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ）集団におけるその存在により確かめられている。これら個々 のものは天然の変異体であるらしい。

Ｂ４１−１４６断片７をいずれかの方向で挿入するか、あるいは断片１２をある 一方向で挿入した場合、全ての形質転換されたストレプトミセス　リビダンス（ ＳＬｌｉｖｉｄａｎｓ）はアクチノルホジンを産生ずることがわかった。従って 、　Ｂ４１−１４６　ＤＮＡ断片はポリケチド抗生物質アクチノルホジンの合成 を活性化する配列を含む。また断片７は、ストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓ 、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　ａｃｔ遺伝遺伝子子異を機能的に相補する配列すな わち遺伝子を含むことも実証された。ａｃｔ遺伝遺伝子子クチノルホジン生合成 の制御に関係があると考えられる。ａｃｔ遺伝遺伝子子能的に相補するＢ４１− １４６　ＤＮＡ配列はミルベマイシン遺伝子■と呼ばれ、これは類似性からミル ベマイシン生合成の制御に関係すると予期される。断片７はａｃｔ遺伝遺伝子列 配列ハイブリダイゼーションを示さず、よってアクチノルホジン制御遺伝子と構 造的に類似していない。

ａｃｔＩＩはまた形質転換されたストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉ ｄａｎｓ）においてアクチノルホジン産生を活性化する。Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ 　ａｎｄ　Ｂｅｐｐｕ　（１９８４）　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　４８　：２１３１−２１３３は、Ａ−因子の生合成を調節しまた赤色素、アク チノルホジンおよびプロジギオシンの産生を調節する制御遺伝子ａｆｓＢの単離 を報告している。現在のところ、　ａｆｓＢがａｃｔ遺伝遺伝子子いはミルベマ イシン遺伝子Ｈのいずれかを等価であるという示唆はない。

ストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）の多くの菌株はポリヶチド抗生 物質産生を含め二次的な代謝物産生のためのサイレント生合成遺伝子を含んでい るのが実情であろう。ミルベマイシン遺伝子■配列およびそれを含む断片は、ス トレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）のような菌株においてポ リケチド抗生物質生合成のこのようなサイレント遺伝子を活性化するのに有用で あり、また他のストレプトミセス（針■蛙と胆浅旦９一種にも広く適用できよう 。ミルベマイシン遺伝子■配列はまた　、天然に抗生物質を産生ずるストレプト ミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）株においてポリケチド抗生物質の産生レベ ルを上げるのにも有用であろう。

ミルベマイシン遺伝子■配列が断片８ａのはるが右側末端に存在することから、 ミルベマイシンの生合成に関連する他の遺伝子はＢ４１−１４６染色体において 断片８ａにわたる領域の右側に隣接する領域に見い出され得るであろうと示唆さ れる。この隣接染色体ＤＮＡを単離しクローニングするために、　８ａのはるか 右末゛端にある副断片（断片１４）を８４１−１４６　ＤＮＡの第二のクローン ライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いるために選択 した。このハイブリダイゼーションスクリーンで、断片８ａの末端から右側方向 に伸びる単離物を含む２つのクローンを選択した。これら断片を６２および６４ と呼び、第８図に断片８ａおよび１０と比較して示す。同様の技法を用いて所望 断片から左側方向に伸びるＤＮＡ配列を単離することができる。このような技法 の適用は染色体“ウオーキングと呼ばれている。

断片１０．８ｂ、　８ａ、　６２および６４は約６２ｋｂ長の染色体領域を限定 しこれに及んでいる。この領域はミルベマイシン産生のための完全な生合成遺伝 子群を含むと考えられる。混成断片である断片ＦＩＣは、適当な制限酵素切断、 連結、および従来のＤＮＡ華離法によるあらゆる中間ＤＮＡ断片および所望ＭＣ 断片の単離により構築できる。断片ＦＩＣはＤＮＡの６２ｋｂにわたる。しかし 。

完全な生合成遺伝子群がクローン化されている他のポリケチド抗生物質との類似 性から、ミルベマイシン遺伝子群はＤＮＡにおいて約３０から４０ｋｂの間の大 きさの範囲にあるにちがいない。従って断片ＭＣはミルベマイシン生合成遺伝子 群の他に生合成に関係のない他の遺伝子を含むようである。ミルベマイシン遺伝 子１．　ＩＩおよび■領域の地図上の位置によれば、ミルベマイシン産生に必須 でないＤＮＡ領域は断片肛の左側末端にあるようである。ミルベマイシン生合成 に必須である領域の概略は、断片ＭＣの左端あるいは右端の配列を繰り返し除去 するとともに、得られたより短いＤＮＡ断片が天然でミルベマイシンを産生じな い細菌宿主（例えば、ストレプトミセスリビダンス（Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ）　 ）においてミルベマイシンを直接合成できるかどうかを中間検定することにより 、描くことができる。断片ＭＣ，およびこれに由来しミルベマイシン産生のため の完全な生合成遺伝子群を含むという点で断片ＭＣと機能上実質的に等価である 断片は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）のミルベマイシン非産 生株においてミルベマイシンを産生ずるためのここで述べる方法において有用で ある。

すでにＣｈａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂｕｒｔｏｎ、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２６ 　：　６７−７８により記述されている挿入不活化技術を用いて、ミルベマイシ ン生合成遺伝子群をさらに特徴付けることを試みた。しかしこの実験の結果は、 予期に反し、　ＣｈａｔｅｒとＢｕｒｔｏｎが述べているものと異なっていた。

末法では、クローン化ＤＮＡ断片と付着部位が欠失してしまっている不完全な０ Ｃ３１ベクターに挿入している。惑染株の染色体のファージ挿入は、挿入される クローン化ＤＮＡにより仲介される相同性組み換えを通して起こる。組み換えは クローン化ＤＮＡにハイブリダイズする染色体配列で生じる。理論的には、クロ ーン化ＤＮＡが転写単位の内部にある（すなわち、転写単位の５゛末端の配列も ３′末端の配列も含まない）場合に、ファージ挿入により遺伝子発現の破壊が生 じるだけである。しかし、ここで述べるＤＮＡ断片と菌株を用いることにより、 ファージ挿入はほとんどの場合遺伝子発現の破壊を誘導することがわかった。こ のことは、完全な転写単位を含むと考えられる。例えば、断片４のようなりロー ン化ＤＮＡ断片でも観察された。この技術はファージＤＮＡと染色体ＤＮＡの両 方の欠失を導くことがわかった。従って。

この技術はミルベマイシン非産生変異体を作る方法であることが判明した。これ ら実験の結果は、これと一致して、断片ＭＣのクローン化Ｂ４１−１４６　ＤＮ Ａはミルベマイシン産生に関連する遺伝子を含むという他の実証をも提供した。

というのは。

この領域における染色体ＤＮＡの欠失により非産生変異体が生じたからである。

ここでミルベマイシン生合成遺伝子群の単離に適用される技術は、ポリケチド抗 生物質生合成遺伝子群の単離用の一般法を限定するものである。末法はポリケチ ド抗生物質生合成遺伝子の単離用に上述した方法の延長であり、他のポリケチド 抗生物質の生合成に関係のある遺伝子または遺伝子の一部を含むプローブとハイ ブリダイズするクローンを最初に選択した後、試験工程と再選別工程とを繰り返 し行い、これにより最初選択したＤＮＡ断片に隣接する染色体配列をクローン化 することを包含する。試験と再選別の工程は完全な生合成遺伝子群がクローン化 されるまで続ける。このクローン化は。

クローン化ＤＮＡｇｉ域が挿入されている天然で非産生性のストレフトミセス（ Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）株においてポリケチド抗生物質の産生を検出するこ とにより確かめられる。適当な対照を用いて、導入されたクローン化ＤＮＡがポ リケチド抗生物質の合成を導くことを確かめるのが望ましいであろう。

ポリケチド抗生物質生合成群が一端単離されれば、これを天然で抗生物質を産生 じない適当な菌株においてその抗生物質を産生ずるために用いることができる。

異種の宿主で抗生物質を産生ずるのが望ましいであろう。何故なら、その選ばれ た宿主は抗生物質の産生に対して２例えば、より速いまたは効率良い増殖、ある いは増殖培地からの抗生物質産物の単離の容易性といった。何らかの利点をもた らすからである。

ミルベマイシン遺伝子Ｉおよびミルベマイシン遺伝子■を含むＢ４１−１４６　 ＤＮＡの断片、特に断片４および５は、ａｃｔ遺伝子Ｉおよびａｃｔ遺伝子■の プローブと同様に、様々なポリケチド抗生物質の生合成遺伝子の単離におけるハ イブリダイゼーションプローブとして有用であると期待される。これら断片およ び遺伝子■や遺伝子■の配列近くに存在する他のＢ４１−１４６　ＤＮＡ断片も ２例えば、アベルメクチンのような、ミルベマイシンと構造的に類似したポリケ チド抗生物質の生合成遺伝子の単離において特に有用であることが期待される。

最近、ａｃｔ遺伝子■およびａｃｔ遺伝子■の配列が、ポリヶチド抗生物質を産 生ずる多くのストレプトミセス（鉦匹■叩云■）株に由来するＤＮＡに特異的に ハイブリダイゼーションすることが報告された（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ　ｅｔ　 ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ＋　１９８６年１１月提出）。ここでのストレプトミセス （Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）株としては、アントラサイクリン類（タートアセ ノマイシンおよびアドリアマイシン）、マクロリド類（スピラマイシン、クイロ ジン、ピクロマイシンおよびオレアンドマイシン）、ポリエーテル類（ノナクチ ン、サリノマイシン、ラサロシドおよびモネンシン）、および他のイソクロマネ キノン抗生物質を産生ずる菌株が含まれる。この報告はさらに、ａｃｔ遺伝子Ｉ 。

ａｃｔ遺伝子ｍ、　ｍ１ｌｂ遺伝子Ｉおよびｍ１ｌｂ遺伝子■のプローブは様々 なポリケチド抗生物質の生合成遺伝子の単離にとって−ｉ的に有用であろうとい う主張を支持している。

ここで述べるハイブリダイゼーション法は様々なポリヶチド抗生物質の生合成遺 伝子の単離に適用できる。本発明方法により、当業者は、変異体の調製、相離性 および遺伝子地図作成に関する従来の長く単調な工程を行う必要なく、ポリヶチ ド抗生物質生合成用の遺伝子を同定し単離することができる。また末法は、変異 体の調製が特にやっかいな場合に１例えば、非産生性変異体の選別法がより簡単 なプレート検定ではなくむしろ化学的分析を含むような場合に適用できる。さら に、このような方法は、抗生物質生合成に関連する耐性遺伝子が存在しない場合 に２例えば抗生物質（ミルベマイシンおよびアベルメクチン）が最近に・対し毒 性でない場合に適用できる。

本発明方法には組み換えＤＮＡ技術の使用が含まれるが、これはそれ自体既知で あり、従って本発明の要素とはならない。

例えば、クローンライブラリーの調製やハイブリダイゼーション選別の技術は当 業者には既知である。従って、当業者は当分野の技術と知識だけで本発明方法を 実施できるであろう。

当分野の多くの標準技法は以下に記載されている：　Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａ ｌ、　（１９８２）　？Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　；　Ｗｕ　（ｅｄ、）　（１９７９）Ｍｅｔ ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８　：　Ｗｕ　ｅｔ　旦、　（ｅｄｓ、）　（１９８ ３）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１００　ａｎｄ　１０１　；　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ　（ ｅｄｓ、）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６５　；　Ｍｉｌｌｅｒ　（ｅｄ、）　（１９７２）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ 　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ ＮｅｗＹｏｒｋ　；　Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ　（１９８１）　」Ｙ 匡り山狙ｏｆ　ＧｅｎｅＭａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｌｅｙ　：５ｃｈｌｅｉｆ　 ａｎｄ　Ｗｅｎｓｉｎｋ　（１９８２）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ彰旦堕」−；　Ｇｌｏｖｅｒ　（ｅｄ、）　（１９ ８５）　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、Ｉ　ａｎｄＩＩ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ、０ｘｆｏｒｄ、Ｕ、に、；　Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　（ｅｄ ｓ、）（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、 ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

Ｕ、Ｋ。

（以下余白） 実施例１：アクチノルホジン　入　゛　云　のプローブを　いＭａｌｐａｒ、ｔ ｉｄａ　ａｎｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　：　 ４６２−４６４は。

ポリケチド抗生物質アクチノルホジンの生合成に関連する遺伝子を含む約３３ｋ ｂ長のストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　ＤＮＡ断片を含有する組み換えプラスミドｐＩＪ２３ ０３を報告している。ｐＩＪ２３０３の挿入物の制限酵素地図を第３図に示す。

この図にはまた。　ＤＮＡ挿入物中の番号付けされたアクチノルホジン遺伝子の 位置も含まれる（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ　ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ　（１９８６） 　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０５　：　６６−７３　）　−ｐＩＪ ２３０３挿入物の副断片を含む２つのプラスミド（ｐＩＪ２３０５およびｐｌＪ ２３０８と命名）はそれぞれｐｌＪ２３０３の」紅■および」旦Ｉ分解物から得 た。第３図はまた。　ｐｌＪ２３０５挿入物およびｐｌＪ２３０Ｂ挿入物の制限 地図、およびこれら挿入物内のアクチノルホジン遺伝子の物理的位置を供する。

ブトミセス　パイグロスコピカス変種オーレオラクリモサス（Ｓ、ｈ　ｒｏｓｃ ｏ　１ｃｕｓ　５ｕｌｓｐ、　ａｕｒｅｏｌａｃｒｉｍｏｓｕｓ　）由来のＤＮ Ａの」叩Ｉ分解物を、ｐＩＪ２３０５の放射能標識化挿入物を用いたサザンハイ プリダイゼーション技法によりプロービングした。

ルホジン生合成用の遺伝子を含む。ストレプトミセス　パイグロスコピカス変種 オーレオラクリモサス（多ユ　加１皿μｆｉｓｕｌｓｐ、　ａｕｒｅｏｌａｃｒ ｉｍｏｓｕｓ）は一般にはストレプトミセス（影工す遵ヒ鮮印ｕ並、　Ｂ４１− １４６　（ＮＲＲＬ　Ｎｏ、５７３９として入手可能）として知られているが、 ポリケチド抗生物質ミルベマイシン（構造は第■図参照）を産生ずる。サザンハ イプリダイゼーションは標準的技法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　；　Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　（ ｅｄｓ）（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ ｎ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ）により行った。より特別には、６ｘＳ ＳＣ（食塩−クエン酸ナトリウム、ここでｌＸ５ＳＣとは０．１５Ｍ　ＮａＣ１ ，０，１５Ｍクエン酸三ナトリウム、　ｐＨ７，０）　１５０％ｖ／ｖホルムア ミド：０．１％ｔｓｔ／ｖＳＯ５（ドデシル硫酸ナトリウム）および５０μｇ／ ｄサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、フィルターを３７℃にて２時間プレハイブリ ダイズさせた。ハイブリダイゼーションは同じ溶液を用いて３７℃にて一晩行っ た。フィルターを２回洗った。最初は６×５ＳＣ１５０％ｖ／ｖホルムアミド１ ０．１％ｗｔ／ｖ　ＳＤＳ溶液で３７℃にて１時間、続いて６ＸＳＳＣで３７℃ にて４０分間、２回目の洗浄を行った。

サザ゛ンハイブリダイゼーションの結果を第４図に示す。ｐＩＪ２３０５挿入物 のプローブは予期した通りに、ストレプトミセスコエリカラ−（Ｓ、ｃｏｅｌｉ ｃｏｌｏｒ）　ＤＮＡの９．１．　３．４．　２．９゜２．３および１．６ｋｂ の」１０断片とハイブリダイズした。同様のハイブリダイゼーションパターンが ストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）　ＤＮＡ断片で観察さ れた。ｐＩＪ２３０５のアクチノルホジン遺伝子プローブ挿入物はまたストレプ トミセス（旦朋旦笠践並）肚、　Ｂ４１−１４６　ＤＮＡの約８．７および４ｋ ｂのサイズを有するいくつかの断片とハイブリダイズした。

ストレプトミセス（鉦皿旦憇圧亜）肚、　Ｂ４１−１４６　ＤＮＡ断片とハイブ リダイズした挿入物ｐｌＪ２３０５の領域を同定するために、ｐｌＪ２３０５挿 入物のＢａｍ）Ｉ　１断片をサブクローン化し、標識化して、ストレプトミセス （Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　ｓ２．　Ｂ４１−１４６ＤＮＡ分解物を用いた ハイブリダイゼーション実験でのプローブとして用いた。これらザザンハイブリ ダイゼーションでは。

プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの工程は上記のように行 った。しかし、フィルターは、６ＸＳＳＣ１５０％ｖ／ｖホルムアミド１０．１ ％−ｔ／ｖ　ＳＤＳで３７℃にて１時間洗い２次いで’ｌ　ｘＳＳＣ１５０％Ｖ ノνホルム７ミドで３７℃にて１時間の洗浄を２回続けて行った。これらハイブ リダイゼーション実験により、アクチノルホジン遺伝子■に対する完全な転写単 位を含むｐｌＪ２３０５挿入物の１．Ｉ　ＢａｍＨＩ断片（第３図）はストレプ トミセス（針皿■印り匹）　丘、　Ｂ４１−１４６　ＤＮＡの約８．０ｋｂ断片 に特異的にハイブリダイズすることが、決定的に示された。

遺伝子Ｉに特異的な第二のアクチノルホジン遺伝子プローブは、ｐＩＪ２３０８ 挿入物をＢａｍＨＩで分解し、アクチノルホジン遺伝子Ｉを含む２．２ｋｂ断片 を単離することにより調製した。

実施例２：アクチノルホジン゛　旧ソ゛ローブによるストレプトミセス（Ｓｔｒ ｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　ｓ　、　Ｂ４１−１４６クローンーイブー１−のハイブ リ　゛イゼーション゛　■ストレプトミセス（ｓＤ狙鮪ジ＋ｃｅｓ）　肚、　Ｂ ４１−１４６　ＤＮＡのコスミンドライブラリーは、５ａｕ３ａ分解により２０ 〜３０ｋｂ断片を得ることにより調製した。断片をシャトルコスミソドｐｌＪ６ １０のＩｎ部位へ、エセリシア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） でのｉｎ　ｖｉｔｒｏパフケージング技術を用いてクローン化した。

シャトルコスミソドｐｌＪ６１０はＴｏｂｉａｓ　Ｋｉｅｓｅｒ、　Ｊｏｈｎ　 Ｉｎｎｅｓ　Ｉｎ−５ｔｉｔｕｔｅから入手できる。ベクターｐＩＪ６１０の制 限地図を第５図に示す。挿入物に対する選択は、フォスファターゼ処理したベク ターに関するｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングのサイズ制約に基づいて行う。

この様にして調製したコスミソドライブラリーを、アクチノルホジン遺伝子■（ 上記参照）を含む１．１ｋｂ　Ｂａｍ）ｌ　Ｉ断片とのハイブリダイゼーション により選別した。従来の技法を使用した。特に、６　ｘｓＳＣ１５０％シ／Ｖホ ルムアミド１０．１％５ＤＳ１５０μｇ／−サケ精子ＤＮＡの溶液を用いて、フ ィルターを３７℃にて２．５時間プレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー ションは同じ溶液を用いて３７℃にて一晩行った。６×５ＳＣ１５０％Ｖ／Ｖホ ルムアミドを用いてフィルターを３７°Ｃにて７０分間洗浄した。選別した１０ ００個のクローンのうち３個がアクチノルホジン遺伝子■のプローブにハイブリ ダイズすることがわかった。これらクローンを８ａ、　８ｂおよび１ｏと名付け た。

これらクローンに含まれるストレプトミセス（釘μｍゆシ工竪）且、　Ｂ４１− １４６のＤＮＡ断片も８ａ、　８ｂおよび１０とした。これら断片の制限地図を 第６図に示す。断片８ａ、　８ｂおよび１０の大体のサイズはそれぞれ、　３２ ｋｂ、　２９ｋｂおよび２９ｋｂである。従来の制限酵素分析により、これら断 片は互いに重なり合っており。

しかも約４８ｋｂのストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　！’、Ｂ ４１−１４６　ＤＮＡの隣接領域にわたっていることが示された。

制限側断片８ａ、　８ｂおよび１０を、１．１　Ｂａｍ）Ｉ　Ｉアクチノルホジ ン遺伝子■特異プローブとのハイブリダイゼーションで選別した。実施例１と同 様にサザンフィルターを２時間プレハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼ ーションをまた実施例１と同様にして一晩行った。フィルターを３７℃にて２回 洗った。最初の洗浄は６　Ｘ５ＳＣ１５０％ｖ／ｖホルムアミドを用いて１時間 行い、２回目の洗浄は２ｘＳＳＣ１５０％ｖ／ｖホルムアミドを用いて１時間行 った。以下の断片が遺伝子■特異プローブにハイブリダイズすることがわかった ：８ａおよび８ｂ両方の８ｋｂＰｓｔｌ副断片（断片刷新命名）で。

この約４ｋｂはまた１０にも存在する；８ａおよび８ｂの１３　ｋ　ｂ」■ＩＩ 副断片（断片２と命名）；１０の７ｋｂＢ■■副断片（断刷新と命名）；および ８ａおよび８ｂの１．６ｋｂ　ＢａｍＨ１刷新片（断片４と命名）で。

この約１ｋｂはまた１０にも存在する。断片１−４の位置は第６図に示されてい る。

断片８ａ、　８ｂおよび１０．そしてその制限側断片をまた。２．２ｋｂ　Ｂａ ｍＨＩアクチノルホジン遺伝子Ｉ特異プローブ（上記参照）とのハイブリダイゼ ーションで分析した。ここでもまた従来のサザンハイプリダイゼーション技法を 用いた。特に。

上述の様にして、フィルターを２時間プレハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼ ーションを３７℃にて一晩行った。フィルターを３７℃にて３回洗った。１回目 は５　Ｘ５ＳＣ１５０％ｖ／ｖホルムアミドで１時間、２回目は２　Ｘ５ＳＣ１ ５０％ｖ／ｖホルムアミドで９０分、３回目はＩ　Ｘ５ＳＣ１５０％Ｖ／νホル ムアミドで９０分行った。遺伝子■特異プローブは８ａと８ｂの両断片にハイブ リダイズするが断片１０にはハイブリダイズしないことがわかった。８ａと８ｂ の断片においては、プローブは４．２ｋｂのＢａｍＨＩ刷新片（断片５と命名） 　、４．２　Ｐｓｔｌ副断片（断片６と命名）。

および１０　ｋ　ｂｌ　ｎ刷新片（断片７と命名）（第６図参照）とハイブリダ イズすることがわかった。

第６図から、断片８ａは両方のアクチノルホジン遺伝子特異プローブにハイブリ ダイズする配列を含むことがわかる。

クローン８ａのほぼ完全な挿入物を、第７図に示すように。

プラスミドｐＩＪ９２２へ両方の方向性で、　２７ｋｂのＢｇｌ　Ｉ［断片（断 片１２）としてサブクローン化した。プラスミドｐＩＪ９２２　（Ｌｙｄｉａｔ ｅ旦旦、　（１９８５）　Ｇｅｎｅ　３５　：　２２３−２３５）は、巨大挿入 物を保持し得る低コピー数のストレプトミセス（ｓμ狙ゎジ＋ｃｅｓ）　ベクタ ーである。クローン８ａをストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）に直 接挿入する際の挿入配列の欠失を避けるためには、クローンバンクの調製で用い るシャトルコスミフドよりむしろこのベクターが選ばれた。

断片８ａをｌＩ［で分解し、そしてアクチノルホジン遺伝子■にハイブリダイズ する配列を含む１３ｋｂ」旺ＩＩ副断片およびアクチノルホジン遺伝子ｌにハイ ブリダイズする配列を含む１０ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ副断片を単離した。これら副 断片は第７図に示すように、それぞれ断片２および断片７と名付けた。８ｏ断片 のＢａｍＨＩ分解により、遺伝子■にハイブリダイズする配列を含む１．６ｋｂ のＢａｍＨＩ副断片が単離され、この副断片を断片４と名付けた（第７図）。断 片２，７および４を、別の低コピー数のストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　 ｃｅｓ）ベクターであるベクターｐｌＪ９４３　（Ｄａｖｉｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ 、　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅより入手可能）へクローン化し た。ｐＩＪ９４３のＩＩＩクローニング部位へのＤＮＡ断片の挿入により、宿主 細菌によるメラニン産生が欠失し、これは挿入に対する便利な選別となる。

アクチノルホジン遺伝子Ｉ　（ＴＭ１８）または遺伝子１　（ＴＭ０１）がブロ ックされたストレプトミセス　コエリカラ−（Ｓ、ｃｏｅｌｉ−ｃｏｌｏｒ）の ２つの変異株をＤａｖｉｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ、　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅから得た。これら変異株のそれぞれを、断片１２　（２７ｋｂ）を 含むｐＩＪ９２２あるいは断片２．断片７または断片４を含むｐＩＪ９４３で形 質転換した。形質転換を含むストレプトミセス（針匹匹虹肛並ｕの全操作は実質 的にはＨｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８５）　ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉ 　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ 　Ｍａｎｕａｌ、ＴｈｅＪｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の ようにして行った。これら相補性実験の結果を表１に示す。アクチノルホジン遺 伝子■にハイブリダイズする配列を含むこれら断片はストレプトミセス　コエリ カラ−（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のＴＫ１８遺伝子遺伝子株変異補すること がわかった。遺伝子■にハイブリダイズする配列を含まない断片１０は遺伝子■ 変異株を相補しなかった。

同様に、遺伝子■プローブにハイブリダイズする配列を含まない断片７は遺伝子 ■変異株を相補しなかった。遺伝子■プローブにハイブリダイズする配列を含む 断片１０はＴＫ１７遺伝子遺伝子株変異補しているようである。しかし、ストレ プトミセス　コエリカラ−（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　ＴＫ１７遺伝子変異 株は“漏出性（Ｌｅａｋｙ）”の表現型を示すことがわかっているので。

表１の結果の解釈は複雑である。アクチノルホジン産生はＭａｌｐａｒｔｉｄａ とＨｏｐｔｙｏｏｄ、　１９８４およびＴｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２８６　：　５２５−５２７に記載の方法を用いて検定 した。

ノルホジン産生の遺伝子を含むが１通常はこの抗生物質を産生しない。この種の 菌株であるストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、　Ｉｉ’ｖｉｄａｎｓ）　ＴＭ ０１　（Ｋｅｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、ユ８５　：　２２３−２２８）を、断片７がいずれかの方向性で挿 入されたｐＩＪ９４３および断片１２がいずれかの方向性で挿入されたｐｌＪ９ ２２により形質転換した。

断片７を含むｐｌＪ９４３で形質転換した全てのストレプトミセス　リビダンス （Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ）　ＴＭ０１は、予期に反してアクチノルホジンを産生 じた。形質転換体におけるこの抗生物質の産生は断片７の方向性に依存しないこ とがねがった。従って断片７は、ストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉ ｄａｎｓ）におけるアクチノルホジンのサイレント遺伝子の“スイッチ・オン” を行うＤＮＡＮ域を含む。この結果はまた。断片７がストレプトミセス（Ｓｔｒ ｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　並、　Ｂ４１−１４６におけるミルベマイシン産生の制 御に関わるＤＮＡ領域を含むことを強く示唆している。

また、ストレプトミセス　リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）への断片１２の 導入により、１つの方向性の場合のみであるが。

アクチノルホジン産生が行われることがわかった。

アクチノルホジン合成の推定上の制御遺伝子であるアクチノルホジン遺伝子Ｕ　 （Ｒｕｄｄ　ａｎｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ　（１９７９）　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１４　：　３５−４３およびＭａｌｐａｒｔｉｄａと Ｈｏｐｗｏｏｄ、　１９８６）に欠陥のあるストレプトミセス　コエリヵラ−（ Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）変異株を、断片７を含むｐＩＪ９４３で形質転換し た。得られたストレプトミセス　コエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃａｌｏｒ）形 質転換体はアクチノルホジンを合成し、これにより断片７中のミルベマイシン配 列はアクチノルホジン遺伝子■の代わりの働きもし得ることが示された。アクチ ノルホジン遺伝子と同様に。

断片７におけるミルベマイシン活性化遺伝子をミルベマイシン遺伝子■と呼ぶ。

断片４の配列がアクチノルホジン遺伝子■を機能的に相補したとしても、断片７ ．ミルベマイシン遺伝子■およびアクチノルホジン遺伝子■の配列間にはハイブ リダイゼーションが検出されなかったことに気付くと面白い。従って断片７中の 配列は遺伝子■中の配列と構造上類似していないことになる。

８ａのはるか右側末端の断片７　（第６図）はミルベマイシン産生に対する潜在 的な制御領域を含むらしいことから、ミルベマイシン遺伝子群は断片８ａの配列 の右側に伸びている可能性があった。ストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃ ｅｓ）　並、　Ｂ４１−１４６領域を断片８ａの右側へクローン化するために、 　８ａの１．９ｋｂ　ＢａｍＨ！副断片（断片１４．第６図）を、ストレプトミ セス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｎ　ｃｅｓ＞並、　Ｂ４１−１４６クローンライブラリー に対するハイブリダイゼーションプローブとして用いるために選んだ。Ｂ４１− １４６　ＤＮＡの５ａｕ３ａによる部分分解物に由来する２ｏ−３ｏｋｂ　ＤＮ Ａ断片をコスミフドベクターｐ１Ｍｓ６０２６に挿入して、第二のコスミッドラ イブラリ−を調製した。この第二のクローンライブラリーを。

Ｙ、　Ｎａｇａｍｉｎｅから得たベクターＰＧＢ２ヘクローン化した標識化断片 １４プローブとのハイブリダイゼーションで選別した。このベクターは、　ｐＩ Ｍｓ６０２６　（Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｇｅ ｎｅ３１　：１６５−１７１）を含むいくつかの通常使用されるＥ、ｃｏｌｉプ ラスミドに対し配列相同性を示さないことから、使用された。

この場合、サザンハイブリダイゼーションは５０℃にて、６×５ＳＣ１５０％ホ ルムアミド１０．１％５ＯＳ１５０μｇ／艷ニシン精子ＤＮＡで３時間プレハイ ブリダイゼーションを行い、そして同じ溶液で一部ハイブリダイゼーションを行 って、実施した。

１時間の洗浄を連続して４回行った。第１回目は５　Ｘ５ＳＣ１５０％ホルムア ミド、２回目は２　ｘＳＳＣ１５０％ホルムアミド。

３回目は１ｘＳＳＣ１５０％ホルムアミド、そして４回目は０．５ｘＳＳＣ１５ ０％ホルムアミドを用いて行った。

４個のクローン（選別した１０００個のうち）が断片１４のプローブとハイブリ ダイズすることがわかった。これら４個のクローンの制限酵素分析により、　ｐ ＰＯＤ１０６２とｐＰＯＤ１０６４の２個だけが８８の右側に配列を伸長させて いることが示された（第８図）。これらクローンの挿入物をそれぞれ断片６２お よび６４と名付け、これら断片の断片８ａに対する位置関係および相互の位置関 係を第８図に示す。

断片１０．８ｂ、　８ａ、　６２および６４は約６２ｋｂ長のストレプトミセス （針匹匹聾り並）肚、　Ｂ４１−１４６領域を限定する。このＩ）ＮＡ領領域ミ ルベマイシン産生の完全な遺伝子群を含むと考えられる。ミルベマイシン遺伝子 群の隣接ＤＮＡを含む混成断片ＭＣ（約６２ｋｂ）は、断片１０．８ｂ、　８ａ 、　６２および６４から出発して２中間断片の適切な制限酵素切断と連結の工程 により構築し。

従来のＤＮＡゲル分離技術により６２ｋｂ　ＭＣ断片を単離する。

災止田■：　２０−ンヒ　の−　によるストレプトミセス（Ｓμ狙功ジ没弘Ｌし Ｌ」ｌＬ月６Ｅ習と≦：３　イア　７　傷今底遺伝王■不遺止 クローン化領域（約６２ｋｂ）がミルベマイシン産生の遺伝子を含むという確証 を、相同組み換え実験において、ストレプ）ミー１＝ス（Ｓ＋工肚馳コニ卦）丘 、　Ｂ４１−１４６のミルベマイシン遺伝子をクローン化領域の断片を用いて挿 入的に不活化するこ７８が用いた技術に基づいている。基本的には、“ミルベマ イシン群”のクローン化領域の副断片を付着部位が欠失した欠陥性ファージベク ターへ挿入した。次に組み換えファージベクターを用いてミルベマイシンを産生 ずるストレプトミセス（鉦匹８匹荘並）且、８４１〜１４６を感染させた。染色 体へのファージ挿入は、挿入された副断片と８４１−１４６染色体との相同性を 介した相同組み換え現象により行った。転写単位内部の副断片のみが発現を破壊 し、その結果（ミルベマイシンを産生じない）変異株の表現型（Ｃｈａｒｔｅｒ とＢｕｒｔｏｎ、　１９８３）を示すであろうと予期される。得られた溶菌液を 培養し、そしてチオストレプトン含有培地で数回継代培養し、生存しているチオ ストレプトン耐性細菌をミルベマイシン産生について分析した。

使用したファージベクターはファージｐＰＯＤ９で、その制限地図を第９図に示 す。このベクターは、」旦１−Ｂａｍ）ＩＩ断片上の」肛（チオストレプトン耐 性）遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ旦、　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　２０　： 　５ｌ−６２）を、■Ｃ３１の誘導体である■Ｃ３１△讐１７のＸ９遺伝子中の Ｂａｍ）］　］部位へ挿入することによ部位に隣接した±（遺伝子を含む。

ミルベマイシン遺伝子■を含む断片４　（１，６ｋｂのＢａｍＨＩ断片）をｐＰ ＯＤ９へ両方向性でクローン化することにより、ファージｐＰＯＤ１０とｐＰＯ Ｄｌｌ　（第１Ｏ図）を得た。遺伝子Ｉに隣接する断片１６　（１，７ｋｂのＢ ａｍＨＩ断片）をクローン化して、ファージｐＰＯＤ１２　（第１１図）を得た 。また断片１４　（１，９ｋｂの」憇）ＩＩ断片）をｐ、ＰＯＤ９へ両方向性で クローン化して、ファージｐＰＯＤ１０７１とｐＰＯＤ１０７２　（第１２図お よび第１３図）を得た。これらのファージを用いて野生型のストレプトミセス（ Ｓｔｒｅ　ｔｏ　ｃｅｓ）ｙ、　Ｂ４１−１４６を感染させ、それぞれの場合に おいて２個々のチオストレプトン耐性溶菌液をミルベマイシン産生について分析 した。

予期に反して、完全なミルベマイシン遺伝子■転写単位を含むｐＰＯＤｌｏおよ びｐｐｏｏｔｔの感染により得られたいくつかの溶菌液は、もはやミルベマイシ ンを産生しないことがわかった。

個々の溶菌液について、ミルベマイシン産生の表現型をまず殺線虫性を検定する プレート上で試験した（下記参照）。表現型は培養ブロス抽出液をミルベマイシ ンについて分析することにより確認した（下記参照）。これらの予期に反した結 果を考慮して、ＤＮＡをいくつかの個々の溶菌液から調製し。

そしていくつかのプローブ゛を用いたサザンフ゛ロソテイニ／グにより調べで、 挿入されたＤＮＡの構造を決定した。溶菌液ｐＰＯＤ１１／６　ｃｐｐｏｐｘｉ の“挿入”により生じる）で例証されるように。

ファージからユ旺遺伝子が組み込まれていたにもかかわらず。

ミルベマイシン遺伝子群は、ファージＤＮＡの一部の欠失ばかりでなくミルベマ イシン遺伝子■の二重コピーの欠失およびミルベマイシン遺伝子Ｉ　％Ｑ域の配 列を含み組み換え部位の右側から離れた染色体ＤＮＡの欠失によっても、破壊さ れていたことがわかった。ｐＰＯＤ１１／６　（非産生性の溶菌液）で生じた欠 失を予想の挿入と比較して第１０図に示す。

同様に、　ｐＰＯＤ１２によるス）−Ｌ／ブトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏ　ｃｅｓ ）鼾２．８４１−１４６の感染によりミルベマイシン産生に欠陥のある溶菌液が 生じた。ここでもまた１選択した溶菌液のＤＮＡ分析でファージＤＮＡと染色体 ＤＮＡの欠失が観察された。例えば、第１１図はｐＰＯＤ１２／１３の欠失を予 想されるファージ挿入と比較したものである。

ストレプトミセス（勺エリ躬〃ｙ斗ｕ社）鮭、　Ｂ４１４４６をｐＰＯ［＋１０ ７１で感染させた場合、得られた溶菌液のわずか約１０％だけがミルベマイシン 産生に欠陥があった。しかし、　ｐＰＯＤ１０７２で感染させると、ミルベマイ シン産生が６８％失われた溶菌液の集団ができた。第１２図はｐＰＯＤ１０７１ の予想される挿入を溶菌液ｐＰＯＤ１０７１／４　（１５）の構造と比較したも のである。■３１配列の欠失だけを受けたこの溶菌液はミルベマイシン産生を維 持する。第１３図はｐＰＯＤ１０７２の予想される挿入をミルベマイシンを産生 しない溶菌液ｐＰＯＤ１０７２／２（１０）の構造と比較したものである。ここ でもまた、ファージＤＮＡと染色体ＤＮＡの欠失がこの溶菌液で観察された。

このように、ミルベマイシン遺伝子クローン由来の断片を含むファージＤＮＡに よる感染実験から、これら断片は確かにミルベマイシン産生に必須の遺伝子を含 むことが示された。

というのは、これら遺伝子の位置でのあるいはその近（での染色体領域の欠失に より、ミルベマイシン産生が失われるからである。

従って、ファージ感染技法を用いることにより、ミルベマイシン生合成群領域の 至る所にＤＮＡ欠失を生じさせて、様々なミルベマイシン非産生性変異株作るこ とができる。これらの変異株は、ミルベマイシン産生の遺伝学の研究をさらに進 め、またミルベマイシン群領域内の他の特異的なミルベマイシン遺伝子を述べる ために利用できる。

２１１例１−二ミルベマイシン産生の。

細菌によるミルベマイシン産生のプレート検定を、ミルベマイシンの殺線虫性の 活性に基づき開発した。ここではストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ ＞　並、　Ｂ４１−１４６によるミルベマイシン産生で例証する。

ストレプトミセス（旦匹旦竺匹弦）■、　Ｂ４１−１４６をＣ寒天培地（Ｇｏｅ ｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　ＥＰＤ　Ｐａｔｅｎｔ　０５８５ １Ｂ）に。

分離した単一コロニーの形成が可能となる濃度でまく。線虫（シノールハブディ ティス　エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉ　ｔｉｓ７）の浮遊液を、細菌の コロニーを含む試験プレートに添加する。プレートをます線虫の濃度および生存 性について調べ、また３〜１０時間後に殺線虫性について調べる。

Ｃ，劇！ＬμＬをＢｒｅｎｎｅｒ　（１９７４）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７７　： 　７１−９４に記載のように培養する。ＮＧ寒天にＥ、ｃｏ旦ウつシルａ　１　 ｅｘｏ　ｔｒｏｐｈＯＰ５Ｄをまいて、３７℃にて１８時間保保温箱菌のローン を作る。

１匹の雌雄動態の線虫（ρ−１町ｕＬ株Ｎ２）を細菌のローンに入れ、プレート を室温にて５日間保温する。保温後、プレートはＳエ　劇四巳邦−の密な集団を 含んでおり、これを次に蒸留水を用いて回収する。

ミルベマイシン産生はまた。　Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３ ）　Ｊ。

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　３６　：　５０２−５０８に記載のＨＰＬＣ法によっ ても検定した。２５０−パンフルフラスコに入れた種培地（５０ｄ）に試験しよ うとする菌株の胞子５０μｌを植菌した。培養液を２８℃にて１２日間、振盪さ せながら保温した（Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８３）。

保温後、全培養液をアセトンで抽出した。アセトン抽出液を１０倍に濃縮し、こ の濃縮抽出液の１００μβを分析用にＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムにかけた。使用 する肝ＬＣの条件はＴａｋｉｇｕｃｈｉ帖　リエ、、　１９８３に記載のもので ある。カラム流出液を２４０ｎｍでモニターした。

当業者には、ここで述べた発明および方法は、特別に記載したちの意外の変更や 手直しが可能であることが認められよう。本発明にはその意図や範囲内にある変 更や手直しが全て含まれることは理解すべきである。

（以下余白） よみ」ヨにフ’　）　５　ｆ　、入」」ユＢ４１−１４６断片＋＝相補性あり　 −一相補性なし く＋）＝可変相補性；　ＴＫ１７変異体は漏出型であるヨニヱ往ユｉ ヤ・リイ肴Ｙ伍多牙す“慣 Ｆｉｇｕｒｅ　１ １′フイ　目し氷ン゛７ Ｆｉｇｕｒｅ　２ 山（’２．）（３） ＶＦ’、ρ−エビ骨ぐイシ、４、＜−ｈ−＞今ンスマ多４−イＣＦｉｇｕｒｅ　 ９ 国際調査報告 ＋、ｎ晴ｎ−１１−＋ａ＊ｅａＣ−＋１＝−ｘ−、ＰＣＴ／ＵＳ　１１１６１０ ２７３ＢＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　°↓、！Ｅ　ＩＮＴＥＲン；Ａτｘｏｈ玖ＬＳ三Ａ スＣＨＰ、三ｐＱスτ　ＣＮ

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．第一のポリケチド抗生物質の生合成に関係のある遺伝子を単離する方法であ って，以下の工程：ａ．各クローンが該第一のポリケチド抗生物質を産生する微 生物由来のＤＮＡ断片を含むようなクローンライブラリーを調製すること； ｂ．該クローンライブラリーを，第二のポリケチド抗生物質の生合成に関係のあ る遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を有する核酸プローブ分子とのハイブリダ イゼーションで選別すること；および ｃ．該核酸プローブ分子とハイブリダイズするクローンを選択することにより， 該第一のポリケチド抗生物質の生合成に関係のある該遺伝子を含有するＤＮＡ断 片を含むクローンを単離すること， を包含する方法。
2. ２．前記微生物がストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌であ る請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記核酸プローブがアクチノルホジンの生合成に関係のある遺伝子の少なく とも一部の核酸配列を含有する請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．前記核酸プローブがアクチノルホジン遺伝子ＩＩＩの少なくとも一部の核酸 配列を含有する請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記核酸プローブがアクチノルホジン遺伝子Ｉの少なくとも一部の核酸配列 を含有する請求の範囲第３項に記載の方法。
6. ６．前記核酸プローブがミルベマイシンの生合成に関係のある遺伝子の少なくと も一部の核酸配列を含有する請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．前記核酸プローブがミルベマイシン遺伝子ＩＩＩの少なくとも一部の核酸配 列を含有する請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．前記核酸プローブがミルベマイシン遺伝子Ｉの少なくとも一部の核酸配列を 含有する請求の範囲第６項に記載の方法。
9. ９．天然で非産生性のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のある 菌株において第一のポリケチド抗生物質を産生する方法であって，以下の工程ａ およびｂを包含する方法：ａ．該第一のポリケチド抗生物質を産生するストレプ トミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のある菌株から，該第一のポリケチド 抗生物質の群を成している生合成遺伝子を含有するＤＮＡ断片を単離する工程で あって，以下の工程ｉ〜ｖｉｉを包含する工程： ｉ．各クローンが該第一のポリケチド抗生物質を産生する微生物由来のＤＮＡ断 片を含むようなクローンライブラリーを調製すること； ｉｉ．該クローンライブラリーを，第二のポリケチド抗生物質の生合成に関係の ある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を有する核酸プローブ分子とのハイブリ ダイゼーションで選別すること； ｉｉｉ．該核酸プローブ分子とハイブリダイズするクローンを選択することによ り，該第一のポリケチド抗生物質の生合成遺伝子群の少なくとも一部を有する第 一のＤＮＡ断片を含むクローンを単離すること； ｉｖ．該第一のポリケチド抗生物質の生合成遺伝子群の少なくとも一部を有する 該第一の選択されたＤＮＡ断片を，該非産生性のストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓ）株において該第一のポリケチド抗生物質を直接合成する能力に ついて試験すること； ｖ．該第一の選択されたＤＮＡ断片の右末端あるいは左末端の領域を有する核酸 プローブを用いて，該クローンライブラリーあるいは第二のクローンライブラリ ーを再選別すること；ｖｉ．該第一の選択されたＤＮＡ断片の右末端あるいは左 末端の領域とハイプリダイズするクローンを選択して，該第一の選択されたクロ ーンの右側あるいは左側の染色体ＤＮＡ配列を有する第二のＤＮＡ配列を含むク ローンを単離すること；ｖｉｉ．該第二の選択されたＤＮＡ断片およびそれに続 いて選択されるＤＮＡ断片を用いて該試験，再選別および選択の工程を繰り返し ，該試験工程で該非産生性のストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ） 株における該第一のポリケチド抗生物質の産生により確認されるような，該第一 のポリケチド抗生物質の群を成す生合成遺伝子を有する該ＤＮＡ断片が単離され るまで行うこと；および ｂ．該生合成遺伝子群を含む該クローン化断片を該非産生性のストレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株に導入して，該非産生性のストレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株において該ポリケチド抗生物質を産生する工程 。
10. １０．前記核酸プローブが前記第二のポリケチド抗生物質の生合成の初期段階に 関係のある遺伝子の少なくとも一部の核酸配列を含有する請求の範囲第９項に記 載の方法。
11. １１．前記核酸プローブがアクチノルホジンの生合成に関係のある遺伝子の少な くとも一部の核酸配列を含有する請求の範囲第９項に記載の方法。
12. １２．前記核酸プローブがアクチノルホジン遺伝子ＩＩＩの少なくとも一部の核 酸配列を含有する請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．前記核酸プローブがアクチノルホジン遺伝子Ｉの少なくとも一部の核酸配 列を含有する請求の範囲第１１項に記載の方法。
14. １４．前記核酸プローブがミルベマイシンの生合成に関係のある遺伝子の少なく とも一部の核酸配列を含有する請求の範囲第９項に記載の方法。
15. １５．前記核酸プローブがミルベマイシン遺伝子ＩＩＩの少なくとも一部の核酸 配列を含有する請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．前記核酸プローブがミルベマイシン遺伝子Ｉの少なくとも一部の核酸配列 を含有する請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. １７．前記天然で非生産性のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） のある菌株がストレプドミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉ ｄａｎｓ）の菌株，ストレプトミセスアンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ ｃｅｓ　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）の菌株，ストレプトミセスコエリカラー（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の菌株およびストレプトミセ スアベルミチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｓ）の菌株 から成る菌株群より選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。
18. １８．前記第一のポリケチド抗生物質がミルベマイシンである請求の範囲第９項 に記載の方法。
19. １９．前記天然で非産生性のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） のある菌株がストレプドミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉ ｄａｎｓ）である請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．前記第一のポリケチド抗生物質がアベルメクチンである請求の範囲第９項 に記載の方法。
21. ２１．前記天然で非産生性のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） のある菌株がストレプトミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉ ｄａｎｓ）である請求の範囲第２０項に記載の方法。
22. ２２．天然でミルベマイシン非生産性のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ）のある菌株においてミルベマイシンを産生する方法であって，該非産 生性の菌株にＤＮＡ断片ＭＣを含有するＤＮＡ断片を導入することを包含する方 法。
23. ２３．前記天然でミルベマイシン非産生性の菌株がストレプ　ドミセスリビダン ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）の株である請求の範囲第２ ２項に記載の方法。
24. ２４．ポリケチド抗生物質の産生に十分な生合成遺伝子を含みポリケチド抗生物 質生合成アクチベーター遺伝子を欠くようなストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ）のある菌株においてポリケチド抗生物質生合成遺伝子群の発現を 活性化する方法であって，該菌株にミルベマイシン遺伝子ＩＩを含有するＤＮＡ 断片を導入することを包含する方法。
25. ２５．前記菌株がストレプドミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉ ｖｉｄａｎｓ）の株である請求の範囲第２４項に記載の方法。
26. ２６．前記ポリケチド抗生物質がアクチノルホジンである請求の範囲第２５項に 記載の方法。
27. ２７．前記菌株がストレプトミセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ 　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の株であり，また前記ポリケチド抗生物質がアクチノ ルホジンである請求の範囲第２４項に記載の方法。
28. ２８．前記菌株がストレプトミセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅ ｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の株であり，また前記ポリケチド抗生物質がアベ ルメクチンである請求の範囲第２４項に記載の方法。
29. ２９．実質的にミルベマイシン生合成遺伝子群から成るＤＮＡ断片を含有するベ クター。
30. ３０．請求の範囲第２９項に記載のベクターを含む菌株。
31. ３１．前記ＤＮＡ断片が断片ＭＣである請求の範囲第３０項に記載のベクター。
32. ３２．請求の範囲第３１項に記載のベクターを含む菌株。
33. ３３．ミルベマイシン遺伝子Ｉ，ミルベマイシン遺伝子ＩＩおよびミルベマイシ ン遺伝子ＩＩＩから成る群より選択されるミルベマイシン遺伝子をコードするＤ ＮＡ配列から実質的に成るＤＮＡ分子を含有するベクター。
34. ３４．請求の範囲第３３項に記載のベクターを含む菌株。
35. ３５．前記ＤＮＡ分子が断片１，断片２．断片３，断片４，断片５，断片６，断 片７，断片８ａ，断片８ｂ．断片１０，断片１２，断片１４，断片１６，断片６ ２および断片６４から成るＤＮＡ断片の群より選択されるＤＮＡ断片である請求 の範囲第２９項に記載のベクター。
36. ３６．請求の範囲第３５項に記載のベクターを含む菌株。
37. ３７．実質的にミルベマイシン生合成遺伝子群から成るハイブリダイゼーシヨン プローブ分子。
38. ３８．断片ＭＣであるハイブリダイゼーシヨンプローブ分子。
39. ３９．ミルベマイシン遺伝子Ｉ，ミルベマイシン遺伝子ＩＩおよびミルベマイシ ン遺伝子ＩＩＩから成るミルベマイシン遺伝子の群より選択されるミルベマイシ ン遺伝子をコードするＤＮＡ配列から実質的に成るハイブリダイゼーシヨンプロ ーブ。
40. ４０．断片１，断片２，断片３．断片４，断片５，断片６，断片７，断片８ａ， 断片８ｂ，断片１０，断片１２，断片１４，断片１６，断片６２および断片６４ から成るＤＮＡ断片の群より選択されるＤＮＡ断片であるハイブリダイゼーシヨ ンプローブ。
41. ４１．配列が断片１，断片２，断片３，断片４，断片５，断片６，断片７，断片 ８ａ，断片８ｂ，断片１０，断片１２，断片１４，断片１６，断片６２および断 片６４から成る断片の群より選択される断片の配列に由来するハイブリダイゼー シヨンプローブ。
42. ４２．断片１，断片２，断片３，断片４．断片５，断片６．断片７，断片８ａ， 断片８ｂ，断片１０，断片１２，断片１４，断片１６，断片６２，断片６４およ び断片ＭＣから成るＤＮＡ断片の群より選択されるＤＮＡ断片。