PT929681E - Aglomerado de genes da biossíntese da rifamicina - Google Patents

Description

ΡΕ0929681 1 DESCRIÇÃO "AGLOMERADO DE GENES DA BIOSSÍNTESE DA RIFAMICINA"

As rifamicinas formam um grupo importante de antibióticos macrociclicos (Wehrli, Topics in Current Chemistry (1971), 72, 21-49). Eles consistem num cromóforo de naftoquinona que se estende por uma longa ponte alifática. As rifamicinas pertencem a uma classe de antibióticos de ansamicina que são produzidos por várias bactérias do solo Gram positivas do grupo dos actinomicetes e algumas plantas.

As ansamicinas são caracterizadas por um núcleo aromático plano que se estende por uma longa ponte alifática que une posições opostas do núcleo. Podem distinguir-se dois grupos diferentes de ansamicinas pela estrutura do núcleo aromático. Um grupo possui um cromóforo de naftoquinóide, sendo representantes tipicos a rifami-cina, estreptovaricina, tolipomicina e naftomicina. 0 segundo grupo, que possui um cromóforo benzoquinóide, é caracterizado por geldanamicina, maitansinas e ansamitocinas (Ghisalba árma., Biotechnology of Industrial Antibiotics Vandamme E.J. Ed., Decker Inc New York, (1984) 281-327). Em contraste com os antibióticos do tipo macrólido, as ansamicinas contêm no sistema de anel alifático não uma ligação lactona, mas uma ligação amida que forma a conexão ao cromóforo. 2 ΡΕ0929681 A descoberta das rifamicinas produzidas pelo microrganismo Streptomyces mediterranei (como o organismo foi denominado nessa altura, ver abaixo) foi descrita pela primeira vez em 1959 (Sensi árma., ármaco Ed. Sei. (1959) 14, 146-147) . A extraeção com acetato de etilo das culturas acidificadas de Streptomyces mediterranei resultou no isolamento de uma mistura de componentes antibioticamente activos, as rifamicinas A, B, C, D e E. A rifamicina B, o componente mais estável, foi separado dos outros componentes e isolado com base nas suas propriedades fortemente acidicas e facilidade de formação de um sal. A rifamicina B possui a estrutura da fórmula (1)

A rifamicina B é o principal componente da fermentação quando é adicionado barbiturato ao meio de fermentação e/ou são utilizados produtores melhorados mutantes de Streptomyces mediterranei. 3 ΡΕ0929681 A estirpe produtora de rifamicina foi originalmente classificada como Streptomyces mediterranei (Sensi et al., Farmaco Ed. Sei. (1959) 14, 146-147). A análise da parede celular de Streptomyces mediterranei por Thiemann et al. revelou, mais tarde, que esta estirpe possui uma parede celular tipica de Nocardia e a estirpe foi reclassifiçada como Nocardia mediterranei (Thieman et al. Arch. Microbiol. (1969), 67 147-151). A Nocardia mediterranei foi novamente reclassifiçada com base em critérios morfológicos e bioquimicos rigorosos mais recentes. Com base na composição exacta da parede celular. A ausência de ácido micólico e a insensibilidade a fagos de Nocardia e Rhodococcus, a estirpe foi atribuida ao novo género Amycolatopsis como Amycolatopsis mediterranei (Lechevalier et al., Int. J. Syst. Bacteriol. (1986), 36, 29). Lai et al. (Crit. Ver. Microbiol. (1995), 21, 19-30)9 reviram métodos para melhorar a produção de rifamicina por Amycolatopsis mediterranei.

As rifamicinas possuem uma actividade antibiótica forte contra bactérias Gram-positivas, tais como micobac-térias, neisserias e estafilococos. O efeito bactericida das rifamicinas deriva da inibição especifica da polimerase de RNA dependente de DNA bacteriana, que interrompe a biossintese do RNA (Wehrli e Staehelin, Bacteriol. Rev. (1971), 35, 290-309). A rifamicina derivada de rifamicina B semi-sintética (rifampicina) é largamente utilizada clini-camente como antibiótico contra o agente que provoca a tuberculose, Mycobacterium tuberculosis. 4 ΡΕ0929681

As ansamicinas naftoquinóides do grupo da estre-ptovaricina e tolipomicina apresenta, tal como a rifa-micina, um efeito antibacteriano através da inibição da polimerase de RNA bacteriana. Em contraste, a naftomicina possui um efeito antibacteriano sem inibir a polimerase de RNA bacteriana. As ansamicinas benzoquinóides não apresentam inibição da polimerase do RNA bacteriano e podem por isso possuir actividade antibacteriana relativamente fraca, ou nenhuma. Por outro lado, alguns representantes desta classe de substâncias possuem um efeito nas células de eucariotas. Assim, as propriedades antifúngicas, antiproto-zoários e antitumorais foram descritas para a geldanami-cina. Por outro lado, as propriedades antimitóticas (anti-tubilina), antileucemia e antitumoral são atribuídas às maitansinas. Algumas rifamicinas também apresentam actividade antitumoral e antiviral, mas apenas a concentrações elevadas. Este efeito biológico parece, assim, ser não específico.

Apesar da grande variedade estrutural das ansamicinas, a sua biossíntese parece ocorrer através de uma via metabólica que contém muitos elementos comuns (Ghisalba et al. Biotechnology of Industrial Antibiotics Vandamme E.J. Ed., Decker Inc. New York, (1984) 281-327). 0 núcleo aromático para todas as ansamicinas é provavelmente construído partindo de ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico. A partir desta molécula, que é presumivelmente activada como coenzima A, a ponte alifática inteira é sintetizada por uma 5 ΡΕ0929681 sintase de policétido multifuncional. 0 comprimento da ponte e o processamento dos grupos ceto, que são inicialmente formados pelos passos de condensação, são controlados pela sintase de policétido. Para construir a ponte alifática completa para rifamicinas, são necessários 10 passos de condensação, 2 com acetato e 8 com propionato como blocos de construção. A sequência destes passos de condensação individual é igualmente determinada pela sintase de policétido. Comparações e estudos estruturais com incorporação de acetato e propionato radioactivos demonstraram que a sequência de incorporação de acetato e de propionato para as várias ansamicinas ocorre de acordo com um esquema que parece ser idêntico, ou muito semelhante, nos primeiros passos de condensação. Assim, a partir de um esquema de síntese comum das sintases de policétido de ansamicina (o esquema de síntese de rifamicina), as sínteses das várias ansamicinas mais cedo ou mais tarde ramificam, de acordo com a sua diferença estrutural em relação à estrutura da rifamicina, nos ramos laterais da síntese (Ghisalba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics Vandamme E.J. Ed. Decker Inc. New Iork, (1984) 281-327)

Devido à grande variedade estrutural das rifamicinas e ao seu efeito biológico específico e interessante, existem um grande interesse no entendimento da base genética da sua síntese de modo a criar a possibilidade de o influenciar especificamente. Isto é particularmente desejável porque, como explicado acima, há muito em comum 6 ΡΕ0929681 entre a síntese de rifamicinas e a de outras ansamicinas. Esta semelhança na biossíntese, que provavelmente deriva de uma origem comum da sua via metabólica, em termos evolutivos, possui naturalmente uma base genética. A base genética da biossíntese dos metabolitos secundários existe essencialmente nos genes que codificam para as enzimas biossintéticas individuais. Os genes da síntese de metabolitos secundários de actinomicetes têm sido, até agora, encontrados como aglomerados de genes adjacentes em todos os sistemas investigados. 0 tamanho desses aglomerados de genes de antibióticos estende-se desde cerca de 10 quilobases (kb) até mais do que 100 kb. Os aglomerados contêm, frequentemente, genes de regulador específico e genes para resistência do organismo produtor aos seu próprio antibiótico (Chater, Ciba Found. Symp. (1992), 171, 144-162). A invenção aqui descrita teve agora sucesso através da identificação e clonagem de genes da biossíntese de rifamicina, criando a base genética para a síntese, através de métodos genéticos de análogos de rifamicina ou ansamicinas novas, que combinam elementos estruturais de rifamicina com outras ansamicinas. Isto também cria a base para preparar novas colecções de substâncias com base no aglomerado de genes da biossíntese de rifamicina através de biossíntese combinatória. identificar e

Foi possível, num primeiro passo 7 ΡΕ0929681 clonar um fragmento de DNA do genoma de Ά. mediterranei, que apresenta homologia com genes da sintase de policétidos conhecidos. Após a obtenção da informação de sequência deste fragmento de DNA, que confirmou uma sequência tipica para sintases de policétido foi possível o rastreio de uma biblioteca de cosmideos de A. mediterranei com sondas de DNA especificas derivadas deste fragmento num programa de rastreio para outros fragmentos de DNA que estão envolvidos no aglomerado de genes de rifamicina. Como um resultado, foi identificado e sujeito a determinação da sequência (SEQ ID NO 3) o aglomerado completo de genes da sintase de policétido de rifamicina. 0 aglomerado de genes compreende seis grelhas de leitura aberta, que são de aqui em diante referidas como ORF A, B, C, D, E e F e que codificam as proteínas e polipéptidos descritos em SEQ ID NOS 4 a 9. O aglomerado de genes isolado e caracterizado deste modo representa a base, por exemplo, para a opti-mização derivada da produção de rifamicina, ansamicina, ou seus análogos. Exemplos de técnicas e possíveis áreas de aplicação disponíveis nesta ligação são como se segue: • Sobrexpressão de genes individuais nas estirpes produtoras com vectores plasmídicos ou através da incorporação no cromossoma. • Estudo da expressão e regulação de transcrição do aglomerado de genes durante a fermentação com várias estirpes produtoras e sua optimização através de parâmetros fisiológicos e condições de fermentação apropriada. ΡΕ0929681 • Identificação de genes de regulação e dos sitios de ligação ao DNA das proteínas de regulação correspondentes no aglomerado de genes. Caracterização do efeito destes elementos de regulação na produção de rifamicinas ou ansamicinas; e influenciá-los para mutação especifica nestes genes ou nos sitios de ligação do DNA. • Duplicação do aglomerado completo de genes ou sua partes em estirpes produtoras.

Para além destas aplicações do aglomerado de genes para melhorar a produção por fermentação como acima descrito, pode ser igualmente empregue para a preparação biossintética de novos análogos de rifamicina ou novas ansamicinas ou compostos do tipo ansamicina, nos quais a ponte alifática é ligada a apenas uma extremidade do núcleo aromático. As seguintes possibilidades entram aqui em consideração, por exemplo: • Inactivação de passos individuais na biossintese, por exemplo por interrupção de genes. • Mutação de passos individuais na biossintese, por exemplo por substituição genética. • Utilização do aglomerado ou seus fragmentos como sonda de DNA, de modo a isolar outros microrganismos naturais, que produzem metabolitos semelhantes a rifamicina ou ansamicinas. 9 ΡΕ0929681 • Permuta de elementos individuais neste aglomerado de genes pelos de outros aglomerados de genes. • Utilização de sintases de policétidos para a construção de bibliotecas de vários análogos de rifamicina ou ansamicinas, gue são então testados em relação à sua actividade (Jackie & Khosla, Chemistry & Biology, (1995), 2, 355-362). • Construção de estirpes de actinomicetes mutados dos quais o aglomerado de genes da biossintese de rifamicina natural ou ansamicina no cromossoma foi parcialmente ou completamente removida e pode por isso ser utilizado para expressar aglomerados de genes geneticamente modificados. • Permuta de elementos individuais no aglomerado de genes.

Descrição detalhada da invenção A invenção refere-se a um fragmento de DNA do genoma de Amycilatopsis mediterranei, que compreende uma região de DNA que está envolvida directa, ou indirec-tamente, no aglomerado de genes responsáveis pela sintese de rifamicina; e as regiões de DNA adjacentes; e seus constituintes ou dominios funcionais.

Os fragmentos de DNA, de acordo com a invenção pode compreender, além disso, sequências reguladoras tais como sitios de ligação de promotores, repressor ou acti-vador, genes de repressor ou activador, terminadores; ou 10 ΡΕ0929681 genes estruturais. Igualmente, parte da invenção são quaisquer combinações destes fragmentos de DNA uns com os outros, ou com outros fragmentos de DNA, por exemplo combinações de sitios de ligação de promotores, repressor ou activador e/ou genes de repressor ou activador de um aglomerado de genes de ansamicina, em particular do aglomerado de genes de rifamicina, com genes estruturais estranhos, ou combinações de genes estruturais do aglomerado de genes de ansamicina, especialmente o aglomerado de genes de rifamicina, com promotores estranhos; e combinações de genes estruturais uns com os outros ou com fragmentos de genes, que codificam para domínios enzimaticamente activos e são de vários sistemas de biossíntese de ansamicina. Os genes estruturais estranhos e fragmentos de gene estranhos codificando para domínios enzimaticamente activos, codificam, por exemplo, proteínas envolvidas na biossíntese de outras ansamicinas.

Um fragmento de DNA preferido é um directamente ou indirectamente envolvido no aglomerado de genes responsável pela síntese de rifamicina. O aglomerado de genes da região de DNA acima descrito contém, por exemplo, os genes que codificam as enzimas individuais envolvidas na biossíntese de ansamicinas e, em particular, de rifamicina e os elementos reguladores que controlam a expressão dos genes de biossíntese. O tamanho desses aglomerados de genes de antibióticos estende-se desde cerca de 10 quilobases (kb) ΡΕ0929681 até mais de 100 kb. Os aglomerados de genes compreendem normalmente genes de regulação específicos e genes para resistência do organismo produtor para o seu próprio antibiótico. Exemplos do que se pretende designar por enzimas ou domínios enzimaticamente activos envolvidos nesta biossíntese são aqueles necessários para sintetizar, iniciando com ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico, as ansamici-nas tais como rifamicina, por exemplo sintases de policétido, aciltransferases, desidratases, cetorredutases, proteínas de veículo de acilo ou sintases de cetoacilo.

Assim, são particularmente preferidos a sequência completa do aglomerado de genes apresentado na SEQ ID NO 3, bem como fragmentos de DNA que compreendem porções de sequência que codificam para uma sintase de policétido, ou um seu domínio enzimaticamente activo. Exemplos desses fragmentos de DNA preferidos são, por exemplo, aqueles que codificam para uma ou mais das proteínas e polipéptidos apresentados nas SEQ ID NOS 4, 5, 6, 7, 8 e 9, ou seus derivados funcionais, também incluindo sequências parciais destes que compreendem, por exemplo, 15 ou mais nucleótidos consecutivos. Outras formas de realização preferidas referem-se a regiões de DNA do aglomerado de genes, de acordo com a invenção ou seus fragmentos, como aqueles presentes nos clones depositados pNE95, pRi44-2 e pNE112, ou seus derivados. Outros fragmentos de DNA preferidos são aqueles que compreendem porções de sequência que apresenta, homologias com as sequências compreendidas pelos clones pNE95, pRi44-2 e/ou pNE112 ou com SEQ ID ID NOS 1 e/ou 3, e 12 ΡΕ0929681 por isso podem ser utilizadas como sonda de hibridação com um banco de genes genómicos com um organismo que produz ansamicina, em particular que produzem rifamicina, para encontrar constituintes do aglomerado de genes correspondentes. 0 fragmento de DNA pode, para além disso, por exemplo, compreender exclusivamente DNA genómico. Um fragmento de DNA particularmente preferido é aquele que compreende a sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID NO 1 a 3, ou sua sequências parciais que, por uma questão de homologias, pode ser encarada como equivalente estrutural ou funcional para a referida sequência ou sequência parcial destas e que por isso são capazes de hibridar com esta sequência.

Os fragmentos de DNA de acordo com a invenção compreendem, por exemplo, porções de sequência que compreendem homologias com as enzimas, domínios de enzimas, ou fragmentos acima descritos. 0 termo homologias e equivalentes estruturais e/ou funcionais refere-se principalmente a sequências de DNA e de aminoácidos com poucas ou nenhumas diferenças entre as sequências relevantes. Estas diferenças podem possuir causas diversas. Assim, por exemplo isto pode requerer mutações ou diferenças específicas da estirpe, que ocorrem naturalmente, ou são induzidas artificialmente. Ou as diferenças observadas a partir da sequência inicial são derivadas de uma modificação alvo, que podem ser introduzidas, por exemplo, durante uma síntese química. ΡΕ0929681

As diferenças funcionais podem ser encaradas como mínimas se, por exemplo, a sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido, uma sequência de proteínas possui essencialmente as mesmas propriedades caracterís-ticas que a sequência inicial, quer em relação à actividade enzimática, reactividade imunológica ou, no caso de uma sequência de nucleótidos, regulação de genes.

As diferenças estruturais podem ser encaradas como mínimas, desde que existe uma sobreposição significativa entre as várias sequências, ou possuem pelo menos propriedades físicas semelhantes. Esta última inclui, por exemplo, a mobilidade electroforética, semelhanças cromato-gráficas, coeficientes de sedimentação, propriedades espec-trofotométricas, etc.

No caso de sequências de nucleótidos, a concordância deve ser de pelo menos 70%, mas de um modo preferido 80% e de um modo muito particularmente preferido 90% ou mais. No caso da sequência de aminoácidos, as figuras correspondentes são pelo menos 50%, mas preferencialmente 60% e de um modo particularmente preferido 70%. É muito particularmente preferida uma concordância de 90%. A invenção refere-se, para além disso, a um método para identificar, isolar e clonar um dos fragmentos de DNA acima descritos. Um método preferido compreende, por exemplo, os passos seguintes: 14 ΡΕ0929681 a) construção de um banco de genes genómico, b) rastreio deste banco de genes com a assistência das sequências de acordo com a invenção, e c) isolamento dos clones identificados como positivos .

Um método geral para identificar fragmentos de DNA envolvidos na biossintese de ansamicinas compreendem, por exemplo, os seguintes passos 1) Clonagem de um fragmento de DNA que apresenta homologia com genes de sintase de policétido conhecidos. a) A presença de fragmentos de DNA possuindo homologia cornos genes da sintase de policétido de acordo com a invenção é detectada nas estirpes do microrganismo a ser investigado através de uma experiência de Southern com DNA cromossómico desta estirpe. O tamanho desses fragmentos de DNA homólogo podem ser determinados através da digestão do DNA com uma enzima de restrição adequada. b) Produção de um banco genético de plasmideos compreendendo os fragmentos cromossómicos acima digeridos. Normalmente, os clones individuais deste banco genético são testados novamente para a homologia com os 15 ΡΕ0929681 genes da sintase de policético de acordo com a invenção. Os clones com plasmídeos recom-binantes compreendendo fragmentos possuindo homologia com a sonda de policétido são então normalmente isolados com base nesta homologia. 2) Análise da região clonada a) Análise de restrição dos plasmideos recombi-nantes isolados e verificação da identidade desses fragmentos clonados um com o outro b) Através de Southern cromossómico com DNA do microrganismo original e o fragmento de DNA isolado como sonda, pode ser demonstrado que o fragmento clonado é um fragmentos de DNA cromossómico original do microrganismo original . c) É possivel, como uma opção, demonstrar uma homologia significativa do fragmento de DNA clonado com o DNA cromossómico de outros produtores de ansamicina (estreptovaricina, tolipomicina, geldanamicina, ansamitocina). Isto confirmaria que o DNA clonado é tipico de aglomerados de genes da biossintese de ansamicina e deste modo, também da biossintese de rifamicina. d) sequenciação de DNA de um fragmento de restrição interno e demonstração, através de análise de sequências comparativa, que a região clonada é uma sequência de DNA típica 16 ΡΕ0929681 de sintases de policétido, codificando para a biossintese de antibióticos de policétido a partir de actinomicetes.

3) Isolamento e caracterização de regiões de DNA adj acentes a) Construção de um banco de cosmideos do microrganismo original e sua análise para ho-mologia com os fragmentos isolados. Isolamento de cosmideos possuindo homologia com este fragmento. b) Demonstração, através de análise de restrição, de que os clones de cosmideo isolados compreendem uma região de DNA do microrganismo original que se sobrepõe ao fragmento original.

Como descrito acima, o primeiro passo no isolamento dos fragmentos de acordo com a invenção é normalmente a construção de bancos de genes genómicos do organismo de interesse, que sintetiza a ansamicina desejada, especialmente rifamicina. 0 DNA genómico pode ser obtido de um organismo hospedeiro de vários modos, por exemplo através de extrac-ção da fracção nuclear e purificação do DNA extraído, através de métodos conhecidos. A fragmentação, que é necessária para construir 17 ΡΕ0929681 um banco de genes representativos do DNA genómico a ser clonado para um tamanho que é adequado para inserção num vector de clonagem pode ocorrer quer por quebra mecânica ou, preferencialmente, através de corte com enzimas de restrição adequados.

Vectores de clonagem adequados, que são já utilização de rotina para produzir bibliotecas de genes genómicos compreendem, por exemplo, vectores cosmidicos, vectores plasmidicos ou vectores fágicos. É então possível, num programa de rastreio, obter clones adequados que compreendem o(s) gene(s) requerido(s) das bibliotecas de genes deste modo.

Uma possibilidade para identificar a região de DNA necessária consiste, por exemplo, na utilização do banco de genes acima descrito para transformar estirpes que, devido ao bloqueamento de uma via sintética, são incapazes de produzir ansamicinas e identificar os clones que são novamente capazes, após a transformação, de produzir ansamicina (revertentes). Os vectores que conduzem a revertentes compreendem um fragmento de DNA que é necessário na síntese de ansamicina.

Outra possibilidade para identificar a região de DNA necessária baseia-se, por exemplo, na utilização de moléculas de sondas adequadas (sonda de DNA), que são obtidas, por exemplo, como descrito acima. São disponíveis 18 ΡΕ0929681 vários métodos convencionais para identificar clones adequados, tais como hidridação de colónias diferencial, ou hibridação de placas. É possivel utilizar como molécula de sonda um fragmento de DNA previamente isolado do gene ou aglomerado de genes igual ou estruturalmente relacionado que, devido à homologia presente, é capaz de hibridar com a secção de sequência correspondente no gene ou aglomerado de genes necessários a ser identificado. É utilizado, preferencialmente, como uma sonda para o objectivo da presente invenção um fragmento de DNA que se pode obter a partir de um gene ou uma sequência de DNA envolvido na sintese de policétidos, tais como ansamicinas ou sorafenos.

Se a sequência de nucleótidos do gene a ser isolado, ou pelo menos partes desta sequência, são conhecidos, é possivel utilizar, numa forma de realização alternativa, com base nesta informação de sequências, uma sequência de DNA sintetizada correspondente para as hibridações ou amplificações por PCR.

De modo a facilitar a detectabilidade do gene necessário, ou pelo menos parte de um gene necessário, uma das moléculas de sonda de DNA acima descritas pode ser marcada com um grupo adequado, facilmente detectável. Um grupo detectável para o objectivo desta invenção significa qualquer material que possui uma propriedade fisica ou química particular facilmente detectável. 19 ΡΕ0929681

Pode ser feita menção particular, neste ponto, a grupos enzimaticamente activos, tais como enzimas, substratos enzimáticos, coenzimas e inibidores enzimáticos, além disso agentes fluorescentes e luminescentes, cromó-foros e radioisótopos, tais como 3H, 35S, 32P, 125I e 14C. A fácil capacidade de detecção destes marcadores baseia-se, por um lado, nas suas propriedades fisicas intrínsecas (por exemplo marcadores fluorescentes, cromóforos, radioisótopos) ou, por outro lado, nas suas propriedades de reacção e ligação (por exemplo enzimas, substratos, coenzimas, inibidores). Os materiais destes tipos são já largamente utilizados, em particular em imunoensaios e, na maioria dos casos, também podem ser utilizados na presente aplicação. Métodos gerais referentes a hibridação de DNA são descritos, por exemplo, por Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982).

Os clones nas bibliotecas previamente descritas que são capazes de hibridar com uma molécula sonda e que podem ser identificados por um dos métodos de detecção acima mencionados podem ser ainda analisados de modo a determinar a extensão e a natureza da sequência codifi- cante, em detalhe.

Um método alternativo para identificar genes de clones baseia-se na construção de uma biblioteca de genes consistindo em vectores plasmídicos ou de expressão. Isto 20 ΡΕ0929681 requer, em analogia com os métodos previamente descritos, que o DNA genómico compreendendo o gene necessário seja inicialmente isolado e depois clonado num vector plasmídico ou de expressão adequado. As bibliotecas de genes produzidas deste modo podem ser então rastreado através de procedimentos adequados, por exemplo através da utilização de estudos complementares e podem ser seleccionados os clones que compreendem o gene necessário ou pelo menos uma parte deste gene como uma inserção. É por isso possível, com o auxílio dos métodos acima descritos, isolar um gene, vários genes ou um aglomerado de genes que codificam par um ou mais produtos de genes particulares.

Para posterior caracterização, as sequências de DNA purificadas e isoladas do modo descrito acima são sujeitas a análise de restrição e a análise de sequências.

Para a análise de sequências, os fragmentos de DNA previamente isolados são primeiro fragmentados utilizando enzimas de restrição adequados e depois clonados em vectores de clonagem adequados. De modo a evitar enganos na sequenciação, é vantajoso sequenciar ambas as cadeias de DNA completamente.

Estão disponíveis várias alternativas para analisar o fragmento de DNA clonado em relação à sua função na biossíntese de ansamicina. 21 ΡΕ0929681

Assim, por exemplo, é possível, em experiências de complementação com mutantes defeituosos, não apenas estabelecer o envolvimento em princípio de um gene ou fragmento de gene na biossíntese dos metabolitos secundários, mas também verificar especificamente o passo sintético no qual o referido fragmento de DNA está envolvido.

Num tipo de análise alternativo, é obtida evidência do modo exactamente oposto. A transferência de plasmídeos que compreende secções de DNA que possuem homologias com secções apropriadas no genoma resulta na integração das referidas secções de DNA homólogo através de recombinação homóloga. Se, como no caso presente, a secção de DNA homólogo é uma região na grelha de leitura aberta do aglomerado de genes, a integração do plasmídeo resulta na activação deste gene através da denominada interrupção de genes e, consequentemente, numa interrupção na produção de metabolitos secundários. Assume-se, de acordo com o conhecimento actual, que uma região homóloga que compreende pelo menos 100 pb, mas preferencialmente mais do que 1000 pb, é suficiente para realizar o evento de recombinação desej ado.

Todavia, é preferida uma região homóloga que se estende ao longo de um intervalo de cerca de 0,3 a 4 kb, mas em particular ao longo de um intervalo de 1 a 3 kb.

Para preparar plasmídeos adequados que possuem 22 ΡΕ0929681 homologia suficiente para integração através de recombi-nação homóloga há uma condição preferencial de um passo de subclonagem em que o DNA previamente isolado é digerido e os fragmentos de tamanho adequado são isolados e subsequentemente clonados num plasmideo adequado. Exemplos de plasmideos adequados são os plasmideos geralmente utilizados para manipulações genéticas em estreptomicetes ou E. coli. É possivel, em principio, utilizar para a preparação e multiplicação das construções previamente descritas, todos os vectores de clonagem convencionais, tais como vectores plasmidicos ou de bacteriófago, desde que possuam sequências de replicação e de controlo derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira. 0 vector de clonagem possui normalmente uma origem de replicação mais genes específicos que resultam em caracteristicas de selecção fenotipicas na célula hospedeira transformada, em particular resistências a antibióticos. Os vectores transformados podem ser seleccionados com base nestes marcadores fenotipicos após transformação numa célula hospedeira.

Marcadores fenotipicos seleccionáveis que podem ser utilizados para o objectivo desta invenção compreendem, por exemplo, sem esta representar uma limitação da matéria sujeito da invenção, resistência a tioestrepona, ampi- cilina, tetraciclina, cloranfenicol, higromicina, G418, 23 ΡΕ0929681 canamicina, neomicina e bleomicina. Outro marcador de selecção pode ser, por exemplo, prototrofia para amino-ácidos particulares. São principalmente preferidos para o objectivo da presente invenção plasmideos de estreptomicetes e de E. coli, por exemplo os plasmideos utilizados para o objectivo da presente invenção. Células hospedeiras principalmente adequadas para a clonagem previamente descrita para o objectivo desta invenção são procariotas, incluindo hospedeiros bacte-rianos, tais como estreptomicetes, actinomicetes, E. coli, ou família das Pseudomonas.

Os hospedeiros de E. coli são particularmente preferidos, por exemplo da estirpe de E. coli HB101 ou X-l blue MR® (Stratagene) ou estreptomicetes, tais como as estirpes de Streptomyces lividans isentas de plasmideos TK2 3 e TK2 4.

As células competentes da estirpe de E. coli HB101 são produzidas pelos métodos normalmente utilizados para transformar E. coli. 0 método de transformação de Hopwood et al (Genetic manipulation of streptomyces a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich (1985)) é normalmente utilizado para estreptomicetes.

Após a transformação e subsequente incubação num 24 ΡΕ0929681 meio adequado, as colónias resultantes são sujeitas a um rastreio diferencial através de plaqueamento em meios selectivos. É então possivel isolar o DNA do plasmideo apropriado das colónias que contêm plasmídeos com fragmentos de DNA neles clonados. 0 fragmento de DNA de acordo com a invenção, que compreende uma região de DNA que está envolvida direc-tamente, ou indirectamente, na biossintese de ansamicina e pode ser obtida do modo previamente descrito a partir do aglomerado de genes da biossintese de ansamicina, pode também ser utilizado como clone iniciador para identificar e isolar outras regiões de DNA adjacentes que se sobrepõem a este a partir do referido aglomerado de genes.

Isto pode ser alcançado, por exemplo, realizando um denominado "caminhar pelo cromossoma" numa biblioteca de genes consistindo em fragmentos de DNA com regiões de DNA que se sobrepõem mutuamente, utilizando o fragmento de DNA previamente isolado ou, em particular, as sequências localizadas nas suas margens 5' e 3'. Os procedimentos para caminhar pelo cromossoma são conhecidos dos especialistas na técnica. Podem ser encontrados detalhes, por exemplo, nas publicações de Smith et al. (Methods Enzymol (1987), 151, 461-489) e Wahl et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., USA (1987), 84, 2160-2164). O pré-requisito para caminhar pelo cromossoma é a presença de clones possuindo fragmentos de DNA coerentes 25 ΡΕ0929681 que são tão compridos quanto possível e se sobrepõem mutuamente numa biblioteca de genes e um clone de iniciação adequado, que compreende um fragmento que está localizado na vizinhança ou de outro modo, preferencialmente, na região a ser analisada. Se a localização exacta do clone iniciador é desconhecida, o caminhar é preferencialmente realizado em ambas as direcções. 0 verdadeiro passo de caminhar inicia-se utilizando o clone iniciador isolado como sonda numa das reacções de hibridação previamente descritas, de modo a detectar clones adjacentes que possuem regiões que se sobrepões ao clone iniciador. É possível, através da análise de hibridação, estabelecer que fragmento se projecta para mais longe além da região de sobreposição. Este é então utilizado como clone iniciador para o 2o passo de clonagem, caso em que há o estabelecimento de um fragmento que se sobrepõe ao referido 2o clone na mesma direcção. A progressão contínua deste modo no cromossoma resulta numa colecção de clones de DNA que se sobrepõem, que cobrem uma região de DNA grande. Estes podem então, quando apropriado após um ou mais passos de subclonagem, ser ligados juntamente através de métodos conhecidos para produzir um fragmento que compreende partes ou, de outro modo, preferencialmente todos os constituintes essenciais para a biossíntese de ansamicina. A reacção de hibridação para estabelecer clones com regiões marginais sobreponíveis faz uso, preferen- 26 ΡΕ0929681 cialmente, não de um fragmento completo muito grande e difícil de manipular mas, em seu lugar, um fragmento parcial da região da margem esquerda ou direita, que pode ser obtido através de um passo de subclonagem. Devido ao tamanho mais pequeno do referido fragmento parcial, a reacção de hibridação resulta em menos sinais de hibridação positiva, de modo a que o esforço analítico seja menos distinto do que na utilização do fragmento completo. É além disso aconselhável caracterizar o fragmento parcial em detalhe, de modo a excluir a inclusão das suas quantidades maiores de sequências repetitivas, que podem ser distribuídas ao longo de todo o genoma e, desse modo, impediria fortemente uma sequência alvo de passos de caminhar.

Uma vez que o aglomerado de genes responsáveis pela biossíntese de ansamicina cobre uma região relativamente grande do genoma, pode ser vantajoso realizar um denominado passo grande de caminhar ou caminhar pelo cosmídeo. É possível nestes casos, utilizando vectores cosmídicos que permitem a clonagem de fragmentos de DNA muito grandes, cobrir uma região muito grande de DNA, que pode compreender até 42 kb, num único passo de caminhar.

Numa possível forma de realização da presente invenção, por exemplo, para construir um banco de genes em cosmideo de estreptomicetes ou actinomicetes, o DNA completo é isolado sendo o tamanho dos fragmentos de DNA da ordem de cerca de 100 kb e é subsequentemente parcialmente digerido com endonucleases de restrição adequadas. 27 ΡΕ0929681 0 DNA digerido é então extraído de um modo convencional, de modo a remover a endonuclease que ainda está presente e é precipitado e finalmente concentrado. 0 concentrado do fragmento resultante é então fraccionado, por exemplo através de centrifugação em gradiente de densidade, de acordo com o tamanho dos fragmentos individuais. Após as fracções que se podem obter deste modo terem sido dialisadas, podem ser analisados num gel de agarose. As fracções que contêm fragmentos de tamanho adequado são misturadas e concentradas para posterior processamento. Os fragmentos a serem encarados como particularmente adequados para o objectivo desta invenção possuem um tamanho da ordem dos 30 kb a 42 kb, mas preferencialmente de 35 kb a 40 kb.

Em paralelo com a fragmentação acima descrita, ou mais tarde, por exemplo um vector cosmídico adequado pWE15® (Stratagene) é completamente digerido com uma enzima de restrição adequada, por exemplo Bam Hl, para a reacção de ligase subsequente. A ligação do DNA cosmídico aos fragmentos de estreptomicetes ou actinomicetes que tinham sido fraccionados de acordo com o seu tamanho pode ser realizada utilizando uma ligase de DNA de T4. A mistura de ligação que se obtém deste modo é, após um tempo de incubação suficiente, empacotado em fagos λ atrav+es de métodos conhecidos de um modo geral. 28 ΡΕ0929681

As partículas fágicas resultantes são então utilizadas para infectar uma estirpe de hospedeiros adequada. É preferida uma estirpe de E. coli recA", tal como E. coli HB101, ou X-l Blue® (Stratagene) . A selecção de clones transfectados e o isolamento do DNA de plasmídeo pode ser realizado através de métodos geralmente conhecidos. 0 rastreio do banco de genes para os fragmentos de DNA que estão envolvidos na biossíntese da ansamicina é realizado, por exemplo, utilizando uma sonda específica de hibridação, que se assume (por exemplo com base na sequência de DNA ou homologia de DNA ou testes de complementação ou interrupção de genes ou a sua função noutros organismos) compreender regiões de DNA do 'aglomerado de genes de ansamicina'.

Um plasmídeo que compreende um fragmento adicional do tamanho requerido, ou que foi identificado com base em hibridações, pode então ser isolado do gel do modo previamente descrito. A identidade deste fragmento adicional com o fragmento requerido do cosmídeo previamente seleccionado pode ser confirmada por transferência de Southern e hibridação. A análise de função dos fragmentos de DNA isolados deste modo podem ser realizados numa experiência de interrupção de gene, como descrito acima.

Outra utilização possível dos fragmentos de DNA 29 ΡΕ0929681 de acordo com a invenção é modificar ou inactivar enzimas ou domínios envolvidos na biossíntese da ansamicina e, em particular, rifamicina, ou para sintetizar oligonucleótidos que são, por sua vez, utilizados para descobrir sequências homólogas em amplificação por PCR.

Para além dos fragmentos de DNA de acordo com a invenção como tal, são também reivindicadas as sua utilizações primeiramente para produzir rifamicina, análogos da rifamicina ou seus percursores e para a produção bios-sintética de novas ansamicinas ou de seus percursores. São incluídas nesta ligação as moléculas em que a ponte ali-fática está ligada através de uma extremidade ao núcleo aromático.

Os fragmentos de DNA de acordo com a invenção permitem, por exemplo, por combinação com fragmentos de DNA de outras vias biossintéticas, ou por sua inactivação ou modificação, a biossíntese de novos compostos híbridos, em particular de novos análogos de ansamicinas ou rifamicinas. Os passos necessários para isto são geralmente conhecidos e são descritos, por exemplo, em Hopwood, Current Opinlon in Biotechnol. (1993), 4, 531-537. A invenção refere-se ainda à utilização dos fragmentos de DNA de acordo com a invenção para realizar a nova tecnologia de biossíntese combinatória para a produção biossintética de bibliotecas de sintases de policétido com base nos genes da biossíntese de rifamicina e ansamicina. 30 ΡΕ0929681

Se, por exemplo, são produzidos vários conjuntos de modificações, é possível produzir, deste modo, por meio de biossínteses, uma biblioteca de policétidos, por exemplo análogos de ansamicinas ou rifamicinas, que precisam então de ser testados apenas para a actividade dos compostos produzidos deste modo. Os passos necessários para isto são geralmente conhecidos e são descritos, por exemplo, em Tsoi e Khosla, Chemistry & Biology (1995) , 2, 355-362 e documento WO-9508548.

Para além do fragmento como tal, é também reivindicada a sua utilização para a construção genética de estirpes de actinomicetes mutadas, nas quais o aglomerado de genes da biossíntese de rifamicina ou ansamicina natural no cromossoma foi parcialmente ou completamente removida e que podem depois ser utilizadas para expressar aglomerados de genes da biossíntese de ansamicina ou rifamicina geneticamente modificados. A invenção refere-se além disso a um vector híbrido que compreende pelo menos um fragmento de DNA de acordo com a invenção, por exemplo um sítio de ligação a um promotor, um repressor ou activador, um gene repressor ou activador, um gene estrutural, um terminador ou uma sua parte funcional. O vector híbrido compreende, por exemplo, uma cassete de expressão que compreende um fragmento de DNA de acordo com a invenção, que é capaz de expressar uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de ansamicina e, em particular na biossíntese de rifamicina, ou um seu 31 ΡΕ0929681 fragmento funcional. A invenção refere-se, de igual modo, a um organismo hospedeiro que compreende o vector hibrido descrito acima. São geralmente conhecidos vectores adequados representam o ponto de partida dos vectores híbridos de acordo com a invenção, e organismos hospedeiros adequados, tais como células de bactérias ou de leveduras. 0 organismo hospedeiro pode ser transformado através de métodos geralmente usuais, tais como por meio de protoplastos, Ca2+, Cs+, polietilenoglicol, electroporação, vírus, vesículas lipídicas, ou uma arma de partículas. Os fragmentos de DNA, de acordo com a invenção podem então estar presentes tanto como constituintes extracomossómicos no organismo hospedeiro e integrados através de secções de sequência adequados no cromossoma do organismo hospedeiro. A invenção refere-se, de igual modo, a sintases de policétidos que compreendem os fragmentos de DNA de acordo com a invenção, em particular aqueles de Amycola-topsis mediterranei, que estão envolvidos directamente ou indirectamente na síntese da rifamicina e seus constituintes funcionais, por exemplo domínios enzimaticamente activos. A invenção refere-se ainda mais a uma sonda de hibridação compreendendo um fragmento de DNA de acordo com a invenção, e à sua utilização, em particular para identi- ΡΕ0929681 ficar fragmentos de DNA envolvidos na biossíntese de ansamicinas.

De modo a obter sinais inequívocos na hibridação, o DNA ligado ao filtro (por exemplo produzidos de nylon ou nitrocelulose) é normalmente lavado a 55-65 °C em 0,2 x SSC (1 x SC = cloreto de sódio a 0,15 M, citrato de sódio a 15 mM) .

Exemplos

Geral

As técnicas gerais de genética molecular, tais como isolamento e purificação de ADN, digestão de restrição de DNA, electroforese de DNA em gel de agarose, ligação de fragmentos de restrição, cultura e transformação de E. coli, isolamento de plasmídeos de E.coli são realizadas como descrito por Maniatis et al.r Molecular Cloning: A laboratory manual, Ia Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982).

As condições de cultura e genética molecular com A. mediterranei e outros actinomycetes são como descritos por Hopwood et al. (Genetic manipulation of streptomyces a laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, 1985) . Todas as culturas líquidas de A. mediterranei e de outros actinomycetes são realizadas em frascos de Erlenmeyer a 28 °C num agitador a 250 rpm. ΡΕ0929681

Meios de Nutriente utilizados: LB Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Ia Edição. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour NY (1982) NL14 8 Schupp + Divers FEMS Microbiology Lett. 36, 159-162 (1986) (NL148 = NL148G sem glicina) R2YE Hopwood et al. (Genetic manipulation of streptomyces a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, 1985) TB: 12 g/L Bacto triptona 24 g/L Bacto extracto de levedura 4 mL/L glicerol Exemplo 1: Detecção de fragmentos de DNA cromossómico de A. mediterranei possuindo homologia com genes de sintase de policétido de outra bactéria

Para obter ADN genómico de A. mediterranei, células da estirpe de A. mediterranei wt3136 (=LBGS3136, colecção de estirpes ETH) são cultivadas em meio NL148 durante 48 horas. É então transferido 1 mL desta cultura para 50 mL de meio NL148 (+ 2,5 g/L de glicina) num frasco

Erlenmeyer de 200 mL e a cultura foi incubada durante 48 h. 34 ΡΕ0929681

As células foram removidas do meio por centrifugação a 3000 g durante 10 min e são ressuspensas em 5 mL de SET (NaCl a 75 mM, EDTA a 25 mM, Tris a 20 mM, pH 7,5) . O DNA de elevado peso molecular é extraído pelo método de Pospiech e Neumann (Trends in Genetics (1995), 11, 217-218).

De modo a detectar, através de uma transferência de Southern, fragmentos individuais do DNA de A. mediterranei isolado que possuem homologia com genes da sintase de policétido, é preparada uma sonda radioactiva a partir de um aglomerado de genes da sintase de policétido conhecido. Para fazer isto, o fragmento de Pvu I de 3,8 kb de tamanho é isolada a partir do plasmideo recombinante p98/l (Schupp et al., J. of Bacteriol. (1995), 177, 3673-3679), que compreende uma região de DNA, de cerca de 32 kb de tamanho, da sintase de policétido para o antibiótico sorafeno A. Cerca de 0,5 pg do fragmento de DNA de Pvu I de 3,8 kg isolado é marcado radioactivamente com 32P-d-CTP através de tradução de "nick" de Gibco/BRL (Basle), de acordo com as instruções do fabricante.

Para a transferência de Southern, cerca de 2 pg do DNA genómico isolado acima a partir de A. mediterranei são completamente digeridos com a enzima de restrição Bgl II (Bõhringer, Mannheim) e os fragmentos resultantes são fraccionados num gel de agarose a 0,8%. Uma transferência de Southern com este gel de agarose e a sonda de DNA isolado acima (fragmento de Pvu I de 3,8 kb) detecta um fragmento de DNA cortado com Bgl II que tem cerca de 13 kb 35 ΡΕ0929681 de tamanho do DNA genómico de A. mediterranei e que possui homologia com a sonda de DNA utilizada. Pode concluir-se, com base nesta homologia que o fragmento de DNA detectado de A. mediterranei é uma região genética que codifica para uma sintase de policétido e desse modo envolvido na síntese de um antibiótico de policétido.

Exemplo 2: Produção de uma colecção de plasmideos recom- binantes específicos compreendendo fragmentos de cromossoma digeridos com Bgl II, de A. mediterranei de 12-16 kb de tamanho 0 vector de selecção positiva de E. coli pIJ4642 (derivado de pIJ666, Kieser & Melton, Gene (1988), 65, 83-91) desenvolvido no John Innes Centre (Norwich, UK) é utilizado para produzir o banco de genes. Este plasmídeo é primeiro cortado com Bam Hl e os dois fragmentos resultantes são fraccionados num gel de agarose. O mais pequeno de dois fragmentos é o fragmento de enchimento do vector e o maior é a porção de vector que, em auto-ligação após a deleção do fragmento de enchimento forma, devido às sequências de terminação que flanqueiam fd, um palindroma perfeito, o que significa que o plasmídeo não pode ser obtido como tal em E. coli. Esta porção de vector de 3,8 kb de tamanho é isolada do gel de agarose por electroeluição, como descrito nas páginas 164-165 de Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Ia Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982) . 36 ΡΕ0929681

Para preparar os fragmentos de DNA cortados com Bgl II de A. mediterranei, é preparado o DNA genómico de elevado peso molecular preparado no Exemplo 1. Cerca de 10 pg deste DNA são completamente digeridos com a enzima de restrição Bgl II e subsequentemente fraccionados num gel de agarose a 0,8%. Os fragmentos de DNA com um tamanho de cerca de 12-16 kb são cortados do gel e retirados do bloco de gel através de electroeluição (ver acima). Cerca de 1 pg dos fragmentos de Bgl II isolados deste modo é ligado a cerca de 0,1 pg da porção de Bam Hl, isolada acima, do vector pIJ4642. A mistura de ligação obtida deste modo é então transformada na estirpe de E. coli HB101 (Stra-tagene). Cerca de 150 colónias transformadas são seleccio-nadas da mistura de transformação em LB agar com 30 pg por mL de cloranfenicol. Estas colónias contêm plasmídeos recombinantes com fragmentos de DNA genómico cortado com Bgl II de A. mediterranei na gama de 12 - 16 kb.

Exemplo 3: Clonagem e caracterização de DNA cromossómico de A. mediterranei possuindo homologia com genes da sintase de policétido bacteriano

Foram analisados 150 dos clones de plasmídeo preparados no Exemplo 2 por hibridação de colónias utilizando um filtro de nitrocelulose (Schleicher & Schuell), como descrito nas páginas 318-319 de Maniatis et ai., Molecular Cloning: A laboratory manual, Ia Edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY ΡΕ0929681 (1982). A sonda de DNA utilizada é o fragmento Pvu I de 3,8 kb, marcado radioactivamente com 32P-d-CTP e isolado no Exemplo 1, do plasmideo p98/l. Os plasmídeos são isolados de 5 clones plasmídicos que apresentam um sinal de hibridação e são caracterizados por duas digestões de restrição com as enzimas Hind III ou Κρη I. A Hind III corta duas vezes na porção do vector dos clones, 0,3 kb para a direita e para a esquerda do sitio de clivagem de Bam Hl, no qual o DNA de A. mediterranei foi integrado. A Κρη I não corta na porção do vector pIJ4642. Esta análise de restrição demonstra que os clones investigados compreendem tanto os fragmentos idênticos de Hind III de cerca de 14 e 3,1 kb como os fragmentos idênticos de Κρη I de aproximadamente 11,4 e 5,7 kb em tamanho. Isto demonstra que estes clones compreendem o mesmo fragmento genómico de Bgl II de A. mediterranei e que o último possui um comprimento de cerca de 13 kb. Pode ser concluído adicionalmente a partir desta análise de restrição que este fragmento clonado de Bgl II não possui um sítio de clivagem interno Hind III, mas possui 2 sítios de clivagem Κρη I, que originam um fragmento Κρη I interno de 5,7 kb de tamanho. O DNA plasmídico dos 5 clones acima com fragmentos de restrição idênticos é ainda caracterizado através de uma transferência de Southern. Para este objectivo, os plasmídeos são cortados com Hind III e Κρη I e a sonda de DNA utilizada é o fragmento Pvu I de 3,8 kb do plasmideo p98/l, marcado radioactivamente com P, 38 ΡΕ0929681 utilizado acima. Esta experiência confirma que os 5 plasmideos contêm fragmentos de DNA de A. mediterranei idênticos e que estes possuem homologia significativa com a sonda de DNA que é caracteristica dos genes da sintase de policétido. Adicionalmente, a transferência de Southern demonstra que o fragmento de Κρη I interno de 5,7 kb de tamanho possui, igualmente, homologia significativa com a sonda de DNA utilizada. 0 plasmídeo denominado pRi7-3 é seleccionado a partir dos 5 plasmideos para posterior processamento.

Para demonstrar que o fragmento Bgl II clonado de cerca de 13 kb em comprimento de A. mediterranei é um fragmento de DNA cromossómico original, é realizada outra transferência de Southern. 0 DNA cromossómico de A. mediterranei que foi cortado com Bgl II, Κρη I ou Bam Hl é empregue nesta transferência. Dois fragmentos Bam Hl que têm cerca de 1,8 e 1,9 kb em tamanho e estão presentes no fragmento Κρη I de 5,7 kb de pRi7-3 são utilizados como sonda de DNA marcado radioactivamente. Esta experiência confirma que o fragmento de DNA de Bgl II de cerca de 13 kb em tamanho clonado no plasmideo recombinante pRi7-3 é um fragmento genómico autêntico de A. mediterranei. Adicionalmente, esta experiência confirma que o fragmento clonado possui um fragmento Κρη I interno de 5,7 kb em tamanho e dois fragmentos Bam Hl de cerca de 1,8 e 1,9 kb em tamanho e que estes fragmentos de DNA são igualmente fragmentos de DNA genómico autênticos de A. mediterranei. 39 ΡΕ0929681

Exemplo 4: Demonstração de uma homologia significativa do fragmento Bgl II de 13 kb qenómico clonado de A. mediterranei com DNA cromossómico de outros actinomycetes que produzem ansamicinas A demonstração de uma homologia significativa entre a região de DNA cromossómica clonada de A. mediterranei e o DNA cromossómico de outros actimomycetes que produzem ansamicina ocorre através de uma experiência de transferência de Southern. As estirpes seguintes que produzem ansamicina são empregues para este efeito (as ansamicinas produzidas pelas estirpes estão entre parêntesis) : Streptomyces spectabilis (estreptovaricinas), Stre-ptomyces tolypophorus (tolipomicinas), Streptomyces hygros-copicus (geldanamicinas), Nocardia species ATCC31281 (ansamitocinas). 0 DNA genómico destas estirpes é isolado como descrito para A. mediterranei no Exemplo 1 e digerido com a enzima de restrição Κρη I e os fragmentos de restrição obtidos deste modo são fraccionados num gel de agarose para a transferência de Southern. Dois fragmentos de Bam Hl de cerca de 1,8 e 1,9 kb em tamanho de A. mediterranei, que são utilizados no Exemplo 3 e são isolados do plasmídeo pRi7-3, são utilizados como sonda radioactiva. Esta experiência demonstra que estas estirpes que produzem ansamicina possuem uma homologia de DNA significativa com a sonda de DNA utilizada e desse modo com a região cromossómica clonada de A. mediterranei. Deve ser observado a este respeito que a homologia no caso de produtores de ansamicinas com um sistema de anel de 40 ΡΕ0929681 naftoquinóide (estreptovaricina, tolipomicina) é maior do que no caso daqueles com sistema de anel de benzoquinóide (geldanamicina, ansamitocina). Este resultado sugere que a região de DNA cromossómico clonada de A. mediterranei é típica dos aglomerados de genes da biossíntese da ansami-cina e, especialmente, dos aglomerados de genes para ansa-micinas com sistemas de anel naftoquinóide, correspondendo ao sistema de anel nas rifamicinas.

Exemplo 5: Determinação da sequência de DNA do fragmento de Κρη I de 5,7 kb em tamanho, localizado no fragmento Bgl II clonado de 13 kb

Para a sequenciação, o fragmento Κρη I de 5,7 kb é isolado do plasmídeo pRi7-3 (DSM 11114) (Maniatis et al. 1992) e subclonado no sítio de clivagem de Κρη I do vector pBRKan4, que é adequado para a sequenciação de DNA, produzindo os plasmídeos pTS004 e pTS005. O vector pBRKanf4 (derivado de pBRKanfl; Bhat, Gene (1993) 134, 83-87) é adequado para introduzir deleções sequenciais de fragmentos Sau 3A no fragmento de inserção clonado, porque este vector não possui, ele próprio, uma sequência de nucleótidos GATC. Adicionalmente, os fragmentos Bam Hl de 1,9 e 1,8 kb em tamanho presentes no fragmento Κρη I de 5,7 kb são sub-clonados no sítio de clivagem Bam Hl de pBRKanf4, resultando nos plasmídeos pTS006 e pTS007, e pTS008 e pTS009, respectivamente.

Para preparar subclones truncados sequencialmente ΡΕ0929681 por fragmentos Sau 3A para a sequenciação de DNA, os plasmídeos pTS004 a pTS009 são parcialmente digeridos com Sau 3A e completamente digeridos com Xba I ou Hind III (um sitio de clivagem na região de clonagem múltipla do vec-tor). 0 DNA obtido deste modo (consistindo no vector linearizado com fragmentos de DNA inseridos truncados pelos fragmentos Sau 3A) é cheio nas suas extremidades utilizando polimerase de Klenow (fragmento da polimerase I, ver Maniatis et al., páginas 113-114), auto-ligados com ligase de DNA de T4 e transformados em E. coli DH5a. 0 DNA plasmidico que corresponde aos plasmídeos pTS004 a pTS009, mas possui regiões de DNA, que são truncados a partir de um lado por fragmentos de Sau 3A, dos fragmentos originais integrados de A. mediterranei, é isolado a partir de clones individuais transformados obtidos deste modo. A sequenciação de DNA é realizada com os plasmídeos obtidos deste modo e com pTS004 a pTS009, utilizando o kit de reacção de Perkin-Elmer/Applied Biosystems com reagentes de terminador marcados com corante (Kit N° 402122) e um iniciador universal, ou um iniciador de T7. É utilizado um protocolo de sequenciação de ciclo convencional com um termociclador (MJ Research DNA Engine Thermo-cycler, Modelo 225) e as reacções de sequenciação são analisadas pelo sequenciador de DNA automático Applied Biosystems (Modelo 373 ou 377) , de acordo com as instruções do fabricante. Para analisar estes resultados, são empregues os seguintes programas de computador (software): software de análise de DNA da Applied Biosystems, Unix 42 ΡΕ0929681

Solaris CDE software, DNA assembly and analysis package GAP licenciada por R. Staden (Nucleic Acids Research (1995) 23, 1406-1410) e Blast (NCBI).

Os métodos acima descritos podem ser utilizados para sequenciar completamente ambas as cadeias de DNA do fragmento de Κρη I de 5,7 kb de A. mediterranei estirpe wt3136. A sequência de DNA do fragmento de 5,7 kb com um comprimento de 5676 pares de bases é apresentada na SEQ ID NO 1.

Exemplo 6: Análise da região que codifica a proteína (genes) no fragmento Κρη I de 5,7 kb de A. mediterranei A sequência de nucleótidos do fragmento de Κρη I de 5,7 kb é analisada utilizando o programa de computador Codonpreference (Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, 1994). Esta análise demonstra que este fragmento é na totalidade do seu comprimento uma região que codifica proteina e assim forma parte de uma grelha de leitura aberta (ORF). Os codões utilizados nesta ORF são tipicos de genes de estreptomicetes e actinomicetes. A sequência de aminoácidos derivada da sequência de DNA desta ORF é apresentada em SEQ ID NO 2.

As sintases de policétido dos antibióticos de macrólido (tais como eritromicina, rapacinina) são proteínas multifuncionais muito grandes que compreendem vários 43 ΡΕ0929681 domínios enzimaticamente activos que são estão agora bem caracterizados (Hopwood e Khosla, Ciba Foundation Symposium (1992), 171, 88-112/ Donadio e Katz, Gene (1992), 111, 51-60; Schwecke et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1995) 92 (17), 7839-7843). A comparação da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 2 com a da muito bem caracterizada sintase de policétido de eritromicina, ORF1 de eryA (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene de sequência de DNA /NO de acesso da EMBL M6367 6) origina os seguintes resultados:

Região da SEQ ID NO 2: aminoácidos 2 - 235: é 40% idêntica ao domínio da aciltransferase do módulo 2 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da SEQ ID NO 2: aminoácidos 325 - 470: é 43% idêntica ao domínio da desidratase do módulo 4 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da SEQ ID NO 2: aminoácidos 7 62 - 940: é 48% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 2 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da SEQ ID NO 2: aminoácidos 1024 - 1109: é 57% idêntica ao domínio da proteína de veículo de acilo do módulo 2 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da SEQ ID NO 2: aminoácidos 1126 - 1584: é 59% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 44 ΡΕ0929681

As semelhanças muito grandes encontradas na sequência de aminoácidos e no tamanho e arranjo dos domínios enzimáticos sugerem que a região Κρη I clonada de 5,7 kb em tamanho de A. mediterranei codifica para parte de uma sintase de policétido que é típica de policétidos do tipo macrólido.

Exemplo 7: Construção de um banco de genes em cosmídeo de A. mediterranei 0 vector cosmídico empregue é o plasmídeo pWE15, que pode ser adquirido (Stratagene, La Jolla, CA, USA). 0 pWE15 é completamente cortado com a enzima Bam Hl (Maniatis et al. 1989) e precipitado com etanol. Para a ligação do DNA cosmídico, o DNA cromossómico de A. mediterranei é isolado como descrito no Exemplo 1 e parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau 3A (Bõhringer, Mannheim) para formar fragmentos de DNA, a maioria dos quais possui um tamanho de 2 0 - 4 0 kb. O DNA pré-tratado deste modo é fraccionado pelo tamanho de fragmento por centrifugação (83 000 g, 20 °C) num gradiente de densidade em sacarose de 10% a 40% durante 18 h. O gradiente é fraccionado em alíquotas de 0,5 mL e dialisado e são analisadas amostras de 10 pL num gel de agarose a 0,3% com padrão de tamanho de DNA. As fracções com DNA de 25 - 40 kb em comprimento são combinadas, precipitadas com etanol e ressuspensas num pequeno volume de água. 45 ΡΕ0929681 A ligação do DNA cosmídico aos fragmentos Sau 3A de A. mediterranei isolados de acordo com o seu tamanho (ver acima) ocorre com a ajuda de uma ligase de DNA de T4. Cerca de 3 gg de cada um dos dois materiais de partida são empregues num volume de reacção de 2 0 gL e a ligação é realizada a 12 °C durante 15 h. São empacotados 4 mL desta mistura de ligação em fagos lambda utilizando um kit de empacotamento in vitro, que pode ser adquirido a Stratagene (La Jolla , CA, USA) (de acordo com as instruções do fabricante ) . Os fagos resultantes são introduzidos por infecção na estirpe de E. coli X-IBlue® (Stratagene), . A titulação do material fágico revela cerca de 20 000 partículas fágicas por mL, a análise de 12 clones de cosmideos demonstra que todos os clones contêm inserções de plasmideo de 25 - 40 kb em tamanho. Exemplo 8: Identificação, clonagem e caracterização da região de DNA cromossómico de A. mediterranei que está adjacente ao fragmento Κρη I de 5,7 kb clonado

Para identificar e clonar a região de DNA cromossómico de A. mediterranei que está adjacente ao fragmento Κρη I de 5,7 kb acima descrito nos Exemplo 3 e 5, primeiramente é preparada uma sonda de DNA radioactiva a partir do fragmento Κρη I de 5,7 kb. Isto é realizado marcando radioactivamente aproximadamente 0,5 gg do fragmento de DNA isolado com 32P-d-CTP através do sistema de tradução de "nick" da Gibco/BRL (Basle), de acordo com as instruções do fabricante. 46 ΡΕ0929681 A infecção de E. coli X-l Blue MR (stratagene) , com uma fracção dos fagos lambda empacotados in vitro (ver Exemplo 7) resulta em mais de 2000 clones em várias placas de LB + ampicilina (50 pg/mL) . Estes clones são testados por hibridação de colónias em filtros de nitrocelulose (ver Exemplo 3 para o método) . A sonda de DNA utilizada no fragmento de DNA Κρη I de 5,7 kb de A. mediterranei, que é marcada radioactivamente com 32P-d-CTP e foi preparada acima.

Foram encontrados 5 clones de cosmideo apresentando um sinal significativo com a sonda de DNA. O DNA plasmidico destes cosmideos é isolado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), digerido com Κρη I e isolado num gel de agarose. A análise revela que todos os 5 plasmideos integraram DNA cromossómico de A. mediterranei, com um tamanho da ordem de cerca de 23-35 kb e contêm todos o fragmento Κρη I de 5,7 kb.

Para caracterizar a região do DNA cromossómico de A. mediterranei que está adjacente ao fragmento Κρη I clo-nado, o plasmideo de um dos 5 clones de cosmideo é sujeito a análise de restrição. O plasmideo seleccionado do clone do cosmideo possui o número pNE112 e, de igual modo, compreende o fragmento Bgl II de 13 kb descrito no Exemplo 3. A digestão do plasmideo pNE112 com as enzimas de 47 ΡΕ0929681 restrição Bam Hl, Bgl II, Hind III (isoladamente ou em combinação) permite que seja preparado um mapa de restrição da região clonada de A. mediterranei e isto permite que esta região de cerca de 2 6 kb em tamanho no cromossoma de A. mediterranei seja caracterizada. Esta região é carac-terizada pelos seguintes sitios de clivagem de restrição, com a distância apresentada em kb a partir de uma extremidade: Bam Hl na posição 3,2 kb, Hind III na posição 6,6 kb, Bgl II na posição 11,5 kb, Bam Hl na posição 16,6 kb, Bam Hl na posição 17,3 kb, Bam Hl na posição 21 kb e Bgl II na posição 24 kb.

Exemplo 9: Determinação da sequência da região de DNA cromossómico de A. mediterranei presente no plasmideo pNE112 e sobrepondo com o fragmento Κρη I de 5,7 kb clonado 0 DNA do plasmideo pNE112 é dividido em fragmentos directamente utilizando um nebulizador Aero-Mist (CIS-US Inc., Bedford, MA, USA) sob uma pressão de azoto de 8-12 libras por polegada quadrada. Estes fragmentos de DNA aleatórios são tratados com polimerase de DNA de T4, cinase de DNA de T4 e polimerase de DNA de E. coli na presença de 4 dNTPs, de modo a criar extremidades rombas nos fragmentos de DNA de cadeia dupla (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Os fragmentos são então fraccionados em agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% (FMC SeaPlaque Agarose, N° de catálogo 50113) e os fragmentos de 48 ΡΕ0929681 1,5-2 kb em tamanho são extraídos por extracção com fenol a quente (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Os fragmentos de DNA obtidos deste modo são então ligados com o auxílio da ligase de DNA de T4 ao vector plasmídico pBRKanf4 (ver Exemplo 5) ou pBlueScript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA), cada um dos quais é cortado uma vez com extremidades quadradas através de digestão de restrição apropriada (Sma I para pBRKanf4 e Eco RV para pBluScript KS+) e é desfosforilado nas extremidades através de tratamento com fosfatase alcalina (Bõhringer, Mannheim). A mistura de ligação é então transformada em E. coli DH5a e as células são incubadas durante a noite em LB agar com o antibiótico apropriado (canamicina a 40 pg/mL para pBRKanf4, ampicilina a 100 pg/mL para pBlueScript KS+) . As colónias crescidas são transferidas isoladamente para 1,25 mL de meio TB líquido com antibiótico em placas de 96 poços com pólos de um volume de 0,2 mL e incubadas a 37 °C durante a noite. O DNA molde para sequenciação é preparado directamente a partir destas culturas por lise alcalina (Birboim, Methods in Enzymology (1993) 100, 243-255) . A sequenciação do DNA ocorre utilizando o kit de reacção da Perkin Elmer/Applied Biosystems com reagentes de terminação marcados com corante (Kit N° 402122) e os iniciadores universais de M13 mpl8/19 ou iniciadores T3, T7, ou com iniciadores preparados pelos autores, que se ligam a sequências internas. É utilizado um protocolo de sequenciação de ciclos convencional com 20 ciclos, com um termociclador (MJ Research DNA Engine Thermocycler, Modelo 225) . As reacções de sequenciação são precipitadas com 49 ΡΕ0929681 etanol, ressuspensas em tampão de aplicação de formamida e fraccionadas e analisadas por electroforese utilizando o sequenciador de DNA automatizado da Applied Biosystems (Modelo 377) de acordo com as instruções do fabricante. Os ficheiros de sequência são produzidos com o auxílio do programa de computador Applied Biosystems DNA Analysis Software e transferidos para um computador SUN UltraSpark para análise posterior. São empregues os seguintes programas de computador (software) para analisar os resultados: o pacote de montagem e análise de DNA GAP (Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsis, R. Staden, Universidade de Cambridge, UK) e os quatro programas: Phred, Cross-match, Phrad e Consed (P. Green, Universidade de Washington, B. Ewing e D. Gordon, Universidade de Washington em Saint Louis). Após as sequências originais terem sido ligadas umas com as outras para produzir sequências coerentes mais longas (contigs), as secções de DNA em falta são sequenciadas especificamente com o auxílio de novos iniciadores (que se ligam a secções sequenciadas), ou através de sequenciação mais longa ou sequenciando a outra cadeia. É possível, com o método descrito acima, sequen-ciar toda a região de DNA cromossómico de 26 kb em tamanho de A mediterranei que é clonado em pNE112. A sequência de DNA é apresentada na SEQ ID NO 3 na secção de 27801 - 53789 pares de bases. A sequência de DNA do fragmento Κρη I de 5,7 kb no Exemplo 5 está presente em pNE112 e é apresentada na SEQ ID NO 3 na região de 43093 - 48768 pares de bases. 50 ΡΕ0929681

Exemplo 10: Identificação e caracterização de clones cosmldicos com fragmentos de DNA cromossómico de A mediterranei que se sobrepõem a uma extremidade da região de A mediterranei de 26 kb de pNE112

Para identificar os clones cosmidicos que compreendem os fragmentos de DNA cromossómico de A mediterranei localizados directamente em frente à região de 26 kb de pNE112, o plasmideo pNE112 é cortado com a enzima de restrição Bam Hl e o fragmento Bam Hl resultante de 3,2 kb em tamanho é separado dos outros fragmentos Bam Hl num gel de agarose e isolado a partir do gel. Este fragmento Bam Hl está localizado numa extremidade do DNA de A mediterranei incorporado em pNE112 (ver Exemplo 8) e pode então ser utilizado como sonda de DNA para descobrir os clones cosmidicos requeridos. Aproximadamente 0,5 pg do fragmento de DNA Bam Hl de 3,2 kb isolado é marcado radioactivamente com 32P-dCTP através do sistema de tradução de "nick" da Gibco/BRL (Basel), de acordo com as instruções do fabricante. O banco de genes em cosmideos de A mediterranei descrito no Exemplo 7 é então analisado por hibridação de colónias (Método do Exemplo 3), utilizando esta sonda de 3,2 kb para clones com sobreposições. Podem ser identificados deste modo dois clones de cosmideos com um forte sinal de hibridação e são-lhes atribuídos os números pNE95 e pRi44-2. É possivel, através de análise de restrição e transferência de Southern, confirmar que os plasmideos 51 ΡΕ0929681 pNE95 e pRi44-2 compreendem fragmentos de DNA cromossómico de A mediterranei, que se sobrepõe ao fragmento Bam Hl de 3,2 kb de pNE112 e em conjunto cobrem uma região cro-mossómica de 35 kb de A mediterranei que está directamente adjacente ao fragmento de 26 kb de A mediterranei de pNE112 clonado em pNE112.

Exemplo 11: Análise de restrição da região cromossómica de A mediterranei clonada com os clones cosmi-dicos pNE112, pNE95 e pRi44-2

A região de DNA cromossómico de A mediterranei clonada com os clones cosmidicos pNE112, pNE95 e pRi44-2 é caracterizada realizando uma análise de restrição. A digestão do DNA plasmidico os três cosmideos com as enzimas de restrição Eco RI, Bgl II e Hind III (isoladamente ou em combinação) produz uma mapa de restrição grosseiro da região clonada de A mediterranei. Os fragmentos sobrepo-níveis dos três plasmideos são, neste caso, estabelecidos e confirmados por transferência de Southern. Esta região cromossómica de A mediterranei possui um tamanho de cerca de 61 kb e é caracterizada pelos seguintes sitios de clivagem de restrição com a distância apresentada em kb a partir de uma extremidade: Eco RI na posição 7,2 kb, Hind III na posição 21 kb, Bgl II na posição 31 kb, Hind III na posição 42 kb, Bgl II na posição 47 kb e Bgl II na posição 59 kb. Nesta região no cromossoma de A mediterranei, o plasmideo pRi 44-2 cobre uma região desde a posição 1 até aproximadamente 37 kb, o plasmideo pNE95 cobre uma região de aproximadamente a posição 9 kb - 51 kb e o plasmideo pNE 52 ΡΕ0929681 112 cobre uma região de aproximadamente a posição 35 kb -61 kb.

Exemplo 12: Determinação da sequência da região de DNA cromossómico de A mediterranei descrita no Exemplo 11 desde o sitio de clivagem de Eco RI na posição 7,2 kb até à extremidade de 61 kb A determinação da sequência de DNA da região cromossómica descrita no Exemplo 11 de A mediterranei (sitio de clivagem de Eco RI na posição 7,2 kb até 51 kb) é realizada com os plasmideos pRi 44-2 e pNE95, utilizando exactamente o mesmo método como descrito no Exemplo 9. A análise da sequência de DNA obtida deste modo confirma o mapa de restrição grosseiro descrito no Exemplo 11 e as sobreposições dos fragmentos de A mediterranei clonados nos plasmideos pNE112, pNE95 e pRi44-2. A sequência de DNA da região de DNA cromossómica de A mediterranei descrita no Exemplo 11 desde o sitio de clivagem de Eco RI na posição 7,2 kb até à extremidade em 61 kb é apresentada na SEQ D NO 3 (comprimento de 537 8 9 pares de bases).

Exemplo 13: Análise de uma região codificante da primeira proteína (ORF A) da região cromossómica de A mediterranei clonada apresentada em SEQ ID NO 3

A sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID ΡΕ0929681 NO 3 é analisada com o programa de computador Codon-preference (Genetics Computer Group, Universidade de Wis-consin, 1994) . Esta análise demonstra que uma grelha de leitura aberta muito grande (ORF A) , que codifica para uma proteína está presente no primeiro terço da sequência (posição 1825 - 15543 incluindo um codão stop na SEQ ID NO 3) . Os codões utilizados na ORF A são típicos de genes de actinomicetes com um teor em G+C elevado. A comparação da sequência de aminoácidos de ORF A (SEQ ID NO 4, tamanho de 4572 aminoácidos) com outras sintases de policétido e especificamente com a sintase de policétido muito bem caracterizada de Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene da sequência de DNA/N° de acesso EMBL M63676) produz os seguintes resultados:

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 370 - 451: é 50% idêntico ao domínio da proteína veículo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 469 - 889: é 65% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 982 - 1292: é 54% idêntica ao domínio da acil-transferase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 54 ΡΕ0929681

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 1324 - 1442: é 42% idêntica ao domínio da desidratase do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 1664 - 1840: é 56% idêntica ao domínio da cetorredutase do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 1929 - 2000: é 53% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 2032 - 2453: é 64% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 2554 - 2865: é 37% idêntica ao domínio da acil-transferase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 2918 - 2991: é 54% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 3009 - 3431: é 65% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 3532 - 3847: 55 ΡΕ0929681 é 53% idêntica ao domínio da acil-transferase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 4142 - 4307: é 43% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos 4405 - 4490: é 50% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Adicionalmente a estas homologias significativas com a sintase de policétido de eryA de S. erythraea, a região da ORF, SEQ ID NO 4: aminoácidos 1 - 356 é 53% idêntico ao domínio forma de realização activação da unidade de iniciação postulado da sintase de policétido da rapamicina de Streptomyces hygroscopicus (Aparicio et al. GENE (1996) 169, 9-16).

As grandes semelhanças encontradas na sequência de aminoácidos dos domínios enzimáticos sugerem, de forma inequívoca, que a região que codifica a proteína (ORF A) da região cromossómica de A. mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 codifica para uma sintase de policétido modular típico (tipo 1). Esta sintase de policétido muito grande de A. mediterranei codificada pela ORF A compreende três módulos bioactivos completos que são, cada um, responsável pela condensação de uma unidade de C2 no anel de macrólido da molécula e pela modificação correcta dos grupos β-ceto 56 ΡΕ0929681 inicialmente formados. Devido à homologia com dominios activantes da sintase de policétido de rapamicina, o primeiro módulo descrito acima compreende muito provavelmente um dominio enzimático para activar a unidade iniciadora aromática da biossintese de rifamicina, ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico (Ghisalba et al.r Biotechnology of Industrial Antibiotics Vandamme E.J. Ed., Decker Inc. New York, (1984) 281-327).

Exemplo 14: Análise de uma região codificando uma segunda proteína (ORF B) da região cromossómica clona-da de A. mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 A sequência de nucleótidos em SEQ ID NO 3 é analisada utilizando o programa de computador Codon-preference (Genetics Computer Group, Universidade de Wis-consin, 1994). Esta análise demonstra que outra grelha de leitura aberta (ORF B) que codifica para uma proteína está presente na região média da sequência (posição 15550 30759 incluindo o codão stop na SEQ ID NO 3) . Os codões utilizados na ORF B são típicos dos genes de actinomicetes com um teor de G + C elevado. A comparação da sequência de aminoácidos de ORF B (SEQ ID NO 5, 5069 aminoácidos de comprimento) com outras sintases de policétido e especificamente com uma sintase de policétido muito bem caracterizada de Saccharopolyspora 57 ΡΕ0929681 erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene da sequência de DNA(N° de acesso da EMBL M63676) produz os seguintes resultados:

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 44 - 468: é 62% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 571 - 889: é 56% idêntica ao domínio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 921 - 1055: é 47% idêntica ao domínio da desidratase do módulo 4 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 1353 - 1525: é 49% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 1621 - 1706: é 53% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 1726 - 2148: é 62% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 58 ΡΕ0929681

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 2251 - 2560: é 55% idêntica ao dominio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 2961 - 3132: é 49% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 3228 - 3313: é 52% idêntica ao domínio da proteína de veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 3332 - 3313; é 63% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5; aminoácidos 3857 - 4173; é 52% idêntica ao domínio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 4664 - 4799: é 47% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos 4929 - 5014: é 52% idêntica ao domínio da proteína de veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 59 ΡΕ0929681

Exemplo 15: Análise da região codificando uma terceira proteína (ORF C) da região cromossómica clona-da de A, mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 A sequência de nucleótidos na SEQ ID NO 3 é analisada utilizando o programa de computador Codon-preference (Genetics Computer Group, Universidade de Wis-consin, 1994) . Esta análise demonstra que uma grelha de leitura aberta (ORF C) que codifica para uma proteína está presente na região média da sequência (posição 30895 30060 incluindo o codão stop na SEQ ID NO 3) . Os codões utilizados na ORF C são típicos dos genes de actinomicetes com um teor de G + C elevado. A comparação da sequência de aminoácidos de ORF C (SEQ ID NO 6, 1721 aminoácidos de comprimento) com outras sintases de policétido e especificamente com uma sintase de policétido muito bem caracterizada de Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene da sequência de DNA(N° de acesso da EMBL M63676) produz os seguintes resultados:

Região da ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos 1 - 414: é 63% idêntica ao domínio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos 614 - 828: é 54% idêntica ao domínio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 60 ΡΕ0929681

Região da ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos 1290 - 1399: é 49% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos 1563 - 1648: é 55% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Exemplo 16: Análise da região codificando uma guarta proteína (ORF D) da região cromossómica clonada de A. mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 A sequência de nucleótidos na SEQ ID NO 3 é analisada utilizando o programa de computador Codonpreference (Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, 1994). Esta análise demonstra que uma grelha de leitura aberta (ORF D) que codifica para uma proteína está presente na região média da sequência (posição 36259 - 41325 incluindo o codão stop na SEQ ID NO 3). Os codões utilizados na ORF D são típicos dos genes de actinomicetes com um teor de G + C elevado. A comparação da sequência de aminoácidos de ORF D (SEQ ID NO 7, 1688 aminoácidos de comprimento) com outras sintases de policétido e especificamente com uma sintase de policétido muito bem caracterizada de Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene da sequência de DNA(N° de acesso da EMBL M63676) produz os seguintes resultados: 61 ΡΕ0929681

Região da ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos 1 - 418: é 64% idêntica ao dominio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos 524 - 841: é 54% idêntica ao domínio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos 1260 - 1432: é 51% idêntica ao domínio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos 1523 - 1608: é 53% idêntica ao dominio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Exemplo 17: Análise da região codificando uma quinta proteína (ORF E) da região cromossómica clonada de A, mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 A sequência de nucleótidos na SEQ ID NO 3 é analisada utilizando o programa de computador Codon-preference (Genetics Computer Group, Universidade de Wis-consin, 1994). Esta análise demonstra que uma grelha de leitura aberta (ORF E) que codifica para uma proteína está presente na região média da sequência (posição 41373 - 51614 incluindo o codão stop na SEQ ID NO 3) . Os codões utilizados na ORF E são típicos dos genes de actinomicetes com um teor de G + C elevado. 62 ΡΕ0929681 A comparação da sequência de aminoácidos de ORF D (SEQ ID NO 8, 3413 aminoácidos de comprimento) com outras sintases de policétido e especificamente com uma sintase de policétido muito bem caracterizada de Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679, gene da sequência de DNA(N° de acesso da EMBL M63676) produz os seguintes resultados:

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 31 - 451: é 64% idêntica ao dominio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 555 - 874: é 37% idêntica ao dominio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 907 - 1036: é 49% idêntica ao dominio da desidratase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 1336 - 1500: é 52% idêntica ao dominio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 1598 - 1683: é 51% idêntica ao domínio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea. 63 ΡΕ0929681

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 1702 - 2124: é 62% idêntica ao dominio da sintase de cetoacilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 2229 - 2543: é 53% idêntica ao dominio da transferase de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 2573 - 2700: é 47% idêntica ao dominio da desidratase do módulo 4 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 3054 - 3227: é 52% idêntica ao dominio da cetorredutase do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Região da ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos 3324 - 3405: é 51% idêntica ao dominio da proteína veículo de acilo do módulo 1 do locus eryA de Saccharopolyspora erythraea.

Exemplo 18: Análise da região codificando uma sexta proteína (ORF F) da região cromossómica clonada de A, mediterranei apresentada na SEQ ID NO 3 A sequência de nucleótidos na SEQ ID NO 3 é analisada utilizando o programa de computador Codon-preference (Genetics Computer Group, Universidade de Wis-consin, 1994) . Esta análise demonstra que uma grelha de leitura aberta (ORF F) que codifica para uma proteína está 64 ΡΕ0929681 presente na região traseira da sequência (posição 51713 -52393 incluindo o codão stop na SEQ ID NO 3) . Os codões utilizados na ORF F são tipicos dos genes de actinomicetes com um teor de G + C elevado. A comparação da sequência de aminoácidos de ORF F (SEQ ID NO 9, 226 aminoácidos de comprimento) com proteínas da base de dados EMBL (Heidelberg) apresenta uma grande semelhança com a O-aciltransferase de N-hidroxilamina de Salmonella typhymurium (29% de identidade numa região de 134 aminoácidos). Também existe homologia significativa com aciltransferases de arilamina de outros organismos. Pode concluir-se a partir destes argumentos que a ORF F encontrada em A. mediterranei na SEQ ID NO 3 codifica para uma transferase de arilaminacilo e pode assumir-se que esta enzima é responsável pela ligação de uma cadeia de acilo longa produzida pela sintase de policétido ao grupo amino na molécula iniciadora, ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico. Esta reacção fecharia o sistema de anel da rifamicina correctamente após a finalização dos passos de condensação pela sintase de policétido.

Exemplo 19: Resumindo a avaliação da função das proteínas codificadas por ORF A - F na SEQ ID NO 3 e o seu papel na biossíntese da rifamicina

As cinco regiões que codificam proteínas (ORF A-E) , descritas nos Exemplos 13 - 17, da SEQ ID NO 3 com- 65 ΡΕ0929681 preendem proteínas com semelhança muito grande (na sequência de aminoácidos e o arranjo dos domínios enzimá-ticos) com sintases de policétido para policétidos do tipo macrólido. Tomadas em conjunto, estas cinco enzimas multifuncionais compreendem 10 módulos da sintase de policétido que são cada um responsável por um passo de condensação na síntese de policétidos. Esses 10 passos de condensação são igualmente necessários para a biossíntese da rifamicina (Ghisalba et al., Biotechnology of Industrial Antibiotics Vandamme E.J. Ed., Decker Inc New York, (1984) 281-327). O processamento dos grupos ceto particulares requeridos pelos domínios enzimáticos nos módulos corresponde substancialmente à actividade requerida pela molécula de rifamicina, se for assumido que a síntese de policétidos ocorrer "colinearmente" com o arranjo dos módulos no aglomerado de genes de A. mediterranei (é o que se passa para outros antibióticos macrólidos, tais como eritromicina e rapamicina). Pode ser aqui adicionado que não é certo se a transcrição das cinco ORFs resulta em cinco proteínas; em particular, a ORF C e a ORF D podem ser possivelmente traduzidas numa proteína grande.

Um domínio enzimático que é muito provavelmente responsável pela activação da molécula iniciadora, ácido 3-hidroxi-5-aminobenzóico, da biossíntese da rifamicina, pode ser encontrada no terminal N da ORF A, o início da sintase de policétido. Directamente abaixo do aglomerado de genes da sintase de policétido rifamicina está um gene (ORF F) 66 ΡΕ0929681 que muito provavelmente determina uma proteína que provoca o fecho do anel da molécula de rifamicina após a finalização dos passos de condensação pela sintase de policétido.

Pode concluir-se, com base nestas descobertas, que a região cromossómica de A. mediterranei descrita na SEQ ID NO 3 é responsável pelos 10 passos de condensação requeridos para a síntese de policétido rifamicina, incluindo a activação da molécula iniciadora ácido 3-hidroxi-5-aminobenzóico e o fecho conclusivo do anel.

Organismos depositados

Foram depositados os seguintes microrganismos e plasmídeos na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg lb, D-381244 Braunschweig, de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste.

Microrganismo/Plasmideo Data do Numero do depósito depósito E. coli com o plasmídeo pRi7-3 10.08.96 DSM 11114 E. coli com o plasmídeo pNE112 14.07.97 DSM 11657 E. coli com 0 plasmídeo pNE95 14.07.97 DSM 11656 E. coli com o plasmídeo pRi44-2 14.07.97 DSM 11655 ΡΕ0929681 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE

(A) NOME: Novartis AG (B) RUA: Schwarzwaldallee 215 (C) CIDADE: Basel (E) PAÍS: Suíça (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4058 (G) TELEFONE: +41 61 324 1111 (H) TELEFAX: +41 61 322 75 32 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Aglomerado de genes da biossíntese da rifamicina (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 9 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/ME-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) 68 ΡΕ0929681 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: osmcccaGT anxmmcG gcg3*tcg&cg ãggctsgoga gcaoctggâc ssoescpse 60 COGGCCGSGC CfâGGC^CSC GimaGSàCG rcCTGCTCGG CGÃ&ST^CCe GCCGMãCCG 120 eSCTOCTGÃÃ CCAGÃCGG1C mãOCCMG <gQH3ClQR CGCCGÍGGMÍ AGC&CGCTGT? 183 TÇCGQCfCGC CGÃATCO?GG QG7S$OG8GC CGGÃCGISSGS QCSOGãOCtC WXMOGQ&* 240 aasascacosc csosms^c íxgggcgtct tctcgctgcc gg&cqcggcc cggatcgtqg 300 OS3CGCGCGG CCGGCTGftTG CASGCGCTGG CGeCGGGOSG ÇGCGAIÍSGTC ÍSCCGlCGCCG 360 OCÍKXGMGC OCÃGGTGGCC GASCBSCTCG GCÇACGGCGff OGMCTCGCC GCCC?TCAaCG 420 SCCCTTCGGC OT®COT TCCGSQGftCG CGGACGCGG3? CSfCGQSSCC CCCGOXGCA 48Õ ^acGCGÃGCÇ CGQQCÃCMG ÃCCÃRGC&GC TCMCKÍFRK: GCÃCGOSm: O^TCCGCSC 540 âGÈSGQSGCC GÃ1CCTGGCG GÃ&HXX3COS COSftâCÍGSC CGGCGTGACG ISGCGGS&GC 500 CKOAGATCCC GSIQGTC^CC l&CGSSftOOG eCCGGTOOSC CGMOCCGGC GÃÃCTGftOCG 660 &3CQGQ3CE& CTGQQCOSfifi CACGTGCGGC GQCCGGIGCG GTTCGCCGftG GGQSTCGCGG 720 CC^GACSGA OEOGGCGGC TSGCTGTTCG TGGAGCTCGG GCCGGQSGCG GCGCfG&CÇG 780

arEOGffCSfc GQftG&OGQCC CÃG0fCftCC7 GC5G5PCGP3GC CXrTGCGGGÃC GSGCGCCCGG B4Q mmcMnGc ccm^rtuice gc^tcgcog asctgttcgt ocôcgqsgtt gcq3icgã.tt §m «Gocoscccs? gctsccgocg qscãccog^t tosksg»oc* gccsèasssc Gceratsacc seo mZMsCMTZh imsc-mms CCCOCOSCGC AGGCCBS0GG& CGOSOCCfCS ercaGC£Aí3Ç 1020 69 ΡΕ0929681 TCGCGGCCGA CCftCCCOCTC £03300(3085 TGGlCCaX? QCCQCRGTCG GísmsCCTGG 1080 irmACcrc iXGOHMprcA ^msmfcsoc ^ccgtggct gsccgaccsc gtciytoígcç imo QGGTGGaCOCT aKTCGOGGQC ACCC^GCTCG mGNSCSGBC CGTCCGGGCC GGGGACGAQG 1200 CCGGCKSCCC GG!PCCSfCQ« (3Ã&aX5GIC& TCG&SGC*CC GCTGGTCOTC CGlimCCACG 1260 SOSGQSimS! CMKXttUSGftC ^ÒSOGGSiS CfâmSâ ímCCGGmiG CGOMGSICG 1320 ÍS&G^Aere CtSfeCQOGRfí (ssceccoess CeS&»fí»2TG GSOX2SSC33C QCCaCC50SG5F 1380 sccixmEGC eaoscosresG c&xaoãríx cgi^ogíctf c&ccgcctqg ccsocgccog 1440 GOGTO3&S30G CCTCGftOCTC G&aaCTTCf AC0=ACl3GCTT CGTCGiACCGC GGSTÀQSCCT 1500 ÃCGQSCCSSC GTKX6t3G©C CTQCGGGCGG TS3SG033CS CGSOÍftCGM GTfSnOSCCG 1560 AGGTCGCCCT GXOAifcGSÃC G&XGCGCSG ACSCGGCCCS SrSCGfíC&TC CACCCCGGCC 1620 fQ2*£GGACGC CGCCCTGCAC GO3GGCATG0 CCQSTGCCM; CACCACGGM G&XC03GCC 1680 SSCSaSGíJSCT -TGGÂACGGCí: TGtfTGCTííCA CGCXaGGCGeG 005®C03CâC 1740 TGCQGGfCCO GCreGCCCOG ASOâSltlCOG ACSCCCS^Se GSTCGAQGOC OC®5&C<38Í3G 1800

GeGGOSGXCT CGTTOTtsRCG QC6GACTOGC IXSGTCTCOCG GOOG£K3TCG Í^CG&MAGC 1860 líSGQCGtGGC mZGM££AC GSCGCGTTGT lOCSGDSfSGà GrçâG&CCGSS ATT7CCTD3G 1920 C3DCGMS£G? imssoss&c CXGTCQàm IXSCTCQM.GC CGT03GOG&S GATCCCCTQ3 1980 AACTGAC-CSl 0£3GCT"CTG GSGGCCGIGC AGftCCTGGCT CGCCGACCCA tKCGÁOGACG 7040 CTCGCCPQST CGTGGOGACC CGCGQCGCOS mi%C<3AGGT GftCTG»CCCG GCCGGTGCCG 2ISÕ CGG1X21GG5G CCimTCCGG GCeGCOCASS CGGÃAAÃCCC GSMX33GATC CHGCTGCFSG 2160 70 ΡΕ0929681 ACACCGftOGiG mM.G'TC£CCÍ CmSGCCGGG IGCSSODCAC OGQOSftGOCC CMACAG0O3 2220 TCCGftGGCGG QySSC^GffC GGCCCGCG3C ItSGCCCGCGC CGÃGGCCGCG í^GGCaCCGG 2280 CÃSfGíiSXGG OSGSSOSSTC CMà&TCTOSG G0QD3QGCTC GCTGGSCGCG CaE&CCGCOC 2340 GGC^XIGGT OSCCCGGCAC QSMÍiCCGGC gC€ÍGS$3CF OSTC&GCCGC CQfGGCCCGíS 2400 ACÇCCGÍfcDSG caram CTGACCGCTG ΑΑΟΟίϊCGC fCAGOSCGCC G&GGfCÊCCG 2460 TÈOSCOCnXÍ CG&GCrt3GCC GfiCCGGGFi.CC AGGfCCÔ&Gl' AtXGCCGSCC GAGCACCGCC 2520 COMGGOOST CGTGCACÃCG GCCGGCGTTC fCGAOS&OSS CGTCVTOSm ^OJGACGC 2580 GGG&GCGGCT <$GC«yfc3$$C l^XXÇCCCA A&3TmOTGC fGaCMf€&.e CTCQffiGÃGC 2840 f&Ã03CGOGà ÃOaSkOTT OSCGCSTtFCG TCGTGFTGTC CTCCCCCTCC Gi^TCTSCG 2700 C^TCCGCOGG «asaXMC fMJGCSCfíerG CCMCCSCCtA OCTCGACGCC GTGGTCGCCA 2700 ACCGCC&3GC CGDGGÍSXCG <SCÔGC&C^ CGC1>3SCCTS GGÇCCTGTGG GMCAGRCCG 2820 ACGGGAme CGCGQiCerC GSCGACGCCG i^CMXsCGOG GSCGAG1ÍCGC GGOGGGGOCC 2880 TCGCXATCTC ACCCGCCGM GGCÁ'KK3AGC IGTfCG^CGC AGCGCCG3AC GGSC3GGSCG 2940 TCCCGG.fCM GCm^£CCG CGCMCACCC GCGCCGGOGG GACGSIXSCCG G%CCTGC7GC 3000 GCGGÍX^SG» CCGCCCGGCA OCCCAGCÂGG OXGTCCSGC GTGCAC1CTG GSOSACGG&C 3080 TGQCCGGGCG ACICGXGGCí CIGGOGCCGG CGGÃíXAGG iSGSGCTGCTS eitG&CSTOG 3120 UCCGCÃCGCâ GSSCGQQCSG GTGCTCGGGC ACGCCGGGCC GQfíGGCCCTC CGGGCGGACA 3180 CGSCGTFCAA GG&CACCGGC miGâOTCGC IGACGl^GG^ fíG4ÂCTGCQe MCCGX1CC 3240 71 ΡΕ0929681 osoMsscKÍMt caxcc®x& cecseesOTr osacsrscoos ;Sfô5s®» oGcmcrcs Ksmxsmcm «p«s mmmsm mcmzmm tâsmstxk mmmm· mzmmmx· «»aa. mo»® ammixxes swcsscf^ <mmmm cmmmmc mmmm mmmm mmmmm wmmm oscmsmm ommcmm wmmmk mmmmc mmm<x& Mcsctccos c^ssMems ícci^xssc, ««5«. criMSMt iccxoscíks mmMmm: mmmxm mmmm mzmxm» mMmmmi mmmmm ymsmmos mommm. mmmccm ommcmm mxàcsssso mm^acm mmmmk wmmm mcssMc& esscsxsm; ssm ·< aMmmwA ®scmi wmsmmM: e» «« mscscmm mammm

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TtssccGGTCA ggcgcgtcgg crasoc&csf Tccimscm cg^gcccctt masesscG 4βοο CCGGTíXG·^ G&ffi&GCCGC QCCCl^GTrCG GCGA^SCGC O&J^fGGKÍ SCSSATfCGG 4860 acc^ams:: coíxgodsct cm^GDQCAC Tsxcecces cgaagacsx ecosocass 4520 TCXXXOS G3TGCCCGCG TOCSSOCT3C CGGGCAÃGC7 OSTOTSGGír® TTCCCCGOX 4980

Mms&CGCà <3fSG835SGQC SJSSGCCGQS WOCCTO» M^STCTCCG «RSHCGCCG 5040 AQCG^TCGC OsfiíãSGTGCG GQCGCGCTGG AGCCGXGM1 CSSQCTGGfCG CXrmXftCa 5100 TCCTOXTGO C®CGGK5AC CfCG&KGGG XGR-PGTGCT OCaSOOOGCS TGCTJTGCGG 5160 TGSRSSICeG CTTGGCOSGe GTCTQGTCXT CÍ3SaG0SSST GGTCCCCGM' QEGBBBCTOS 5220 OCCACTCCCh GG5TGAGATC GCOSCÍSGCGT GCGICTQGGG I^GCCTTG^CG CTGía&SATG 5280 CQXGMtXr GSmoCCTG CGCAGCXmS COffiC^DSC G&AGCrCFOC GGCCGOGGCG 5340 qg^gocttc mucmcns qgcgaagcog «reissieic gcggctggog gacggggscg 5400 âiessQQcasc assaaoesr crnscercos feeiQflosc ggsgoksgcc <asecccrcs 5460 73 ΡΕ0929681 5520 5580 5840 5878

MGAMCGCT efò&âC&CfG fCCGGTGGGG GAMCCOGSC TCGGCGGGfG GCÇGTGG&CT ACGCCfCSCA CAOX.GGCAC GTCGMG&CÃ 1CSÃM1ACAC CCTCGCCGÃA SOQCTOGCGG íiiSMeSãCCC CCGGQCQCCG C35SGEQXS® fCCKSCCÃC CCimCCGGC GftSTSGATCC CSTCGTGGAC SGCGGCÍA^ GSTACC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1891 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Tyr Fm Vai 3S» A1& Thr Ala Fh» &sp filu Ma Cys Ghx <*Ut Leu &sp 1 5 10 15

Vai Cys Leu Ma GLy Mg Ma Gly 8i» Arg Vai Arg Asp Vai Vai Leu 20 25 3δ

Sly Glu Vai Pr© Ma Glu Thr Gly Leu L®u Asa Gla Thr Vai Phs Thr 35 40 45

Gin Ma Gly Leu Phe Ma Vai Glu Ser Ma Leu Pi» Arg Leu Ma Glu 50 SS 60

Ser Trp Gly vai Arg Pro Asp Vai Vai Leu Gly Bis Ser 2le Gly Glu €5 70 75 80 74 ΡΕ0929681

Ile Thr Ma Ala Tyr Ala Ala Gly Vai Phe Ser Leu Pr© Asp Ala Ala ÔS 30 3S

Arg Ile Vai Ala Ala Arg Gly Arg Leu Met Gin Ala Man Ala Pr© Gly 100 10S 110

Gly Ala Met Vai Ala Vai. Ala Ala Ser Glu Ma Glu Vai Ala Glu Leu 115 120 125

Lm Gly As$> Gly Vai Glu. Leu Ala Ma Vai Μή Gly p*o Ser Ala vai 130 135 140 Vâl Leu Ser Gly Asp Ala Asp Ala Vai Vâl Ala Ml Ala Ala .Arg Mefe 145 150 155 150

Arg Glu Arg Gly Hl® Lys The Lys Gin Leu Lys Vai Ser Bis .Ala ihe 1C5 170 175

Sis Ser Ala Arg Met Ala ire itefc Leu Ma Glu She Ala Ala Glu Le& ISO 185 130

Ala Gly Vai Shr frn Arg Glu iro Glu Xle Pr© Vai Vai Ser Mn Vai 135 200 205

Thr Gly Arg Eh» Ala Glu Pro Gly Glu Leu Thr Glu Pr© Gly Tyr Trp 210 SIS 220

Mi Glu His Vai Arg Arg Pro Vai Mg Phe Ma Glu Gly Vai Ala Ma 235 230 235 240

Ala Thr Glu Ser Gly Gly Ser Leu Fbe Vâl Glu Leu Gly iro Gly Ma 245 250 253

Ala Leu. Thr Ma Leu Vai Glu Glu. Thr Ala Glu Vai Thr Çys Vai Ala 260 235 270 75 ΡΕ0929681

Ala teu Arg tep Asp Mg Pro Glu Vai TM Ma teu Ile fhr Ala Vai 21% 200 285

Ha Ç&a tem Phe Vai Mg Gly V»1 Ma Vai Asp Trp Peo Ala Leu teu 230 2.95 300 Ρϊο Pro Vai Shr Gly Ffe* Vai Asp teu Pro Ly» Tyr Ala pte Asp Gin 305 310 315 320

Gin Sis Tyr Trp teu Gin Pro Ma. Ala Gin Ma Thr Mp Ala Ala Ser 325 330 335 teu Gly Gin Vai Ma Ma Asp lis Pm teu Leu ôly Ma Vai Vai Arg 340 34S 350 teu Pro Glu Ser Ásp Gly teu Vai Pte Thr Ser Arf teu Ser teu tys 355 360 365

Ser Bis Pro Trp teu Ma Asp- sis Vai Xle Gly Gly Vai Vai te» vai 370 375 MÔ

Ma Gly $hr Gly teu Vai Glu teu Ala Vai Arg Ma Gly Asp Glut Ala 305 390 395 400

Gly Cys Pro Vai teu Glu ,Glu teu Vai lie Glu Ma Pro teu vai Vai 405 410 415

Pro Mp Bis Gly Gly Vai Arg He Gla vai ;Val Vai Gly Ala Pro Gly 420 425 430

Glu Thr Gly Ser Mg Ma Vai Glu Vai Tyr ter teu Arg Glu Asp Ala 435 440 445

Gly Ma Glu Vai Trp Ala Ãxg Bis Ma Thr Gly Phe teu Ma Ma Thr 459 455 460

Pro Ser Gin Hís Lys Pro Phe Asp Pbe Thr Ale Trp Pr© Pro Pro Gly 76 ΡΕ0929681 465 470 480

Vai Qlu Arf Vai Asp Vai Qlvt Jtôp Fhe Tyr Asp Gly FAe Vai Asp Arg 485 49Q 4f5

Gly Tyr Ma Tyr Gly Fm Ser Fhs Arg Gly Leu Rrg Ma Vai Trp Arg 500 505 510

Arg Gly Asp Glu Vai Mie Ma Glu Vai Ala Leu Ma Glu Ásp Asp Arg SIS 520 525

Ais Asp ili Ala Arg Fhe Gly Xle Ris Fr© eiy la» ta» Asp Ala Ala 530 535 540

Leu Hls Ala Gly Met Alá Gly Alá TM Thr TM Glu Glu Fro Gly Arg 545 555 555 56Ô

Pr© Vai Lee í*ró Fhe Ãlã TTp fea Gly Leu Vâl Leu Sis Ala Ala Gly 565 570 575

Ala ser Ala Leu Arg Vai Arg Leu Ala Fr© Ser Gly aro Asp Ma Leu 580 585 500

Ser Vai Glu Ala Ala Asp Glu Ala Gly Gly Leu Vai Vál TM Ma Asp 595 500 805

Ser Leu Vai Ser Arg Pr© v&X ser Ala Gly Gin Lei Gly Ala Ala, Ala, €10 615 620 itóm ílis Asp Ala Lee Phe Arg Vai Glu Trp Thr Glu Ile Ser Ser Ala 625 630 635 €40

Gly Asp Vai Pro Ala ASp Ui& Vai Gla Vai 'Leu Glu Ma Vai Gly Gly S4S 650 655

Asp Fr© Leu Glu Leu Thr Gly Arg Vai Leu Glu Ma Vai Gin Thr Lrp 660 6Ê5 670 77 ΡΕ0929681

leu Má Asp Ma Ala Asp Ãáp Ma Arg Lee Vai Vai Vai T&r Ãrg Gly S7ã 6S0 68S

Ala Vai His G&u Vai 5hr Asp Pm Ma 61y Ala. Ma Vai Ττρ Gly Leu 690 69S 700 11a Ãrg Ma Ma Mã Ma Ma Asa Fro Asp Arg 11a Vai Leu Leu Asp 705 710 715 720 fia: Asp Gly Giu Vai Aro Lao Gly Ãrg Vai Lesa Ma Shr Gly Glu Pr© 725 730 735

Gin Thr Ala Vai. Ârg Gly Ma Thr leu Fhe Ma Fro Arg Leu Ma Arg 740 745 750

Ma Glu Ma Ma alo Ma Pro Ma Vai Thr Gly Gly Thr Vai Leu Ile 755 760 765

Ser Gly Ma Gly Ser L*u aiy Ma Leu Thr Ma Arg His Leu vai Ma 770 775 780

Arg His Gly Vai Arg Arg Leu Vai Lm Vai Ser &rg Arg Gly Pro Aap 785 7SG 795 800

Ma Asp Gly Hei Ma Glu Leu Thr Ma Glu Leu Lie Ala Gia Gly Ma SQ5 810 815 <SL» Vai Ala Vai Vai Ala Cya Aap Leu Ma Asp Arg Asu Gin Vai Arg 82 D 825 830

Vai, leu Lea Ala Glu His Ajçg Fro Aan Ale Vai Vai Hi$ Thr Ala Gly 835 840 845

Vai Leu Aap Asp Gly Vai Phe Glu Ser Leu fisr Arg Glu Arg? Leu Ala

650 85S 860 78 ΡΕ0929681

Xys Vâl Phe Ma Fro Lys Vai Thr Ma Ala ÀS» His Leu Asp «la L*tt 86.5 870 87S 8B0

Tte Mg Glu Leu Asp Mu Arg Ala Phe Vai ¥&1 Phe Ser Ser Ma Ser 885 890 895

Gly Vâl Phe Gly Ser Ala Gly Gin Gly As» Tyr Mt Ma Ma &sn Ma. 900 905 910

Tyr Lô» Asp Ala Vai Vai Ala A*a Arg Arg Ala Ala Gly Im 'Pre Gly 915 920 925

Thr S®r Mn Ala Trp Gly Mu Trp Glw Gin Tfcr Asp Gly Met Thr Ma 930 935 940

His L®a Gly Ãsp Ma Asp Gin Ala Arg Ala. Ser Arg Gly Gly vai M» 945 950 955 960

Ma He ser Pro Ma Gin Gly M©t Gin Mu Phe Asp Ala Ala Píe Asse 965 970 975

Gly Leu Vai Vai Pro ¥al Lys Leu Mp Mu Arg Lys Thr Arg Ma Gly 980 §85 990

Gly ϊδιχ Vai Pro Sis Leu' Leu Arg Gly hm Vai Arg Pr» Gly Mg Gin 995 1000 1005

Gin Ala Mg Pr» Ala Ser T&x Vai Asp Mn Gly Lea Ala Gly Mg Leu 1010 1015 1030

Ma Gly Leu Mi Pro Ma. Slu Gin Glu Ala Lsu Leu Mu Asp Vai Vai 1025 1030 1035 1040

Arg Tte Gin Vai Ala Leu Vai Mu Gly Bi* Ala Gly Pro Gin Ma Vai 1045 1050 1055

Arg Ma Ase Thr Ma Pliá x»ye Asp Tte Gly f.he Asp Ser Le« Tte Ser 79 ΡΕ0929681 leso mm 1070 V&1 Glu &eu Arg Mo Arg Leu &eg Sl» Ma ser Gly Leu Lys L*u Bro 1075 1080 1085

Ma Thr Jmu Vai Phe Mje Tyr Pro fia: Pro Vai Ala Leu Ma Arg Tyr 1080 1095 1100

Leu Arg Asp Clu Phe Gly Mp ffer Vai Ma Thr rhr pro Vai Ma Thr 1105 mo 1115 1120

Ala Ma Ma Ma Mp Ma Gly Glu Pro Xle Ma Me Vai Gly Met Ma 1125 llâO 1135

Cys &rg Leu Pro Gly Gly Vai Tsr Asp Pro Glu Gly Leu Trp &rg Leu 1140 1145 1150

Vai Arg Mp Gly Loa Glu Gly Leu Ser Pro Pbe Pro Glu Mp Arg Gly 1155 1168 1165 txp Mp Leu Glu Asm Leu Phe Mp Asp Mp Pro Mp Arg Ser Gly a&r 1170 1175 1180

Thr Tyr Thr Ser Arg Gly Gly Phe teu Mp Gly Ma Gly Leu Phe Asp 1185 lim 1155 1200

Ala Gly Ffee Phs Gly lie sor Pro Arg Glu Ma Leu Ala itet Mp Pro 1205 1210 1215

Glu Glu Arg Leu Leu Leu Glu Ala Ma Trp Gla Ala Leu Glu Gly Thr· .ma 1225 1230

Gly Vai Mp Pro Gly Ser Leu Lys Gly Ma Mp Vai Gly Vai Phe Ala 1235 1240 1245

Gly Vai Ser Má Glá GLy Tyr Gly Hat Gly Má Mp Pro M© Glu Leu 1258 1255 1260 80 ΡΕ0929681

Ms Gly fyr Ma Ser Tfcr Ma Gly Ma Ser Ser vai ¥al Ser Gly Arg 1265 2270 127$ 1280 V&X Ser Tyr Vtá Phe Gly Phe Glu Gly Frõ Ala VAI Thr lie Asp fhr 1285 1290 1295

Ala Çys Ser Ser Ser Lee Vai Ala Mei Eis Leu Ma Gly Glu Ma Leu 1300 .1305 1310

Arg Gin Gly Glu Cys Ser Mefe Ala Leu Ma Gly Gly Vai Thr Vai Met 1325 2320 1325

Gly Thr Pro Gly Thr Pfe Vai Glu Lhe Ma Lys Gin Arg Gly' Leu Ma 1330 1335 1340

Gly Asp Gly Arg Cys Lys Ma Tyr Ala Glu Gly M.a Mp Gly TM Gly 1345 135© 1355 136©

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Arg Glu Arg Gly Eis Mg Vai Leu Ma Vai Leu Mg Gly Ser Ma Vai 136© 2385 1350

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Tyz Trp Tvr ISSO (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53789 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GAftTTCCÃGG CCGTCGACGG CTSCGACATC CCGGTCnSC GSTOGTCGCA CCGCA03A&S 60 MVQCCGMT A&GM-rTTCC GGÃTCTCCCÃ CGGGfeMGGT TKCATGACC GACGCAATAT 120

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Ket Phs Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Arf Pro Lys Gly Vai Vai Ser 1 5 20 15

Thr eln Arg Asa Cys Leu Trp ser ¥al Ala Ser Cys Tyr Vai Pr© Phs 20 25 30

Pr© 61y Leu Ser Asp Gin Asp Arg Vai Leu Trp Pr© Lev £*©· Leu Pha 35 40 45

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Ser Leu Arg II© Gly Lm? Me Gly Gly Ma Vai Leu Gly Ma Gly Leu Π5 no 128

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Ser 61 u Glu Asp Alt Vai Ala Arg Leu Thr Fro frp Ala Mn Arg Vai 3665 3670 3675 3600 <31« Vsl Ala Ma Vai Mn Bar Fre Bar Ser Vai Vfcl lie Ma Gly Asp 3695 3699 3695

Ala Gin Ala leu Asp Gi» Ma Seu 61« Ala Imi Ma Gly Asp Gly Vai 3700 3705 3710

Arg Vai Arg Arg Vai Ala Vai Mp Tyr Ma Ser His Shr Acg 8ÍS Vâl 3715 3720 3725 61a Ala Ile Ala 61% Thr Leu Ala Lys 3fcr Mu Ala Gly Ile Asp Ma 3730 3735 3740

Arg Vei Fro Ma XI* Fro Fhe 7yr Ser Tfer Vai Leu Gly Fhr Frp Ile 3745 3750 3755 3760

Glu Gin Ala Vai Vai Asp Ala Gly 7¾¾1 Trp Tyr Arg Asn Leu Arg Gin 3765 3770 3775

Gin Vai Mg FM Gly Fre Ser Vai Ala Asp leu Ala Gly Leu Gly His 3390 3785 3790 ISxt Vai Phs Vai Slu II* Ser Ma lis F*o Vâl Leu Vai Gin Fro Leu 3795 3800 3805 ser 61« Ile Ser Asp Asp Ala Vai Vai shr Gly Ber Leu Arg Arg Asp 3810 3815 3820 152 ΡΕ0929681

Asp 6iy «ly Leu Arg Arg te» Le» Ma Ser Ala Ma 61» Xe» Tyr Vai 3825 3830 3835 3840

Arg Gly Vai Ala Vai Asp Trp Tfrr Ala Ala Vai Fr© Ma Ala Gly Trp 384S 3850 3855

Vai Asp Lsu Pr© Thr Tyr Ala Pfe© Asp Mg Arg Sis Fhs Trp Leu His 3860 3805 3810 <Ela Ma Glu Thr Sis Gl« Ala Ala Gla Gly Msfc Asp Gly Glu Phe Trp 3875 3880 3885

Thr Ma Ile Glu Gin Sar Asp Vai Asp Ser hm Ma Gl» tem Leu GLu 3830 3885 3900 te» Vai Fr© Glw 61» Arg Gly Ma Leu Ser Tfer Vai Vai Pr© Vai Leu 3905 3910 3S15 39.20

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Arg Tyr 61» Vai *hr Trp Gin sxo teu Glu Mg 61» Ma Ma 6Xy Vai 3940 3945 3950

Pr© Gly Gly Arg Trp %m Ala Vai Vãl Pr© Ma Gly Thr Thr Asp Ma 3955 .3960 3 955

Leu Leu Lys eic Lee Thr G.iy Gin Gly t*tt Asp Ile Vsl Arg Leu 61» 3970 3975 3380 lie Sltt 61» Ala Ser Arg Ala Gin im Ma 61» 6in Leu Mg Mn Vai 3985 3990 3995 4000 teu Ma Glu Sis Âsp Leu Thr Gly Vai Leu Ser Leu hm Ma Leu Asp 4005 4010 4015

Gly Gly Pr© Ma Asp Ma Ma Glu tle Thr Ma Ser Thr leu A1.& Leu 153 ΡΕ0929681 4020 4023 4030

Vai Gin M* .Leu Gly Asp Tfer TM TM Ser Ma Pro Leu Trp Cys Leu 4035 4040 4045

Thr Ser Gly Ma Vai Asn Ile Giy Ik Gin Asp Ma Vai TM Ma Pm 4050 4055 40ê0

Ma Gin Ma Ma Vai Trp Giy Leu Gly Arg Ma Vai Ma Leu GIu Arg 4065 4070 4075 4080

Leu Asp Arg Trp Gly Gly Leu Vai Asp Leu Pro Ala Ma Ile Aáp Ala 4085 4080 4095

Arg Thr Ma Gin Ma Leu Leu Gly Vhl Leu Ae» Gly Ma Ma Gly Glu 4100 4105 4110 Ãsp Gin Leu Ala Vai Arg Arg Ser Gly Vai Tyx mg Arg Arg Leu Vai 4115 4120 4125

Arg Lys Pxo Vai. Pro Glu Ser Ma Thr fier Arg Trp Glw Pro Arg Gly 4130 4135 4140

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Vai Trp Leu Ma Gin Ser Gly Ala Gin Arg Leu lie Vai Thr Gly Thr 41S5 4110 4115

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Ala Asp Ser Glu Vai Thr Ma v&l vai Hl* Ma Ma Aap lie Ma Gin 4220 4210 4215 154 ΡΕ0929681

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Ala Ala Lya vai 3&r Thr Ala Vai frp Leu Asp Gin Leu Phe Giu Asp 4245 4250 4255

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Leu Ala Asp Ser Leu Arg Ala Vai Pr© Asp Ala Glu Gla Asn Arg 11« 4405 4410 4415 155 ΡΕ0929681 feu Leu Lys Le&a Vàl Arg Gly lis Mi. Ser for \%I Leu Gly Sis Ser 442® 4428 4430

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Ser Gly Leu Vai ©In Mg Ala Leu Gly GM flír Ser 4548 4576 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5069 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ΡΕ0929681 156 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Met Ma Mn Gin Ser Arg Lys Asn. Met Ser Me Pro Asn Mu 61a 1 S 10 15 II® val Mn Me Leu Mg Me Ser Lee Lys Glu Mn Vai Arg Leu Gla 20 25 30 Gin Slu Mn Ser Ma Lee Me Ma Ala Ala. Ma Slu Aro Vai Ma Ile 35 40 45 Vai Ser Msfc Ale Cys Arg Tyr Sla Gly Gly Ile Arg Gly Fro Slu &sp 50 55 ¢0 Phe Trp Mg Vãl Vel Ser Glu Gly Ala Asp Vai fyr Thr Gly Pba J?ro 55 70 75 80

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Leu Glu Arg Ala Gly lie Asp Bro Bis ser vai Arg Gly Ser Asp II® 145 ISO 155 160 155 157 ΡΕ0929681

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Gly Vai Ala Ser Gly Arg Vai Ala Tyr Shr Leu Gly Leu Gltt Gly £»0 135 300 205

Ala yal ifcx Vai Asp Thx Met Çys Ser Ser Ser leu Vai Ala Ile Bis 210 215 220

Laus Ala Mâ Gin Ala Lao Arg Jfcrç Gly Glu Cy» Ser Hat Ma L«u Ala 225 230 2:35 240

Gly Gly Ser Thr Vai .Hat Ms ®har Pxxt Gly Gly She Vai Gly Fha Ala 245 250 255

Jteg Gin Arg Ma Lea Ma Phe Asp Gly Arg Çys ly» Ser 3yr Ala Ala 280 2S5 270

Ala Ma tóp: Gly Ser Gly Irp Ma Glu Gly Vai Gly Vai Leu I,ea Jjeu 375- 280 285

Glu Arg La.«. Sex Vai Ala Arg Glu Arg Gly ais Gin Vai leu Ala Vai 290 295 300

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Vai Lys Ser Vai Vai Gly Sis fc Gin Ma Ma S&z Gly Vai Ala Giy 385 330 305 400 VM lis iys Hat Vãl. Gin Ser Leu Arg lis Giy Gin Leu Fro Ala Hir 405 410 415

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Arg Arg Gly Gly Jle Ser Ser Phe Gly Ala Ser Gly T&r Mo Ma His 450 455 400

Het li© lesa Gin Gin Ala Pro Gin Asp Gin Fro Vai Thr du Ãla Fro 465 470 475 480

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Gin Arg Ma Vai Vai Vai Ala Gly Ser His G.lu Glu Ma Vai ®tsr Giy 530 S3S 540 leu Arg Me Leu Ma Arg Gly Glu Ser Ma Fro Gly Leu Leu Ser Gly 159 ΡΕ0929681 545 SSO 553 560

Arg Oiy Ser Gly Vai Pro Gly Lya Vai Vai Trp Vai Phe Pr® Gly Sln

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Vai Asp ©et» Ser La» Asp Vai Leu Arg Gly Glu Ale Aep Leu Leu ¢10 615 620

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Leu Ala Ma Vai Tsp Ala Ser Leu Gly Vai GI« Rro Glu Ala vai Vâl $45 65Õ 655

Gly fíls Ser Gi» Gly 61« Π® Ma Ala Ala Cys Vai Ser Gly Ala Leu 660: §65 670

Ser Leu Glu Asp Ala Ma Lys Vfel Vai Ala Leu Arg Ser Oln Ala Ha 675 600 SS5

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Leu Ala Gly Gly Vai Ala Vai Ktet Gly Ser Fr© He Gly Vai lie Gly 1935 1925 1930 166 ΡΕ0929681

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Gly Leu Tbx Ma Lee Ala &rg Gly Glu Ser Ala Ser Gly Lao Vai Thr 222$ 2230 2235 2240

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Leu Glu Mg» Ma Ma Lys vai Vai Ma Lôu Mg Ser Gin Ma Ila Ma 2355 2360 2365

Ma Gle Leu Ser Gly Arg Gly Gly Met. Ala Sar Ile Glu Leu Ser sis 2370 2375 2380

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Gly Vai Mg Mp Leu Vai Gin Leu Ala Fhe Gly Mp Glu 5060 5965 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 182 ΡΕ0929681 (A) COMPRIMENTO: 1721 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Mb* Ala Cys Arg Leu Pro Gly Gly Vai Thr Gly Pt© Gly Asp Leu Trp 15 10 15

Mq Leu Vai Ala Glu Gly Gly Asp Ala Vai Ser Gly Phe Lro Thr Asp 20 25 30

Arg Cys Asp Las Asp Thr Leu Asp Sr© Asp Aro Asp Mis Ala 35 40 45

Gly Thr Ser Tyr fhr Asp Gin Gly Giy Phe Leu ai» Asp Ala Ala Leu 50 55 60

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Gly Arg Vai Ser Tyr Vai P.he Gly P&e ela Gly Pr© Ma Vai Thr He 145 150 155 150

Aap Tísr ala Cys ser Ser Ser Seu Vai Ma Hat ais Leu Ma Ma Gin 165 HO 1.75

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Me* Vai Leu Ma βία Gly 21® Ster Vâl Vai Vai Lee Gla Mg Leu Ser 225 230 235 240

Vai. Ma Arg Glu Mg Gly Sis Arg Vai Leu Ma Vai Leu Arg Gly Ser 245 250 255

Ma Vai Ass Glo Asp Gly Ma Ser Asn Gly Leu Thr Ma Pr© Asn Gly 260 265 270

Fr© Ser Gls Glu Arg Vai He Arg Ala Ala Leu Ma Âsrs Ma Gly He 275 280 255

Gly Fr© Ser Aep Vai Asp Leu Vai Glu Ma Bis Gly TM Gly Thr Ser 2SQ 285 300

Leu Gly Mp Fr© 11$ Glu Alt Gla Ala Leu leu Ma Thr Tyr Gly Glo 303 310 313 320

Asp Arg Glu Tfcr Fr© Leu Trp Leu Gly Ser Leu Lys Ser tón He Gly 330 335 325 184 ΡΕ0929681

His Thr ®Ln Ais Ma Ala Gly Vai Ala Seat Vai 11« tya VAl Vai ela · 340 345 350

Xk Leu Arg Bis Gly Vai Met Pr© Pr© fhr Leu Eis Vai Asp Glu Frõ 355 360 365

Bar Bar Gin Vai Asp Trp Ser Glu Gly Ma Vai Glu Leu Leu Thr Gly 370 375 380

Ser Arg Asp Trp Pr© Arg Gly Mp Arg Pr© Arg Mg Ma Gly Vai Ser 385 350 335 4SÓ

Ser Phe Gly Vai Sar Gly Thr Vai His Leu 11« Ile Glu Glu Ma 405 *10 415

Pr© Glu ela ?ro Ala Ala, Ala. Vai p*» Thr Ser Ma Asp vsal vai Fr© 420 425 430

Leu Val vai. Ser Ala Arg Ser Thr Gly Ser Leu Ma Gly Gin Ma ásp 435 440 445

Arg Leu Thr Glu Val A»p Val. Fr© Leu Gly Ei® L«u Ma Gly Ala. Leu 450 455 460

Vai Ma Gly Arg Ma Val Leu Glu Glu &rg Ala Val Val val Ma Gly 465 470 473 480

Ser Ma Glu Glu Ala Arg Ma Gly Leu Gly Ala Leu Ala Arg Gly Gin 485 490 495

Ala Ala iro Gly val Val Thr Gly Thr Ala Gly Lys firo Gly Lys Vai SOO 505 510

Val Trp Vai Phe fir» Gly Gin Gly Thr Gin Trp Val Gly Mefc Gly Arg

SIS 520 525 185 ΡΕ0929681

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Ala Ala Ma Leu Asp Gin Trp Tfor Asp Irp Ser Leu Leu Asp Vai Leu 545 550 555 550

Arg Gly Asp Gly Asp Leu Asp Ser Vai Glu Vai Leu Gin Pro Ma Cys 565 570 575

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Leu Arg ser Gin Ma lie Ma Ma Arg Leu Ser Gly Arg Gly Gly Met SIS 630 635 640

Ma Ser Vai Ma Leu Ser Glu Asp Glu Ma Asn Ala Arg Leu Giy Leu 645 650 655

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Vai Ile Ala Gly Asp Ala Gin Ala Leu Asp Glu Ala Leu Glu Vai Leu 675 680 6ÊS

Ala Gly Asp Glv Vai Arg Vai Arg Gin Vai Ala VM Mp Tyr Ala Ser 690 685 700

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Ma Gly He Shr Ala Gin Ala vro Asp vai Sr© Phe Arg ser ®hr Vai 186 ΡΕ0929681 725 73Ô 735

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Tyr Arg Mn Leu HJCg Aon Oln Vai Arg Fhà Gly fseo Ma VAX Ala Gl« 755 760 755 l^t> Ljêís eiu Gin Gly His Sly Vai- Fh® VAX- GX» Vai Ser Ma Eis Faro 770 775 790

Vai Leu. Vai Gin Pr» Ile Ssr Gin Leu Sbc Asp Ma Vai Vai Tfcr Gly

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Lm Arg Lys Lm Vai 3410 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 226 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples ΡΕ0929681 218 (ϋ) (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Met. Ma lie Pro Tyr Ser Ssr Leu Ala Tyr Sk Leu Arg Asp Ma Vai 1 S m 15

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Lisboa 17 de Novembro de 2006

Claims (17)

1 ΡΕ0929681 REIVINDICAÇÕES 1. DNA isolado que é (i) o aglomerado isolado responsável pela biossintese de rifamicina em Amycolatopsis mediterranei, compreendendo SEQ ID NO: 3, ou (ii) uma porção de DNA de (i) que codifica para uma sintase de policétido ou um seu domínio enzima-ticamente activo, ou (iii) uma porção de SEQ ID NO: 3 compreendendo pelo menos 15 nucleótidos consecutivos desta e que pode ser utilizada como sonda de hibridação num banco de genes genómico de um organismo de produção de rifamicina para encontrar constituintes do aglomerado de genes correspondente, ou (iv) um DNA possuindo pelo menos 70% de identidade com o DNA de (ii) e que codifica para um polipéptido possuindo a mesma actividade de sintase de policétido que a codificada pelo DNA de (ii).

2. DNA isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido DNA (i) compreende uma sequência de nucleótidos seleccio-nada do grupo consistindo em ORF A consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 1825 até 15543 2 ΡΕ0929681 ORF B consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 15550 até 30759, ORF C consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 30895 até 36060, ORF D consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 36359 até 41325, ORF E consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 41373 até 51614, ORF F consistindo num fragmento da SEQ ID NO:3 começando no nucleótido nas posições 51713 até 52393; ou, (ii) codifica uma ou mais das proteínas ou polipéptidos das SEQ ID NOS 4 a 9.

3. Método para identificar, isolar e clonar um DNA isolado da reivindicação 1, de um organismo que sintetiza rifamicina, compreendendo o referido método os seguintes passos: construir um banco de genes genómico do referido organismo que sintetiza rifamicina; rastrear este banco de genes com o auxílio do DNA da reivindicação 1; isolar os clones identificados como positivos. 3 ΡΕ0929681

4. Utilização do DNA da reivindicação 1 na produção de ansamicinas ou seus percursores; incluindo aqueles em que a ponte alifática é ligada apenas numa extremidade do núcleo aromático.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a referida ansamicina é rifamicina.

6. Utilização do DNA da reivindicação 1 para inactivar ou modificar genes da biossintese da ansamicina.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a referida ansamicina é rifamicina.

8. Utilização do DNA da reivindicação 1 para construir estirpes de actinomicetes mutadas das quais o aglomerado de genes da biossintese da rifamicina ou ansamicina natural, no cromossoma, foi parcialmente ou completamente removida.

9. Utilização do DNA da reivindicação 1 para reunir uma biblioteca de sintases de policétido.

10. Sintase de policétido de Amycolatopsis medi-terranei que está envolvida na sintese da rifamicina, ou um seu dominio enzimaticamente activo, em que a referida sintase de policétido é codificada por um DNA da reivindicação 1. 4 ΡΕ0929681

11. Utilização da sintase de policétido de acordo com a reivindicação 10, para sintetizar ansamicinas.

12. Utilização da reivindicação 11, para sintetizar uma biblioteca de ansamicinas.

13. Vector hibrido compreendendo o DNA da reivindicação 1.

14. Vector hibrido compreendendo um vector de expressão compreendendo o DNA da reivindicação 1.

15. Organismo hospedeiro compreendendo o vector hibrido da reivindicação 14.

16. Sonda de hibridação compreendendo o DNA da reivindicação 1.

17. Utilização da sonda de hibridação de acordo com a reivindicação 16 para identificar fragmentos de DNA envolvidos na biossintese de ansamicinas. Lisboa, 17 de Novembro de 2006