JP2002537833A - マイトマイシン生合成遺伝子クラスター - Google Patents

マイトマイシン生合成遺伝子クラスター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、マイトマイシン生合成遺伝子クラスター、ならびに生合成を変更するためにクラスター内で1またはそれ以上の遺伝子を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 ストレプトマイセス（Streptomyces）は、70モル％より大きいG＋Cヌクレオチ
ド塩基組成を有するフィラメント状グラム陽性土壌細菌である（Stackebrandtお
よびWoese、1981）。それらは、商業的に重要な天然産物の代謝物質の2／3以上
を包含する、広範な種類の生物学的に活性な化合物を産生する（Alderson他、19
93；Bevax、1998）。過去15年にわたって蓄積された遺伝情報は、天然産物のア
センブリーの酵素をコードする遺伝子がストレプトマイセス（Streptomyces）ゲ
ノム上にクラスターすることを証明した（Martin、1992）。
【０００２】 さらに、1またはそれ以上の経路特異的転写調節遺伝子、および少なくとも1つ
の耐性遺伝子は典型的には抗生物質生合成遺伝子クラスター内に見出される（Ch
ater、1992）。高度に保存された生合成酵素アミノ酸配列をベースとする遺伝子
プローブとの異種ハイブリダイズは、抗生物質生合成遺伝子をクローニングする
ために有効であった（Hopwood、1997；SenoおよびBaltz、1989；TurgayおよびMa
rahiel、1994）。
【０００３】 マイトマイシンは、種々の官能基、例えば、アミノベンゾキノンおよびアジリ
ジン環系を含有する天然産物の1グループである。このファミリーの1つの代表、
マイトマイシンC（MC）は、最初に認識された生物還元性アルキル化因子である
。特に、1960年代におけるその発見および抗癌活性の証明以来、MCの化学および
生物学の多数の面は研究されてきている。これはその先例のない分子メカニズム
、独特な生物学的および薬理学的特性、薬剤耐性、および生物活性アナローグに
関する詳細な情報を提供した（Hata他、1956；Verwij、1977）。MCは、その活性
が還元性アクチベーターに依存する、プロトタイプの天然産物のアルキル化因子
と見なされる（化学的に、低いpH、または酵素的に、例えば、DT−ジアホレーズ
、NADHシトクロムCレダクターゼ）（Boxer、1997；Cummings他、1998）。
【０００４】 活性化されたMCは二本鎖DNAを架橋し、引き続いてこのDNAは多様な生物学的作
用、例えば、DNA合成の選択的阻害、突然変異誘発、DNA修復の誘導（SOS応答）
、姉妹クロマチド交換、シグナルトランスダクション、およびアポトーシスの誘
導を誘導する（TomaszおよびPalem、1997）。腫瘍低酸素および悪性細胞におけ
る生物還元性酵素の発現の増加は薬剤活性化の選択的環境をつくり、そしてMCを
抗腫瘍療法のために魅力的因子とする（Spanswick他、1998）。MCは非小細胞肺
癌腫および他の軟性腫瘍に対して最も有効な抗腫瘍薬剤、ならびに軟性腫瘍の組
合わせ癌化学療法および放射線療法の臨床的に重要な成分の1つとなった（Hende
rson、1993）。
【０００５】 その生物学的および薬理学的重要性に加えて、MCの分子のメカニズムは構造的
に関係する抗腫瘍抗生物質、例えば、ポルフィロマイシン（PanおよびIracki、1
988）、マイトマイシン（Wakaki他、1958）、FR66979（PazおよびHopkins、1997
）、FR900482（Williams他、1997）、FK973（Hirai他、1994）、およびFK317（N
aoe他、1998）、ならびに構造的に無関係の生物還元性因子、例えば、EO9（Smit
skampwilms他、1996）、およびチラパザミン（Evans他、1998）のためのモデル
を表すので、MCは際立っている。多数のMC誘導体が合成され、増強された活性に
ついて試験されてきており、それらの例は最近同定された選択的タンパク質チロ
シンキナーゼインヒビター、1a−ドコサヘキサエノイルMCである（KasaiおよびA
rai、1995；Shikano他、1998）。
【０００６】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（Streptomyces lavendulae）はMCを産生す
る。この分子は、ミトサン核を与えるアジリジン、ピロリジジン、ピロロ−（1,
2a）−インドール、およびアミノメチルベンゾキノン環から構成された異常な構
造を有する（Webb他、1962）。MCのミトサンコアは、アミノ−メチルベンゾキノ
ン（mC7N単位）およびヘキソサミンの連結から誘導されることが示された（Horn
emann、1981）。C6N単位は炭素1、2、3、9、9a、10から成り、アジリジン窒素は
D−グルコサミンから無傷で誘導されている（Hornemann、1981）。
【０００７】 MCおよびアンサマイシン中のmC7N単位は3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸（
AHBA）から誘導される（Becker他、1983；KibbyおよびRichards、1981）。AHBA
は最初にアンサマイシン抗生物質アクタマイシンの中に組込まれることが示され
た（Kibby他、1980）。引き続いて、それはリファマイシン（Becker他、1983；K
ibbyおよびRichards、1981；GhilsalbaおよびNeuesch、1981）、ゲルダマイシン
（Potgieter、1983）、アンサミトシン（Hatano他、1982）、アンサトリエン（W
u他、1987）、ストレプトバリシン（StaleyおよびRinehart、1991）およびナフ
トマイシン（Lee他、1994）のための効率よい前駆体であることが確証された。
【０００８】 Anderson他（1980）は、MCと同一ミトサンコアを含有するポルフィロマイシン
のC−6メチル基の中に［カルボキシ−13C］AHBAを組込むことができることを証
明した。放射能標識化前駆体を使用する組込み実験は、MCのミトサンコアがAHBA
およびD−グルコサミンの結合部から誘導されることを証明した（Anderson他、1
980：Hornemann、1981）。
【０００９】 しばらくして、O−またはN−（C−ではない）メチル基はL−メチオニンに由来
するが、C−10カルバモイル基はL−アルギニンまたはL−シトルリンからくるこ
とが示された（BezansonおよびVining、1971；HornemannおよびEggert、1975；H
ornemann他、1974）。D−グルコース、ピルベートおよびD−エリトロースを使用
する［14C］標識化前駆体供給研究は、AHBAの新たな生合成がシキメート経路か
ら直接的に生ずることを示した。しかしながら、MC（Hornemann、1981）または
アンサマイシン抗生物質（Chiao他、1998）のmC7N単位の中への組込みは、スキ
ム酸、シキメート前駆体3−デヒドロキニン酸、またはシキメート由来アミノ酸
を使用する標識化研究において発見されなかった。
【００１０】 これらの結果は修飾されたシキメート経路の仮定に導き、ここで3−デオキシ
−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−ホスフェート（DAHP）シンターゼ様酵素は
、3,4−ジデオキシ−4−アミノ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−ホスフェー
ト（アミノ−DAHP）が変換してアンモニア化シキメート経路を与えるのを触媒す
る。変換しない通常のシキメート経路中間体DAHP（Kim他、1992；Kim他、1996）
と対照的に、Floss（1997）は、アミノDAHP、5−デオキシ−5−アミノ−3−デヒ
ドロキニン酸（アミノDHQ）、および5−デオキシ−5−アミノ−3−デヒドロスキ
ム酸（アミノDHS）がアミコラトプシス・メディテラネイ（Amycolatopsis medi
terranei）（リファマイシンプロデューサー）の無細胞抽出物によりAHBAに効率
よく変換できることを示すことによって、シキメート経路の新規な変異型を提供
した。
【００１１】 最近、アミコラトプシス・メディテラネイ（A. mediterranei）からのAHBAシ
ンターゼ（rifK）遺伝子はクローニングされ、配列決定され、機能的に特性決定
された（Kim他、1998）。
【００１２】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）におけるAHBAおよびD−
グルコサミンからのMCの収れんアセンブリーの詳述、すなわち、その新たな生合
成が、芳香族アミノ酸生合成のための微生物および植物における重要なルートで
ある、一次代謝シキメート経路に関係するかどうか、に関してほとんど知られて
いない。さらに、DNA中の好ましいMCアルキル化部位がグアニンまたはシトシン
であり、そしてMC誘導細胞死は単一架橋／ゲノムから生じうる（Tomasz、1995）
ので、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）がMCの活性に対して
耐性である原因は不明瞭である。
【００１３】 こうして、抗生物質に対する耐性を与えるか、あるいは抗生物質の産生を増強
する遺伝子を包含する、抗生物質生合成遺伝子を同定し、単離することが必要と
されている。
【００１４】 発明の要約 本発明は、マイトマイシンの遺伝子クラスターを含んでなる単離、精製された
核酸分子、例えば、DNA、その変異型またはフラグメント（mit／mmc遺伝子クラ
スター）を提供する。後述するように、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）マイトマイシン遺伝子クラスターは、隣接DNAの55kbをスパニング
する47マイトマイシン生合成遺伝子を含んでなるマイトマイシン生合成遺伝子ク
ラスターを包含する。
【００１５】 遺伝子クラスターの生合成部分は、生合成前駆体、ミトサン環系アセンブリー
および機能化（例えば、メチル化、ヒドロキシル化、アミノ転移、カルバモイル
化、およびカルボニルの還元）の発生に関係するポリペプチドをコードする遺伝
子、mrdおよび非連鎖mcrと異なるマイトマイシン耐性遺伝子、ならびにいくつか
の調節遺伝子を包含する。遺伝子のいくつかをさらに特性決定するために、遺伝
子崩壊を使用する。22の遺伝子崩壊突然変異体のうちの14はマイトマイシン生合
成に影響を与え、薬剤産生の阻害または過剰発現を生ずる、例えば、マイトマイ
シン経路レギュレーター（例えば、mmcW）のターゲッテッド遺伝学的崩壊は薬剤
産生を実質的に増加させた。
【００１６】 本発明の単離、精製された核酸分子は、ストレプトマイセス（Streptomyces）
spp.、例えば、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（Streptomyces lavendulae）
（例えば、B19／ATCC 27422、NRRL 2564、KY681、ATCC 27423、またはPB1000
）、ストレプトマイセス・ケスピトスス（Streptomyces caespitosus）、スト
レプトマイセス・ベルチシラツス（Streptomyces verticillatus）、およびス
トレプトマイセス・サンデンシス（Streptomyces sandaensis）（FERM−P7654
）からの核酸であることが好ましいが、マイトマイシンまたはその生物学的また
は機能的同等物を産生する他の生物から単離、精製された核酸分子はまた本発明
の範囲内に入る。本発明の核酸分子は二本鎖または一本鎖である。
【００１７】 後述するように、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノム
から3つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでなる3.8kbのBamHIフラ
グメントが単離された。ORFの1つ（mitA）は以前に同定されたAHBAシンターゼ遺
伝子（Kim他、1998）に対して高い類似性を示したが、他のもの（mitB）はいく
つかの原核生物および真核生物のグルコシルトランスフェラーゼに対して配列の
類似性を示した。
【００１８】 ヌクレオチド配列分析は、mitAがアミコラトプシス・メディテラネイ（Amycol
atopsis mediterranei）からのリファマイシンAHBA、ならびに関係するアンサ
マイシン抗生物質産生微生物からの2つの追加のAHBAシンターゼと71％の同一性
（80％の類似性）を有する、388アミノ酸のタンパク質をコードすることを示し
た。mitAのストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）染色体コピーの
遺伝子崩壊および部位特異的突然変異誘発は、MCの産生を完全にブロックした。
mitAの機能は、MitAの中にK191A突然変異を含有するストレプトマイセス・ラベ
ンヅレ（S. lavendulae）株と3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸との相補性に
より確証された、すなわち、mitA突然変異株を外因的3−アミノ−5−ヒドロキシ
安息香酸の存在下に培養したとき、MC産生は回復した。mitBは272アミノ酸のタ
ンパク質をコードする。
【００１９】 7つの遺伝子産物（アミノDHQシンターゼ（MitP）、アミノキネートデヒドロゲ
ナーゼ（MitT）、アミノDHQデヒドラターゼ（MmcF）、AHBAシンターゼ（MitA）
、オキシドレダクターゼ（MitG）、ホスファターゼ（MitJ）、およびキナーゼ（
MitS））は、シキメート経路の変異型を通して中間体3−アミノ−5−ヒドロキシ
安息香酸（AHBA）のアセンブリーに関係するようである。しかしながら、ホスホ
エノールピルベート（PEP）およびエリトロース4−ホスフェート（E4P）からのA
HBA生合成に関係する最初の推定された酵素であるアミノDAHPシンターゼをコー
ドする遺伝子は、マイトマイシン生合成遺伝子クラスター内で連鎖されない。
【００２０】 マイトマイシン耐性決定因子（mct）は、細胞からのマイトマイシンの外分泌
に関係する膜関連タンパク質をコードする。挿入不活性化によるmctの崩壊は、M
Cに対してかなりいっそう感受性であるストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. l
avendulae）突然変異体株を生じた。大腸菌（E. coli）中のmctの発現はMCに対
する細胞耐性を5倍増加し、膜関連タンパク質の合成に導き、薬剤の細胞内蓄積
の減少と相関した。大腸菌（E. coli）中のmctおよびmrdの共発現は耐性を150
倍増加し、MCの細胞内蓄積を減少させた。これらの結果により、MRDはMCについ
て高いアフィニティーを維持し、引き続くMCTによる輸送のための一次レセプタ
ー（補助的成分として薬剤輸送系に参加する）として働くことができる。
【００２１】 クローニングされたマイトマイシン生合成遺伝子は、ミトサン環系の生合成の
分子的基礎を明らかにし、ならびに新規な天然産物の生合成を操作するために有
効である。そのうえ、輸送、耐性および調節タンパク質の遺伝子操作または過剰
発現は、産生培養物からのマイトマイシン化合物のより高い力価に導くことがあ
る。
【００２２】 好ましくは、遺伝子クラスターを含んでなる単離された核酸分子は、配列番号
96または配列番号76を含んでなる核酸配列、その変異型またはフラグメント、例
えば、中程度の、またはより好ましくはストリンジェントの、ハイブリダイズ条
件下に配列番号96または配列番号76にハイブリダイズする核酸分子、その補体、
またはそのフラグメントを包含する。中程度またはストリンジェントのハイブリ
ダイズ条件当業者によく知られており、例えば、下記の文献を参照のこと：Samb
rook他の節9.47−9.51（Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold S
pring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1989）。
【００２３】 例えば、ストリンジェント条件は次の通りである：（1）洗浄のために低いイ
オン強度および高い温度、例えば、0.015MのNaCl／0.0015Mのクエン酸ナトリウ
ム（SSC）；0.1％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を50℃においてを使用する
、または（2）ハイブリダイズの間に変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、5
0％のホルムアミドおよび0.1％のウシ血清アルブミン／0.1％のフィコール／0.1
％のポリビニルピロリドン／50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5および750mM
のNaCl、75mMのクエン酸ナトリウムを42℃において使用する。
【００２４】 他の例は、50％のホルムアミド、5×SSC（0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナ
トリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム
、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg／ml）、0.1％のドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）、および10％の硫酸デキストランを42℃において使
用し、0.2×SSCおよび0.1％のSDS中で42℃において洗浄を実施することである。
【００２５】 本発明の好ましい核酸は、下記のものを包含するが、これらに限定されないペ
プチドをコードする核酸配列を含んでなる：MitA（例えば、配列番号97によりコ
ードされる配列番号10）、MitB（例えば、配列番号98によりコードされる配列番
号11）、MitC（例えば、配列番号99によりコードされる配列番号12）、MitD（例
えば、配列番号45によりコードされる配列番号100）、MitE（例えば、配列番号4
4によりコードされる配列番号101）、MitF（例えば、配列番号43によりコードさ
れる配列番号102）、MitG（例えば、配列番号42によりコードされる配列番号103
）、MitH（例えば、配列番号41によりコードされる配列番号104）、MitI（例え
ば、配列番号40によりコードされる配列番号105）、MitJ（例えば、配列番号39
によりコードされる配列番号106）、
【００２６】 MitK（例えば、配列番号38によりコードされる配列番号107）、MitL（例えば
、配列番号37によりコードされる配列番号108）、MitM（例えば、配列番号36に
よりコードされる配列番号109）、MitN（例えば、配列番号35によりコードされ
る配列番号110）、MitO（例えば、配列番号34によりコードされる配列番号111）
、MitP（例えば、配列番号33によりコードされる配列番号112）、MitQ（例えば
、配列番号32によりコードされる配列番号113）、MitR（例えば、配列番号31に
よりコードされる配列番号114）、MitS（例えば、配列番号30によりコードされ
る配列番号115）、MitT（例えば、配列番号29によりコードされる配列番号140）
、MmcA（例えば、配列番号49によりコードされる配列番号116）、
【００２７】 MmcB（例えば、配列番号50によりコードされる配列番号117）、MmcC（例えば
、配列番号51によりコードされる配列番号118）、MmcD（例えば、配列番号52に
よりコードされる配列番号119）、MmcE（例えば、配列番号53によりコードされ
る配列番号120）、MmcF（例えば、配列番号54によりコードされる配列番号121）
、MmcG（例えば、配列番号55によりコードされる配列番号122）、MmcH（例えば
、配列番号56によりコードされる配列番号123）、MmcI（例えば、配列番号57に
よりコードされる配列番号124）、MmcJ（例えば、配列番号58によりコードされ
る配列番号125）、MmcK（例えば、配列番号59によりコードされる配列番号126）
、MmcL（例えば、配列番号60によりコードされる配列番号127）、MmcM（例えば
、配列番号61によりコードされる配列番号128）、
【００２８】 MmcN（例えば、配列番号62によりコードされる配列番号129）、MmcO（例えば
、配列番号63によりコードされる配列番号130）、MmcP（例えば、配列番号64に
よりコードされる配列番号131）、MmcQ（例えば、配列番号65によりコードされ
る配列番号132）、MmcR（例えば、配列番号66によりコードされる配列番号133）
、MmcS（例えば、配列番号67によりコードされる配列番号134）、MmcT（例えば
、配列番号68によりコードされる配列番号135）、MmcU（例えば、配列番号69に
よりコードされる配列番号136）、MmcV（例えば、配列番号70によりコードされ
る配列番号137）、MmcW（例えば、配列番号71によりコードされる配列番号138）
、
【００２９】 MmcX（例えば、配列番号72によりコードされる配列番号139）、MmcY（例えば
、配列番号73によりコードされる配列番号140）、Mct（例えば、配列番号16によ
りコードされる配列番号117）、変異型またはそのフラグメント、例えば、例え
ば、上に同定した核酸配列の少なくとも1つまたはその補体に対して、中程度の
、またはより好ましくはストリンジェントの、ハイブリダイズ条件下にハイブリ
ダイズする核酸分子。
【００３０】 本発明は、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖されかつポリケタイ
ド生合成酵素をコードする単離、精製された核酸分子、その変異型またはフラグ
メントを提供する。好ましくは、本発明のこの態様の核酸分子は、少なくとも1
つの、好ましくは少なくとも5つの、より好ましくは少なくとも9つの、オープン
リーディングフレームを含んでなる。より好ましくは、核酸分子は、中程度の、
またはより好ましくはストリンジェントの、ハイブリダイズ条件下に配列番号74
またはその一部分に対してハイブリダイズする。
【００３１】 本発明は、また、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖されかつ糖生
合成酵素をコードする単離、精製された核酸分子、その変異型またはフラグメン
トを提供する。好ましくは、本発明のこの態様の核酸分子は、少なくとも1つの
、好ましくは少なくとも5つの、より好ましくは少なくとも9つの、なおより好ま
しくは少なくとも12の、オープンリーディングフレームを含んでなる。好ましく
は、本発明のこの態様の核酸分子は、中程度の、またはより好ましくはストリン
ジェントの、ハイブリダイズ条件下に配列番号75またはその一部分に対してハイ
ブリダイズする。
【００３２】 本発明は、また、配列番号76によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、またはそのフラグメントに対して、少なくとも約80％、より好ましくは
少なくとも約90％、なおより好ましくは少なくとも約95％であるが、100％より
低い、隣接アミノ酸配列の同一性を有する変異型ポリペプチドを提供する。好ま
しい変異型ポリペプチドは、配列番号10〜12、17または100〜141を含んでなるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの活性の、少なくとも約1％、より好ましくは
少なくとも約10％、なおより好ましくは少なくとも約50％を有する変異型ポリペ
プチドまたはそのフラグメントを包含する。こうして、例えば、配列番号98を有
するポリペプチドの活性は、配列番号98に関して少なくとも1つのアミノ酸の置
換、挿入、または欠失を有する配列番号98の変異型に対して比較することができ
る。
【００３３】 本発明の変異型核酸配列は、配列番号76を含んでなる核酸配列、その補体、ま
たはそのフラグメントに対して、少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも
約90％、なおより好ましくは少なくとも約95％であるが、100％より低い、隣接
アミノ酸配列の同一性を有する。2つの配列のアミノ酸および／または核酸の類
似性（または相同性）はマニュアル的にまたはこの分野においてよく知られてい
るアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００３４】 本発明は、また、本発明の核酸分子の少なくとも一部分を含んでなるプローブ
およびプライマーを提供する。好ましくは、本発明のプローブまたはプライマー
は検出可能に標識化されるか、あるいは検出可能な標識のための結合部位を有す
る。好ましくは、本発明のプローブまたはプライマーは、本発明の単離された核
酸分子に対して、少なくとも約80％の同一性、より好ましくは少なくとも約90％
の同一性を有する、少なくとも約7、より好ましくは少なくとも約15の隣接ヌク
レオチド塩基である。
【００３５】 このようなプローブまたはプライマーは、マイトマイシン生合成遺伝子クラス
ターに関係する配列、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖されたポリ
ケタイド生合成酵素をコードするものに関係する配列、マイトマイシン生合成遺
伝子クラスターに連鎖された糖生合成酵素をコードするものに関係する配列、そ
の変異型またはフラグメントに対する相補性を有するDNA鎖を検出し、定量し、
単離しおよび／または増幅するために有効である。
【００３６】 また、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖された、マイ
トマイシン生合成遺伝子クラスターの少なくとも一部分を含んでなる核酸分子、
マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖されかつポリケタイド生合成酵素
をコードする核酸分子、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖されかつ
糖生合成酵素をコードする核酸分子を含んでなる発現カセットが提供される。遺
伝学的に修飾された宿主細胞、すなわち、組換え宿主細胞は、発現カセット、例
えば、本発明の発現カセットを含んでなる宿主細胞、あるいは本発明の特定のマ
イトマイシン生合成遺伝子、ポリケタイド生合成遺伝子または糖生合成遺伝子の
発現を減少または排除するように、ゲノムが遺伝学的に操作された、例えば、宿
主染色体の一部分の欠失、一部分の置換、または宿主染色体の崩壊により操作さ
れた、宿主細胞を包含する。
【００３７】 本発明の1つの態様は、好ましくは変更されたマイトマイシン合成、例えば、
マイトマイシン合成の増加、および／または新規化合物の産生を生ずるように、
マイトマイシン遺伝子クラスターを含んでなる核酸配列の一部分、すなわち、内
因的または天然ゲノム配列が、例えば、異種配列の挿入により、崩壊または置換
されているか、あるいは本発明の変異型核酸配列で置換されている、組換え宿主
細胞、例えば、細菌細胞である。例えば、本発明は、マイトマイシン産生が増加
された組換え宿主細胞を生ずるように、mmcW遺伝子が、例えば、選択可能なマー
カー遺伝子との置換により、崩壊されている、組換え宿主細胞を包含する。
【００３８】 本発明の他の態様は、そのゲノムが、例えば、染色体外因子、例えば、プラス
ミドを介するか、あるいは宿主染色体の中への安定な挿入により、発現カセット
により増強されている、組換え宿主細胞である。こうして、対応する非組換え宿
主細胞に関して変更されたレベルのマイトマイシンおよび／または1またはそれ
以上の新規化合物を生ずるように、組換え宿主細胞のゲノムは少なくとも1つの
マイトマイシン生合成遺伝子、ポリケタイド生合成遺伝子または糖生合成遺伝子
で増強されている。
【００３９】 あるいは、組換え宿主細胞のゲノムを非マイトマイシン生合成遺伝子、および
必要に応じて、本発明の少なくとも1つのマイトマイシン生合成遺伝子、ポリケ
タイド生合成遺伝子または糖生合成遺伝子で増強して、対応する非組換え宿主細
胞に関して変更されたレベルの突然変異および／または1またはそれ以上の新規
化合物を産生する。例えば、組換え宿主細胞をpikA（参照：米国特許出願第09／
105,537号1998年6月26日発行、その開示は引用することによって本明細書の一部
とされる）で増強し、そしてpikAを1またはそれ以上の新規化合物を生ずるため
に有効量で発現させることができる。
【００４０】 本発明の組換え宿主細胞を調製するために有効な宿主細胞は、本発明の核酸分
子、例えば、マイトマイシン生合成遺伝子に対応する核酸を発現しないか、ある
いはそれを含まない細胞、ならびに自然にマイトマイシンを産生しない細胞を包
含する。 こうして、本発明は、また、本発明の核酸分子によりコードされる単離、精製
されたポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のポリペプチドは組換え宿
主細胞、例えば、本発明の核酸分子により増強されたゲノムを有する組換え宿主
細胞から得られる。さらに、本発明のマイトマイシン生合成遺伝子クラスターの
少なくとも一部分のアンチセンスを含んでなる発現カセットおよび宿主細胞が考
えられる。
【００４１】 本発明の他の態様において、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに連鎖さ
れかつポリケタイド生合成酵素、例えば、ポリケタイドシンターゼをコードする
単離、精製された核酸分子は、組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシ
ンターゼおよびポリマーを製造する方法において有効である。
【００４２】 こうして、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼを製造する方
法を提供する。この方法は発現カセットを宿主細胞の中に導入することを含んで
なる。発現カセットは、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連
鎖された、ポリケタイドシンターゼをコードするDNA分子を含んでなる。DNA分子
は好ましくはマイトマイシン産生生物、例えば、ストレプトマイセス（Streptom
yces）spp.、例えば、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）から
得られる。次いでポリケタイドシンターゼをコードするDNA分子を細胞において
発現させる。こうして、本発明の他の態様は、シンターゼを発現する宿主細胞か
ら単離された、精製された組換えポリケタイドを提供する。
【００４３】 本発明の他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーを製造する方法
である。この方法は、第1発現カセットおよび第2発現カセットを宿主細胞の中に
導入することを含んでなる。第1発現カセットは、デヒドラーゼ活性が不活性化
されておりかつ脂肪酸シンターゼをコードし、宿主細胞、例えば、昆虫細胞にお
いて機能的なプロモーターに作用可能に連鎖されたDNAセグメントを含んでなる
。不活性化はデヒドラーゼの触媒部位における突然変異を介してなされることが
好ましい。第2発現カセットは、好ましくはマイトマイシン産生生物から得られ
たポリケタイドシンターゼをコードし、宿主細胞において機能的なプロモーター
に作用可能に連鎖されたDNAセグメントを含んでなる。発現カセットは同一分子
または別の分子上に存在することができる。発現カセット中のDNAセグメントは
細胞中で発現されて、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーを生ずる。
【００４４】 本発明は、また、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコード
し、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖された核酸分子を
含んでなる発現カセットを提供する。核酸分子は複数のDNAセグメントを含んで
なる。こうして、核酸分子は少なくとも第1および第2のDNAセグメントを含んで
なる。第1DNAセグメントは第1モジュールをコードし、そして第2DNAセグメント
は第2モジュールをコードし、ここでDNAセグメントは一緒にポリヒドロキシアル
カノエートモノマーシンターゼをコードする。
【００４５】 1以下のDNAセグメントはサッカロポリスポラ・エリトレア（Saccaropolyspora
erythraea）のeryA遺伝子クラスターに由来する。また、第1DNAセグメントは
マイトマイシン産生生物、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）spp.か
らのモジュールを含んでなることが好ましい。核酸分子はさらにポリヒドロキシ
アルカノエートシンターゼをコードする第3DNAセグメントを含んでなることがで
きる。あるいは、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする第2核
酸分子を宿主細胞の中に導入することができる。
【００４６】 また、単離、精製されたDNA分子が提供される。DNA分子は複数のDNAセグメン
トを含んでなる。こうして、DNA分子は少なくとも第1および第2のDNAセグメント
を含んでなる。第1DNAセグメントは第1モジュールをコードし、そして第2DNAセ
グメントは第2モジュールをコードする。DNAセグメントは一緒に組換えポリヒド
ロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードする。1以下のDNAセグメント
はサッカロポリスポラ・エリトレア（Saccaropolyspora erythraea）のeryA遺
伝子クラスターに由来することが好ましい。
【００４７】 また、1以下のモジュールは、ラパマイシンをコードするストレプトマイセス
・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）からの遺伝子クラスター
またはスピラマイシンをコードする遺伝子クラスターに由来する。本発明の好ま
しい態様は、マイトマイシン産生生物からのモジュールを含んでなる第1DNAセグ
メントを使用する。本発明の単離されたDNA分子のそれ以上の好ましい態様は、
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNAセグメントを包含す
る。
【００４８】 さらに、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーを製造する方法が提供される
。この方法は、第1DNA分子および第2DNA分子を宿主細胞の中に導入することを含
んでなる。第1DNA分子は、組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンタ
ーゼをコードするDNAセグメントを含んでなる。組換えポリヒドロキシアルカノ
エートモノマーシンターゼは複数のモジュールを含んでなる。こうして、モノマ
ーシンターゼは少なくとも第1モジュールおよび第2モジュールを含んでなる。第
1DNA分子は、宿主細胞において機能的なプロモーターに連鎖されている。
【００４９】 第2DNA分子は、宿主細胞において機能的なプロモーターに連鎖されている、ポ
リヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNAセグメントを含んでな
る。少なくとも1つのモジュールはマイトマイシン産生生物に由来することが好
ましい。組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼおよびポリヒ
ドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNAは宿主細胞において発現さ
れて、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーを発生する。
【００５０】 本発明のなお他の態様は、単離、精製されたDNA分子である。DNA分子は複数の
DNAセグメントを含んでなる。すなわち、DNA分子は少なくとも第1および第2のDN
Aセグメントを含んでなる。第1DNAセグメントは脂肪酸シンターゼをコードし、
そして第2DNAセグメントはポリケタイドシンターゼのモジュールをコードする。
本発明の好ましい態様は、マイトマイシン産生生物、例えば、ストレプトマイセ
ス（Streptomyces）からのポリケタイドシンターゼのモジュールを含んでなる第
2DNAセグメントを使用する。
【００５１】 また、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼを製造する方法が提
供される。この方法は、発現カセットを宿主細胞の中に導入することを含んでな
る。発現カセットは、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖
された、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードするDNA分
子を含んでなる。モノマーシンターゼは複数のモジュールを含んでなる。こうし
て、モノマーシンターゼは一緒にモノマーシンターゼをコードする、少なくとも
第1および第2のモジュールを含んでなる。本発明の好ましい態様は、マイトマイ
シン産生生物からのモジュールを使用する。必要に応じて、発現カセットは、ポ
リヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする第2DNA分子をさらに含んで
なる。
【００５２】 本発明は、また、第1モジュールをコードする第1DNAセグメントと、第2モジュ
ールをコードする第2DNAセグメントとを含んでなり、ここでDNAセグメントが一
緒に組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードする、単
離、精製されたDNA分子を提供する。好ましくは、少なくとも1つのDNAセグメン
トは、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のマイトマイシン遺
伝子クラスターに作用可能に連鎖されたDNAに由来する。
【００５３】 また、好ましくは、1以下のDNAセグメントはサッカロポリスポラ・エリトレア
（Saccaropolyspora erythraea）のeryA遺伝子クラスターに由来する。本発明
の1つの態様において、本発明の単離されたDNA分子の3'の大部分のDNAセグメン
トはチオエステラーゼIIをコードする。また、宿主細胞において機能的なプロモ
ーターに作用可能に連鎖された、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンタ
ーゼをコードする核酸分子を含んでなる発現カセットが提供される。
【００５４】 本発明のなお他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを提供する
方法である。この方法は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に
連鎖された、組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコード
するDNAセグメントを含んでなるDNA分子を宿主細胞の中に導入することを含んで
なる。好ましくは、第2DNA分子は、マイトマイシン遺伝子クラスターに連鎖され
たDNAに由来する。組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼは
第1および第2のモジュールを含んでなり、ここで少なくとも1つのDNAセグメント
は、マイトマイシン遺伝子クラスター、例えば、ストレプトマイセス・ラベンヅ
レ（S. lavendulae）のマイトマイシン遺伝子クラスターに連鎖されたDNAに由
来する。
【００５５】 次いで、組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードす
るDNAを宿主細胞中で発現させて、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを発
生させる。必要に応じて、第2DNA分子を宿主細胞の中に導入することができる。
第2DNA分子は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖された
、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNAセグメントを含ん
でなる。2つのDNA分子は宿主細胞中で発現されて、ポリヒドロキシアルカノエー
トポリマーを発生する。
【００５６】 本発明の他の態様は、脂肪酸シンターゼをコードする第1DNAセグメントと、ス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のマイトマイシン遺伝子クラ
スターに連鎖されたDNAからのモジュールをコードする第2DNAセグメントとを含
んでなる、単離、精製された核酸分子である。このようなDNA分子は、ポリヒド
ロキシアルカノエートモノマーを製造する方法において使用することができる。
こうして、脂肪酸シンターゼをコードする第1DNAセグメントと、ポリケタイドシ
ンターゼをコードする第2DNAセグメントとを含んでなるDNAを宿主の中に導入す
る。
【００５７】 第1DNAセグメントは第2DNAセグメントに対して5'であり、そして第1DNAセグメ
ントは宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖されている。連
鎖されたDNAセグメントが融合タンパク質を発現するように、第1DNAセグメント
は第2DNAセグメントに連鎖されている。DNA分子は宿主細胞において発現されて
、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを発生する。
【００５８】 さらに、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼを製造する方法が
提供される。この方法は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に
連鎖された、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNA分子を
含んでなる発現カセットを導入することを含んでなる。DNA分子は第1モジュール
をコードする第1DNAセグメントと、第2モジュールをコードする第2DNAセグメン
トとを含んでなり、ここでDNAセグメントは一緒にポリヒドロキシアルカノエー
トモノマーシンターゼをコードする。
【００５９】 少なくとも1つのDNAセグメントは、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. la
vendulae）のマイトマイシン遺伝子クラスターに連鎖されたDNAに由来する。DNA
分子は宿主において発現される。必要に応じて、DNA分子はポリヒドロキシアル
カノエートシンターゼをコードするDNAセグメントをさらに含んでなる。あるい
は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする、第2の、別のDNA分
子を宿主細胞の中に導入する。
【００６０】 こうして、本発明は、第1モジュールをコードする第1DNAセグメントと、第2モ
ジュールをコードする第2DNAセグメントとを含んでなり、DNAセグメントは一緒
に組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードし、かつ少
なくとも1つのDNAセグメントがストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendul
ae）のmit／mmc遺伝子クラスターに由来する、単離、精製された核酸分子を提供
する。好ましくは、1以下のDNAセグメントはサッカロポリスポラ・エリトレア（
Saccaropolyspora erythraea）のeryA遺伝子クラスターに由来する。本発明の
他の態様において、本発明の単離されたDNA分子の3'の大部分のDNAセグメントは
チオエステラーゼIIをコードする。また、宿主細胞において機能的なプロモータ
ーに作用可能に連鎖された、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼ
をコードする核酸分子を含んでなる発現カセットが提供される。
【００６１】 本発明のなお他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを提供する
方法である。この方法は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に
連鎖された、組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコード
するDNAセグメントを含んでなるDNA分子を宿主細胞の中に導入することを含んで
なる。組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼは第1および第2
のモジュールを含んでなり、ここで少なくとも1つのDNAセグメントはストレプト
マイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のmit／mmc遺伝子クラスターに由来す
る。
【００６２】 組換えポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼをコードするDNAを
宿主細胞中で発現させて、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを発生させる
。必要に応じて、第2DNA分子を宿主細胞の中に導入することができる。第2DNA分
子は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖された、ポリヒ
ドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNAセグメントを含んでなる。2
つのDNA分子は宿主細胞中で発現されて、ポリヒドロキシアルカノエートポリマ
ーを発生する。
【００６３】 本発明の他の態様は、脂肪酸シンターゼをコードする第1DNAセグメントと、ス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のmit／mmc遺伝子クラスター
からのモジュールをコードする第2DNAセグメントとを含んでなる単離、精製され
た核酸分子である。このようなDNA分子は、ポリヒドロキシアルカノエートモノ
マーを提供する方法において使用することができる。
【００６４】 こうして、脂肪酸シンターゼをコードする第1DNAセグメントと、ポリケタイド
シンターゼをコードする第2DNAセグメントとを含んでなるDNA分子を宿主細胞の
中に導入する。第1DNAセグメントは第2DNAセグメントに対して5'であり、そして
第1DNAセグメントは宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖さ
れている。連鎖されたDNAセグメントが融合タンパク質を発現するように、第1DN
Aセグメントは第2DNAセグメントに連鎖されている。DNA分子は宿主細胞において
発現されて、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを発生する。
【００６５】 さらに、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼを提供する方法が
提供される。この方法は、宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に
連鎖された、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードするDNA分子を
含んでなる発現カセットを導入することを含んでなる。DNA分子は第1モジュール
をコードする第1DNAセグメントと、第2モジュールをコードする第2DNAセグメン
トとを含んでなり、ここでDNAセグメントは一緒にポリヒドロキシアルカノエー
トモノマーシンターゼをコードする。
【００６６】 少なくとも1つのDNAセグメントは、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. la
vendulae）のmit／mmc遺伝子クラスターに連鎖されたDNAに由来する。DNA分子は
宿主において発現される。必要に応じて、DNA分子はポリヒドロキシアルカノエ
ートシンターゼをコードするDNAセグメントをさらに含んでなる。あるいは、ポ
リヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする、第2の、別のDNA分子を宿
主細胞の中に導入する。
【００６７】 また、ポリケタイド産生微生物の遺伝学的操作により特異的糖修飾ポリケタイ
ドの生合成を指令する方法が提供される。この方法は、糖生合成における酵素を
コードするDNA配列、例えば、配列番号75を含んでなるDNA配列、その変異型また
はフラグメントをポリケタイド産生微生物の中に導入し、こうして特異的糖修飾
ポリケタイドを産生する微生物を生ずることを含む。あるいは、本発明のアンチ
センスDNA配列を使用することができる。次いで、糖修飾ポリケタイドを微生物
から単離する。糖生合成における少なくとも1つの酵素活性を不活性化するか、
あるいは糖をポリケタイドに結合させるように、DNA配列を修飾することが好ま
しい。
【００６８】 こうして、本発明の核酸セグメントによりコードされるモジュールを、前述の
方法において使用して、変化する鎖長さまたは種々の側鎖置換を有するポリヒド
ロキシアルカノエートを製造することができる。 本発明の組換え宿主細胞により産生される化合物は、生物学的に活性な因子、
例えば、抗生物質、抗炎症剤、抗癌剤、抗生物質、免疫エンハンサー、免疫抑制
剤、ぜん息治療剤、慢性閉塞性肺疾患ならびに他の疾患、例えば、呼吸器ｉｈｍ
、またはコレステロール低下剤；または作物保護剤（例えば、殺真菌剤または殺
虫剤）、ならびにバイオポリマー、例えば、包装または生物医学的応用における
バイオポリマー、またはPHAモノマーシンターゼを操作するためのバイオポリマ
ーであることが好ましい。また、このような療法を必要とする哺乳動物、例えば
、ヒト、鳥類、または魚類を治療するために、これらの化合物を使用して方法が
考えられる。
【００６９】 発明の詳細な説明 定義 本明細書において使用するとき、「I型ポリケタイドシンターゼ」は反復使用
される活性部位を有する単一ポリペプチドである。これは1系列のポリペプチド
上の活性部位を使用するII型ポリケタイドシンターゼと対照的である。 本明細書において使用するとき、「リンカー領域」は、触媒活性を有するアミ
ノ酸配列よりもアミノ酸配列中の保存程度が低い、多機能的タンパク質の中に存
在するアミノ酸配列である。
【００７０】 本明細書において使用するとき、「エクステンダー単位」の触媒または酵素ド
メインは、2〜4炭素単位をアシル鎖に付加することによって鎖伸長を触媒しかつ
他のアシルトランスフェラーゼに対してカルボキシ末端に位置するモジュール中
のアシルトランスフェラーゼである。例えば、メチルマロニルCoA特異性を有す
るエクステンダー単位はアシル基をメチルマロニルCoA分子に付加する。
【００７１】 本明細書において使用するとき、「ポリヒドロキシアルカノエート」または「
PHA」は下記のものを包含するが、これらに限定されない：好ましくは異種の、
高度に保存されたアミノ酸、例えば、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシ
バレレート、3−ヒドロキシカプロエート、3−ヒドロキシヘプタノエート、3−
ヒドロキシオクタノエート、3−ヒドロキシデカノエート、および3−ヒドロキシ
ドデカノエート、およびそれらの4−ヒドロキシおよび5−ヒドロキシ対応物。
【００７２】 本明細書において使用するとき、「組換え」核酸またはタンパク質分子はタン
パク質をコードする核酸分子であり、その配列は天然に存在しないか、あるいは
修飾されなかったゲノムの中に天然に存在する配列が位置するように、位置しな
い天然に存在する配列に対応するように、in vitro修飾されている。 本明細書において使用するとき、「多機能的タンパク質」は、2またはそれ以
上の酵素的活性部位が単一ポリペプチド上に存在するタンパク質である。 本明細書において使用するとき、「モジュール」は多機能的タンパク質中の1
系列の反復単位の1つ、例えば、I型ポリケタイドシンターゼまたは脂肪酸シンタ
ーゼである。
【００７３】 本明細書において使用するとき、「未熟終結産物」(premature termination p
roduct)は、非組換え多機能的タンパク質により産生される産物と異なる、組換
え多機能的タンパク質により産生される産物である。一般に、組換え多機能的タ
ンパク質により産生される産物はより少ないアシル基を有する。 本明細書において使用するとき、遺伝子クラスター「に由来する」DNAは、ゲ
ノムDNAから単離され、in vitro精製されたDNAであるか、あるいはゲノムDNAの
配列をベースとして合成的に製造されたDNAである。
【００７４】 「抗生物質」は、本明細書において使用するとき、自然に、または制限された
化学的修飾で、他の微生物または真核細胞の成長を阻害するか、あるいはそれら
を殺す、微生物により産生された物質である。 「抗生物質生合成遺伝子」は、一次的代謝物質を抗生物質に変換するプロセス
における酵素反応のために必要である酵素活性をコードする核酸、例えば、DNA
、セグメントまたは配列である。 「抗生物質生合成経路」は、一次的代謝物質を抗生物質に変換するプロセスの
ために必要な抗生物質生合成遺伝子の全体の組を包含する。これらの遺伝子はこ
の分野においてよく知られている方法により例示することができる、例えば、米
国特許第4,935,340号参照。
【００７５】 抗生物質産性生物は任意の生物を包含し、これらは下記のものを包含するが、
これらに限定されない：アクチノプラネス(Actinoplanes)、アクチノマドラ(Act
inomadura)、バシルス(Bacillus)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、ミク
ロモノスポラ(Micromonospora)、ペニシリウム(Penicillium)、ノカルディア(No
cardia)、及びストレプトマイセス(Streptomyces)：これらは抗生物質を産生す
るか、あるいは、発現された場合、抗生物質を産生する遺伝子を含有する。
【００７６】 用語「ポリケタイド」は、本明細書において使用するとき、抗生物質、抗真菌
、抗癌、および抗蠕虫性化合物を包含するが、これらに限定されない、大きいか
つ多様なクラスの天然産物を意味する。 用語「ポリケタイド産生微生物」は、本明細書において使用するとき、自然に
または適当に（すなわち、遺伝学的に）操作した後ポリケタイドを産生すること
ができる任意の微生物を包含する。自然にポリケタイドを産生するアクチノミセ
テスの例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：
【００７７】 ミクロモノスポラ・ロザリア(Micromonospora rosaria)、ミクロモノスポラ・
メガロミセア(Micromonospora megalomicea)、サッカロポリスポラ・エリスラー
(Saccharopolyspora erythraea)、ストレプトマイセス・アンチビオチクス(Stre
ptomyces antibioticus)、ストレプトマイセス・アルベレチクリ(Streptomyces
albereticuli)、ストレプトマイセス・アムボファシスンス(Streptomyces ambof
aciens)、ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)、
ストレプトマイセス・フラシア(Streptomyces fradiae)、ストレプトマイセス・
グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・ヒドロスコピクス(S
treptomyces hydroscopicus)、ストレプトマイセス・ツクルバエンシス(Strepto
myces tsukulubaensis)、ストレプトマイセス・ミカロファシエンス(Streptomyc
es mycarofasciens)、ストレプトマイセス・プラテンシス(Streptomyces platen
esis)、ストレプトマイセス・ビオラセオニガー(Streptomyces violaceoniger)
、ストレプトマイセス・ビオラセオニガー(Streptomyces violaceoniger)、スト
レプトマイセス・サーモトレアンス(Streptomyces thermotolerans)、ストレプ
トマイセス・リモサス(Streptomyces rimosus)、ストレプトマイセス・ペラセチ
ウス(Streptomyces peucetius)、ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomy
ces coelicolor)、ストレプトマイセス・グラウセセンス(Streptomyces glauces
cens)、ストレプトマイセス・ロゼオフルブス(Streptomyces roseofulvus)、ス
トレプトマイセス・シンナモネシス(Streptomyces cinnamonensis)、ストレプト
マイセス・クラコイ(Streptomyces curacoi)、及びアミコラトプシス・メディテ
ラネイ(Amycolatopsis mediterranei)（Hopwood, D.A及びSherman, D.H., Anna.
Rev. Genet. 24. 37-66(1990)を参照のこと、引用することによって本明細書の
一部とされる）。ポリケタイドを自然に産生するポリケタイド産生微生物の他の
例は、種々のActinomadura、DactylosporangiumおよびNocardia株を包含する。
【００７８】 用語「グリコシル化ポリケタイド」は、1またはそれ以上の糖残基を含有する
ポリケタイドを意味する。 用語「グリコシル化修飾ポリケタイド」は、非修飾または自然の状態の特定の
ポリケタイドに関して変化したグリコシル化パターンまたは立体配置を有するポ
リケタイドを意味する。 用語「糖生合成遺伝子」は、本明細書において使用するとき、糖生合成酵素を
コードする、生物、例えば、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae
）からのヌクレオチド配列を意味し、そしてストレプトマイセス・ラベンヅレ（
S. lavendulae）から得られたものと同一であるか、あるいはそれらに類似する
、他のポリケタイド産生微生物からのDNA配列を包含することを意図する。
【００７９】 用語「糖生合成酵素」は、本明細書において使用するとき、ポリケタイド関連
糖およびそれらの誘導体および中間体の生合成および／または結合に関係するポ
リペプチドを意味する。 用語「ポリケタイド関連糖」は、本明細書に記載するプロセスによりポリケタ
イドに結合させることができるポリケタイドに結合することが知られている糖を
意味する。 用語「糖誘導体」は、自然にポリケタイドに関連するが、非修飾または天然の
ポリケタイドに関する変更されている糖を意味する。 用語「糖中間体」は、糖生合成経路において産生される中間体化合物を意味す
る。
【００８０】 本発明の「組換え」宿主細胞は、本発明の少なくとも1つの遺伝子、例えば、
マイトマイシン生合成遺伝子クラスター中の遺伝子、の機能または活性を変更す
る、例えば、減少または崩壊させるか、あるいは増加させるように、in vitro
で操作されたゲノムを有する。 本明細書において使用するとき、「mit／mmc」または「マイトマイシン」遺伝
子クラスターは、ミトサン前駆体形成、ミトサン環アセンブリー、マイトマイシ
ン生合成の調節、機能化、およびマイトマイシンに対する耐性のための酵素をコ
ードする配列、ならびにポリケタイドおよび糖生合成酵素をコードする密接に連
鎖した配列を包含する。
【００８１】 本明細書において使用するとき、用語「単離されたおよび／または精製された
」は、RNA、DNAまたはポリペプチドの分子をその自然の細胞の環境から、および
細胞の他の成分、例えば、核酸またはポリペプチドとのアソシエートからin vi
tro単離して、配列決定し、複製し、および／または発現させることができるこ
とを意味する。そのうえ、核酸は2以上のポリペプチドをコードすることができ
る。
【００８２】 例えば、「AHBAシンターゼをコードする単離されたDNA分子」は、AHBAシンタ
ーゼRNAの非コーディング鎖に対して相補的であるか、あるいはコーディング鎖
に対して相補的であるか、あるいはAHBAシンターゼをコードするRNAまたはDNAに
対してハイブリダイズしかつ、この分野においてよく知られている方法（例えば
、Sambrook他、前掲、参照）により規定される低い、中程度、またはストリンジ
ェントの条件下に安定に結合して止まる、好ましくは生物学的に活性なポリペプ
チドをコードする、7より多い、好ましくは15、より好ましくは20またはそれよ
り多い順次のヌクレオチド塩基を含有するRNAまたはDNA、またはそれらのフラグ
メントまたは変異型である。
【００８３】 抗生物質耐性を与える遺伝子は、単独で、または他の遺伝子産物と組み合わせ
て、抗生物質に対する耐性を与える、酵素的または他の活性をコードする核酸セ
グメントである。 本明細書において使用するとき、「マイトマイシン」下記のものを包含するが
、これらに限定されない：マイトマイシンA、マイトマイシンB、マイトマイシン
C、ポルフィロマイシン、ミトロマイシン、マイトマイシンD、マイトマイシンE
、マイトマイシンF、マイトマイシンG、マイトマイシンH、マイトマイシンI、マ
イトマイシンJ、マイトマイシンL、マイトマイシンM、マイトマイシンK、アルボ
マイトマイシンA、イソマイトマイシンA、KW2149、KW2149代謝物質、例えば、M
−16およびM−18、FR66979、FK973、FK317、およびFR900482、ならびにそれらの
構造的または機能的同等物（「アナローグ」）、またはそれらの誘導体。
【００８４】 本明細書において使用するとき、用語「誘導体」は、本発明の宿主細胞により
産生された、あるいは本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドを使用
してin vitro製造された特定の化合物が、他の成分、例えば、ペプチドまたは
ポリペプチド分子、例えば、抗体またはフラグメント、核酸分子、糖、脂質、脂
肪、検出可能なシグナル分子、例えば、放射性同位体、例えば、ガンマ放射体、
小さい化学物質、金属、塩、合成ポリマー、例えば、ポリアクチドおよびポリグ
リコリド、界面活性剤およびグリコサミノグリカン（これらは共有結合または非
共有結合に化合物に結合または連鎖されている）を含んでなるように、修飾され
ていることを意味する。
【００８５】 当業者は認識するように、キラル中心を有する本発明の化合物の各原子は、光
学的に活性の状態またはラセミ体の形態で存在することができ、そしてこれらの
状態または形態で単離することができる。いくつかの化合物は多形性を示すこと
ができる。
【００８６】 本発明は、本明細書に記載する有用な特性を有する、任意のラセミ体、光学的
に活性な、多形性または立体異性体の形態、またはこれらの混合物を包含するこ
とを理解すべきであり、光学的に活性な形態を製造する方法（例えば、ラセミ体
の形態の分割により、再結晶化技術により、光学的に活性な出発物質からの合成
により、キラル合成により、またはキラル静止相を使用するクロマトグラフィー
分離により）および本明細書に記載する標準的試験を使用するか、あるいはこの
分野においてよく知られている他の同様な試験により活性を測定する方法は、こ
の分野においてよく知られている。
【００８７】 用語「配列相同性」または「配列同一性」は、2つの核酸配列間の比率または2
つのアミノ酸配列間のアミノ酸合致を意味する。配列相同性を百分率、例えば、
50％として表すとき、百分率がいくつかの他の配列に比較して配列の長さにわた
って合致する比率を意味する。ギャップ（2つの配列のいずれかにおける）は合
致を最大するために許容される；15またはそれより小さい塩基のギャップ長さが
通常使用され、6またはそれより小さい塩基は好ましく、2またはそれより小さい
塩基はより好ましい。
【００８８】 オリゴヌクレオチドをプローブとして使用するとき、ターゲット核酸とオリゴ
ヌクレオチド配列との間の配列相同性は一般に20の可能なオリゴヌクレオチド塩
基対の合致のうちの17より少ない塩基の合致（85％）；好ましくは10の可能なオ
リゴヌクレオチド塩基対の合致のうちの9より少ない塩基の合致（90％）、そし
てより好ましくは20の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の合致のうちの19より少
ない塩基の合致（95％）である。
【００８９】 部分的または完全な同一性が2つのアミノ酸配列が存在する場合、それらの配
列は相同性である。例えば、85％の相同性は、2つの配列が最大の合致のために
整列されるとき、アミノ酸の85％が同一であることを意味する。ギャップ（合致
する2つの配列のいずれかにおける）は合致を最大するために許容される；5また
はそれより小さいギャップ長さは好ましく、2またはそれより小さい塩基はより
好ましい。あるいは、好ましくは、2つのタンパク質配列（または少なくとも30
アミノ酸長さのそれらに由来するポリペプチド配列）は、この用語を本明細書に
おいて使用するとき、プログラムALIGNを突然変異データマトリックスおよび6ま
たはそれより大きいギャップペナルティーとともに使用して、それらが5より大
きい整列スコア（標準偏差の単位）を有する場合、相同性である。
【００９０】 下記の文献を参照のこと：Dayhoff、M. O.、Atlas of Protein Sequence
and Structure、1972、Vol. 5、National Research Foundation、pp. 10
1−110、およびSupplement 2〜Vol. 5、pp. 1〜10。2つの配列またはそれら
の一部分は、ALIGNプログラムを使用して最適に整列されるとき、それらのアミ
ノ酸が50％またはそれより大きい同一性を有する場合、より好ましくは相同性で
ある。
【００９１】 2またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために、下記
の用語を使用する：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配
列同一性の百分率」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列の比較の
基礎として使用される規定された配列である：参照配列は、例えば、配列リスト
に記載する全長のcDNAまたは遺伝子配列として、より大きい配列のサブセットで
あることができるか、あるいは完全なcDNAまたは遺伝子配列を含んでなることが
できる。
【００９２】 一般に、参照配列は少なくとも20ヌクレオチド長さ、頻繁に少なくとも25ヌク
レオチド長さ、しばしば少なくとも50ヌクレオチド長さである。2つのポリヌク
レオチドは各々（1）2つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全
ポリヌクレオチド配列の一部分）を含んでなることができ、そして（2）2つのポ
リヌクレオチド間で発散する配列をさらに含んでなることができるので、2つ（
またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列の比較は典型的には2つのポリヌ
クレオチドを「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列の類似性の局所的領
域を同定し、比較することによって実行される。
【００９３】 「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用するとき、少なくとも20隣接ヌ
クレオチドの概念的セグメントを意味し、そして比較ウィンドウにおけるポリヌ
クレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適な整列のために参照配列（これは
付加または欠失を含まない）と比較して、20％またはそれより少ない付加または
欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【００９４】 比較ウィンドウを整列するために配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman
（1981）Adv. Appl. Math. 2：482の局所的相同性アルゴリズムにより、Need
lemanおよびWunsch（1970）J. Mol. Biol. 48：443の相同性整列アルゴリズ
ムにより、PearsonおよびLipman（1998）Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）
85：2444の類似性の検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター化実
行（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Pa
ckage Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、ウイ
スコンシン州マディソン）により、または検査により実施することができ、そし
て種々の方法により発生した最良の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたって
相同性の最高の百分率を生ずる）を選択する。
【００９５】 用語「配列同一性」は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウにわた
って同一である（すなわち、ヌクレオチド／ヌクレオチドに基づいて）ことを意
味する。用語「配列同一性の百分率」は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウ
ィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド／ヌクレオチドに基づ
いて）ことを意味する。2つの最適に整列されたポリヌクレオチド配列を比較ウ
ィンドウにわたって比較し、同一核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）
が両方の配列の中に存在する位置の数を決定して合致した位置の数を生成し、合
致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ
）で割り、結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって、用語「
配列同一性の百分率」を計算する。
【００９６】 用語「実質的同一性」は、本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチド
配列の特徴を意味し、ここでポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチド位
置の比較ウィンドウ、頻繁に少なくとも20〜50ヌクレオチドの比較ウィンドウに
わたって参照配列に比較して、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なく
とも90〜95％の配列同一性を有する配列を含んでなり、ここで配列同一性の百分
率は参照配列を比較ウィンドウにわたって合計20％以下の欠失または付加を含む
ことができるポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。
【００９７】 ポリペプチドに適用するとき、用語「配列同一性」は、例えば、プログラムGA
PまたはPESTFITによりデフォルトギャップ重量を使用して、最適に整列したとき
、2つのペプチド配列が少なくとも約80％の配列同一性、好ましくは少なくとも
約90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95％の配列同一性、最も好ま
しくは少なくとも約99％の配列同一性を共有することを意味する。
【００９８】 本発明によれば、マイトマイシン生合成のための全体の経路をコードする単離
、精製された核酸分子、ならびにマイトマイシン生合成遺伝子に連鎖されたポリ
ケタイド生合成遺伝子および糖生合成遺伝子が提供される。望ましくは、核酸分
子はストレプトマイセス（Streptomyces）spp.から単離されたDNAである。本発
明は、さらに、標準的またはストリンジェント条件下に本発明の核酸分子に対し
てハイブリダイズする、単離、精製されたDNA配列を包含する。本発明は、また
、本発明の核酸分子の配列によりコードされることができる、単離、精製された
ポリペプチドを包含することを理解すべきである。
【００９９】 本明細書に記載する本発明は、マイトマイシン、そのアナローグまたは誘導体
、または新規化合物を製造するために使用することができる。マイトマイシンの
商業的化学的合成は不可能である。本明細書に記載する遺伝子クラスターは、抗
生物質のミトサングループ、広範な種類の癌、例えば、非小細胞肺癌、転移性乳
癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および肛門癌の治療において使用される臨床的に処
方される抗腫瘍化合物である化合物、の製造に必要な遺伝子のすべてを含有する
。
【０１００】 こうして、この遺伝子クラスターの単離および特性決定は、マイトマイシン抗
生物質の選択的産生、特定の化合物の過剰産生および過小産生、例えば、ある種
のマイトマイシン抗生物質の過剰産生、および新規化合物、例えば、マイトマイ
シン由来化合物の産生ならびに新規なヌクレオチド位置の番号マイトマイシン関
係化合物の産生を可能とする。例えば、マイトマイシン抗生物質の生合成をベー
スとする修飾の組合わせは、クラスター内の特異的遺伝子の選択的活性化または
崩壊によるか、あるいは広い範囲の生物学的活性についてアッセイされるバイア
スされた生合成ライブラリーの中に遺伝子を組込んで、マイトマイシンにおける
より大きい化学的多様性を誘導することによって、達成することができる。
【０１０１】 それ以上の例は、他の代謝物質、中間体または宿主細胞の成分に対する1また
はそれ以上のマイトマイシン生合成遺伝子の活性のために、新規な非マイトマイ
シン関係化合物を産生するように、特定の宿主細胞の中に1またはそれ以上のマ
イトマイシン生合成遺伝子を導入することを包含する。この遺伝子クラスターか
らのポリペプチドのin vitro発現は、また、少量で産生される既知のマイトマ
イシン化合物の産生に対する酵素的経路、あるいは他の既知または新規のマイト
マイシンへの現在入手可能なマイトマイシンの変換、例えば、ポルフィロマイシ
ンへのマイトマイシンCの変換に対する酵素的経路を提供する。
【０１０２】 マイトマイシン耐性遺伝子は、また、治療を受けている患者に対して、そして
クローンを選択する目的で（例えば、mrdを使用して）より高いマイトマイシン
耐性を提供するために使用することができる。例えば、1またはそれ以上の耐性
遺伝子をヒト骨髄細胞系統の中に挿入して非癌細胞により高い耐性を与え、こう
して癌患者により高い投与量のマイトマイシンを投与できるようにすることがで
きる。そのうえ、マイトマイシンはDNAそれ自体に直接的に作用するので、その
毒性は極めて広く、したがって耐性遺伝子は効率よい選択性で原核生物、菌類、
植物、哺乳動物細胞の培養、および昆虫細胞の培養において使用することができ
るであろう。さらに、調節耐性および輸送遺伝子を使用して、現在伝統的発酵法
により得ることができるよりもいっそうマイトマイシンを合成することができる
、より高い産生性の株をつくることができる。
【０１０３】 さらに、本明細書に記載する本発明は、DNA、例えば、ストレプトマイセス（S
treptomyces）spp.の中に見出されるDNAの遺伝学的再設計により、多様な範囲の
生物分解性PHAポリマーを包含する新規化合物を製造するために使用することが
できる。次いで、組換えPHAシンターゼにより産生されたモノマーを生物分解性
ポリマーに重合する能力について、異なるPHAシンターゼを試験することができ
る。当業者によく知られている方法により異なるモノマー基質に関する特異性に
ついて、PHAシンターゼを試験することができる。
【０１０４】 PHAモノマーシンターゼおよびPHAシンターゼにより産生されるPHAの潜在的使
用および応用は、医学的応用および工業的応用の両方を包含する。PHAの医学的
応用は、外科用ピン、縫合糸、ステープル、スワブ、創傷包帯、血管置換、骨置
換およびプレート、圧電性による骨成長の刺激、および医薬の長期間投与のため
の生物分解性担体を包含する。PHAの工業的用途は、使い捨て物品、例えば、子
供のおむつ、包装容器、びん、包装材料、バッグ、およびフィルム、および除草
剤、殺菌剤、殺虫剤、または肥料の長期間投与のための生物分解性担体を包含す
る。
【０１０５】 動物において、マロニル−CoAからの脂肪酸の新たな生合成はFASにより触媒さ
れる。例えば、ラットFASは、2505アミノ酸残基から成るサブユニット構造を有
する、分子量272,340Daのホモダイマーである。各サブユニットは別々の物理的
ドメインにおいて7つの触媒活性から成る（Amy他、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86：3114（1989））。6つの触媒活性、すなわち、ケトアシルシンターゼ
（KS）、マロニル／アセチルトランスフェラーゼ（M／AT）、エノイルレダクタ
ーゼ（ER）、ケトレダクターゼ（KR）、アシルキャリヤータンパク質（ACP）、
およびチオエステラーゼ（TE）の物理的位置は下記により確立された：
【０１０６】 （1）全FASの制限されたタンパク質分解的消化からの触媒的に活性なフラグメ
ントの単離による、全アミノ酸配列内の種々の活性部位残基の同定、（2）種々
の一官能価タンパク質との配列類似性を示す、FAS内の領域の同定、（3）組換え
タンパク質を産生する触媒的に活性なを有するアミノ酸配列をコードするDNAの
発現、および（4）触媒的に活性なをコードしないDNA、すなわち、リンカー領域
をコードするDNAの同定。（Smith他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73：11
84（1976）；Tsukamoto他、J. Biol. Chem. 263：16225（1988）；Rangan他
、J. Biol. Chem. 266：1980（1991））。
【０１０７】 第7触媒活性、デヒドラーゼ（DH）は、サッカロポリスポラ・エリトレア（Sac
caropolyspora erythraea）のeryAポリケタイドシンターゼ（PKS）遺伝子クラ
スターの3つのオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列
とのFASのアミノ酸比較により、ATとERとの間に物理的に存在するとして同定さ
れた。このPKSを含んでなる3つのポリペプチドを、それらのアミノ酸配列および
構成成分のドメインの順序の両方により、動物FASに類似する「モジュール」か
ら構築する（Donadio他、Gene 111：51（1992）；Benh他、Eur. J. Biochem.
204：39（1992））。
【０１０８】 本発明の1つの態様は、DHが不活性化されているFASを使用する（FAS DH−）
。本発明のこの態様において使用するFAS DH−は、好ましくは真核生物FAS DH
−であり、より好ましくは、哺乳動物FAS DH−である。本発明の最も好ましい
態様は、DH中の活性部位が突然変異により不活性化されているFASである。例え
ば、Joshi他、（J. Biol. Chem. 268：22508（1993））は、部位特異的突然
変異誘発により、ラットFAS中のHis878残基をアラニン残基に変化させた。in v
itro研究により、この変化を有するFAS（ratFAS206）は、アセチル−CoA、マロ
ニル−CoAおよびNADPHからの未熟終結産物として、3−ヒドロキシブチリルCoAを
産生したことが示された。
【０１０９】 FAS DH−は、通常の16−炭素産物、パルミチン酸よりむしろ、未熟終結産物
としてD（−）−3−ヒドロキシブチレートを産生することによって、自然経路の
β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−CoAレダクターゼ活性を置換する。
次いで、この未熟終結産物をPHBシンターゼによりPHBの中に組込むことができる
。 本発明の他の態様は、PHAシンターゼのためのモノマーとして働くことがで
きる、種々のβ−ヒドロキシCoAエステルを産生するために、組換えストレプト
マイセス（Streptomyces）spp.PKSを使用する。I型PKSをコードするDNAの1つの
例はeryA遺伝子であり、これはエリスロマイシンアグリコンデオキシエイリスロ
ノリドB（DEB）の合成を支配する。
【０１１０】 この遺伝子クラスターは、モジュールまたはシンターゼ単位（SU）と命名され
る、6つの反復単位をコードする。各モジュールまたはSUは、1系列の推定上のFA
S様活性を含んでなり、DEB形成に必要な6つの伸長サイクルの1つの役割をする。
こうして、複合体ポリケタイドの中に見出される非対称アシル鎖のプロセシブ合
成はプログラミングされたタンパク質鋳型を使用して達成され、ここで各点にお
ける化学反応は各SUにおける特異性により決定される。
【０１１１】 2つの他のI型PKSはtyl（チロシン）およびmet（メチオニン）遺伝子クラスタ
ーによりコードされる（参照：米国特許出願第09／108,537号、その全体は引用
することによって本明細書の一部とされる）。tylおよびmetによりコードされる
マクロリド多機能的シンターゼは、eryA遺伝子クラスターの中に見出されるより
もより大きい程度の代謝多様性を提供する。eryA遺伝子クラスターによりコード
されるPKSは、メチルマロニルCoAとの鎖伸長のみを触媒し、これに対してtylお
よびmetPKSはマロニルCoA、メチルマロニルCoAおよびエチルマロニルCoAとの鎖
伸長を触媒する。詳しくは、tylPKSは2つのマロニルCoAエクステンダー単位およ
び1つのエチルマロニルCoAエクステンダー単位を含み、そしてmetPKSは1つのマ
ロニルCoAエクステンダー単位を含む。
【０１１２】 各モジュール内の触媒特異性を操作するために、触媒活性をコードするDNAは
非混乱状態に止まらなくてはならない。触媒活性を有するアミノ酸配列、「リン
カー領域」、関係するモジュールのアミノ酸配列間のアミノ酸配列を同定するた
めに、好ましくは2以上の遺伝子クラ ターによりコードされるものを比較する
。リンカー領域は、触媒活性を有するアミノ酸配列よりも保存される程度が低い
アミノ酸配列である。Witkowski、Eur. J. Biochem. 198：571（1991）。
【０１１３】 本発明の別の態様において、TEを有しかつ機能的DHを欠如するI型PKSをコード
するDNAを提供するために、第1モジュールをコードするDNAの3'末端に、モジュ
ールFをコードし、KS、MT、KR、ACP、およびTE触媒活性を含有するDNAを導入す
る。モジュールFは、TEドメインが存在する結果として、PHAモノマー合成の最終
工程において最終（R）−3−ヒドロキシルアシル基を導入する。モジュールFを
コードするDNAはeryAPKS遺伝子クラスターの中に存在しない（Donadio他、前掲
、1991）。
【０１１４】 組換えモノマーシンターゼをコードするDNAを発現ベクターの中に挿入する。
使用する発現ベクターは、発現ベクターで形質転換すべき宿主細胞に依存して変
化する。すなわち、ベクターを導入すべき種々の宿主細胞において遺伝子を効率
よく発現するために必要な、転写、翻訳および／または翻訳後のシグナル、例え
ば、ターゲッティングシグナルを有するベクターを使用する。このようなベクタ
ーはこの分野においてよく知られている方法により構築され、宿主細胞の中に形
質転換される。下記の文献を参照のこと：Sambrook他、Molecular Cloning：A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor（1989）。
【０１１５】 本発明のベクターのために好ましい宿主細胞は、昆虫、細菌、および植物の細
胞を包含する。好ましい昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）細胞、例えば、Sf21、およびトリコデルマ・ニ（Trichoderma n
i）細胞を包含する。好ましい細菌細胞は、大腸菌（Escherichia coli）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびシュードモナス（Pseudomonas）を包含
する。好ましい植物細胞は、単子葉植物および双子葉植物、例えば、トウモロコ
シ、イネ、コムギ、タバコ、マメ科植物、ニンジン、カボチャ、カノーラ（cano
la）、大豆、ジャガイモ、およびその他を包含する。
【０１１６】 そのうえ、真核生物の発現ベクターを構築するとき、真核細胞中の酵素を捜し
出すべき適当な細胞下コンパートメントを考慮しなくてはならない。2つの因子
が重要である：アセチル−CoAの産生部位、およびPHAポリマーを貯蔵するための
利用可能な空間。酵素を特定の細胞下位置に向けるために、組換え分子をコード
する配列にターゲッティング配列を付加することができる。
【０１１７】 バキュロウイルス系は組換えFASまたはPKSモノマーシンターゼをコードするDN
Aの導入に特に適用可能である。なぜなら、大きいサブユニットを収容できる、
転移プラスミドの種類を増加が可能となり、そしてウイルスを高い力価に増殖さ
せることができるからである。そのうえ、昆虫細胞を懸濁培養に容易に採用し、
比較的大きい規模の組換えタンパク質の産生を促進することができる。さらに、
組換えタンパク質は昆虫細胞においてもっぱら可溶性タンパク質として産生され
る傾向があり、こうして、大きい多機能的タンパク質の場合において特に気力を
くじくことがある仕事である、再フォルディングの必要性を回避する。Sf21／バ
キュロウイルス系はミリグラム量の触媒的に活性な組換え脂肪酸シンターゼを日
常的に発現してきている。最後に、バキュロウイルス／昆虫細胞系は、モノマー
を独特の生物分解性ポリマーに重合する能力を有する、異なるシンターゼタンパ
ク質を構築し、分析する能力を提供する。
【０１１８】 本発明の他の態様は、PHAシンターゼをコードするDNAの少なくとも1つおよびP
HAモノマーシンターゼをコードするDNAを宿主細胞の中に導入することである。
このようなシンターゼは下記のものを包含するが、これらに限定されない：アル
カリゲネス・エウトロフス（A. eutrophus）3−ヒドロキシ、4−ヒドロキシ、
および5−ヒドロキシアルカノエートシンターゼ、ロドコッカス・ルベウ（Rhodo
coccus ruber）C3−C5ヒドロキシアルカノエートシンターゼ、シュードモナス
・オレロランス（Pseudomonas olerorans）C6−C14ヒドロキシアルカノエート
シンターゼ、
【０１１９】 シュードモナス・プチダ（P. putida）C6−C14ヒドロキシアルカノエートシ
ンターゼ、シュードモナス・エルジノーサ（P. aeruginosa）C5−C10ヒドロキ
シアルカノエートシンターゼ、シュードモナス・レシノボランス（P. riboflav
ina）C4−C10ヒドロキシアルカノエートシンターゼ、ロドスピリルム・ルブルム
（Rhodococcus rubrum）C4−C7ヒドロキシアルカノエートシンターゼ、ロドス
ピリルム・ゲラチノルス（Rhodococcus gelatinorus）C4−C7、チオカプサ・プ
フェンイギ（Thiocapsa pfennigii）C4−C8ヒドロキシアルカノエートシンター
ゼ、およびバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）C4−C5ヒドロキシ
アルカノエートシンターゼ。
【０１２０】 異なるPHAシンターゼが示す特異性のために、特定のPHAポリマーを産生するた
めに、2以上のPHAシンターゼをコードする1またはそれ以上のDNAの導入を必要と
することがある。異常なモノマー構造を生成するために多機能的タンパク質は変
更されるので、シンターゼの特異性は特定の基質について問題となることがある
。アルカリゲネス・エウトロフス（A. eutrophus）PHAシンターゼは基質として
C4およびC5化合物を利用するので、それは初期の研究についてすぐれたプロトト
ロフのシンターゼであるように思われる。
【０１２１】 なぜなら、それは3−ヒドロキシブチレートおよび4−ヒドロキシブチレートの
コポリマー（Kunioka他、Macromolecules 22：694（1989））ならびに3−ヒド
ロキシバレレート、3−ヒドロキシブチレート、および5−ヒドロキシバレレート
のコポリマー（Doi他、Macromolecules 19：2860（1986））を製造することが
できることが知られているからである。他のシンターゼ、特にシュードモナス・
エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（Timm他、Eur. J. Biochem. 209
：15（1992））およびロドコッカス・ルベウ（Rhodococcus ruber）（Pieper他
、FEMS Microbiol. Lett. 96：73（1992））のシンターゼを、また、本発明
の実施において使用することができる。シンターゼの特異性を分子生物学により
変更することができる。
【０１２２】 本発明のなお他の態様において、FASおよびPHAシンターゼをコードするDNAを
単一発現ベクターの中に導入し、宿主細胞の中に遺伝子を個々に導入することを
排除することができる。 本発明の他の態様は、真核生物または原核生物由来のFASと、PKSモジュールF
とを含んでなる、組換え多機能的タンパク質をコードするDNAの発生である。モ
ジュールFは、2つの追加の炭素を含むように最後鎖エクステンション、および（
R）−3−ヒドロキシアシルCoA成分を生ずる、β−ケト遺伝子産物の還元を実施
するであろう。
【０１２３】 この組換えタンパク質を製造するために、バイモジュールORFのACP−KSドメイ
ン間領域の中に通常見出されるリンカー領域をコードするDNAとFAS TEをコード
するDNAを置換する。次いで、リンカー領域をコードするDNAに対して3'に、モジ
ュールFをコードするDNAを挿入する。異なるリンカー領域、例えば、長さおよび
アミノ酸組成が変化する後述するリンカー領域を試験して、どのリンカーが、最
終の鎖伸長およびケト還元工程のモジュールFへの、発生期の脂肪酸中間体の必
要な転移を最も効率よく仲介またはを可能とするかを決定することができる。
【０１２４】 次いで、タンパク質をコードする生ずるDNAを昆虫細胞、例えば、Sf21細胞、
またはストレプトマイセス（Streptomyces）、またはシュードモナス（Pseudomo
nas）における長鎖β−ヒドロキシ脂肪酸の発現について試験することができる
。期待される3−ヒドロキシC−18脂肪酸は、長鎖アルキル基を受け入れることが
できるPHAシンターゼの潜在的基質として働くことができる。本発明の好ましい
態様は、4〜22間の鎖長さ特異性を有するFASである。
【０１２５】 本発明のこの態様において使用できるリンカー領域の例は下記のものを包含す
るが、これらに限定されない：下記によりコードされるACP−KSリンカー：tylOR
F1（ACP1−KS2；ACP2−KS3）、およびORF3（ACP5−KS6）、eryAORF1（ACP1−KS1 ；ACP2−KS2）、ORF2（ACP3−KS4）およびORF3（ACP5−KS6）。 また、長鎖脂肪酸を発生するFASの能力を制限することによって、より短い鎖
の脂肪酸基を製造するために、このアプローチを使用することができる。KSを使
用して出発する、種々のFAS触媒活性をコードするDNAの突然変異誘発は、短鎖（
R）−3−ヒドロキシ脂肪酸の合成を生ずることがある。
【０１２６】 次いでPHAポリマーをバイオマスから回収する。大規模溶媒抽出を使用するこ
とができるが、費用のかかる。引き続く酵素的および洗浄剤消化プロセスととも
に熱ショックを含む別法もまた利用可能である（Byron、Trends Biotechnical
5：246（1987）；Holmes、Developments in Crystalline Polmers、D. C.
Bassett（編者）、pp. 1−65（1988））。PHBおよび他のPHAは、塩素化炭化
水素により微生物から容易に抽出される。クロロホルムを使用する還流は使用に
費用がかかる；生ずる溶液を濾過して破片を除去し、濃縮し、ポリマーをメタノ
ールまたはエタノールで沈降させ、溶液の中に低分子量脂質を残す。
【０１２７】 より長い側鎖のPHAはPHBよりも低い制限された溶解度を示し、例えば、アセト
ンの中に可溶性である。他の採用される方法は、バイオマスからPHBを抽出する
ためにLafferty他（Chem. Rundschau 30：14（1977））が開示するエチレンカ
ーボネートおよびプロピレンカーボネートの使用を包含する。Scandola他（Int.
J. Biol. Microbiol. 10：373（1988））は、リゾビウム・メリロチ（Rhiz
obium meliloti）を1MのHCl−クロロホルムで抽出すると、アセトンを使用する
ときの1.4ｋ１６に比較して、Mw＝6×104のPHBが生ずることを報告した。
【０１２８】 微生物のPHBまたはPHAの含量、PHAの組成、およびポリマー中のモノマー単位
の分布を決定する方法はこの分野においてよく知られている。ガスクロマトグラ
フィーおよび高性能液体クロマトグラフィーは定量的PHB分析のために広く使用
される。このような方法の概観については下記の文献を参照のこと：Anderson、
Microbiol. Rev. 54：450（1990）。また、ポリマー組成、およびモノマー単
位の分布を決定するために、NMR技術を使用するすることができる。
【０１２９】本発明の核酸分子の変異型 本発明は、低い、中程度のまたは高いストリンジェンシイ条件下に本明細書に
おいて記載する典型的な核酸配列に対してハイブリダイズ核酸配列を包含する。
ハイブリダイズ条件はこの分野においてよく知られている。こうして、変異型ポ
リペプチド、すなわち、少なくとも1つのアミノ酸の置換、挿入、付加または欠
失を有するポリペプチド、または保存的（例えば、サイレント）ヌクレオチド置
換を有する核酸配列（参照：第24図〜第25図）は本発明の範囲内に入る。好まし
くは、本発明の核酸配列によりコードされる変異型ポリペプチドは生物学的に活
性である。本発明は、また、本明細書に記載する核酸配列の天然に存在するアレ
レ変異および突然変異を包含する。
【０１３０】 この分野においてよく知られているように、遺伝子クラスターのデジェネラシ
ーのために、典型的な生合成遺伝子およびそれらのフラグメントによりコードさ
れるポリペプチドと同一のポリペプチドをコードする、多数の他のDNAおよびRNA
が存在する。したがって、本発明は、発現すると、例えば、配列番号96のポリペ
プチド、例えば、一部分をコードする、他のDNAおよびRNAを包含する。マイトマ
イシン、糖またはポリケタイド生合成遺伝子によりコードされるアミノ酸残基の
配列が同定され、そして各特定のアミノ酸残基のためのすべてのトリプレットコ
ドンの知識が得られると、すべてのこのようなエンコーディングRNAおよびDNA配
列を記載することができる。詳しく本明細書に開示したもの以外のDNAおよびRNA
分子、および単に特定のアミノ酸のコドンの変化により特性決定される分子は、
本発明の範囲内に入る。
【０１３１】 20の普通のアミノ酸およびそれらの代表的な略号、記号およびコドンはこの分
野においてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Molecular B
iology of the Cell、第2版、B. Alberts他、Garland Publishing inc.、
New YorkおよびLondon、1989）。また、この分野においてよく知られているよ
うに、コドンはmRNA分子中のヌクレオチドのトリプレット配列を構築し、そして
、それ自体、DNA分子の中に存在する塩基チミジン（T）の代わりに塩基ウラシル
（U）により特徴づけられる。
【０１３２】 ポリヌクレオチド内の同一アミノ酸残基のコドンの簡単な変化は、コードされ
たポリペプチドの構造を変化させないであろう。1例として、配列番号16から理
解することができるように、セリンのTCAコドンはヌクレオチド位置146〜148に
存在する。しかしながら、セリンはTCTコドン、およびTCCコドンによりコードさ
れることができる。セリンの後者のコドンをセリンのTCAコドンと置換すること
、またはその逆は、配列番号16のDNA配列を実質的に変更せず、同一ポリペプチ
ドを生ずる。同様な方法において、記載するコドンを他の同等のコドンで置換す
ることは、本発明の範囲から逸脱しないで同様な方法で実行することができる。
【０１３３】 本発明の核酸の分子、セグメントまたは配列は、また、RNAの分子、セグメン
トまたは配列であることができる。本発明に包含されるRNA分子は、本明細書に
おいて記載するDNA配列のいずれかに対応し、相補的であるか、あるいは低い、
中程度のまたは高いストリンジェンシイ条件下に、それに対してハイブリダイズ
する。典型的な、好ましいRNA分子は、少なくとも1つの本発明のマイトマイシン
、糖またはポリケタイド生合成遺伝子を含んでなるmRNA分子である。
【０１３４】 突然変異を本発明の天然核酸配列に対して行うことができ、突然変異体が他の
配列とともに機能して、同定可能な糖、ポリケタイドまたはマイトマイシンの合
成を集合的に触媒することができるかぎり、このような突然変異体は天然配列の
代わりに使用することができる。このような突然変異は、慣用技術を使用して、
例えば、突然変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、突然変異した配列を
制限エンドヌクレアーゼ消化により遺伝子の中に挿入することによって、天然配
列について実行することができる。
【０１３５】 （例えば、下記の文献を参照のこと：Kunkel、T. A.、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA（1985）82：448；Geisselsoder他、Bio Techniques（1987）5：78
6。）あるいは、ミスマッチ二重らせんの溶融温度より低い温度において天然核
酸配列（一般にRNA配列に対応するcDNA）に対してハイブリダイズするミスマッ
チプライマー（一般に10〜30ヌクレオチド長さ）を使用して、突然変異を実行す
ることができる。プライマー長さおよび塩基組成を比較的狭い限界内に保持しか
つ突然変異塩基を中心に位置させることによって、プライマーを特異的とするこ
とができる。
【０１３６】 ZollerおよびSmith、Methods Enzymol.（1983）100：468。DNAポリメラーゼ
を使用してプライマーエクステンションを実施し、産物をクローニングし、突然
変異したDNAを含有するクローンをプライマー延長した鎖の分離により誘導し、
選択する。また、この技術は多重点突然変異の発生に適用可能である。例えば、
下記の文献を参照のこと：Dalbie−McFarland他、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA（1982）79:6409。また、所望の突然変異を実行するために、PCR突然変異誘
発をできるであろう。
【０１３７】 この分野において知られているいくつかの異なる技術により、例えば、制限エ
ンドヌクレアーゼ部位内の配列を変更し、オリゴヌクレオチドリンカーをプラス
ミドの中にランダムに挿入することによって、X線または紫外線で照射すること
によって、in vitroDNA合成の間に不正確なヌクレオチドを組込むことによって
、誤りがちなPCR突然変異誘発により、合成突然変異体を調製することによって
、またはin vitroでプラスミドDNAを化学物質で損傷することによって、ヌクレ
オチド配列のランダム突然変異を達成することができる。
【０１３８】 化学的突然変異は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドキシルアミン
、塩基を損傷または除去し、これにより正常の塩基対を妨害する因子、例えば、
ヒドラジンまたはギ酸、ヌクレオチド前駆体のアナローグ、例えば、ニトロソグ
アニジン、5−ブロモウラシル、2−アミノプリン、またはアクリジン内位添加因
子、例えば、フロフラビン、アクリフラビン、グイナクリン、およびその他を包
含する。一般に、プラスミドDNAまたはDNAフラグメントを化学物質で処理し、大
腸菌（E. coli）の中に形質転換し、突然変異プラスミドのプールまたはライブ
ラリーとして増殖させる。
【０１３９】 ランダム酵素変異型の大きい集団をin vitroにおいて「組換え増強された突
然変異誘発」により構築することができる。この方法は、例えば、106突然変異
体の、2またはそれ以上のプールを使用し、各々は任意の慣用突然変異誘発技術
を使用して発生させ、次いでクローニングベクターの中に挿入されたヌクレオチ
ド配列をコードする野生型である。
【０１４０】本発明のキメラ発現カセット、ベクターおよび宿主細胞 本明細書において使用するとき、「キメラ」は、ベクターが少なくとも2つの
異なる種からのDNAを含んでなるか、あるいは種の「天然」または野生型におい
て存在しない方法で連鎖またはアソシエートされた、同一種のDNAを含んでなる
ことを意味する。ここにおける形質転換に使用される、組換えDNA配列は、環状
または線状、二本鎖または一本鎖であることができる。
【０１４１】 一般に、DNAの配列またはセグメントは、生ずる形質転換された（組換え体）
宿主細胞の中に存在するDNAの発現を促進する制御配列によりフランクされたコ
ーディング領域を含有することもできる、キメラDNA、例えば、プラスミドDNAの
形態である。本発明の核酸分子またはその一部分の転写単位として働くDNA配列
を別として、DNAの一部分は翻訳されておらず、調節または構造的機能として働
くことができる。例えば、前もって選択したDNAはそれ自体特定の宿主細胞にお
いて活性であるプロモーターを含んでなることができる。
【０１４２】 宿主細胞において機能的な他の因子、例えば、イントロン、エンハンサー、ポ
リアデニル化配列およびその他は、また、DNAの一部分であることができる。こ
のような因子はDNAの機能に必要であるか、あるいは必要でないことができるが
、mRNAの転写、安定性、またはその他に影響を与えることによって、DNAの発現
を改良することができる。このような因子を必要に応じてDNAの中に含めて、細
胞におけるDNAの形質転換の最適な実行を得ることができる。
【０１４３】 「制御配列」は、特定の宿主生物における作用可能に連鎖されたコーディング
配列の発現に必要なDNA配列を意味する。原核細胞ために適当である制御配列は
、例えば、プロモーター、および必要に応じてオペレーター配列、およびリボソ
ーム結合部位を包含する。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、
およびエンハンサーを利用することが知られている。また、宿主細胞の成長に関
係する遺伝子の発現の調節を可能とする、他の調節配列はの望ましいことがある
。調節配列はこの分野において知られており、そして例は調節化合物の存在を包
含する、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにす
る配列を包含する。また、調節因子の他の型は、ベクター、例えば、エンハンサ
ー配列の中に存在することができる。
【０１４４】 「作用可能に連鎖された」は、核酸が他の核酸配列と機能的関係に配置されて
いることを意味する。例えば、前配列または分泌リーダーは、それがポリペプチ
ドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNA
に作用可能に連鎖されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列
の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作用可能に連鎖されている；あ
るいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合、コー
ディング配列に作用可能に連鎖されている。
【０１４５】 一般に、「作用可能に連鎖された」は、連鎖されているDNA配列が隣接であり
、そして、分泌リーダーの場合において、隣接でありかつリーディング相にある
。しかしながら、エンハンサーは隣接である必要はない。連鎖は好都合な制限部
位における結合により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリ
ゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用の実施に従い使用する。
【０１４６】 細胞の中に導入ターゲットDNAは、一般に選択可能なマーカー遺伝子またはリ
ポーター遺伝子または両方をさらに含有して、形質転換しようとする細胞集団か
らの形質転換された細胞の同定および選択を促進する。あるいは、選択可能なマ
ーカーはDNAの別々の片上に存在させ、共形質転換手順において使用することが
できる。選択可能なマーカーおよびリポーター遺伝子の両方を適当な調節配列で
フランクさせて、宿主細胞において発現を可能とすることができる。有効な選択
可能なマーカーはこの分野においてよく知られており、そして、例えば、抗生物
質および除草剤耐性遺伝子、例えば、neo、hpt、dhfr、bar、aroA、dapAおよび
その他を包含する。また、Lundquist他（米国特許第5,848,956号）の表1に列挙
された遺伝子を参照のこと。
【０１４７】 リポーター遺伝子は潜在的に形質転換された細胞を同定し、調節配列の機能性
を評価するために使用される。容易にアッセイできるタンパク質をコードする調
節遺伝子はこの分野においてよく知られている。一般に、リポーター遺伝子は、
レシピエント生物または組織の中に存在しないか、あるいはそれらにより発現さ
れずかつその発現がいくつかの検出容易な特性、例えば、酵素活性により表現さ
れるタンパク質をコードする遺伝子である。リポーター遺伝子の発現は、DNAが
レシピエント細胞の中に導入された後の適当な時間に、アッセイされる。
【０１４８】 原核生物の発現系は好ましく、特に、ストレプトマイセス（Streptomyces）sp
p.と適合性の系は特に重要である。このような系において使用するための制御因
子はプロモーターを包含し、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム
結合部位を含有する。特に有効なプロモーターは、本発明の遺伝子クラスターに
由来する制御配列を包含する。しかしながら、他の細菌プロモーター、例えば、
糖代謝化酵素、例えば、ガラクトース、ラクトース（lac）およびマルトースに
由来するプロモーターは、また、デソサミンをコードする発現カセットにおいて
使用される。
【０１４９】 好ましいプロモーターはストレプトマイセス（Streptomyces）プロモーターで
あり、下記のものを包含するが、これらに限定されない：ermE＊、pikAおよびti
pA。追加の例は下記のものに由来するプロモーター配列を包含する：生合成酵素
、例えば、トリプトファン（trp）、β−ラクタマーゼ（bla）プロモーター系、
バクテリオファージ、ラムダPL、およびT5。さらに、天然に存在しない合成プロ
モーター、例えば、tacプロモーター（米国特許第4,551,433号）もまた細菌宿主
細胞において機能する。
【０１５０】 問題の種々の核酸分子を1またはそれ以上の組換えベクターの中に個々のカセ
ットとして、別々に制御因子とともに、あるいは、例えば、単一プロモーターの
制御下にクローニングすることができる。核酸分子は、他の配列の容易な欠失お
よび挿入を可能とするために、フランキング制限部位を含むことができる。この
ようなユニーク制限部位の設計はこの分野において知られており、そして部位特
異的突然変異誘発およびPCRのような技術を使用して達成することができる。
【０１５１】 ランダム突然変異誘発により発生した配列について、ベクターの選択は突然変
異体配列のプール、すなわち、それらと一緒に使用すべき、ドナーまたはレシピ
エントに依存する。さらに、ベクターの選択は、特許請求の範囲に記載する方法
の引き続く工程において使用すべき宿主細胞を決定する。任意のトランスデュー
ス可能なクローニングベクターは、突然変異体のドナープールのためのクローニ
ングベクターとして使用することができる。しかしながら、突然変異体のドナー
プールをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞の中にクローニングするために
、ファージミド、コスミド、または同様なクローニングベクターを使用すること
が好ましい。例えば、ファージミドおよびコスミドは、それぞれ、M13ファージ
およびλファージよりも大きいDNAフラグメントを挿入し、その中で安定に増殖
する能力のために、好都合なベクターである。
【０１５２】 この方法において使用されるファージミドは、一般に、プラスミドとフィラメ
ント状ファージクローニングベヒクルとの間のハイブリッドを包含する。この方
法において使用されるコスミドは、一般に、cos部位が挿入されているλファー
ジをベースとするベクターを包含する。レシピエントプールのクローニングベク
ターは任意の適当なプラスミドであることができる。突然変異体プールを挿入す
るクローニングベクターは同定するか、あるいは異なる遺伝学的マーカーを収容
し、発現するように構築することができる（参照：例えば、Sambrook他、前掲）
。首尾よいトランスダクションの決定を促進するために、異なるマーカー遺伝子
を有するこのようなベクターを使用する実用性を利用することができる。
【０１５３】 こうして、例えば、使用するクローニングベクターは、大腸菌（E. coli）／
ストレプトマイセス（Streptomyces）シャトルベクター（例えば、下記の文献を
参照のこと：米国特許第4,416,994号、第4,343,906号、第4,477,571号、第4,362
,816号、および第4,340,674号）、コスミド、プラスミド、人工的細菌染色体（
例えば、下記の文献を参照のこと：ZhangおよびWing、Plant Mol. Biol. 35
：115（1997）；Schalkwyk他、Cur. Opin. Biotech. 6：37 91995）；および
MonacoおよびLavin、Trends in Biochem. 12：280（1994）、またはファージ
ミドであることができ、そして宿主細胞は細菌細胞、例えば、大腸菌（E. coli
）、ペニシリウム・パツルム（Penicillium patulum）、およびストレプトマイ
セス（Streptomyces）spp.、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（S. li
vidans）、ストレプトマイセス・ベネズエレ（S. venezuelae）、またはストレ
プトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）、または真核細胞、例えば、菌類
、酵母または植物細胞、例えば、単子葉植物および双子葉植物の細胞、好ましく
は再生可能である細胞であることができる。
【０１５４】 ターゲット細胞を形質転換することができる組換えDNAを構築する一般的方法
はこの分野においてよく知られており、そして構築の同一の組成および方法を利
用して本発明において有効なDNAを産生することができる。例えば、J. Sambroo
k他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor La
boratory Press（第2版、1989）は、適当な構築方法を提供する。
【０１５５】 特定の細胞の中への導入に有効な任意の手順、例えば、リン酸カルシウム沈澱
法、プロトプラスト融合、複合化、リポフェクション、エレクトロポレーション
、およびその他により、組換えDNAを宿主細胞の中に容易に導入することができ
る。 本明細書において使用するとき、用語「細胞系統」または「宿主細胞」は
、十分に特性決定された均質な、生物学的に純粋な細胞集団を意味することを意
図する。これらの細胞は、新形成であるか、あるいはこの分野において知られて
いる方法によりin vitroで「永久分裂能化」された真核細胞、ならびに一次細
胞、または原核細胞であることができる。特に、細胞系統または宿主細胞は、哺
乳動物、植物、昆虫、酵母、菌類または細菌に由来することができる。
【０１５６】 「トランスフェトされた」または「形質転換された」は、少なくとも1つのDNA
配列の存在により変更または増強されているゲノムを有する、任意の宿主細胞ま
たは細胞系統を本発明において包含し、前記DNAはまた遺伝子工学のの野におい
て「異種DNA」、「組換えDNA」、「外因的DNA」、「遺伝子操作された」、「非
天然」、または「外来DNA」と呼ばれ、ここで前記DNAは遺伝子工学のプロセスに
より単離され、宿主細胞または細胞系統のゲノムの中に導入されている。トラン
スフェトされたDNAは、染色体外因子として、または宿主染色体の中に安定に組
込まれた因子として維持されることができる。
【０１５７】 そのうえ、特定の活性を有する組換えポリペプチドは「遺伝子シャフリング」
を介して調製することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Carmeri他
、Nature 391：288（1998）；Patten他、Cur. Opin. Biotech. 8：724（199
7）、米国特許第5,837,458号、第5,834,252号、第5,830,727号、第5,811,238号
、第5,605,793号）。
【０１５８】 ファージミドについて、ファージミドを含有する宿主細胞を感染させると、一
本鎖ファージミドDNAが産生され、パッケージされ、他のファージベクターと同
様な方法においてトランスデューシングファージの形態で細胞から押出される。
ファージミドにより担持される、突然変異体をコードするヌクレオチド配列のク
ローナル増幅は、適当な宿主細胞においてファージミドを増殖させることによっ
て達成される。
【０１５９】 クローナル増幅後、突然変異体のクローニングしたドナープールをヘルパーフ
ァージで感染させて、ヘルパーファージゲノムまたは野生型をコードするヌクレ
オチド配列のファージミド突然変異体アレレを含有するファージ粒子の混合物を
得る。 ヘルパーファージによる宿主細胞の感染、またはトランスフェクションは、一
般に、この分野においてよく知られている方法により達成される（例えば、下記
の文献を参照のこと：Sambrook他、前掲；およびRussel他（1986）Gene 45：33
3−338）。
【０１６０】 ヘルパーファージは、感染性トランスデューシングファージを産生するために
クローニングファージと組み合わせて使用できる任意のファージである。例えば
、クローニングベクターがコスミドである場合、ヘルパーファージは必然的にλ
ファージであろう。好ましくは、クローニングベクターはファージミドであり、
そしてヘルパーファージはフィラメント状ファージ、プライマーエクステンショ
ン反応ファージM13である。
【０１６１】 必要に応じてファージミドをヘルパーファージで感染させ、ファージ粒子の混
合物を得た後、トランスデューシングファージをサイズの差に基づいて（Barnes
他（1983）Methods Enzymol. 101：98−122）、または他の同様に有効な技術
によりヘルパーファージから分離することができる。
【０１６２】 ここで、突然変異体プールをコードするヌクレオチド配列がその中にトランス
デュースまたは形質転換された、コロニー的に増幅されたレシピエントの中に、
クローニングされたドナー突然変異体の全体のスペクトルをトランスデュースす
ることができる。開示しかつ特許請求の範囲に記載する方法において使用するこ
とができるレシピエント細胞は、例えば、大腸菌（E. coli）であるか、あるい
は組換え欠如ではない、他の細菌発現系であることができる。組換え欠如細胞は
、組換え事象が大きく減少されている細胞、例えば、大腸菌（E. coli）のrec- 突然変異体である（参照：Clark他（1965）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5
3：451−459）。
【０１６３】 これらの形質転換体はここで所望の発現されたタンパク質の特性または特徴に
ついて選択し、必要な場合または所望ならば、増幅することができる。必要に応
じて、突然変異体の各プールをその中にクローニングするファージミドを異なる
遺伝学的マーカーを発現するように構築する場合、前述したように、形質導入体
はドナーおよびレシピエントの両方のプラスミドマーカーの発現により選択する
ことができる。 次いで前述の方法により発生した組換え体を適当な方法、例えば、酵素活性ま
たは生物学的活性により選択またはスクリーニングすることができる。
【０１６４】 増幅、感染、トランスダクション、および組換えの前述のサイクルは、プラス
ミド上でクローニングした追加のドナープールを使用して、任意の回数反復する
ことができる。前述したように、突然変異体の各プールをその中にクローニング
すべきファージミドは異なるマーカー遺伝子を発現するように構築することがで
きる。各サイクルは独特な突然変異体の数を106のファクターまで増加すること
ができるであろう。こうして、任意の個々の細胞におけるアレレ間の組換え事象
が発生する確率がf（実際に組換えする突然変異体間の距離の関数であるパラメ
ーター）である場合、106アレレ突然変異体の2つのプールからトランスデュース
された培養は1012／f細胞の集団において1012までの独特な突然変異体を発現す
るであろう。
【０１６５】本発明のポリペプチドの調製、単離および修飾 本発明の単離、精製されたポリペプチド、その変異型またはフラグメントは、
例えば、固相ペプチド合成法または組換えDNAアプローチ（上を参照）により、i
n vitroで合成することができる。固相ペプチド合成法は確立され、広く使用さ
れている法であり、下記の参考文献に記載されている：Stewart他、Solid Phas
e Peptide Synthesis、W. H. Freeman Co.、San Francisco（1969）；Mer
rifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149（1963）；Meienhofer、″Hormonal
Proteins and Peptides″、C. H. Li編、Vol. 2（Academic Press、197
3）、pp. 48−267；BavaayおよびMerrifield、″The Peptides″、E. Gross
およびF. Meienhofer編、Vol. 2（Academic Press、1980）、pp. 3−285；
およびClark−Lewis他、Meth. Enzymol. 287：233（1997）。
【０１６６】 これらのポリペプチドは下記の手段によりさらに精製することができる：イム
ノアフィニティーまたはイオン交換カラム上の分画；エタノール沈降；逆相HPLC
；シリカまたはアニオン交換樹脂、例えば、DEAE上のクロマトグラフィー；クロ
マトフォーカシング；SDS−PAGE；硫酸アンモニウム沈降；例えば、Sephadex G
−75を使用する、ゲル濾過；またはリガンドアフィニティークロマトグラフィー
。
【０１６７】 特に、精製において有効なアミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドを調製
する、例えば、Hisタグはニッケルカラム上の融合ポリペプチドを精製するため
に有効である。いったん単離され、特性決定されると、所定のポリペプチドの誘
導体、例えば、化学的に誘導された誘導体を容易に調製することができる。例え
ば、本発明のポリペプチドのアミドは、また、カルボン酸基または前駆体をアミ
ドに変換するためにこの分野においてよく知られている技術により調製すること
ができる。C末端のカルボキシル基においてアミドを形成する好ましい方法は、
適当なアミンで固体支持体からポリペプチドを切断するか、あるいはアルコール
の存在下に切断して、エステルを形成し、次いで所望のアミンでアミノ分解する
ことである。
【０１６８】 本発明のポリペプチドまたはポリペプチド変異型のカルボキシル基の塩は、通
常の方法において、ポリペプチドを1またはそれ以上の所望の塩基の同等物と接
触することによって調製することができ、このような塩基の同等物の例は次の通
りである：金属ヒドロキシド塩基、例えば、水酸化ナトリウム；炭酸塩または重
炭酸塩の塩基、例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム；またはアミン
塩基、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、およびその他。
【０１６９】 ポリペプチドまたはポリペプチド変異型のアミノ基のN−アシル誘導体は、最
後縮合反応のためにN−アシル保護されたアミノ酸を利用するか、あるいは保護
されたまたは非保護のポリペプチドをアシル化することによって調製することが
できる。O−アシル誘導体は、例えば、遊離ヒドロキシペプチドまたはペプチド
樹脂をアシル化することによって調製することができる。いずれのアシル化も標
準的アシル化試薬、例えば、アシルハライド、無水物、アシルイミダゾール、お
よびその他を使用して実施することができる。両方のN−アシル化またはO−アシ
ル化を、必要に応じて、実施することができる。
【０１７０】 ポリペプチド変異型が生物学的に活性であるかぎり、ポリペプチドの残基の1
またはそれ以上を変更することができる。例えば、変異型は対応する非変異型ポ
リペプチドの生物学的活性の少なくとも約1％を有することが好ましい、例えば
、保存的アミノ酸置換は好ましい−−すなわち、例えば、酸性アミノ酸としてア
スパラギン酸−グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてリシン／ヒスチジン；疎水
性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン、メチオニン／バリン、アラニン／バ
リン；親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン／トレオニン。保存的
アミノ酸置換は、また、側鎖に基づくグルーピングを包含する。
【０１７１】 例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の1グループは、グリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有す
るアミノ酸の1グループは、セリンおよびトレオニンである；アミドを含有する
側鎖を有するアミノ酸の1グループは、アスパラギンおよびグルタミンである；
芳香族側鎖を有するアミノ酸の1グループは、フェニルアラニン、チロシン、お
よびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の1グループは、リシ
ン、アルギニン、およびヒスチジンである；そして硫黄を含有する側鎖を有する
アミノ酸の1グループは、システインおよびメチオニンである。
【０１７２】 例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸塩に
よりアスパラギン酸塩の置換、セリンによりトレオニンの置換、または構造的に
関係するアミノ酸によりアミノ酸の同様な置換は、生ずる変異型ポリペプチドの
特性に対して主要な作用をもたないことを期待することは合理的である。アミノ
酸変化が機能的ポリペプチドを生ずるかどうかは、ポリペプチド変異型の特異的
活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。
【０１７３】 保存的置換は第25図に典型的な置換の題目の下に示されている。より好ましい
置換は好ましい置換の題目の下に存在する。置換が導入された後、変異型を生物
学的活性についてスクリーニングする。 本発明の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般に、（a）置換の領域におけるペ
プチドバックボーンの構造、（b）ターゲット部位における分子の電荷または疎
水性、または（c）側鎖の嵩を維持することに対する作用において有意に異なら
ない置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、普通の側
鎖の特性に基づいて下記のグループに分割される：
【０１７４】 （1） 疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile； （2） 中性の親水性；cys、ser、thr； （3） 酸性：asp、glu； （4） 塩基性：asn、gln、his、lys、arg； （5） 鎖の向きに影響を及ぼす残基：gly、pro；および （6） 芳香族：trp、tyr、phe。
【０１７５】 本発明は、また、非保存的置換を有するポリペプチド変異型を包含する。非保
存的置換は、前述のクラスの1つのメンバーを他のメンバーと交換することを伴
う。 ポリペプチドまたは変異型ペプチドの酸付加塩あるいはポリペプチドまたは変
異型ペプチドのアミノ残基の酸付加塩は、ポリペプチドまたはアミンを1または
それ以上の当量の所望の無機酸または有機酸、例えば、塩酸と接触させることに
よって製造することができる。ポリペプチドのヘキシル基のエステルは、また、
この分野において知られている通常の方法により製造することができる。
【０１７６】本発明の抗体 本発明の抗体は標準的技術を使用して調製される。ポリクローナル抗体または
「抗血清」を調製するために、本発明の単離、精製されたポリペプチドである抗
原を動物に接種し、動物が免疫応答を有した後、免疫グロブリンを含有する流体
、例えば、血清から免疫グロブリンを回収する。接種後、抗原を好ましくは担体
ポリペプチドに結合させ、生物学的に適当な乳化剤、例えば、フロインド不完全
アジュバントで乳化する。種々の哺乳動物またはトリの宿主を使用して、ポリク
ローナル抗体を調製することができる。
【０１７７】 免疫化後、Igを免疫化された鳥または哺乳動物、例えば、ヤギ、ウサギ、マウ
ス、ラット、またはロバおよびその他から精製する。ある種の応用のために、抗
体が免疫原と反応しない抗体を本質的に含まない組成物を得ることが好ましい。
この組成物は事実上完全に高い力価の、単一特異性の、精製された抗原に対する
ポリクローナル抗体から構成される。抗体はアフィニティークロマトグラフィー
により精製することができる。
【０１７８】 アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製は一般にこの分野におい
て知られている（例えば、米国特許第4,533,630号参照）。簡単に述べると、精
製された抗体を固体支持体に結合された精製されたポリペプチド、またはそのペ
プチドと、抗体がポリペプチドまたはペプチドに結合するために十分な時間の間
かつ適当な条件下に、接触させる。このような時間または条件は当業者により容
易に決定される。次いで、例えば、洗浄により、非結合、未反応の抗体を除去す
る。次いで結合した抗体をカラムから抗体の溶離により回収して、精製された単
一特異性ポリクローナル抗体を得る。
【０１７９】 また、既知のハイブリドーマ細胞培養技術により、モノクローナル抗体を調製
することができる。一般に、この方法は、抗体を産生する融合した細胞系統、例
えば、骨髄腫細胞のコンパティブル連続的系統と融合した一次脾細胞を調製し、
そして大量培養において、あるいは骨髄腫細胞系統が由来した、またはコンパテ
ィブルである動物種、例えば、ネズミ種において融合した細胞を成長させること
を包含する。このような抗体は、高度に特異的でありかつ感受性であり、そして
免疫化学的に比較的「純粋」であるので、動物の接種により産生された抗体に比
較して、多数の利点を提供する。本発明の免疫学的に活性なフラグメント、例え
ば、F（ab）フラグメント、scFv抗体、ならびに部分的にヒト化されたモノクロ
ーナル抗体もまた本発明の範囲内に入る。
【０１８０】 こうして、当業者は理解するように、本明細書に記載するハイブリドーマを遺
伝学的に突然変異させるか、あるいは他の変化に付すと同時に、同一の所望の特
異性を有するモノクローナル抗体を産生する能力をハイブリドーマに保持させる
ことができる。本発明は、ハイブリドーマの突然変異体、他の誘導体および子孫
を包含する。
【０１８１】 さらに当業者は理解するように、抗体を組換えDNA技術に付して、もとのモノ
クローナル抗体の特異性を保持する、他の誘導体の抗体、ヒト化またはキメラ分
子または抗体フラグメントを産生することができる。このような技術は、モノク
ローナル抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（CDR）をコー
ドするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワ
ーク領域をコードするDNAと組合わせて、マウス由来モノクローナル抗体を主と
してヒト免疫グロブリン特徴を有するもの変換することを含むことができる（参
照：EP 184187A、2188638A、引用することによって本明細書の一部とされる）
。
【０１８２】 本発明の抗体は、試料中の本発明のポリペプチドの存在または量を検出または
決定するために有用である。抗体がポリペプチドに結合して、前記抗体の少なく
とも一部分と前記ポリペプチドとの間の二成分の複合体を形成するために十分な
時間の間かつ条件下に、抗体を試料と接触させる。当業者は、により容易に決定
このような時間、条件および反応媒質を容易に決定することができる。
【０１８３】 例えば、細胞を溶解して、細胞のタンパク質を含んでなる抽出物を形成する。
あるいは、高分子、すなわち、抗体が細胞の中に入る方法で、無傷の細胞を透過
性とする。次いで、本発明の抗体を、タンパク質抽出物と、例えば、ウェスタン
ブロットにおいてインキュベートするか、あるいは透過性とした細胞と、例えば
、フローサイトメトリー前に、インキュベートして、複合体を形成する。次いで
複合体の存在または量を決定または検出する。
【０１８４】 本発明の抗体をまた不溶性または可溶性の基質にカップリングさせることがで
きる。可溶性基質は、タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンを包含する。好
ましくは、抗体を不溶性基質、すなわち、固体支持体に結合させる。抗体がポリ
ペプチド（リガンド）に結合できる量および方法において、抗体を支持体に結合
させる。所定の基質に関する抗体の使用量は、使用する特定の抗体、特定の基質
、およびリガンドに対する抗体の結合効率に依存する。抗体を任意の適当な方法
において基質に結合させることができる。共有結合、非共有結合、またはイオン
結合を使用することができる。基質上の反応性基に抗体を直接的にまたは結合成
分を通して結合することによって、共有結合を実現することができる。
【０１８５】 固体支持体は、抗体が結合できかつ本発明のアッセイにおいて好都合に使用で
きる、任意の不溶性物質であることができる。このような固体支持体は、透過性
および半透過性膜、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、プ
ラスチックマイクロタイターウェルまたは管、アガロースまたはデキストラン粒
子、セファローズ、およびケイ藻土を包含する。あるいは、抗体を任意の多孔質
または液体の透過性物質、例えば、繊維質（紙、フェルト、およびその他）スト
リップまたはまたはシート、またはスクリーンまたはネットに結合させることが
できる。結合剤がリガンドに結合する抗体の能力を妨害しないかぎり、結合剤を
使用することができる。
【０１８６】 下記の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。実施例1 ．mit／mmc生合成遺伝子クラスターの分子の特性決定および分析 材料および方法 細菌置換およびクローニングベクター コスミドライブラリーの構築および遺伝子崩壊突然変異体発生の源株として、
ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）NRRL 2564を使用した。ラ
イブラリーの構築および引き続いてDNA操作のための宿主株として、大腸菌（E.
coli）DH5αを使用した。
【０１８７】 外来DNAをストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の中に導入す
るための接合性宿主として、大腸菌（E. coli）S17−1株（Mazodier他、1989）
を使用した。コスミドライブラリーを大腸菌（E. coli）／ストレプトマイセス
（Streptomyces）シャトルベクターpNJ1（Tuan他、1990）で構築し、そしてpUC1
19をサブクローニングおよび配列決定のためのベクターとして日常的に使用した
。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）における遺伝子崩壊のた
めに、接合性大腸菌（E. coli）／ストレプトマイセス（Streptomyces）シャト
ルベクターpKC1139（Bierman他、1992）を使用した。
【０１８８】DNA操作 DNA操作のために標準的in vitro技術を使用した（Sambrook他、1989）。スト
レプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノムDNAを標準的手順により
収集した（Hopwood他、1985）。 pNJ1（Tuan他、1990）中のサイズ分画ゲノムDNAのライブラリーをアミコラト
プシス・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）からのリファマイシ
ンAHBAシンターゼ（rifK）遺伝子プローブでスクリーニングした（Kim他、1998
）。
【０１８９】 引き続くコスミドウォーキングにより、推定上のマイトマイシン生合成遺伝子
を含有するストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）染色体DNAの隣
接120kbの領域をマッピングした。M13前方向および逆方向プライマーを配列決定
のためにを使用した（Gibco BRL、マリイランド州ガイサースバーグ）。これを
達成するために、5kbより小さい個々のフラグメントをpUC119の中にサブクロー
ニングし、エクソヌクレアーゼIIIエラーゼ−塩基系（Promega、ウイスコンシン
州マディソン）を使用して、連続希釈サブクローンを発生させた。
【０１９０】DNA配列決定および分析 ABI PRSMTMダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・
リアクション・キット（Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kit）（
Applied Biosystems、英国ワーリントン）を使用して、自動化DNA配列決定を実
施し、大学（the University of Minnesota Advanced Genetic Analysis
Cener）においてアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）モー
ド377 DNA配列決定装置により分析した。
【０１９１】 両方DNA鎖を最小3回重複して配列決定した。マック・ベクター（Mac Vector
）（Oxford Molecular Group、カリフォルニア州マウンテンビュー）およびジ
ーン・ワークス（Gene Works）（Oxford Molecular Group）ソフトウェアを
使用して、配列編纂を実行し、そしてブラスト（Blast）（Altschul他、1990）
およびGCGプログラム（Deverux他、1984）を使用して、配列相同性分析を達成し
た。
【０１９２】崩壊(disruption)突然変異体構築 遺伝子崩壊構築物の発生のための選択マーカーとして、カナマイシン耐性のap
hII遺伝子を含有するpFD666（DenisおよびBrzezinski、1998）からの1.4kbのApa
LI−HindIIIフラグメントを日常的に使用した。ターゲット遺伝子をpUC119の中
にサブクローニングし、ユニーク内部制限部位において切断し、平滑末端とし、
末端平滑された選択マーカーと結合させた。次いでインサートをpUC119からpKC1
139に移し、野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の中に
結合した。
【０１９３】 トランスコンジュガント(transconjugant)をAS1プレート（Baltz、1980）上で
選択し、アプラマイシン、カナマイシン、およびナリジキシン酸をオーバーレイ
し、次いでR5Tプレート（g／L：スクロース 121.1、K2SO4 0.3、MgCl2・6H2O
11.92、グルコース 11.8、酵母エキス 5.89、カサアミノ酸 0.12、微量元
素 2.35ml（Hopwood他、1985）、寒天 25.9、オートクレーブ処理後、下記の
溶液を添加した：0.5％のKH2PO4 11.8ml、5MのCaCl2 4.71ml、1N NaOH 8.25
ml）上で37℃において数世代について増殖した。アプラマイシンおよびカナマイ
シン耐性からアプラマイシン感受性およびカナマイシン耐性に変化する表現型に
基づいて、崩壊突然変異体を選択した。ターゲット遺伝子の染色体コピーが崩壊
したプラスミドを担持するコピーで置換されたことが、サザンブロットハイブリ
ダイズにより確証された。
【０１９４】マイトマイシンCの分析 Nishikohri培地（NishikohriおよびFukui、1978）中で3日間培養することによ
って、MC産生を評価した。培養ブロスを等しい体積の酢酸エチルで2回抽出した
。真空により化学的溶媒を除去した後、粗製ブロス抽出物を50％のメタノールお
よび50％の50mMのpH7.2Tris緩衝液中に溶解し、HPLC（C18逆相カラム）により36
3nmにおいてモニターした。24分にわたってメタノール／50mMのpH7.2Tris緩衝液
系中の20％〜60％の連続的メタノール勾配を使用して、MCを他の抽出成分から分
割した。90％CHCl3／10％MeOH溶媒系を使用して、TLCプレート上のMCを分割し、
検出した。
【０１９５】結果 マイトマイシン生合成遺伝子クラスターの同定 mrdとアミコラトプシス・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）か
らのリファマイシンAHBAシンターゼ（Kim他、1998）をコードするrifK遺伝子と
ハイブリダイズした遺伝子（mitA）とを含有するコスミドクローンの連鎖により
、マイトマイシンクラスターが同定された。引き続いてmitAはマイトマイシン生
合成のための必須であることが示された。なぜなら、染色体コピーの遺伝学的崩
壊はMC産生をブロックし、外因的AHBAで相補されることができたからである（実
施例2）。
【０１９６】 マイトマイシン耐性遺伝子（mrd）の1つとのmitAの結合は、対応する生合成遺
伝子がmitAに対して隣接したことを意味した。コスミドウォーキングを使用して
、mitAに隣接するストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）染色体の
120kbより多くをスパニングする、オーバーラップするDNAフラグメントを得た。
引き続くヌクレオチド配列の分析は55kbのコンディショニングDNAを含み、47遺
伝子がマイトマイシンのアセンブリー、調節および耐性に関係することが明らか
にされた（第2図および第5図）。
【０１９７】
【表１】
【０１９８】mitTはマイトマイシンクラスターの左側境界を定める ヌクレオチド配列分析はmitAの30kbの下流に拡張し、I型ポリケタイドシンタ
ーゼ（PKS、orf9、配列番号18；orf8、配列番号19）およびチオエステラーゼ（T
EII、ofr7、配列番号20）に対応する遺伝子の組を明らかにした。MCはポリケタ
イド経路に由来せず、こうしてorf8崩壊突然変異体は期待されるように正常のMC
産生を示した（表1）。mitAのほぼ20kb下流に、それぞれ、推定上のアミノキネ
ートデヒドロゲナーゼおよびグルコースキナーゼをコードする2つの遺伝子（mit
T、配列番号29およびmitS、配列番号30）が位置した。
【０１９９】 両方はAHBA生合成に関係すると考えられる。なぜなら、それらの同等物がまた
リファマイシン生合成遺伝子クラスター（rifクラスター）の中に存在するから
である（August他、1998）。しかしながら、ofr7とmitTとの間の6つの遺伝子がM
C生合成に関係するかどうかは不明瞭である。なぜなら、2つの推定上のヒドロキ
シラーゼ（orf3、配列番号24およびorf4、配列番号22）および候補のアクチベー
ター遺伝子（orf1、配列番号26）はMC産生においてある役割を演ずることができ
るであろうからである。
【０２００】 orf3およびorf4の両方は、それぞれ、オレアンドマイシンおよびラパマイシン
の生合成についてのOlePおよびRapNに対して最も類似するOrf4（50％の同一性、
50％の類似性）を有するシトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードすることが
予測される（Rodriguez他、1995；Schwecke他、1995）。Orf3はストレプトマイ
セス（Streptomyces）spp.におけるシトクロムP450およびストレプトマイセス・
グリセオルス（Streptomyces griseolus）におけるシトクロムP450−SU2（Hori
i他、1990；Omer他、1990）に対して高度の類似性を示す（49％の同一性、64％
の類似性）。
【０２０１】 OrfIは、それぞれ、アクチノルホジン、ウンデシルプロジギオシン、ダウノル
ビシン、およびセファマイシンの産生を調節するストレプトマイセス（Streptom
yces）抗生物質経路特異的アクチベーターのActII−ORF4、RedD、DnrIおよびCca
Rファミリーに属することがデータベースの解析により明らかにされた（Fernand
ez−Moreno他、1991；Perez−Laraine他、1997；Takano他、1992；Tang他、1996
；WietzorrekおよびBibb、1997）。このグループのアクチベーターの共通の特徴
は、対応する遺伝子の崩壊が対応する抗生物質の産生を壊滅させるが、過剰発現
が代謝物質の産生を数倍増加させることである。
【０２０２】 しかしながら、orf1が崩壊されるとき、突然変異株は正常のMC産生を示した（
表1）。そのうえ、pKC1139においてorf1の追加のコピーを含有する野生型MCプロ
デューサーもまた正常のMC産生プロファイルを有した（表1）。興味深いことに
は、orf4、すなわち、orf1に隣接するシトクロムP450モノオキシゲナーゼをコー
ドする遺伝子の1つは、また、崩壊したとき、正常のMC産生を示した（表1）。こ
うして、mitTはマイトマイシンクラスターの左端にマッピングされるように思わ
れるが、orf1〜orf9は多分ポリケタイド産物の生合成を特定する。
【０２０３】mmcYはマイトマイシンクラスターの右側境界を定める マイトマイシン生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列の分析は、mitAの
30kb上流に拡張され、そして糖代謝に関係する遺伝子に対応するいくつかのorf
が同定された。それらは下記のものを包含する：酸トレハラーゼ（orf12、配列
番号28）、1つのABC型トランスポーター（orf16、配列番号79）、および18kbよ
り多くをスパニングする澱粉分解のための4つの隣接するα−アミラーゼ（orf19
、配列番号82；orf20、配列番号83；orf21、配列番号84；orf22、配列番号85）
（第2図）。
【０２０４】 この領域内の4つの遺伝子（orf11、配列番号27；orf12、配列番号28；orf16、
配列番号79；orf19、配列番号82）の崩壊は野生型レベルのMC産生プロファイル
を有する突然変異体を生じ、それらはマイトマイシンクラスターの外側に存在す
ることが示された（表1）。糖代謝遺伝子のこのグループの開始において、推定
されたキチナーゼをコードする遺伝子（mmcY、配列番号75）は、マイトマイシン
クラスターの上流末端に存在することが提案される。
【０２０５】 これは明らかである。なぜなら、マイトマイシンは生合成前駆体としてD−グ
ルコサミンを必要とし、そしてMmcYはキチンからN−アセチルグルコサミンを発
生させるストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）からのキチナーゼC遺
伝子（chiC）と75％の同一性（85％の類似性）を示すからである（Ohno他、1996
）。さらに、崩壊したorf11およびorf12を有する突然変異体はMC産生に対して作
用をもたなかったが、mmcW（配列番号71）およびmmcX（配列番号72）の両方の崩
壊はMC産生に有意に影響を与えた（表1）。
【０２０６】マイトマイシン耐性遺伝子 抗生物質生合成遺伝子クラスターは典型的には細胞自己保護のための1または
それ以上の遺伝子を含む（SenoおよびBaltz、1989）。以前の研究は、mitAに連
鎖したmrdを有する2つのマイトマイシンC耐性遺伝子（mcrおよびmrd）を同定し
た（August他、1994；Sheldon他、1997；実施例2）。MRDは1：1化学量論でマイ
トマイシンCに結合する耐性タンパク質であることが、引き続く分析において示
された（Sheldon他、1997）。しかしながら、結合した薬剤が細胞の中から外に
輸送されないかぎり、この耐性メカニズムは極めて非効率的であろう。
【０２０７】 事実、mrdから5kb上流において、推定された抗生物質トランスポーターをコー
ドするmct遺伝子（配列番号16、推定上のマイトマイシントランスロカーゼ）が
見出され、第3耐性成分であることが示された（実施例3）。mctは14の予測され
たトランスメンブランドメインを有する484アミノ酸のタンパク質をコードする
。mctの崩壊はMCに対して実質的にいっそう感受性である突然変異体ストレプト
マイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）株を生じたが、大腸菌（E. coli）に
おけるmctとmrdとの共発現は遺伝子の個々の発現に比較してMC耐性レベルを劇的
に増加した。
【０２０８】 対照的に、活性化されたMCを再酸化することができるMCオキシダーゼ（MCRA）
をコードする高いレベルのMC耐性遺伝子（mcrA）（Johnson他、1997）はこのク
ラスターと連鎖しない（August他、1990；実施例2）。興味あることには、デー
タベースの検索において、MCクラスター内に2つのMcrA相同体（MitR、MmcM）が
同定され、それらの両方はFMN／FAD結合モチーフ内に保存された推定上のフロボ
タンパク質をコードする。MitRはMcrAと弱い類似性（26％の同一性、33％の類似
性）を表示したが、MmcMはタンパク質と端対端（54％の同一性、69％の類似性）
整列を示した。mitR（配列番号31）およびMmcM（配列番号61）は遺伝学的に崩壊
され、野生型MC産生レベルを表示したMmcM突然変異体と対照的に、mitR突然変異
株におけるMC産生を実質的に減少させた（表1）。
【０２０９】調節遺伝子 2つの遺伝子、mitQ（配列番号32）およびmmcW（配列番号71）がマイトマイシ
ンクラスターにおいて同定され、経路特異的レギュレーターであると推定される
。MitQは2成分の調節系におけるDNA結合性レギュレーターのOmpR−PhoBサブファ
ミリーに属し、ホスフェート同化経路のメンバー（PhoR−PhoB）（Makino他、19
86）、Fe3+エンテロバクチン応答対（PfeR−PfeS）、およびテルモタガ・マリチ
マ（Thermotaga maritima）からの1つのヒスチジンタンパク質キナーゼ−応答
調節系（HpkA−DrrA）（LeeおよびStock、1996）に対して最大の類似性を有する
。
【０２１０】 典型的には転写アクチベーターとして働くレギュレーターのMitQグループ（Mi
zunoおよびTanaka、1997）と対照的に、MmcWはリプレッサーのMarRグループと高
い配列類似性を示した。最も有意な類似性は、EmrR、大腸菌（E. coli）多薬物
耐性ポンプEmrABの陰性レギュレーター（Lomvskaya他、1995）、およびPacs、エ
ルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）におけるペクチナーゼ、
セルラーゼ、および青色顔料の産生のリプレッサー（Praillet他、1996）に対応
する。有意には、mmcW崩壊突然変異体はMC産生の数倍の増加を表示した（表1）
。
【０２１１】AHBA生合成遺伝子 以前の前駆体組込みの研究において、AHBAはアンサマイシンおよびマイトマイ
シンの両方の天然産物についての中間体であることが証明された（Becker他、19
83；実施例2）。アンサマイシン抗生物質リファマイシンの生合成に関する生化
学、酵素および分子遺伝学の結果を組合わせることによって、FlossはAHBAがア
ンモニア化シキメート経路からホスフェノピルベート（PEP）およびエリトース4
−ホスフェート（E4P）を介して窒素の初期組込みにより誘導されることを提案
した（Kim他、1996）。
【０２１２】 シキメート経路において、PEPおよびE4Pは最初に3−デオキシ−D−アラビノ−
ヘプツロソン酸−7−ホスフェート（DAHP）に変換され、次いで3−デヒドロキネ
ート（DHQ）、3−デヒドロシキメート（DHS）およびシキメートに変換され、そ
れぞれ、DAHPシンターゼ、DHQシンターゼ、およびシキメートデヒドロゲナーゼ
により触媒される（Dewick、1998）。また、キネートはキネートデヒドロゲナー
ゼの作用によりこの経路に入ってDHQを発生する。
【０２１３】 シキメート経路のこの新しい変法を支持する証拠は、下記の実験の観測を包含
する。第1に、PEP、E4P、3,4−ジデオキシ−4−アミノ−D−アラビノ−ヘプツロ
ソン酸（アミノDHQ）および5−デオキシ−5−アミノ−3−デヒドロスキム酸（ア
ミノDHS）を包含する、すべての提案されたアンモニア化シキメート経路の化合
物はアンサマイシン産物からの無細胞抽出物によりAHBAに容易に変換されること
ができるが、初期のシキメート経路中間体、DAHP、DHQ、キニン酸、シキミ酸の
いずれも同一条件下にAHBAの中に組込むことができない（Hornemann、1981；Kim
他、1996）。
【０２１４】 第2に、リファマイシン生合成遺伝子クラスター（rifクラスター）は配列決定
され、そして初期シキメート経路酵素をコードする遺伝子はクラスター内に見出
された（August他、1998）。最後に、AHBAへのアミノDHSの脱水を触媒するリフ
ァマイシンAHBAシンターゼ（RifK）の能力は以前に証明された（Kim他、1998）
。実施例2に記載されているように、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lav
endulae）におけるAHBAシンターゼ遺伝子（mitA）はAHBA生合成のために要求さ
れる。
【０２１５】 rifについて記載したものに類似するAHBA生合成遺伝子の1グループがマイトマ
イシンクラスターにおいて同定された。AHBAシンターゼに加えて、クラスター中
の6つの遺伝子産物は、それらのリファマイシンAHBA生合成遺伝子相同体と高い
配列類似性（43％を超える）を示した。これらの遺伝子産物は、アミノDHQシン
ターゼ（MitP、RifG同等物）、アミノキネートデヒドロゲナーゼ（mitT、RifI同
等物）、オキシドレダクターゼ（MitG、RifL同等物）、ホスファターゼ（MitJ、
RifM同等物）、キナーゼ（mitS、RifN同等物）、およびアミノDHQデヒドラーゼ
（MmcF、RifJ同等物）を包含する。
【０２１６】 リファマイシン対応物に対する有意な類似性に加えて、すべての3つの推定上
のマイトマイシンシキメート経路酵素は、下記のものを包含する、微生物の一次
シキメート代謝酵素との有意な整列を表示した：mitTおよびメタノコックス・ジ
ャンナシイ（Methanococcus jannaschii）からのキネートデヒドロゲナーゼ（A
roE）（28％の同一性、46％の類似性）（Bult他、1996）、MitPおよびヒト型結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）からのDHQシンターゼ（AroB）（46％の同
一性、61％の類似性）（Cole他、1998）、およびMmcFおよびストレプトマイセス
・ケリコロル（S. coelicolor）からのDHQデヒドラターゼ（50％の同一性、662
の類似性）（White他、1990）。
【０２１７】 マイトマイシンクラスターのマッピングされた右端および左端の両側における
15kbの広範な配列決定にかかわらず、RifH（rifクラスターにおけるPEPおよびE4
Pからの新たな生合成における提案された第1酵素）に対応するアミノDAHPシンタ
ーゼ遺伝子は見出されなかった（第2図）。興味あることには、rifH相同体をス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノムDNAからサザンハイブ
リダイズによりクローニングし、マイトマイシンクラスターに類似しないことが
示された。
【０２１８】 マイトマイシンクラスター（MitJ／MitS）およびrifクラスター（RifM／RifN
）における非シキメート経路に関係するホスファターゼ／キナーゼ対の存在は、
これらの2つの遺伝子がAHBA生合成に要求されるという発見をさらに支持する（F
loss、1997）。RifMに対する強い相同性に加えて、MitJはまたアンサマイシン抗
生物質アンサマイシンプロデューサーアクチノシンネマ・プレイオスム・アウラ
ンチクム（Actinosynnema pretiosum auranticum）からのORF8と56％の同一性
（69％の類似性）を示した。かなりの配列類似性を有する他のポリペプチドは、
グリコレート酸化におけるホスホグリコレートホスファターゼのCBBYファミリー
に属する（Schaferjohann他、1993）。
【０２１９】 mitSは、RifNに対して最も類似し（53％の同一性、63％の類似性）、また、ス
トレプトマイセス・ケリコロル（S. coelicolor）およびバシラス・メガテリウ
ム（B. megaterium）からのグルコースキナーゼ（グルコース抑制に関係する）
と有意な類似性を示した（Angell他、1992；Spath他、1997）。MitG、すなわち
、このクラスターにおいて第3の非シキメート経路に関係するAHBA生合成遺伝子
もまた注目に値する。なぜなら、それはオキシドリダクターゼRifLおよびアクチ
ノシンネマ・プレイオスム・アウランチクム（Actinosynnema pretiosum aura
nticum）におけるその同等物に対して独占的類似性（46％の同一性、61％の類似
性）を示すからである。
【０２２０】ミトサン形成遺伝子 前駆体組込み研究は、ミトサンコアがAHBAおよびD−グルコサミンの縮合反応
から組立てられることを確立した。AHBAおよびD−グルコサミンを架橋する3つの
結合の形成に特定の遺伝子産物を帰属させることができないが、mitA（配列番号
97）、mitB（配列番号99）、およびmitE（配列番号44）より下流の2つの遺伝子
はこれらの反応の1つを仲介する酵素をコードするようである。MitBはグリコペ
プチド抗生物質および多糖の生合成に関係するグルコシルトランスフェラーゼの
1グループに対して局所的配列類似性を示し、その典型的な機能は活性化された
糖残基をコア化合物に結合させることである（Yamazaki他、1996；実施例2）。
【０２２１】 しばらくして、MitEは芳香族化合物の嫌気的分解におけるロドシュードモナス
・パルストリス（Phodopseudomonas palustris）からの2つのクローニングされ
た4−ヒドロキシベンゾエート−CoAリガーゼに対して弱い類似性（22％の同一性
、45％の類似性）を示した。また、それは長鎖脂肪酸CoAリガーゼの1グループに
対して、ならびにビタミンK2生合成におけるO−スクシニル安息香酸CoAシンター
ゼに対して類似性を示した（Kwon他、1996）。mitBおよびmitEの両方の崩壊突然
変異体はMC欠陥表現型を有した（表1）。
【０２２２】 AHBAとD−グルコサミンとの縮合反応は2つの異なる方法で開始することができ
る。これはアシル化またはアルキル化反応によるC8a−C9結合の初期の形成、ま
たはAHBA窒素とD−グルコサミンC1アルデヒドとの間のシッフ塩基の形成、およ
び引き続くC8a−C9における閉環を包含する。mitR（配列番号31）、すなわち、2
つのMcrA相同体のうちの1つは閉環反応の1つに関係することができる。
【０２２３】 興味深いことには、MitRはベンゾフェナントリジンアルカロイド形成における
植物ベルベリン架橋酵素（BBE）に対して高い配列相同性（30％の同一性、37％
の類似性）を示し、ここでそれは（S）−レチクリンのN−メチル炭素からの（S
）−スコウレリンのベルベリンブリッジヘッド炭素の異常なC−C結合の形成を触
媒する（DittrichおよびKutchan、1991）。BBEに類似するメカニズムを使用して
、MitBをC8a−C9結合の形成に関係づけることができる。mitR破壊突然変異体に
おけるMC産生の減少は、機能的mitRの非存在下に反応を触媒することができるイ
ソ酵素（例えば、MmcM）の存在のためであることがある。
【０２２４】側鎖基修飾遺伝子 MCの完全なアセンブリーは、コアミトサン環系上のいくつかの部位の機能化を
必要とする。第1に、C−6におけるカルボニル基が完全に還元されなくてはなら
ない。第2に、C−5およびC9aにおいてヒドロキシル化し、次いでC−9aにおいて
メチル化しなくてはならない。第3に、C−7におけるアミン化を多分初期ヒドロ
キシル化および引き続くアミン交換により起こさなくてはならない。第4に、C−
5およびC−8におけるヒドロキシル基を酸化してベンゾキノンを形成させること
が必要である。第5に、C−1におけるN−1aにより分子内アミン化により、アジリ
ジンを形成し、最後に、C−10におけるカルバモイル化により分子のアセンブリ
ーを完結しなくてはならない。このクラスターの中に見出されるいくつかの酵素
はこれらの修飾を触媒し、これらについて後述する。
【０２２５】メチル化 C−9aにO−メチル基を有するMCと対照的に、マイトマイシンAおよびマイトマ
イシンBはまたC−7Oメチル基を含有するが、マイトマイシンB、マイトマイシンD
およびポルフィロマイシンはアジリジン環上にN−メチルを有する（第1図）。放
射能標識化前駆体組込み研究において、マイトマイシン分子中のO−およびN−メ
チル（しかいC−メチルではない）基のすべてはL−メチオニンに由来することが
示された（BezansonおよびVining、1971）。典型的には、大部分のC1反応のため
のメチルドナーはS−アデノシル−L−メチオニン（SAM）であり、これはATPによ
るL−メチオニンの活性化により形成することができる。
【０２２６】 3つのSAM従属的メチルトランスフェラーゼ遺伝子がこのクラスターにおいて同
定された（MitM、MitN、およびMmcRをコードする）、それらのすべては3つの保
存されたS−アデノシルメチオニンまたはS−アデノシルホモシステイン結合モチ
ーフを有する（KaganおよびClarke、1994）（第3図）。興味深いことには、MitM
およびMitN（MC C−9a側鎖のメチル化に関係するようである）のデータベース
検索は、リファマイシンO−メチルトランスフェラーゼ（ORF14）およびエリスロ
マイシンO−メチルトランスフェラーゼ（EryG）（5、86）とより密接な関係を有
する1グループの植物δ−（24）−ステロールC−メチルトランスフェラーゼを明
らかにした（第4図）。
【０２２７】 対照的に、MmcRがストレプトマイセス・アヌラツス（S. anulatus）からのO
−デメチルプロマイシンO−メチルトランスフェラーゼ（44％の同一性、60％の
類似性）およびストレプトマイセス・ペウセチウス（S. peucetius）からのカ
ルミノマイシン4−O−メチルトランスフェラーゼに対して最大の類似性を有する
、他のストレプトマイセス（Streptomyces）抗生物質生合成O−メチルトランス
フェラーゼに最も関係することが、タンパク質データベース検索により明らかに
された（Lacalle他、1991；Madduri他、1963）。MmcRは、キノンへの酸化前に、
MCのフェノール環のO−メチル化に関係することがある。mmcR（配列番号67）お
よびmitM（配列番号36）の両方は、各1つの崩壊がMC産生を完全に壊滅したので
、MC生合成に必須であることが示された（表1）。
【０２２８】 また、SAM独立的メチルトランスフェラーゼ、MmcDがマイトマイシンクラスタ
ーにおいて同定された。MmcDは下記に対して強い相同性を明らかにした：メタノ
バクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrop
hicum）（受け入れ番号2622915）からのマグネシウム−プロトポルフィリンIXモ
ノメチルエステル酸化性シクラーゼ（34％の同一性、53％の類似性）、ならびに
ストレプトマイセス・ウェドモレンシス（Streptomyces wedmorensis）からの
ホスホノアセトアルデヒド（Hidaka他、1995）、ストレプトマイセス・ヒグロス
コピカス（Streptomyces hygroscopicus）からのp−メチルトランスフェラーゼ
（Hidaka他、1995）およびミクロモノスポラ・オリバステロスポラ（Micromonos
pora olivasteospora）からのフォルチマイシンKLメチルトランスフェラーゼ（
Kuzuyama他、1995）。
【０２２９】 SAMの代わりに、このグループのメチルトランスフェラーゼは直接的メチルド
ナーとしてメチルコバラミンまたは構造的に関係するプロトポルフィリンを使用
する。最大数の合致がプロトポルフィリンメチルトランスフェラーゼに対してな
されたが、この酵素はマイトマイシンC生合成経路において他の機能を有するこ
とが期待される。なぜなら、MCのすべてのO−およびN−メチル基はSAM従属的メ
チルトランスフェラーゼに由来することが示されたからである。
【０２３０】C−6カルボニル還元 C−6メチル基は以前にAHBAのカルボン酸の還元から誘導されることが示された
。なぜなら、［カルボキシ−13C］AHBAをポルフィロマイシンのC−6メチル基の
中に効率よくかつ特異的に組込むことができるからである（Anderson他、1980）
。マイトマイシンクラスターにおいて、4つのF420従属的テトラヒドロメタノプ
テリン（H4MPT）レダクターゼ遺伝子（MitH、MitK、MmcI、MmcJをコードする）
および1つのH4MPT：CoMメチルトランスフェラーゼ遺伝子（MmcEをコードする）
はC−6カルボニル還元のための候補である。
【０２３１】 メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Methanobacterium thermo
autotrophicum）のメタン発生経路において、2つのコファクター従属的H4MPTレ
ダクターゼ、および1つのコファクターCoM従属的メチルトランスフェラーゼはCO 2 からCH4への7工程の還元において要求される。CH−H4MPTからCH2−H4MPT、およ
びCH3−H4MPTからCH3−CoMへの工程4〜6は、それぞれ、N5，N10−メチレン−H4M
PTデヒドロゲナーゼ、N5，N10−メチレン−H4MPTレダクターゼ、およびN5−メチ
ル−H4MPT：CoMメチルトランスフェラーゼにより触媒される（Deppenmeier他、1
966；Thauer他、1993）。
【０２３２】 このクラスターにおけるすべての4つの酵素は、クローニングされたF420従属
的H4MPTレダクターゼに対する局所的配列類似性を示した（いくつかの50アミノ
酸フラグメントにおいて、42％の同一性、62％の類似性）（Noilling他、1995；
VaupelおよびThauer、1995）。これらの遺伝子の1つ、mitH（配列番号41）を崩
壊させ、そして突然変異株はMC欠陥表現型を表示した（表1）。
【０２３３】 推定されたタンパク質配列はメタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム
（Methanobacterium thermoautotrophicum）からのH4MPT：CoMメチルトランス
フェラーゼのN末端に対して有意な整列（33％の同一性、56％の類似性）を示す2
つのドメインを含有する（Stupperch他、1993）が、残りのC末端は脂肪酸生合成
アシル担体タンパク質（ACP）に関係する（Morbidoni他、1996；Platt他、1990
）。MC生合成におけるACP様ドメインの潜在的機能、ならびにMmcE（配列番号53
）の直ぐ上流において同定された推定上のACPをコードする独特な遺伝子（mmcB
、配列番号50）の役割は未知のままである。有意には、mmcBの崩壊はMC産生を完
全に阻害した（表1）。
【０２３４】ヒドロキシル化 マイトマイシンクラスターにおいて同定された2つの推定上のヒドロキシラー
ゼ（mmcN、配列番号62およびmmcT、配列番号69によりコードされる）は、マイト
マイシン系上のC−5、C−7、およびC−9a位置におけるヒドロキシル化を触媒す
る候補である。MmcNはモノオキシゲナーゼのシトクロムP450ファミリーに属し、
ストレプトマイセス・グリセオルス（Streptomyces griseolus）からの2つの除
草剤誘導可能なシトクロムP450（P450−SU1およびP450−SU2）、ならびにストレ
プトマイセス・ヒグロスコピカス（S. hygroscopicus）からのラパマイシン生
合成遺伝子クラスターにおけるRapJおよびRapNに対して最大の相同性（37％の同
一性、56％の類似性）を有する（Omer他、1990；Schwecke他、1995）。
【０２３５】 MmcTはストレプトマイセス・グラウセセンス（Streptomyces glaucescens）
におけるテトラセノマイシンCヒドロキシラーゼ（TcmG）に対して最高の類似性
を示し、フェノールまたはヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼの1グルー
プに対して低いが、有意な配列類似性を有する（Decker他、1993）。mmcTの遺伝
学的崩壊はMC生合成をブロックした（表1）。
【０２３６】カルバモイル化 MCのカルバモイル基は、組込まれた前駆体としてカルバモイルホスフェートを
使用してL−シツルリンまたはL−アルギニンから無傷で誘導される（Hornemann
、1981）。真性細菌において、カルバモイルホスフェートはL−グルタミン、HCO 3 、およびATPから、ピリミジン生合成のために不可欠である、酵素カルバモイル
ホスフェートシンターゼにより発生させることができる。1つの候補のカルバモ
イルトランスフェラーゼ遺伝子（mmcS、配列番号68）はmmcTの上流から直接同定
された。
【０２３７】 MmcSはO−カルバモイル化酵素のNoduU／CmcHファミリーに属し、リゾビウム(R
hizobium)sp.からのNolOに対して最大の類似性（35％の同一性、44％の類似性）
を有する。このファミリーにおいて有意な整列を有する他のメンバーは、ブラデ
ィリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）からのNolO（Luka
他、1993）およびNod−因子の6−O−カルバモイル化のためのリゾビウム(Rhizob
ium)sp.からのNodU（Jabbouri他、1995）およびセファマイシン生合成における3
'−ヒドロキシメチルセファムO−カルバモイル化のためのノカルジア・ラクタム
ヅランス（Nocardia lactamdurans）およびストレプトマイセス・クアブリゲル
ス（S. clavuligerus）からのCmcH（Coque他、1995）を包含する。
【０２３８】論考 架橋性一次および二次代謝 シキメート経路は、芳香族アミノ酸生合成のための微生物および植物における
必須代謝経路である。種々の生物からの初期シキメート経路酵素をコードする遺
伝子は十分に研究されてきており、しばしばゲノム配列決定プロジェクトにより
明らかであるように染色体に沿って分散されている（Blattner他、1997；Bult他
、1996；Cole他、1998）。細菌染色体上でクラスター化している遺伝子を有する
アンモニア化シキメート経路からアンサマイシンおよびマイトマイシン天然産物
が一部分由来するという発見は、一次代謝ネットワークに対して有意な差を有し
、そして二次代謝に導く、重要な進化的架橋を示唆するであろう。
【０２３９】 マイトマイシンおよびアンサマイシン代謝物質への初期シキメート経路中間体
の欠如は、別のアンモニア化シキメート経路酵素の存在および基質特異性を示し
た。しかしながら、対応する一次シキメート経路酵素による、それぞれ、アミノ
DHQおよびアミノDHSへのアミノDAHPおよびアミノシキミ酸の変換（Kim他、1996
）は、一次代謝シキメート経路における基質特異性が主として初期反応工程によ
り決定されること示唆した。この見解は、ほんのわずかに影響を受けたリファマ
イシン産物を示すrifGおよびrifI突然変異体についての崩壊結果により、さらに
支持される（Floss、1997）。 アミノDAHPシンターゼ遺伝子の非存在に加えて
、MCクラスターにおけるAHBA生合成遺伝子の体制化はrifクラスターに比較して
非常に異なる。
【０２４０】 rif（rifJを除外する）において、すべてのAHBA生合成遺伝子は単一の明らか
なオペロンに体制化される、規定されたサブクラスター内に見出される。対照的
に、mit／mmcコード化AHBA遺伝子のほとんどすべては55kbのMCクラスター内で散
乱している。こうして、それらの構築物の線形性が正確な生合成パターンを反映
する、多機能的ポリケタイド遺伝子クラスターと反対に、MCクラスターは同様な
一次的分析に基づいて生化学的に低い透明性を有する。さらに、MCクラスターは
、垂直的に、一次代謝シキメート経路から二次シキメート経路関係ルートに向か
って、かつ水平的に、二次代謝生合成クラスターの異なるグループを比較するこ
とによって、遺伝学的進化を分析するためのすぐれたモデルを提供する。
【０２４１】MC生合成ネットワーク ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の典型的には液体培養に
おいて、MC産生は種子培養物の接種後24時間に開始し、2日に最大産生に到達し
、さらに2日間定常期の間に薬剤合成を維持する。野生型ストレプトマイセス・
ラベンヅレ（S. lavendulae）の高いレベルのMC耐性（＞150μg／ml）に比較し
て、MC産生は比較的低い（＜5μg／mlのMC）。自己耐性と産生レベルとの間の有
意なギャップは、遺伝子操作を通して薬剤産生の改良を可能とする。本明細書に
おいて記載するように、マイトマイシンクラスターにおける候補のリプレッサー
遺伝子（mmcW）および下流のmmcX（推定上の膜タンパク質をコードする）の崩壊
は、MC産生を数倍増加した。
【０２４２】 1またはそれ以上のリプレッサー遺伝子の存在は、ストレプトマイセス（Strep
tomyces）抗生物質生合成遺伝子クラスターにおいて普通ではない。以前の例は
、メチルネオマイシンクラスターからのmmyR（ChaterおよびBriton、1985）、ア
クチノロジンクラスターにおけるactII−orf1（Caballero他、1991）、ジャドマ
イシン生合成（Yang他、1995）におけるjadR（Anderson他、1980）、およびダウ
ノルビシンにおけるdnrO（Otten，1995）を包含する。また、jadRおよびmmyRの
崩壊は対応する抗生物質のレベルを増加した（ChaterおよびBruton、1985；Yang
他、1995）。
【０２４３】 自己毒性を回避するために、薬剤産生微生物は自己保護系を発生しなくてはな
らない。現在、3つの型の自己保護メカニズムがマイトマイシン耐性のためのス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）において同定されてきており
、これらはMC結合（MRD）、流出（MCT）、および逆転MC還元活性化（MCRA）を包
含する。原理的には、耐性遺伝子は薬剤形成前に発現されなくてはならない。こ
れに関して、マイトマイシン耐性遺伝子と調節遺伝子との連鎖の注目することは
興味深いことである。高いレベルの耐性遺伝子mcrAの発現は、多分mcrAと共転写
される、下流遺伝子mcrBにより調節されることが証明された（August他、1994）
。
【０２４４】 マイトマイシンクラスターにおけるMcrA相同体MitRの機能は未知のままである
が、またmitRに引き続いて共転写された調節遺伝子（mitQ）が存在する。膜輸出
／耐性およびリプレッサー遺伝子の遺伝学的連鎖は、下記を包含する、多数の場
合において記載されてきている：テトラサイクリン耐性におけるtetA／tetR（Gu
ilfoileおよびHutchinson、1992）、テトラセノマイシンC耐性におけるtcmA／tc
mR（GuilfoileおよびHutchinson、1992）、アクチノロジン耐性におけるactII−
orf2／actII−orf2（Caballero他、1991）、および黄色ブドウ球菌（S. aureus
）における多薬物耐性のためのqacA／qacR対（Grkovic他、1998）。
【０２４５】結論 MCは40年より以前において単離され、1960年代以来抗癌化学療法において使用
されてきているが、その生合成のメカニズムの詳述および順序は不明瞭のままで
ある。本明細書に記載する結果は1970年代における収集された前駆体組込みの研
究と明瞭に一致し、MCが生合成的にD−グルコサミン、L−メチオニン、カルバモ
イルホスフェート、およびAHBAから誘導されることを示し、また、AHBAに導く変
異型の新しいシキメート経路の使用を支持する（Hornemann、1981；Kim他、1996
）。ミトサンおよびアジリジン環の形成に関係する遺伝子の、全部でないにして
も、多数は55kbのマイトマイシンクラスターの境界内に究極的に位置する。これ
らの遺伝子は特に重要である。なぜなら、それらは他の微生物および植物からの
関係する天然産物生合成遺伝子を同定するプローブとして有効であることがある
からである。
【０２４６】 ここに提示したクローニングされた遺伝子は、マイトマイシン生合成および天
然産物のアセンブリーを研究するために有効である。この情報を有することの利
点は、MC産生を数倍増加させた、候補のリプレッサー遺伝子（mmcW）の遺伝学的
崩壊を通して既に証明された。さらに、選択した遺伝子の発現および遺伝学的崩
壊は、臨床的に価値のあるマイトマイシンアナローグ、ならびにいっそう複雑な
天然産物系の生合成を操作するために有効であろう。最後に、このクラスターに
おいて同定されたMC耐性遺伝子および調節遺伝子は、ストレプトマイセス・ラベ
ンヅレ（S. lavendulae）におけるマイトマイシン生合成および調節ネットワー
クに関する重要な洞察を提供する。
【０２４７】実施例2 ．MC生合成に必要な2つの遺伝子の遺伝学的局在化および分子の特性決定 材料および方法 株および培養条件 大腸菌（E. coli）DH5αを液体培地としてLuriaブロス（
LB）またはトリプシンダイズブロス（TSB）（Difco）または寒天平板中で成長さ
せた。大腸菌（E. coli）DH5αF'、一本鎖DNAを収集するための宿主、を37℃に
おいてTBG（1.2％のトリプトン、2.4％の酵母エキス、0.4％のグリセロール、17
mMのK2HPO4、55mMのK2HPO4、および20mMのグルコース）上で成長させた。接合の
ために使用した大腸菌（E. coli）S17−1（Mazodier他、1989）は、10μg／ml
のストレプトマイシンを含むTSB中で成長させた。
【０２４８】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）はTSB中でまたはR5Tプレ
ート上で成長させた。MC産生のために、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）を凍結した菌糸体の1％v／vからNishikohri培地（g／L：グルコー
ス 15、可溶性澱粉 5、NaCl 5、CaCO3 3、酵母エキス 5）中で72時間成長
させた。崩壊突然変異体、MV100、および部位特異的突然変異体、MV102に対する
AHBAのパルス供給は、76時間に収集した培養物の24、43、および57時間において
3つのパルスでpH7.1においてAHBAのナトリウム塩の20mg／mlの溶液の2.5mgの供
給により実施した。
【０２４９】 DNAの調製および増幅 DNAの単離および精製を標準的方法により実行した（Sa
mbrook他、1989）。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）NRRL
2564ゲノムDNAを、変更されたChaterプロトコル（Hopwood他、1988）により単離
した。プラスミドDNAを大腸菌（E. coli）からアルカリ性ドデシル硫酸ナトリ
ウム法により単離した。
【０２５０】 pDHS2002を次のようにして構築した：1.1kbのチオストレプトン耐性遺伝子（t
sr）フラグメントをpDHS5000からSmaI−BamHI消化により取出し、DNAポリメラー
ゼ（Gibco BRL）の大きいフラグメントで平滑末端とし、MscI制限酵素消化pDHS
7601に結合させてpDHS20001を生成した。pDHS7601をMscIで消化すると、mitA遺
伝子のC末端において155ヌクレオチドが除去され、pDHS7601のMscI部位に隣接し
てtsrの平滑末端BamHI部位を結合させると、pDHS20001においてBamHIが再生され
た。
【０２５１】 プライマー仲介部位特異的突然変異誘発（SDM）を使用して、mitAの中にK191A
突然変異を含有するpDHS2015を構築した。プライマー1：5'−GGCAAGGCATGCGAGGG
TCGC−3'（配列番号46）およびプライマー2：5'−TTCCAGAACGGCGCCCTGATGACCGCC
GGC−3'（配列番号47）を使用して、mitAの5'末端の691bpのフラグメントを増幅
した。mitAの3'末端をプライマー3：5'−GCCGGCGGTCATCAGGGCGCCGTTCTGGAA−
3'（配列番号48）およびプライマー5：5'−TCAGAATTCGGATCCGAGGGCCGGAGT−3'（
配列番号86）で増幅して、1151bpのバンドを発生させた（参照：実施例3におけ
る増幅反応条件）。
【０２５２】 プライマー1およびプライマー4とともに初期鋳型としてオーバーラップする69
1および1151bpの単位を使用して、PCRの第2ラウンドを実行して1.8kbのフラグメ
ントを生成した。突然変異化したmitAを含有する最終産物をEcoRI−SphIで消化
し、pDHS7601からの2.1kbのEcoRI−SphIフラグメントおよびEcoRI−HindIII消化
pKC1139に結合してpDSH2015を生成した。前方向プライマー：5'−ACCTACTGCCTCG
ATGCC−3'（配列番号87）および逆方向プライマー：5'−CTGATCCTTCAAGCG−3'（
配列番号88）を使用する配列決定により、pDSH2015中のmitA K191Aの部位特異
的突然変異誘発を実施した。
【０２５３】 mitB崩壊ベクターpDHS7702を次のようにして構築した：pDHS7601をBstBIで消
化し、平滑末端とし、pFD666からの1.4kbのネオマイシン耐性遺伝子のフラグメ
ント（DenisおよびBrzezinski他、1992）（ApaL1−HindIII消化、平滑末端）と
結合させた。生ずる構築物pDHS7701からの5.2kbのEcoRI−HindIIIフラグメント
をpKC1139の中にサブクローニングして、pDHS7702をつくった。
【０２５４】 DNAライブラリーの構築およびスクリーニング ストレプトマイセス・ラベン
ヅレ（S. lavendulae）NRRL 2564ゲノムDNAをSau3AIで部分的に消化し、30〜5
0kgのフラグメントを含有する画分をスクロース勾配遠心により回収し、大腸菌
（E. coli）−ストレプトマイセス（Streptomyces）シャトルベクターpNJ1（Tu
an他、1990）の仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（CIP）処理BglII部位の中に
結合し、次いでパッカジーン・ラムダ（Pacagene Lambda）DNAパッケージング
・システム（Promega）でパッケージした。コスミドライブラリーを大腸菌（E.
coli）DH5αのトランスフェクションにより構築し、100μg／mlのアンピシリ
ンを含有するLBプレート上に出現したコロニーをBioTrace NTニトロセルロース
ブロッティング膜（Gelman Sciences、ミシガン州アンアーバー）に移した。
【０２５５】 コロニーハイブリダイズを製造業者の使用説明書に従い実行した。PCR増幅し
た0.7kbのプラスミドpKN108からのフラグメント（第6図）を使用して、ライブラ
リーをスクリーニングした。PCRに使用したプライマー次の通りであった：5'−G
CGTCCGTGCTGCTGCGCGCGA−3'（配列番号89）および5'−TGCGCGCGCAGCACGGACGC−3
'（配列番号90）。陽性コロニーからのコスミドをスロットブロットハイブリダ
イズにより確証し、そしてマイトマイシン耐性決定因子（mrd）を含有するpDHS3
001からの1.7kbのAflIII−BamHIフラグメント（Sheldon他、1997）をプローブと
して使用して、遺伝学的連鎖を確立した。
【０２５６】 DNAの配列決定および分析 エキソヌクレアーゼIII Erase−a−Base System
（Promega）を使用して、pDHS7601から欠失サブクローンを作った。ABI PRISMT M ダイ″ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション
・キット（Applied Biosystems）を使用して配列決定を実施し、大学（Univers
ity of Minnensota Advanced Genetic Analysis Center）においてアプラ
イド・バイオシステムス（Applied Biosystems）377 DNA配列決定装置で分析
した。
【０２５７】 一本鎖DNAを発生させるために、pUC119における欠失サブクローンを大腸菌（E
. coli）DH5αF'の中に形質転換し、そしてM13K07ヘルパーファージ（GIBCO B
RL）を使用した。ウィスコンシン・ジェネティック・コンピューター・グループ
のソフトウェア（バージョン9.0）（Devereux他、1984）、およびジーン・ワー
クスのソフトウェア（バージョン2.51）（Oxford Molecular Group）を使用し
て、ヌクレオチド配列のデータを解析した。mitABCについての遺伝子バンク受け
入れ番号はAF115779である。
【０２５８】 大腸菌（E. coli）S17−1からストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavend ulae）への接合 下記の変更を加えて、Bierman他の手順（Bierman他、1992）を
使用した。大腸菌（E. coli）S17−1／pDHS2002の単一コピーを使用して、100
μg／mlのアプラマイシンおよび10μg／mlのストレプトマイシンを含有するTSB
の2mlを接種した。37℃において一夜インキュベートした後、100μg／mlのアプ
ラマイシンおよび10μg／mlのストレプトマイシンを含有するTSBブロスの中に1
：100の接種を行った。
【０２５９】 この培養物を37℃において3時間成長させ、細胞をTSBで2回洗浄し、2mlのTBS
の中に再懸濁させて、ドナー大腸菌（E. coli）培養物を形成した。9mlのTSBに
1mlの凍結野生型培養物を接種することによって、レシピエントストレプトマイ
セス・ラベンヅレ（S. lavendulae）培養物を発生させた。29℃において一夜（
16時間）インキュベートした後、培養物を超音波処理により均質化し、この培養
物の2mlを18mlのTBSに接種した。29℃において一夜インキュベートし、超音波処
理して培養物を均質化した後、1mlの接種物をTSBの中に入れた。この培養物を3
時間成長させ、菌糸体をTSBで洗浄し、2mlのTSBの中に再懸濁させて、ストック
レシピエント培養物を形成した。
【０２６０】 ドナークラスターおよびレシピエントクラスターを一緒に9：1、1：1、および
1：1／10のドナー：レシピエントの比で混合し、100μlの細胞混合物をAS1プレ
ート上に広げた（Batz、1980）。プレートを29℃において一夜インキュベートし
、500μg／mlのチオストレプトン、アプラマイシンおよびナリジキシン酸の各々
を含有する水の1mlをオーバーレイした。pUC119対照について、アプラマイシン
およびナリジキシン酸のみをオーバーレイしたが、pDHS7702について、500μg／
mlのカナマイシンをチオストレプトンの代わりに使用した。
【０２６１】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）エキソコンジュゲイトは
ほぼ11〜13日までに10-7〜10-5の範囲の頻度で出現した。pKC1139は温度感受性
ストレプトマイセス（Streptomyces）複製起点を有し、ここで34℃以上の温度に
おいて複製することができない（Muth他、1989）が、ストレプトマイセス・ラベ
ンヅレ（S. lavendulae）宿主は42℃において十分に成長した。こうして、39℃
において数世代にわたってコンジュガントを増殖させた後、二重クロスオーバー
突然変異体が容易に発生した。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendul
ae）トランスコンジュガントからのプラスミド抽出物で大腸菌（E. coli）DH5
αを形質転換することによって、プラスミドの存在を決定した。
【０２６２】 二重クロスオーバーの選択手順 R5Tプレート（50μg／mlのチオストレプトン
およびアプラマイシン）上で成長したストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. la
vendulae）／pDHS2002の単一コロニーを使用して、20μg／mlのチオストレプト
ンを含有するTSBブロスを接種した。39℃において72時間インキュベートした後
、10-4、10-5および10-6希釈アリコートを使用して、50μg／mlのチオストレプ
トンを含有するR5Tプレートを接種した。
【０２６３】 39℃において48時間成長させた後、84コロニーをランダムに取り上げ、各コロ
ニーを別々の50μg／mlのチオストレプトンおよび50μg／mlのアプラマイシンを
含有するR5Tプレート上にパッチングした。84コロニーのうちの1つはチオストレ
プトン耐性およびアプラマイシン感受性の二重クロスオーバー表現型を表示した
。tsr崩壊したmitA遺伝子および統合およびプラスミドpDHS2002の喪失がサザン
ハイブリダイズ分析により確証された。
【０２６４】 MV100／pDSH2015をR5Tプレート上で37℃において2世代にわたって増殖させる
ことによって、MitA K191A部位特異的突然変異体（MV102）を選択した。コロニ
ーを50μg／mlのチオストレプトンを含有するプレートおよび抗生物質を含まな
いプレートに複製した。第1ラウンドにおいて複製した108コロニーのうちで、1
つは正しい（チオストレプトン感受性）表現型を有した。K191A突然変異を確証
するために、mitA遺伝子を染色体からプライマー1および4で増幅した。pDSH2015
の正しい構築を確証するためにを使用した同一配列決定プライマーで、保存され
たリシンカルボニルコドン（AAG）からアラニンコドン（GCC）への突然変異を確
認した。アラニンコドンは前方向および逆方向の両方の配列データにおいて観測
された。
【０２６５】 mitBの突然変異体（MM101）を次のようにして選択した：ストレプトマイセス
・ラベンヅレ（S. lavendulae）／pDHS7702をR5Tプレート上で39℃において5世
代にわたって増殖させた後、前述したように、単一コロニーをR5Tプレート上で
複製させた。試験した300コロニーのうちで、12コロニーは正しい表現型（カナ
マイシン耐性およびアプラマイシン感受性）を表示した。選択されたmitB突然変
異体の遺伝子型をストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノムDN
Aのスロットブロットハイブリダイズにより確証した。
【０２６６】 MC産生の分析 MC抽出に意図したすべての培養物を、Nishikohri（Nishikohri
およびFukui、1975）中で72時間成長させた。すべての場合において、野生型ス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）培養物を突然変異体培養物と
同時に成長させて、MC産生の参照点を得た。mitA K191A MV102突然変異体株の
72時間の、50mlの培養物（250mlのフラスコ）に、125μlのAHBAのナトリウム塩
の20mg／ml溶液（pH7.05）を24、43および55時間に補充した。各場合において、
培養ブロスを菌糸体から遠心により分離し、次いで等しい体積の酢酸エチルで3
回抽出した。
【０２６７】 酢酸エチル抽出液をプールし、溶媒を真空により除去して粗製ブロス抽出物を
得た。MC産生の予備的スクリーンは、シリカゲルプレート（Whatman K6）上の
薄層クロマトグラフィー（TLC）および9：1クロロホルム：メタノールを使用す
る溶離を包含した。80％50mMのTris緩衝液（pH7.1）／20％メタノールから40％5
0mMのTris緩衝液（pH7.2）／60％メタノールまでの勾配を使用するHPLC（C18逆
相カラム）によりUV検出器を363nmに設定して、MC産生をモニターした。
【０２６８】 野生型、MV100、pKC1139ベクター対照粗製抽出物およびMC標準のHPLC注入から
マイトマイシン保持時間において溶離する画分を1cmのディスクに負荷すること
によって、MCのバイオアッセイ検出を実行した。ディスクを抗生物質培地No. 2
寒天平板（Difco）上に配置し、枯草菌（Bacillus subtilis）胞子を直接培地
に添加した。プレートを29℃において一夜インキュベートし、阻害ゾーンを検査
した。外因性AHBAの存在下にMV102によりMC産生を確証するために、MC保持時間
に溶離する画分を収集し、乾燥し、脱塩し、Bio−Ion 20R DS−MS計器（Appli
ed Biosystems）による脱着イオン化質量分析に付した。MC（分子量＝334）−
ナトリウム（分子量＝23）付加物のピーク、［M＋Na］+＝357は、AHBA補充培養
においてMCの存在を示した。
【０２６９】結果 mrdおよびahbas遺伝子はストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae） ゲノムにおいて連鎖されている 。アミコラトプシス・メディテラネイ（A. medi
terranei）AHBAシンターゼ（rifK）遺伝子プローブ（Kim他、1998）を使用する
サザンブロット分析は、BamHI消化したストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. l
avendulae）ゲノムDNAとハイブリダイズした単一3.8kbのバンドを示した（第8図
）。引き続いて、大腸菌（E. coli）−ストレプトマイセス（Streptomyces）シ
ャトルベクターコスミドpNJ1を使用して、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）ゲノムDNAを構築した。
【０２７０】 スクリーニングした5,000コロニーのうちで、21の陽性クローンが同定され、
これらのうちの6つはmrd遺伝子プローブとハイブリダイズした（August他、1994
に記載するmcr遺伝子プローブといずれもハイブリダイズしなかった）。コスミ
ドクローンの制限酵素マッピングおよび相互ハイブリダイズは、mrdおよびスト
レプトマイセス・メディテラネイ（S. mediterranei）AHBAシンターゼ相同遺伝
子がストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノム中で約20kbだけ
離れていることを確立した。推定上のストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. la
vendulae）AHBAシンターゼ遺伝子を担持する3.8kbのBamHIフラグメントをサブク
ローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。
【０２７１】 3つのORFは3.8kbのBamHIフラグメント内で同定される。3 のORF（mitA、mitB
、mitC）が、配列決定された3.8kbのBamHIフラグメント内で同定された（第8図
および第9図）。mitAは1164ヌクレオチドを含んでなり、潜在的リボソーム結合
部位（RBS）、GAAAGG（配列番号91）が先行するATG（配列決定されたフラグメン
トの位置579）から開始する。mitA遺伝子の推定された産物は、41,949Daの予測
されたMrおよび5.62の計算されたpIを有する388アミノ酸の親水性タンパク質を
コードする。
【０２７２】 BLAST（Altschul他、1990）検索は、予測されたMitAタンパク質がAHBAシンタ
ーゼ（AHBAS）と高い配列類似性（約71％の同一性、80％の類似性）を有するこ
とを示し、両方はリファマイシンプロデューサーアミコラトプシス・メディテラ
ネイ（A. mediterranei）（Kim他、1998）および他のアンサマイシン産生放線
菌、例えば、アクチノシンネマ・プレチオスム（Actinosynnema pretiosum）（
アンサミトシン）およびストレプトマイセス・コリヌス（Streptomyces collin
us）（ナフトマイシンAおよびアンサトリエニン）に由来する（第10図）。保存
されたリシン残基を包含する保存されたピリドキサルホスフェート（PLP）補酵
素結合モチーフ（GX3DX7AX8EDX14KX4-5geGGX19G）（配列番号92）を、また、こ
れらの4つのタンパク質の中に見出すことができる（Piepersberg、1994）。
【０２７３】 mitB遺伝子は推定されたRBS（GGAACG）（配列番号93）が先行するGTG（位置18
79）において開始すると予測される。この遺伝子は、28,648Daの予測されたMrお
よび6.06の計算されたpIを有する272アミノ酸のタンパク質をコードする。デー
タベースの配列相同性検索は、mitBの産物が多糖生合成に関係するO−グリコシ
ルトランスフェラーゼの1グループと局所的配列類似性を示すことを明らかにし
た。MitBのN末端における70アミノ酸残基の1つのセグメントは、2つのグリコシ
ルトランスフェラーゼ、それぞれ、多糖（S88）およびスクシノグリカンの生合
成に関係するスフィンゴモナス（Sphingomonas）S88からのSpsLおよびSpsQ、お
よびリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）からのExoOに対して43％の
同一性（36％の類似性）を有する（Becker他、1963）。
【０２７４】 C末端に位置する他の60アミノ酸残基は、ムス・ムスクルス（Mus musculus）
およびホモ・サピエンス（Homo sapiens）からのUDP−GalNAc：ポリペプチドN
−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに対して30％の同一性を表示し
た（Bennett他、1996）。 第3のORF、mitCは位置2694におけるATGから開始し、
これは停止コドンTGAにカップリングされ、27,817Daの分子量および10.45のpIを
有する260アミノ酸のタンパク質をコードする。推定されたタンパク質産物を使
用するデータベース検索は、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium lep
rae）（U15183）からのlmbE遺伝子産物に対して最初の90アミノ酸を超える有意
な類似性（38％の同一性、40％の類似性）を示した。
【０２７５】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）におけるmitAおよびmitB 遺伝子の挿入崩壊 MC生合成について機能的mitAおよびmitB遺伝子の依存性を試
験するために、対応するストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）同
質遺伝子的突然変異株を引き続いて単離するために、遺伝子崩壊構築物を発生さ
せた。
【０２７６】 2つのMscI部位（pDHS7601中のmitA遺伝子のC末端に位置する）間の155bpのフ
ラグメントを、pDHS5000からのチオストレプトン耐性遺伝子を含有する1.1kbのS
maI−BamHIフラグメントと置換することによって、mitA崩壊構築物を作った（第
11A図）。この置換は接合部にBamHI部位を再生し、次いで生ずる構築物を大腸菌
（E. coli）−スフィンゴモナス（Sphingomonas）接合性シャトルプラスミドpK
C1139の中にサブクローンし、次いでストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lav
endulae）の中に接合した。二重クロスオーバー突然変異株（MV100）を期待した
表現型（チオストレプトン耐性、アプラマイシン感受性）に基づいて選択し、さ
らにスロットブロットハイブリダイズにより確証した。
【０２７７】 野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）およびMV100から
のゲノムDNAをBamHIおよびSphIで消化し、pDHS2001からの4.9kbのEcoRI−HindII
I tsr−崩壊mitAフラグメントとハイブリダイズさせた。期待されるように、野
生型株における4.0kbのSphIハイブリダイズしたバンドはMV100において4.9kbに
シフトされたが、野生型における3.8kbのBamHIハイブリダイズバンドは突然変異
体において2つのバンド（2.5kbおよび2.5kb）に変換された（第11B図）。 ネオ
マイシン耐性遺伝子（aphII）をBstBI部位（mitBの5'末端に位置する）の中に挿
入することによって、mitB遺伝子を崩壊させた（第12A図）。
【０２７８】 トランスコンジュガントをカナマイシン／アプラマイシンプレート上で選択し
、二重クロスオーバー突然変異株（MM101）をカナマイシン耐性、アプラマイシ
ン感受性表現型で同定し、引き続いてスロットブロットハイブリダイズにより確
証した。期待されるように、野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lave
ndulae）における3.8kbのハイブリダイズバンドはMM101において5.2kbにシフト
されたが、5.2kbのSacIハイブリダイズバンドは6.6kbにシフトされた（第12B図
）。
【０２７９】 mitAおよびmitB崩壊した株（MV100、MM101）はMC生合成においてブロックされ る 。液体培地中のおよび寒天平板上のMV100およびMM101の成長特徴および形態は
、野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）と同一であった。
HPLCを使用してMV100およびMM101におけるMC産生を定量し（第13A図）、そして
培養抽出物を生物学的アッセイにおいて使用して薬物の存在について試験した（
第13B図）。1mgの野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）培
養抽出物の注入は、HPLCにおいてMC標準と同一保持時間で溶離されるピークを与
えた。
【０２８０】 mitAまたはmitB崩壊した株（MV100、MM101）からの1mgの培養抽出物を注入し
たとき、MCピークは観測しなかった。MC産生の欠如を確証するために、MV100培
養抽出物から得られるHPLC溶出液をMCについて決定された保持時間の範囲にわた
って収集した。この溶出液は枯草菌（Bacillus subtilis）（MCターゲット株）
に対する生物学的活性を欠如したが、野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（
S. lavendulae）の同一保持時間範囲から収集した画分およびベクター対照株培
養抽出物は実質的なレベルの生物学的活性を示した（第13B図）。
【０２８１】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）中のベクターpKC1139の
存在は全粗製抽出物におけるMCの百分率を減少させると同時に、酢酸エチルによ
り抽出可能な材料の全量を増加させることに注目してみることは興味深いことで
ある。これらの2つの作用の組合わせは、野生型培養抽出物に比較して、MCの絶
対量をベクター対照培養抽出物においてほぼ25％だけ減少させる。
【０２８２】 外因性AHBAはMC欠陥mitA K191A突然変異体におけるMC産生を回復させる。培
地の中に外因性3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸を添加することによって、MV
100（mitA挿入崩壊物）の相補を試みたが、HPLCまたは生物学的アッセイにより
測定して、MC産生は回復しなかった。MV100におけるtsr崩壊されたmitAより下流
の遺伝子に対する極性作用は同様に出現した。なぜなら、中程度のコピー数のプ
ラスミド（MV103）上にトランスでmitAを供給しても、また、MC産生を回復する
ことができなったからである。したがって、部位特異的突然変異誘発を使用して
MitA K191A突然変異体を発生させて株MV102を産生した。Kim他（1998）は、ア
ミコラトプシス・メディテラネイ（A. mediterranei）からのAHBAシンターゼが
PLP従属的であり、5−デオキシ−5−アミノ−3−デヒドロスキム酸（アミノDHS
）の芳香族化を触媒することを証明した。
【０２８３】 こうして、保存されたリシン191の窒素はPLPコファクターとシッフ塩基を形成
すると仮定される。リシン191をアラニンと置換すると、コファクターの結合が
妨害され、酵素活性が排除される。野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）中のリシン191をコードするAGGコドンがMV102中のGCCコドンで置
換されることは、ヌクレオチド配列分析により確証された。期待されるように、
MV102はMCを産生しなかったが、培地に外因性AHBAを補充すると、MS（［M＋Na］ + ＝357）、HPLCおよびTLC分析により測定して、MC産生は回復した（表2）。
【０２８４】
【表２】
【０２８５】論考 放線菌における天然産物生合成遺伝子クラスターを同定する有効な方法は、抗
生物質耐性遺伝子をクローニングし、次いで隣接するDNAを構造および調節遺伝
子の存在について研究することを包含した（Butler他、1989；Donadio他、1991
；MotamediおよびHutchinson、1987；Vara他、1985）。抗生物質耐性遺伝子およ
び生合成遺伝子の連鎖は原核生物における一般的特徴であるように見えるが、増
加する数の例は生合成遺伝子クラスターに連鎖することができるか、あるいは連
鎖することができない多重耐性遺伝子座の存在を包含する（Vara他、1985；Seno
およびBaltz、1989；Smith他、1995）。
【０２８６】 MCについて2つの遺伝学的に非連鎖の耐性遺伝子座（August他、1994；Sheldon
他、1997）の同定および特性決定は、MC生合成遺伝子クラスターについて有効な
検索を準備するためのジレンマを発生させた。しかしながら、アミコラトプシス
・メディテラネイ（A. mediterranei）からのAHBAシンターゼ遺伝子を使用する
と、連鎖したMC耐性遺伝子を支持するコスミドクローンを同定するために有効な
プローブが得られた。
【０２８７】 こうして、アミコラトプシス・メディテラネイ（A. mediterranei）AHBAシン
ターゼ遺伝子およびストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）mrd遺
伝子の両方に対してハイブリダイズした、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）ゲノムDNAライブラリーからいくつかのコスミドクローンを単離
すると、MC生合成遺伝子クラスターはmrdに隣接するDNA上に存在することを示し
た。3.8kbのBamHIフラグメントのDNA配列の分析は3つのORFを明らかにし、ORFの
推定されたタンパク質配列はAHBAシンターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、
およびlmbE様産物に対応した。
【０２８８】 前駆体供給実験により決定して、ミトサンコアはAHBAとD−グルコサミンとの
縮合反応を通して形成される（Hornemann、1981）。AHBAはアンモニア化シキメ
ート経路を介してPEPおよびE4Pから誘導されると考えられ、ここでアミンDHSか
らAHBAへの最後の工程はAHBAシンターゼにより触媒される（第7図）（Kim他、19
96；Kim他、1998）。しばらくして、活性化糖残基をコア化合物に結合させる反
応は、マクロリド、グリコペプチド抗生物質および多糖の生合成により特定して
、グリコシルトランスフェラーゼと呼ぶ酵素の1グループにより通常触媒される
（Kahler他、1996；Otten他、1995b；Solenberg他、1997；Yamazaki他、1996）
。
【０２８９】 原理的には、AHBAとD−グルコサミンとの縮合反応は2つの異なる方法で開始す
ることができる（第7図）。1つは求電子性芳香族アルキル化またはアシル化によ
るC8a−C9結合の形成を包含する。第2の可能性はAHBAの窒素とD−グルコサミンC
1アルデヒドとの間のシッフ塩基の形成、および引き続くC8a−C9の閉環を包含す
る。いずれの場合においても、O−グリコシルトランスフェラーゼの代わりにC−
またはN−が期待される。
【０２９０】 以前に記載されたガラクトースは高度の配列分岐を表示する（Yamazaki他、19
96）が、O−グリコシル転移とのメカニズムの類似性により、mitBはグルコサミ
ンをAHBAに連鎖することによってミトサン系の形成を開始するN−グリコシルト
ランスフェラーゼをコードすることが示唆される。mitAおよびmitB遺伝子および
それらの対応する産物は、それぞれ、AHBAおよびミトサン環系の形成を仲介する
候補であるようである。しかしながら、lmbE様タンパク質の可能な機能は不明瞭
のままである。なぜなら、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）
のリンコマイシン生合成経路内のその現在の役割は知られていないからである（
Peschke他、1995）。
【０２９１】 MC生合成におけるAHBAシンターゼ（mitA）および推定上のガラクトース（mitB
）の掛かり合いは、MC生合成において欠如される突然変異体をつくる遺伝子崩壊
により確立された。これはDNAをストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendu
lae）NRRL 2564の中に導入する方法の開発を必要とした。なぜなら、この株は
伝統的スフィンゴモナス（Sphingomonas）プロトプラストおよびエレクトロポレ
ーション仲介形質転換手順に対して不応性に止まるからである。他のこのような
不応性株はATCC 27422を包含するが、これに限定されない。
【０２９２】 変更されたBiermanプロトコル（Bierman他、1992）に従い、大腸菌（E. coli
）−スフィンゴモナス（Sphingomonas）シャトルプラスミドpKC1139を使用して
、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の中への効率よい接合性
転移を実施した。この結果は有意である。なぜなら、それはマイトマイシン生合
成に関係する遺伝子を詳細に分析するために有効な系の開発を可能とするからで
ある。
【０２９３】 培地中で外因性3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸をMV100およびMV102株に供
給することによって、mitAの機能をプロービングすることができる。MV100を相
補する反復した試みにかかわらず、HPLCまたは生物学的アッセイにより測定して
、MC産生は回復されなかった。mitAの中にtsr遺伝子を挿入すると、直ぐ下流に
おいて生合成遺伝子が崩壊されると考えられる。なぜなら、中程度のコピー数の
プラスミド上にmitAをトランスで供給しても、また、MV100に対してMC産生を回
復することができなったからである。
【０２９４】 MitA K191A突然変異株MV102を発生することによって、この推定上の極性作用
は排除された。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のこの突然
変異株に外因性3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸を供給すると、TLC、HPLCお
よび質量分析により示されるように、MC産生は回復した。MV102をAHBA非存在下
に成長させたとき、検出可能なMC産生は存在しなかった。突然変異体MitAタンパ
ク質を相補する3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸の能力は、rifKについての以
前の研究（Kim他、1996）およびデータベースタンパク質配列整列により示され
るように、AHBAシンターゼとしてのMitAの機能を支持する。
【０２９５】実施例3 ．ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）におけるマイト
マイシン耐性は薬物結合性タンパク質従属的輸出系を包含する 化学的または酵素的還元が分子を高度に有効なアルキル化剤とするまで、MCは
プロドラッグとして非反応性である（IyerおよびSzybalski、1964）。MC生物活
性の分子的基礎は、主として、5'−CpG配列においてDNAと共有結合的に相互作用
し、致死的鎖内または鎖間の架橋ならびに一官能価のアルキル化を引き起こす、
その性向に由来する（Tomasz、1995）。
【０２９６】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）は潜在的致死的MC仲介架
橋を回避するとき気力をくじく挑戦に直面する。なぜなら、それは70％を超える
染色体G＋C含量を有し、これは少なくとも1×106潜在的薬剤ターゲット部位／細
胞に翻訳されるからである。事実、マイトマイシン耐性を仲介する2つの遺伝子
座がこの生物において報告された。1つの遺伝子座（mcr）は、レドックスリレー
メカニズムを介してMCの還元された、生物活性化種の酸化を触媒するタンパク質
（MCRA）をコードする（August他、1994；Johnson他、1997）。
【０２９７】 第2遺伝子座（mrd）は、特異的マイトマイシン結合性タンパク質によりプロド
ラッグを封鎖する機能をするMRDをコードする（Sheldon他、1997）。マイトマイ
シン耐性に関する現在のパラドックスは、薬剤輸出のための明瞭なメカニズムの
欠如であった。事実、観測された化学量論により示唆されるように、細胞の自己
保護のための単独のメカニズムとして、MRDを利用することはストレプトマイセ
ス・ラベンヅレ（S. lavendulae）にとって無効であろう。病原性細菌（Nikaid
o、1994）、および抗生物質産生微生物（Cundliffe、1992；MendezおよびSalas
、1998）は、耐性手段として毒性化合物の輸出を使用する。
【０２９８】材料および方法 細菌株、培養条件、および培地。二本鎖プラスミドDNAを発生させるための宿
主として使用する大腸菌（E. coli）DH5αをLB培地上で37℃において成長させ
た。タンパク質発現のための宿主として使用する大腸菌（E. coli）BL21（DE3
）をNZCYM培地（Sambrook他、1989）中で37℃において成長させた。ゲノムDNAを
調製するために、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）NRRL 25
64をYEME培地（Hopwood他、1985）上で30℃において成長させた。
【０２９９】 DNAの調製および増幅。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）
ゲノムDNAをリゾチーム−2X Kirby混合法（Hopwood他、19885）単離した。一般
的DNA操作を以前に記載されたように実施した（August他、1994）。PCRのための
オリゴヌクレオチドおよび配列決定をGibco BRLから入手した。Hybaidサーマル
サイクラー（Haybaid Ltd.、英国テッディングトン）を使用して、PCR増幅を実
施した。
【０３００】 mctのクローニングおよび配列決定。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. l
avendulae）NRRL 2564ゲノムDNAライブラリーを以前に記載されているように（
August他、1994）コスミドベクターpNJ1（Tuan他、1990）中で構築した。mrdを
フランキングする配列を含有するコスミドクローンのインサートDNAをBamHIで消
化し、pUC119のBamHI部位の中にサブクローニングした。エクソヌクレアーゼIII
（Earase−A−Baseキット、Promega、ウイスコンシン州マディソン）を使用して
、1組のネステッド欠失クローンを発生させ、ABI373自動化配列決定装置と共同
してABIプリズムキット（PE Applied Biosystems）を使用してジデオキシ連鎖
停止法により、インサートDNAの両方の鎖を配列決定した。
【０３０１】 10％DMSOを反応に添加して圧縮を減少させた。ジーン・ワークス（Gene Work
s）（Oxford Molecular）を使用して、配列決定を分析した。コンピューター・
グループのバージョン9.0ソフトウェア（Oxford Molecular Group）のBLASTプ
ログラムを使用して、推定されたアミノ酸配列のデータを入手可能なデータベー
スと比較した。mct遺伝子は遺伝子バンクに受け入れ番号AF120930で受託された
。
【０３０２】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のmct突然変異株の構築 mct崩壊ベクターpDHS7704を次のようにして構築した：pDHS7661をEcoRIで消化
し、平滑末端とし、pFD666からの1.4kbのネオマイシン耐性遺伝子フラグメント
（ApaLI−HindIII消化、平滑末端）（Ames、1986）と結合した。生ずる構築物（
pDHS7703）からの5.4kbのEcoRI−HindIIIフラグメントをpKC1139の中にサブクロ
ーニングしてpDHS7704をつくり、Bierman他（1992）に従いストレプトマイセス
・ラベンヅレ（S. lavendulae）の中に接合した。39℃において5世代にわたっ
てR5Tプレート上でトランスコンジュガントを増殖させた後、mct二重クロスオー
バー突然変異体を選択した。カナマイシン耐性およびアプラマイシン感受性コロ
ニーをサザンブロットによりさらに試験して、所望の二重クロスオーバー遺伝子
型を確証した。
【０３０３】 mct発現プラスミドの構築 大腸菌（E. coli）発現プラスミドを構築するた
めに、それぞれ、mctの翻訳開始コドンにおよび翻訳停止コドンの下流にNdeIお
よびHindIII部位を導入した。PCRに使用したプライマー次の通りであった：5'−
GGGAATTCCATATGATGCAGTCCATGTCAC−3'（配列番号94）および5'−GGGAATTCAAGCTT
TCATTCCGCCGGGGTC−3'（配列番号95）。2.8UのTaqポリメラーゼ、0.4μgの各プ
ライマー、鋳型として1μgのpDHS7661、10mMのdATP−dGTP−dCTP−dTTPの各々、
1.5mMのMgCl2、および10μlの10×Promega PCR緩衝液を100μlの全体積でを使
用して、PCRを実施した。
【０３０４】 30サイクルの94℃において30秒間の変性、37℃において1分間のアニーリング
、および70℃において2分間のエクステンションを使用して、増幅を達成した。1
.45kbのPCR生成物を0.8％アガロースゲル電気泳動により回収し、NdeI−HindIII
で消化し、同様にEcoRI−HindIIIで切断された、T7発現プラスミドpET17b（Nova
gen）の中に結合して、pDHS7023を形成した。pDHS7023を形質転換により大腸菌
（E. coli）BL21（DE3）の中に導入して株PJS102を得た。
【０３０５】 mct−MRD共発現プラスミドの構築 プラスミドpDHS7006（Sheldon他、1997）
から、2.1kbのSspIフラグメントを単離した。フラグメントはT7プロモーターの
制御下にmrd遺伝子を含有し、mrdの上流および下流に転写停止配列（rrnBT1）を
含んだ。MscIで切断したMCトランスロカーゼ構築物pDHS7023の中にフラグメント
を結合してpDHS7024を形成した。pDHS7024を形質転換により大腸菌（E. coli）
BL21（DE3）の中に導入して株PJS103を得た。
【０３０６】 大腸菌（E. coli）のMC耐性表現型 大腸菌（E. coli）におけるMCトランス
ロカーゼの発現により与えられる耐性を分析するために、100μg／mlのアンピシ
リン、1.0mMの最終濃度にIPTG、および種々の濃度のMCを含有するLB寒天上に10
μlの株PJS102を広げた。培養物を37℃において一夜成長させ、コロニー形成単
位（CFU）を測定した。同様に、株PJS103（mcr−mrd共発現株）のMC耐性表現型
を定量した。
【０３０７】 株PJS102およびPJS103の［3H］−MC吸収アッセイ ［3H］−MCを協和発酵工業
から入手した。PJS100、PJS102、PJS103および大腸菌（E. coli）BL21（DE3）
：：pT7SCおよびpET17bの全細胞について吸収研究を実施した。IPTGを1mMの最終
濃度に添加した5mlのNCZYM培地中でPJS100、PJS102、およびPJS103ならびにベク
ターのみの培養物を培養した（37℃）（ほぼ3時間の成長）。9時間（後期指数的
成長相）において、細胞を遠心により収集し、1mlのNCZYMブロス（5×濃度）の
中に再懸濁させた。
【０３０８】 後期指数的成長相の細胞の濃縮した懸濁液を、0.022μg／ml（0.0655nmol）の
最終濃度の［3H］−MC（59Ci／mmol）に対して暴露した。アリコート（100μl）
を頻繁な間隔で取出し、1.2μMのGF／Cフィルター（Whatman International、
英国メイドストーン）上に配置し、真空圧下にフィルター上に注いだ6mlの0.85
％NaClで1回洗浄した。タンパク質含量を測定するために、追加のアリコートを
同時に取出した（タンパク質アッセイキット、Bio−Rad Laboratories、カリフ
ォルニア州リッチモンド）。フィルター上の放射能をベックマンLS7000シンチレ
ーションカウンターにより定量した。結果をngのマイトマイシン／mgの細胞とし
て表した。
【０３０９】結果 トランスメンブランタンパク質をコードする遺伝子をmrdに物理的に結合させ
る。以前に特性決定されたMC耐性決定因子（Sheldon他、1997）、mrd遺伝子座を
含有するコスミドクローンのDNA配列分析は、高度に疎水性であることが予測さ
れたポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を同定し
た。このポリペプチドは薬剤産生放線菌中の種々の抗生物質輸出タンパク質に対
して類似性を示す。意味あることには、推定上のマイトマイシン輸出因子（MC−
トランスロカーゼ；MCT）タンパク質をコードする遺伝子（mct、配列番号72）は
mrd（配列番号64）の5kb内に位置し、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターに
物理的に連鎖させる（第15図）。
【０３１０】 mct遺伝子座の配列分析 コスミドクローンpDHS7547のヌクレオチド配列分析
はORFを明らかにし、このORFは位置132におけるATGコドンで開始し、ヌクレオチ
ド1587におけるTGAコドンで終わり（第16図）、50,023ダルトンの予測された分
子量を有する484アミノ酸のポリペプチドを生ずることが予測された。mct遺伝子
の推定されたアミノ酸配列を入手可能なデータベース中のタンパク質と比較する
と、薬剤を与える、いくつかの一体的膜タンパク質に対する有意な類似性を明ら
かにした。
【０３１１】 これらはセファマイシンプロデューサー、ノカルジア・ラクタムヅランス（No
cardia lactamdurans）からのCmcTタンパク質（Coque他、1993）、プロマイシ
ンプロデューサー、ストレプトマイセス・アルボニガー（Streptomyces albong
er）からのPur8タンパク質（Tercero他、1993）、メチレノマイシンプロデュー
サー、ストレプトマイセス・ケリコロル（Streptomyces coelicolor）からのMm
rタンパク質（NealおよびChater、1987）、およびリンコマイシンプロデューサ
ー、ストレプトマイセス・リンコルネンシス（Streptomyces lincolnensis）か
らのLmrA（Zhang他、1992）を包含する。mct遺伝子産物および関係するタンパク
質の類似性は全体の配列にわたって延長し、最高レベルの類似性はアミノ末端領
域内に見出された（第17図）。
【０３１２】 MmrおよびLmrAを包含する、いくつかの抗生物質流出タンパク質のN末端領域内
において、いくつかの高度に保存された構造的モチーフが認められた。β−回転
モチーフ（VxGxLxDxxGRKxxxL）は、トランスメンブランドメインを2および3つの
大部分の真核生物および原核生物の輸出タンパク質に分離する、高度に保存され
た細胞質ループの配列内に見出され、MCTの中の位置79〜95において明瞭に明ら
かである（第16図）。14のトランスメンブランセグメントのファミリー（Paulso
nおよびSkurray（1993））に対して特異的な、トランスメンブランドメイン1の
末端に見出されるモチーフ（LDxTVxNVALP）は、MCTの中の位置41〜51に存在する
。さらに、いくつかの他の不変のモチーフがMCT配列において明らかである。
【０３１３】 活性流出により抗生物質および防腐剤に対する耐性を仲介するトランスメンブ
ランタンパク質は、高度に関係し、通常12または14のトランスメンブラン領域を
含有する。顕著には、MCTとの相同性を共有する、放線菌薬剤輸出タンパク質は1
4のトランスメンブランスパニング領域を含有し、1ファミリーの薬剤耐性トラン
スロカーゼを構築するように思われる。膜構造およびトポロジープログラムMEMS
AT（University College、ロンドン）、およびKyteおよびDoolittle（1982）の
アルゴリズムをベースとするヒドロパシー分析を利用して、14のトランスメンブ
ランスパニングドメインの予測をMCTの推定されたアミノ酸配列について行った
（第18図）。
【０３１４】 mctの不活性化はMCに対してより大きい特異性を生ずる。ストレプトマイセス
・ラベンヅレ（S. lavendulae）におけるMCTの生理学的役割を確立するために
、トランスポゾンTn5からのaphII遺伝子を挿入してpDHS7704を形成することによ
って、対応する遺伝子（mct）を不活性化した。大腸菌（E. coli）からストレ
プトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）へpDHS7704をコンジュガル転移さ
せそして選択的条件下にトランスコンジュガントを成長させた後、二重クロスオ
ーバー相同的組換えにより天然mctのターゲッテッド置換を達成した。
【０３１５】 mct遺伝子座を含むDNAプローブとストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lave
ndulae）野生型からの全DNAおよび突然変異体をサザンハイブリダイズさせるこ
とによって、遺伝子崩壊を確証した。ゲノムDNAを分析的に消化して、突然変異
株および野生型株における予測されたシフトを検出した（第19図）。ストレプト
マイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）mct破壊突然変異株（MM105）は、100
μgのMC／mlの培地に対して暴露したとき、MCに対する耐性のほぼ25倍の減少を
示した（表3）。MCを欠如する培地において、株MM105の成長反応速度は野生型ス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）株に匹敵した。
【０３１６】
【表３】
【０３１７】 大腸菌（E. coli）におけるmctの発現 mctの機能をさらに研究するために、
大腸菌（E. coli）中の遺伝子の異種発現をPCRにより増幅し、タンパク質発現
ベクターpET17bの中にクローニングしてpDHS7023を形成した。次いでpDHS7023の
中に導入して株PJS102を形成した。超音波処理により細胞を崩壊させた後、一体
的膜タンパク質について期待されるように、MCTは主として細胞ライゼイトの膜
画分とアソシエートすることが見出された。株PJS102がMCに対して耐性であるか
どうかを決定するために、培養物を成長させ、種々の濃度のMCを含有する寒天培
地上にプレートした。意味あることには、PJS102のIPTG誘導培養物は、ベクター
単独を含有する大腸菌（E. coli）BL21（DE3）よりも5倍大きい薬剤濃度におい
てMCに対する耐性を示した（表4）。
【０３１８】
【表４】
【０３１９】 大腸菌（E. coli）におけるmctおよびmrdの共発現 MRDおよびMCTタンパク質
が結合性タンパク質従属的薬剤輸出系の成分として参加するという考えを扱うた
めに、mctおよびmrd遺伝子を大腸菌（E. coli）中で共発現させた。プラスミド
pDHS7006（mrd発現構築物）（Sheldon他、1997）から、T7プロモーターの制御下
にmrd遺伝子を含有するDNAフラグメントをpDHS7023の中に結合してpDHS7024を形
成した。次いでpDHS7024を大腸菌（E. coli）BL21（DE3）の中に導入してPJS10
3を形成した。株PJS103がMCに対して耐性であるかどうかを決定するために、培
養物を成長させ、種々の濃度のMCを含有する寒天培地上にプレートした。意味あ
ることには、PJS103のIPTG誘導培養物はベクター単独を含有する大腸菌（E. co
li）BL21（DE3）よりも300倍大きい薬剤濃度においてMCに対する耐性を示した（
150μg／ml vs 0.5μg／mlのMC；表4）。
【０３２０】 ベクター対照株のそれを超えるレベルの耐性を維持するPJS103に加えて、mct
およびmrdの共発現は、それぞれ、PJS100（mrd遺伝子単独を含有する）（Sheldo
n他、1997）または株PJS102（mct遺伝子単独を含有する）に比較して5および60
倍大きい薬剤濃度においてMC耐性を与える。また、株PJS103はマイトマイシンB
、すなわち、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）によりまた産
生されたマイトマイシン、に対して高いレベルの耐性を表示した（表4）。
【０３２１】 mct、mrdまたはmct／mrdを発現する大腸菌（E. coli）細胞によるMCの吸収
mct遺伝子の推定されたアミノ酸配列は抗生物質輸出タンパク質に類似したので
、MCTを発現する細胞におけるMC蓄積の減少が期待されたであろう。大腸菌（E.
coli）におけるテトラサイクリン流出仲介耐性を研究するために使用した実験
後にモデル化されたアッセイ（LevyおよびMcMurry、1978）を設計して、感受性
ベクター対照および耐性mct、mrdおよびmct／mrd発現大腸菌（E. coli）株によ
る［3H］−MCの吸収を研究した。
【０３２２】 感受性ベクター対照株（BL21（DE3）：：pET17b）は5分において最大レベルに
到達し、その後一定濃度に維持されることが見出された。対照的に、耐性mct発
現株（PJS102）におけるMCの蓄積量は5分において感受性対照のわずかに25％で
あり、その後減少したレベルに維持された（第12図）。PJS102における薬剤蓄積
の減少は、mctが細胞からのMC輸出を促進するタンパク質をコードすることを示
唆する。大腸菌（E. coli）におけるmctおよびmrdの共発現がまたMC蓄積を減少
させるかどうかを決定するために、［3H］−MC吸収アッセイを使用して株PJS103
を分析した。株PJS100（Sheldon他、1997）の培養による薬剤吸収の分析をまた
実施して、このMC耐性大腸菌（E. coli）株における蓄積レベルを測定した。
【０３２３】 結果はMC感受性株と耐性株との間のMC蓄積の明瞭な差を示す。ベクター単独を
支持する大腸菌（E. coli）細胞に比較して、PJS103におけるMC蓄積は5分にお
いてわずかに35％であり、その後減少したレベルに維持された。実験の過程にわ
たってわずかにより高いレベル（約23％より大きい）にもかかわらず、PJS103に
おける薬剤蓄積は株PJS102のそれと平行であることが見出された。興味深いこと
には、株PJS100は、有意な濃度のMCに対して耐性であるが、30分において薬剤感
受性ベクターよりも42％より高いレベルに薬剤を蓄積した（第20図）。
【０３２４】論考 大部分の抗生物質は、細胞の必須代謝プロセスを含むタンパク質または他の高
分子成分に結合することによって、細菌の成長を阻害する（Cundliffe、1992）
。例えば、MCによるDNAアルキル化は染色体の複製を崩壊して細胞死に導く（Iye
rおよびSzybalski、1964）。多数の抗生物質産生ストレプトマイセスにおいて、
1またはそれ以上の高分子ターゲット部位は内因的細胞障害性化合物に対して同
様に感受性である（これはストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）
において真実である）。
【０３２５】 こうして、抗生物質の産生および／または再吸収に等しい速度で抗生物質を細
胞の中から外に送り出すと、細胞内ターゲット部位への薬剤アクセスが妨害され
る。大部分の抗生物質発酵ブロスにおいて見出される薬剤レベル（細胞内薬剤濃
度は低い）に基づいて、薬剤産生生物はしばしば効率よい抗生物質輸送メカニズ
ムに依存することが明らかである。事実、種々の抗生物質の輸送（したがって、
耐性）に関係する増大する数の膜系が薬剤産生ストレプトマイセスにおいて発見
された（MendezおよびSalas、1998；Paulsen他、1996）。
【０３２６】 一般に、薬剤輸出タンパク質をコードする遺伝子は、抗生物質産微生物のゲノ
ム内の対応する生合成遺伝子に物理的に連鎖される。多分、抗生物質輸出遺伝子
および生合成遺伝子の堅固な連鎖は共同的遺伝子調節を保証する。興味深いこと
には、抗生物質輸出遺伝子および調節遺伝子の背合せおよびオーバーラップする
分岐プロモーターの存在は、テトラセノマイシン（GuilfoileおよびHutchinson
、1992）およびアクチノロジン（Caballero、1991）生合成遺伝子クラスター内
で観測された。この実施例と順応して、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S.
lavendulae）はマイトマイシン生合成遺伝子クラスター内に内在性膜薬剤輸出タ
ンパク質をコードする遺伝子を有する。
【０３２７】 MCTの推定されたアミノ酸配列の分析は、薬剤輸出因子として機能することが
予測された放線菌タンパク質に対するいくつかの類似性を明らかにした。輸送を
刺激するためにプロトン推進力を使用することが示された（Littlejohn、1992）
テトラサイクリン耐性タンパク質に対する相同性に基づいて、この研究において
引用された放線菌薬剤耐性トランスロカーゼは、プロトン従属的電気化学的勾配
により外分泌を促進することが予測される。これらのタンパク質のアミノ末端領
域内に高度に保存された配列はプロトン転位においてある役割を演ずる（Rouch
他、1990）が、保存程度が低いC末端領域は薬剤結合（Paulsen他、1996；および
その中の参考文献）またはタンパク質−薬剤複合体の認識に関係づけることがで
きることが示唆された。
【０３２８】 ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）中のmctを崩壊させると
、外因的に添加されたMCに対する感受性が25倍増加し、MCTがストレプトマイセ
ス・ラベンヅレ（S. lavendulae）における薬剤耐性を提供することにおいてあ
る役割を維持するという証拠を与える。この作用は有意であるが、細胞の自己保
護の別のメカニズムが働き続けていることが明らかである。これは明らかにMCRA
、すなわち、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）において活性
化されたMCを再酸化する新規なレドックスリレータンパク質を包含する。また、
同定されない生体内異物輸送は、より低い効率にもかかわらず、MCTの非存在下
に薬剤輸送の別のモードを提供するようである。
【０３２９】 MC結合性タンパク質の存在および非存在下に薬剤を輸送するMCTの能力を証明
するために、大腸菌（E. coli）中の［3H］−MCの蓄積を分析した。大腸菌（E.
coli）中のmctの発現は、ベクター対照を支持する株よりも低いレベルで薬剤
を蓄積する、MC耐性培養物を生じた（第20図）。興味深いことには、株PJS102（
mctのみを発現する）はPJS103（mrdおよびmctを発現する）よりも少ない量の薬
剤を細胞内に蓄積する（第20図）。株PJS100における薬剤蓄積の増加は、MRDとM
Cとの間の等モル結合のモードを支持することができる（Sheldon他、1997）。
【０３３０】 株PJS100におけるより高いレベルの薬剤蓄積は、MRDによる細胞内封鎖の結果
であることがある。したがって、MRDの存在は株PJS102（mct単独を発現する）に
比較してPJS103（mrdおよびmctを共発現する）におけるMC蓄積レベルがより大き
い理由をまた説明することができるであろう。結合性タンパク質従属的移入系（
Miller他、1983）に匹敵して、MRDによるMCの結合は薬剤輸出プロセスにおいて
速度限定的であることがある。
【０３３１】 総合すると、これらの結果が示唆するように、MCTにより与えられる細胞保護
は細胞質からの薬剤輸送の関数である。興味深いことには、大腸菌（E. coli）
におけるmrdおよびmctの共発現は、外因的に添加された薬剤に対して劇的にいっ
そう耐性である培養物に導いた。結合性タンパク質がアソシエートする輸送系を
通常必要とするが、多くの場合において、結合性タンパク質は溶質転位のプロセ
スに対して内在性ではない（Higgins他、1990）。
【０３３２】 同様に、MRDの存在はMC転位に必要ではないが、薬剤耐性を劇的に増強する。
それゆえ、結合性タンパク質（MRD）はアクセサリー成分、最適な薬剤耐性に要
求される、むしろ特異的な適応と考えることができる。mct単独およびmctとmrd
との組合わせを発現する大腸菌（E. coli）株の薬剤耐性表現型は、これらの株
のMC吸収分析と一緒に、MRDおよびMCTが新規な薬剤輸送系の成分であるという証
拠を提供する。環境への効率よい外分泌のために無傷の薬剤を封鎖する、このよ
うな耐性メカニズムは、MC産生生物による自己保護のための独特の細胞戦略を表
す。
【０３３３】実施例4 ．マイトマイシン生合成経路におけるMitMの特性決定 1950年代におけるストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）培養物
からの抗腫瘍抗生物質マイトマイシンの同定（Hata他、1956）以来、数ダースの
新規な変化するメチル化およびアミン化パターンを有するマイトマイシンが単離
されてきている。1970年代および1980年代における生合成研究は、マイトマイシ
ンが前駆体3−アミノ−5−ヒドロキシ安息香酸（Anderson他、1980）、D−グル
コサミン（Hornemann、1974）、カルバモイルホスフェート（Hornemann、1975）
、およびS−アデノシルメチオニン（Benzanson他、1971）の集中的生合成により
産生されること示した。しかしながら、これらの重要な化合物のアセンブリーに
必要な反応の特定の順序は未知のままである。
【０３３４】 化合物の抗腫瘍マイトマイシンファミリーの変化する活性および毒性は、ミト
サン骨格上に存在するメトキシおよびアミノ置換パターンにより決定される（Ku
nz他、1991）。自然から単離された多様なマイトマイシンを生ずる、後期のマイ
トマイシン生合成工程を研究するために、分子遺伝学的方法を使用してマイトマ
イシン生合成におけるメチルトランスフェラーゼの役割が理解されてきている。
マイトマイシン生合成遺伝子クラスターが同定され（Mao他、1999a；実施例1〜3
参照）そしてDNA転移および生合成経路の遺伝学的操作の接合的方法が開発され
た（Mao他、1999b；実施例1〜3参照）。
【０３３５】 法が開発されたS−アデノシルメチオニンはC7、C9a、およびアジリジンOおよ
びNメチル基を標識化することが知られている（Bezanson他、1971）。メチルト
ランスフェラーゼ反応は（Altschul他、1990）他の既知の二次代謝メチルトラン
スフェラーゼに対する配列相同性によりmitM、mitNおよびmmcR遺伝子の産物に推
定的に帰属された（Kagan他、1994；Lacalle他、1991；Madduri他、1993；およ
びShi他、1996）。これらの酵素が実施する反応順序の詳述な理解は、産生され
る多様なマイトマイシンの基礎を説明することが期待される。
【０３３６】 マイトマイシンプロデューサーの遺伝子操作、MitM酵素のバイオアッセイ指針
単離および過剰発現は、メチルトランスフェラーゼmitM欠失突然変異株、ストレ
プトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）MM107から蓄積された中間体の特
性決定および変換を可能とした。後期マイトマイシン生合成工程の理解に加えて
、mit／mmc経路の操作は、例えば、この経路の生合成操作の組合わせを通して、
新規なマイトマイシンを産生することができる。後述する結果は、多様な単離さ
れたマイトマイシンを生ずる後期段階のメチル化の順序を示し、そして新規なマ
イトマイシン化合物の産生を証明する。
【０３３７】結果 マイトマイシンC産生は染色体的にインフレームでmitM遺伝子欠失ストレプト
マイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）突然変異株MM107において存在しなか
った（実施例5参照）が、枯草菌（Bacillus subtilis）に対する少量の活性の
観測は、新規化合物である9a−デメトキシマイトマイシンAのバイオアッセイ誘
導単離の実施を可能とした。この単離法は、培養ブロス培養物の粗製酢酸エチル
抽出液をSephadex LH−20カラムに適用し、次いで調製用および分析用逆相HPLC
により精製して9a−デメトキシマイトマイシンA（1）（第27A図）を10〜30μg／
リットルの培養物の収量で得ることから成っていた。
【０３３８】 新規化合物の1H NMRにおけるプロトンH1、H2、H3α、H3βα、Me6、H9、H10
、およびH10'のための信号の観測はマイトマイシン骨格の非存在を示した（9aデ
メトキシマイトマイシンAについてのデータ：1H NMR (CD3CN, 800 MHz).1.77,(s
, C6-メチル), 2.74(m, H2), 2.81(d, J=m, H1), 3.31(dd, J=4.3, 11.3 Hz, H9
), 3.39(d, J=12.8 Hz, H3α), 3.84(, J=12.8, H3β), 3.95(s, C7-OCH3), 4.1
6(dd, J=10.4, 11.3 H10'), 4.71(dd, J=4.3, 10.4, H10);1H NMR 9-エピマイト
マイシンB(2)のデータ：(CD3CN, 800 MHz).1.78, (s, C6-メチル), 2.22(s, N-
アジリジンMe), 2.31(m, オーバーラップH1, H2), 3.31(ddJ=4.9, 9.8 Hz, H9),
3.38(d, J=12.2 Hz, H3α), 3.84(d, J=12.2, H3β), 3.96(s, C7-OMe), 4.06(
dd, J=9.8, 12.2 Hz, H10'), 4.67(dd, J=4.9, 12.2 Hz, H10))。
【０３３９】 4.0ppmにおけるメトキシ一重項の存在および、それぞれ、3.3ppmおよび2.2ppm
における他のメトキシまたはアジリジン−Nメチル信号の非存在は、9a−デメト
キシマイトマイシンAと一致する予備的構造に導いた。［M＋K］+のHRESIMSから
の374.0074のm／z（計算値の1.9ppm）はこの構造を確証した。
【０３４０】 直接検出した13C NMR実験から十分な信号を直接得ることが困難であるために
、炭素骨格についての13C NMR信号をHMQCおよびHMBC実験により観測した（13C
NMR（CD3CN、800MHz、HMQCおよびHMBCにより逆に検出した、ppm、原子）。37.
4、Cl、33.4m C2、49.6、C3、152.0、C4、184、C5、7.5、C6a（メチル）、125
、C6、160.4、C7、114.2、62.0、C7a（O−メチル）、C8a、103、C9a、49.4、C9
、157.9、C10a（カルバモイルカルボニル）、63.0、C10。C8はHMBCにより検出さ
れなかった）。13C NMRスペクトルを提供することに加えて、ヘテロ核相関実験
はキノン部分の存在、アミノキノンに対する7−メトキシおよびC6メチル基の結
合性、およびカルバモイル炭素のH10からC10aへの相関の存在を証明した。
【０３４１】 C9−C10結合についての化学量論の決定を、まず、差nOe、NOESYおよびROESY実
験により試みたが、C10上のプロトン、およびH1、H2およびH3プロトンの間の明
瞭なnOe効果の欠如は化学量論の帰属を妨害した。大腸菌（E. coli）から過剰
発現されたMitM（実施例5）を使用して、9a−デメトキシマイトマイシンAをN−
アジリジンメチル化産物に変換した。2.2ppmのメチル信号および2.90および2.85
から2.5ppmにおける没入までのH1およびH2信号のアップフィールドのシフトは、
マイトマイシン系列の化合物中のN−アジリジン基と一致する。
【０３４２】 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、9：1 CHCl3：CH3OH）により、生成物
（Rf＝0.21）はマイトマイシンB（Rf＝0.26）ではなく、こうしてβ立体配置に
おいてC9−C10を有する9−エピマイトマイシンBでなくてはならないことが明ら
かであった。前に単離されたマイトマイシン（Hornemann他、1985）と一致する
生合成に基づいて、C9a、C1およびC2炭素における1および2の化学量論は帰属さ
れた。
【０３４３】 9a−デメトキシマイトマイシンAに対するMitMの活性を検査して、マイトマイ
シンC生合成経路におけるこの酵素の役割を同定した。MitMは8のpH最適値を有す
ることが見出された（あるpHより高いと、SAM基質は分解するが、pH7より低いと
、マイトマイシンは不安定であることが知られている）。前述したように、MitM
は9a−デメトキシマイトマイシンAのアジリジン窒素を特異的にメチル化するこ
と知られているが、9a酸素をそのまま残した。メチル基の付加は2のHRESIMSによ
り確証され、これはm／z＝［M＋Na］+372.1186（計算値の3.9ppm）を提供した。
【０３４４】 500μMのSAMにおいて変化する量の9a−デメトキシマイトマイシンAを有し反応
速度論の実験は、263μMのKmおよび0.11／秒のkcatの測定を可能とした。SAMに
ついて、30μMのKmおよびkcat23μMが測定されたが、これらの実験は9a−デメト
キシマイトマイシンAの量が制限されるために400μMのマイトマイシンAを使用し
て実施された。マイトマイシンAおよび9a−デメトキシマイトマイシンA酵素的変
換のための活性を提供した同一条件下に、変換産物がマイトマイシンB、C、D、
およびGについて観測された。
【０３４５】論考 マイトマイシンC生合成経路の同定および配列決定は、遺伝子mitM、mitN、お
よびmmcRによりコードされるタンパク質へのメチルトランスフェラーゼ画分の帰
属を可能とした（Mao他、1999a）。ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lave
ndulae）についての接合的方法を使用して、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（
S. lavendulae）染色体上のこれらの遺伝子の欠失または挿入的に崩壊されたバ
ージョンを含有する突然変異体をつくった（Mao他、1999b）。
【０３４６】 蓄積された中間体についてのmitM欠失突然変異体、MM107の検査は、新規なマ
イトマイシン。9a−デメトキシマイトマイシンAの単離および特性決定に導いた
。脱メチル化マイトマイシンの存在は、他の二次および一次代謝物質メチルトラ
ンスフェラーゼに対する相同性に基づいた、mitMへのメチルトランスフェラーゼ
活性の以前の帰属から期待された。この新規化合物の同定は、マイトマイシンC
生合成経路におけるノックアウト突然変異体がこの重要な抗癌剤の生合成順序を
決定する有効な戦略であることを再確認する。
【０３４７】 単離された中間体9a−デメトキシマイトマイシンAは、SAMにより9a酸素または
アジリジン窒素において潜在的にメチル化することができる。9a−デメトキシマ
イトマイシンAをMitMと反応させると、9−エピマイトマイシンBが得られ、この
メチルトランスフェラーゼがアジリジン窒素に特異的に作用することを示す。マ
イトマイシンA、B、C、DおよびGを使用して、MitM活性の他のプローブを実施し
た。マイトマイシンAのみはアジリジン窒素においてMitMによりメチル化されて
、マイトマイシンFを産生する。
【０３４８】 マイトマイシンCはまた潜在的にメチル化されてポルフィロマイシンを形成す
ることができる遊離アジリジン窒素を有するが、これはMitMとの反応において観
測されなかった。こうして、MitMの反応性はC7−メトキシ基を有するマイトマイ
シン、例えば、マイトマイシンAおよび9a−デメトキシマイトマイシンAのアジリ
ジン位置に関して一般的であるように思われるが、マイトマイシンCのC7−アミ
ンの存在はこの活性を妨害する。マイトマイシンB系列の化合物（αC9−C10結合
の立体配置、非メチル化アジリジン）において適当な基質が欠如するために、こ
の立体化学に関するMitMの特異性を測定することができなかった。
【０３４９】 マイトマイシンAの力価は最初に発生し、次いでマイトマイシンCの力価が増加
するとき、低下することが観測された（Hornemann、1981）。これはマイトマイ
シンCがマイトマイシンAから産生されることを意味した。今日まで、この形質転
換について直接的生化学的証拠は存在しなかった。本明細書に記載する結果から
、マイトマイシンA〜Fおよび9a−デメトキシマイトマイシンAを9−エピマイトマ
イシンBに変換する酵素に影響を与えると、マイトマイシンC産生が壊滅すること
が見出された。
【０３５０】 C9α立体化学を有するマイトマイシンについての後期のメチル化を検査したと
き、スキーム1（第28図）、推定上の脱メチル化前駆体未知Aからの初期の分割を
仮定することができる。この推定上の前駆体をC7位置においてメチル化して9a−
デメトキシマイトマイシンAを生成し、化合物のマイトマイシンA系列に入ること
ができるか、あるいはアミンをC7位置に付加して未知Bを生成し、化合物のマイ
トマイシンCグループを開始することができる。分割がスキーム1に示すように初
期に起こるかどうか、あるいはマイトマイシンAまたはその関係するC7メトキシ
化合物の1つに作用するアミノトランスフェラーゼが存在するかどうかは未知で
ある。
【０３５１】 こうして、MitMはアジリジン窒素を1〜2にメチル化すると同時に、また、マイ
トマイシンAをFに変換することに関係するように思われる。それゆえ、マイトマ
イシン生合成経路の分子遺伝子操作はマイトマイシンC生合成に関係する反応順
序に関する情報を提供した。化合物1は以前には合成または単離されず（Yoda他
、1993）そして2は出発物質としてマイトマイシンBを使用する合成から知られて
いるだけである（Kasai他、1989）。
【０３５２】実施例5 ．マイトマイシン生合成遺伝子クラスターにおける2つのアジリジンN−
メチルトランスフェラーゼ（MitMN）の遺伝学的および酵素的分析 マイトマイシンC（MC）は臨床的に重要な抗腫瘍抗生物質であり、そして30年
間以上にわたって癌の化学療法および放射線療法の組合わせに広く使用されてき
ている（Henderson、1993）。いっそう効力のある、低い毒性の抗腫瘍薬剤を選
択する努力において、化学者および微生物学者は種々のマイトマイシンアナロー
グを合成してきている（Kasi他、1995）。最初の単離されたマイトマイシン抗生
物質は1956年におけるストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の発
酵におけるマイトマイシンA（MA）およびマイトマイシンB（MB）である（Hata他
、1956）。
【０３５３】 その後、Wakaki他（1958）は同一培養ブロスにおいてマイトマイシンC（MC）
を発見し、このときそのブロスはMAおよびMBを産生しなかった。引き続いて発酵
ブロスから小さいマイトマイシン成分の1グループの同定によりマイトマイシン
ファミリーはさらに豊富になった（Shirahata他、1981）。これらの化合物は共
通のヘテロサイクル環系：ミトサン環を有したが、それらはN−1a、C−7およびC
−9位置において異なる修飾（例えば、メチル化、アミン化、または両方）を有
した（第27B図）。これらの位置におけるメチル基はL−メチオニンから誘導され
ることが証明された。
【０３５４】 なぜなら、放射能標識化L−［14CH3］メチオニンはMA中のO−およびN−メチル
基を特異的に標識化することができるが、抗生物質の産生はメチオニンアゴニス
トD，L−エチオニンにより開始されたからである（Kirsh他、1964；Bezanson他
、1971）。1970年代初期における他の実験は、外因的L−メチオニン、ATPおよび
Mg2＋を供給したとき、MCの脱メチル化誘導体の1つをストレプトマイセス・ラベ
ンヅレ（S. lavendulae）の無細胞抽出物によりMAすることができるが、C10脱
カルバモイル化形態は変換不可能であることを示した（Nishikohri他、1975）。
これらの実験はMC生合成におけるメチルトランスフェラーゼの存在および掛かり
合いを証明するばかりでなく、かつまたこれらの酵素が同一程度の基質特異性を
有することを示した。
【０３５５】 メチルドナーとしてL−メチオニンを利用するメチル転移のための第1支持は、
通常、S−アデノシルメチオニン（SAM）従属的メチルトランスフェラーゼと呼ば
れる1グループの酵素で触媒される。ATPおよびMg2＋の存在下に、L−メチオニン
は最初にシンターゼによりSAMに変換された。次いでこれらのメチルトランスフ
ェラーゼはメチル基をSAMから高分子、例えば、タンパク質、核酸（RNAまたはDN
A）、リン脂質、多糖、または小さい分子、例えば、薬剤、ホルモン、および神
経伝達物質に転移させて、メチルエステル、メチルエーテル、メチルチオエーテ
ル、メチルアミン、および他の誘導体を生成する（Weinshilboum他、1999）。
【０３５６】 酵素内に3つのゆるく保存されたSAMまたはS−アデノシル−ホモシステン結合
モチーフが存在したが、メチルトランスフェラーゼはシトクロムP450の間で見出
された程度と同程度に配列相同性を表示せず、そして支配的な分類系は開発され
てきていない（Kagan他、1994）。大部分の普通に見出される小さい分子メチル
トランスフェラーゼは、真核生物（例えば、カテコールO−メチルトランスフェ
ラーゼ；Lundstom他、1995参照）および原核生物の両方において広く見出された
、O−メチルトランスフェラーゼであった。報告されたマクロリド抗生物質生合
成メチルトランスフェラーゼの大部分はこのカテゴリーの中に入ることが明らか
であった。
【０３５７】 これらの遺伝子は下記のものを包含する：エリスロマイシンについてeryG（Ha
ydock他、1991）、テトラセノマイシンについてtcmN（Summers他、1992）、カル
シノマイシンについてdnrK（Madduri他、1993）、ダウノマイシンについてdauK
（Dickens他、1995）、リファマイシンについてorf14（August他、1998）、アベ
ルマイシンについてaveD（Ikeda他、1999）、FK06についてfkbM（Motamedi他、1
996）、ミデカマイシンについてmdmC（Hara他、1992）、およびプロマイシンに
ついてdmpM（Lacalle他、1991）。
【０３５８】 小分子SAM従属的N−メチルトランスフェラーゼは多数の内因的神経伝達物質お
よびホルモン、例えば、フェニルエタノールアミンN−メチルトランスフェラー
ゼ（Vance他、1998）、ヒスタミンN−メチルトランスフェラーゼ（Okinga他、19
95）、およびグリシンN−メチルトランスフェラーゼ（Ogawa他、1998）の代謝に
おいて哺乳動物細胞では非常に普通である。N−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子はまた抗生物質生合成遺伝子クラスター（プロマイシン遺伝子におけるpur5；
Tercero他、1996参照）、スペクチノマイシン生合成のためのspcM（AAD28488）
、チロシンクラスターにおけるtylM1（Gandecha他、1997）において提案された
が、それらの機能は確証されてきていない。
【０３５９】 3つのSAM従属的メチルトランスフェラーゼ（MmcR、MitMおよびMitN）は、それ
らのタンパク質配列内に3つの保存されたSAM結合モチーフのために、MC生合成遺
伝子クラスターに帰属された（Mao他、1999）。データベース分析は、MmcRが1グ
ループの抗生物質O−メチルトランスフェラーゼと強い配列類似性を示したが、M
itMおよびMitNの両方が1グループの植物δ−（24）−ステロールC−メチルトラ
ンスフェラーゼならびにいくつかの抗生物質生合成O−メチルトランスフェラー
ゼに最も密接に関係することを明らかにした（Mao他、1999）。
【０３６０】 マイトマイシン分子中のO−およびN−メチル基の両方がL−メチオニンから誘
導され、そしてMCクラスターにおいて有効な3つのSAM従属的メチルトランスフェ
ラーゼが存在したことを考慮すると、MC生合成におけるこれらのメチルトランス
フェラーゼの詳細な機能の局在化はMC生合成およびこれらの酵素の基質特異性の
詳細の決定における洞察を提供するであろう。
【０３６１】材料および方法 細菌株およびクローニングベクター 大腸菌（E. coli）DH5α（表5）はクローニング宿主として日常的に使用され
、LB培地上で増殖された。大腸菌（E. coli）S17−1は大腸菌（E. coli）から
ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）への遺伝子転移のための接
合宿主として使用された。接合はAS1培地上で実行され、そして二重クロスオー
バーは以前に記載されたようにR5培地上で選択された（Mao他、1999）。大腸菌
（E. coli）BL21（DE3）はNZYM培地におけるタンパク質過剰発現宿主であった
。
【０３６２】
【表５】
【０３６３】 pUC119は大腸菌（E. coli）におけるクローニングベクターであった。pKC113
9、大腸菌（E. coli）−ストレプトマイセス（Streptomyces）接合性シャトル
ベクターを使用して、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）にお
いて破壊突然変異体をつくった。プラスミドpET28（b）を大腸菌（E. coli）BL
21（DE3）におけるタンパク質の過剰発現のために使用した。
【０３６４】DNA操作 mitM挿入崩壊ベクターpDHS7706を次のようにして構築した：mitMN遺伝子を含
有するプラスミドpDHS7608をBpu11021で消化し、平滑末端とし、次いでpFD666か
らの1.4kbのApaLI−HindIII（aphII）フラグメントと結合した。Bpu11021の中に
aphII遺伝子を挿入すると、mitMが崩壊された。次いでpDHS7705からの3.9kgのBa
mHIインサートをシャトルベクターpKC1139に動かして、pDHS7706を発生させた。
【０３６５】 3対のプライマーを使用してmitMおよびmitNインフレーム欠失ベクターpDHS710
8およびpDHS7710を構築した。mitMインフレーム欠失ベクターpDHS7708について
、プライマーf1：5'−GC TCT AGA TCT ACG TCT CCC GCG−3'（XbaI；配
列番号146）およびプライマーr1：5'−GC CTC GAG CAT GGA GGA TCC CTC
TCG−3'（XhoI；配列番号147）を使用して、mitM翻訳開始コドン後の右に追加
のXhoI部位を導入することによって、1.1kbのmitM上流フラグメント（MTF11）を
発生させた。
【０３６６】 プライマーf2：5'−GC CTC GAG CCG GGA AAG TGA GCG GCA−3'（XhoI
；配列番号148）およびプライマーr3：5'−GC AAG CTT CGG CAT CAC GCG
CCA−3'（HindIII；配列番号149）を使用して、mitM翻訳開始コドンの直ぐ上
流にXhoI部位を導入することによって、2.1kbの下流フラグメント（MTF23）を増
幅した。次いでMTF11およびMTF23をそれぞれXbaI／XhoIおよびXhoI／HindIIIで
消化し、XbaI／HindIII消化pUC119に結合してpDHS7707をつくった。この場合に
おいて、mitNは左において無傷であったが、mitMの全ORFはXhoI部位により置換
されていた。
【０３６７】 次いでpDHS7707からの3.2kbのインサートをpKC1139のXbaI／HindIII部位の中
にサブクローニングしてpDHS7608を発生させた。同様に、1.9kbの上流フラグメ
ント（MTF12）および1.3kgの下流フラグメント（MTF33）を2対のプライマーで増
幅した：MTF12についてプライマーf1およびプライマーr2：5'−GC CTC GAG C
GT CAT GCC GCT CAC TTT−3'（XhoI；配列番号150）およびMTF33について
プライマーr3：5'−GC CTC GAG TAG GGC TCC CAC GGG AAG−3'（XhoI；
配列番号151）およびプライマーr3。XbaI／XhoI消化MTF12、XhoI／HindIII消化M
TF33およびXbaI／HindIII消化pUC119の3方法の結合はpDHS7709を生じ、ここでmi
tN ORFはXhoI部位で置換されたが、mitMは左において無傷であった。pDHS7709
からの3.2ｂkbのXhoI／HindIIIインサートをpKC1139の中にサブクローニングす
ることによって、pDHS7710をつくった。
【０３６８】 MitMおよびMitN過剰発現ベクターを構築するために、プライマーf4：5'−GGG ATC GCA TAT GCC GCA CTC CGA GCT GTC−3'（NdeI；配列番号152）を
使用してMitMの翻訳開始コドンに、そしてプライマーf5：5'−GTG AGC CAT A
TG ACG GAA ACC GCG TCC GC−3'（NdeI；配列番号153）を使用してmitNの
翻訳開始コドンにNdeI部位を導入した。鋳型としてpDHS7608、および他のPCRプ
ライマー対としてM13／pUC逆方向配列決定プライマーを使用して、それぞれ、2.
31kbのフラグメント（MitMについて）および1.45kbのフラグメント（MitMについ
て）を増幅した。次いで生ずるフラグメントをNdeI／HindIIIで消化し、pET28b
の対応する部位の中にサブクローニングしてpDHS7801（MitMについて）およびpD
HS7802（MitMについて）を発生させた。両方の場合において、発現されたタンパ
ク質をN末端の6XHisタグを含むように操作した。
【０３６９】ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）の破壊突然変異株の発生 Mao他（1999）のプロトコルに従いmitM崩壊ベクターpDHS7706を野生型ストレ
プトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）NRRL 2564の中に結合することに
よって、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）のmitM挿入破壊突
然変異体MM106をつくった。アプラマイシン、カナマイシン二重耐性接合体を選
択し、R5Tプレート上で39℃において数世代にわたって増殖させて、二重クロス
オーバー突然変異体について選択した。サザンハイブリダイズにより、カナマイ
シン耐性およびアプラマイシン感受性コロニーが正しい二重クロスオーバー遺伝
子型を有することについて検査した。
【０３７０】 2工程の組換え戦略を使用して、mitMおよびmitNインフレーム異なる突然変異
体MM107およびMM108をつくった。これらの実験において、pDHS7708およびpDHS77
10をMM106、mitM挿入破壊突然変異体の中に結合した。対応する二重抗生物質耐
性接合体からカナマイシンおよびアプラマイシン感受性コロニーを選択し、mitM
およびmitNは首尾よく染色体から欠失された。MM107におけるmitMおよびMM108に
おけるmitNの欠失はサザンハイブリダイズにより確証された。
【０３７１】MitMおよびMitNの過剰発現および精製 それぞれ、MitMおよびMitNの過剰発現のために、pDHS7801およびpDHS7802を大
腸菌（E. coli）BL21（DE3）株の中に形質転換した。50μg／mlのカナマイシン
を含有するNZCMブロス中で37℃において大腸菌（E. coli）細胞をOD600＝0.6ま
で成長させた。IPTGを0.1mMの最終濃度に添加し、温度を25℃に低下させること
によって、MitM（またはMitN）の発現を誘導した。培養物を一夜インキュベート
した後、細胞を収集し、氷冷溶解緩衝液（50mMのNaH2PO4、pH8.0；300mMのNaCl
；10mMのイミダゾール）の中に懸濁させ、超音波処理（200〜300Wにおいて10秒
のパルスで6×10秒）により溶解した。ライゼイトを10,000g、4℃において遠心
することによって収集した上清を使用して、Qiagen Ni−NTAカラムに製造業者
の使用説明書に従い通過させた。
【０３７２】 カラムを洗浄緩衝液（50mMのNaH2PO4、pH8.0；300mMのNaCl；20mMのイミダゾ
ール）で2回溶離し、次いでタンパク質を溶離緩衝液（50mMのNaH2PO4、pH8.0；3
00mMのNaCl；250mMのイミダゾール）の中に溶解した。次いでカラムから溶離し
たタンパク質を60％の硫酸アンモニウムで沈降させ、Pharmacia PD−10カラム
に通過させることによって脱塩し、1mMのPMSFを含む50mMのpH7.4リン酸塩緩衝液
中に溶解した。標準としてBSAを使用するブラッドフォードアッセイによりタン
パク質濃度を測定した。MitMの最終濃度は0.38mg／mlであり、そしてMitNは0.71
mg／mlであった。
【０３７３】酵素アッセイ 100μMのS−アデノシルメチオニン（SAM）、適当な量の基質、および5μgの精
製された酵素を含有する50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中で100μlの
全体積で、異なる基質を使用するMitM（MitN）の酵素的変換を実施した。反応物
を30℃において30分間インキュベートし、等しい体積の酢酸エチルで2回抽出す
ることによって停止させた。生ずる有機抽出液を一緒にし、真空乾燥し、それ以
上のTLCまたはHPLC分析のために20μlのメタノールの中に再懸濁させた（Mao他
、1999）。
【０３７４】産物の同定 MitMおよびMitNの両方はMAを新規な産物に変換することができ、これはMFと同
一のTLCおよびHPLCの挙動を有する。それ以上の情報を得るために、産物を単離
し、いくつかの標準的酵素反応からHPLCにより精製し、1H NMRにより分析した
。
【０３７５】反応速度論的測定 1.9μgのMitMまたは1.4μgのMitNを使用して初期速度（5〜20分）の条件下にH
PLCで313nmにおいてMF産生を検出することによって、MitMおよびMitNによるMAの
MFへの変換についての反応速度論的データを得た。ライウィーバー−バーク（Li
neweaver−Burk）二重逆プロットから基質MAおよびSAMの両方について、反応速
度論的パラメーター（Vmax）を決定した。MAについて、固定量のSAM（200μM）
において変化量の基質MA（30〜300μM）を使用して反応を実施したが、可変SAM
（40〜400μM）についてのパラメーターをMAの固定濃度（200μM）において測定
した。Kcatコンピューターを使用して、線形回帰によりミカエリス−メントン方
程式にデータを適合させることによって、計算を実施した。
【０３７６】結果 mitMおよびmitN破壊突然変異体の発生 オープンリーディングフレームの中央にネオマイシン耐性マーカーを挿入する
ことによって、mitM遺伝子の染色体コピーを崩壊させた。生ずる突然変異株MM10
6はMC産生を壊滅させた。しかしながら、マイトマイシン化合物の産生を完全に
ブロックした初期マイトマイシン生合成遺伝子（mitA）ノックアウト突然変異体
と異なり、MM106は多少の色を有する生物活性マイトマイシン中間体をなお産生
した（データは示されていない）。mitMおよびmitNは同一転写方向を有した14遺
伝子クラスター内の最後の2つの遺伝子である（Mao他、1999）ので、mitMの挿入
崩壊は下流mitN遺伝子の発現に多分影響を与える。このような極性作用を回避す
るために、mitMインフレーム破壊突然変異体mC7N単位をMM106からつくり、次い
で全mitMORFを2アミノ酸で置換する2工程の組換えを実施した（第38図）。
【０３７７】 同様に、mitNインフレーム破壊突然変異体MM108をまた同一戦略に従いMM106か
らつくった。両方の突然変異体をカナマイシン、アプラマイシン二重耐性から二
重感受性に変化する表現型に基づいて選択し、サザンハイブリダイズを使用して
正しいバンドシフトにより確証した（データは示されていない）。 第39図に示すように、mitM欠失突然変異体（MM107）はMCを産生しないが、mit
Nのきれいな欠失突然変異体（MM108）はMC産生をわずかに増加させる。これらの
結果が示すように、MitMはMC生合成において主要な酵素であるが、mitNは分路代
謝物質の産生において多分働く。
【０３７８】大腸菌（E. coli）におけるMitMおよびMitNの過剰発現および精製 MitMは31kDの計算分子量（MW）を有する283アミノ酸から構成された親水性タ
ンパク質（推定されたpI＝4.66）。同様に、MitNは30kDの推定されたMWおよび4.
59の推定されたpIを有する275アミノ酸から成る。pT7プロモーターを使用して大
腸菌（E. coli）中で、MitMおよびMitNの両方を過剰発現させた。両方のタンパ
ク質の過剰発現は非常に低い濃縮のIPTG（0.1mM）を添加することによって達成
され、均質までの精製をNi−NTAカラムにより実施した（第40図）。
【０３７９】MitMおよびMitNの両方によるMAのMFへの変換 MitMまたはMitNによるMM107のブロス抽出物からのMC変換をin vitroアッセイ
は検出することができなず（データは示されていない）、MitMはMC生合成におけ
る最後の工程の酵素でないことが示される。MitMおよびMitNの両方についての候
補の基質として、MA、MB、MC、MDおよびMHを使用した。SAMの存在下に、両方の
酵素の基質としてMAを使用して、同様な新規な産物が形成されたが、他のマイト
マイシンを使用して変換は検出されなかった。これらの新規な産物のTLCおよびH
PLCプロファイルはMFのそれらと正確に同一であった。新規化合物中のメチル基
をさらに捜し出すために、産物をHPLCに通して精製し、NMRにより分析した。
【０３８０】 1H NMR地図において、標準MAは3つの対応するメチル基の3つのピークを有す
る：1.83（C6a メチル）、3.22（C9a O−メチル）、および3.99（C7a O−メ
チル）。MF中の余分のN1aメチル基は2.74に新しいピークを付加し、ならびにC9a
O−メチルピークを3.21にシフトさせる。MitMおよびMitNの両方の変換産物はMF
において出現するピークと同一の4つのピーク（1.38、2.74、3.21、3.99）を有
した。さらにNMRの結果は、メチル基は両方変換産物においてMAのN1a位置に付加
され、そしてMitMおよびMitNの両方はN−メチルトランスフェラーゼであること
を確証した。
【０３８１】変換の反応速度論的データ pH5.0〜8.0の範囲において、MitMは8.0において最適pHを有し、そしてMitNの
最適pHは7.4である。pH7.4において両方の酵素について、反応速度論的データを
測定した。表6に示すように、MitNはMAに対してMitM（Km＝169.2μM）よりも高
いアフィニティー（Km＝94.7μM）を有したが、MitMはSAMに対してMitN（Km＝86
.6μM）よりも高いアフィニティー（Km＝22.8μM）を有した。しかしながら、Mi
tNはMAまたはSAMについてMitMよりも大きいVmaxを有した。
【０３８２】
【表６】
【０３８３】論考 MitMおよびMitNの両方がアジリジンN−メチルトランスフェラーゼであるとい
う発見は予期せざることである。mitMの崩壊がMC産生をブロックするが、突然変
異体ブロス抽出物をMitMによりMCに変換することができない（データは示されて
いない）という事実にに基づいて、MitMは主要であるが、MC生合成における最後
の工程の酵素ではないと結論することができる。mitN崩壊結果と組合わせると、
MC生合成におけるMitMおよびMitNの両方の機能は次のように描くことができる：
【０３８４】
【表７】
【０３８５】 ここでAおよびBはMitMのそれぞれ現実の基質および産物である。CはMitNの産物
であるが、MitNの現実の基質はMC生合成中間体（分岐）またはMC後の下流のマイ
トマイシン（改造）であることができる。
【０３８６】 タンパク質配列分析およびin vitro変換実験により明らかなように、MitMはN
−メチルトランスフェラーゼである。しかしながら、MC分子の中にメチル基は存
在しないので、MC生合成におけるMitMの機能は問題となる。1つの可能性は、ア
ジリジンのN−メチル化が他の反応のための一時的保護として働き、そしてメチ
ル基は終わりにおいて残るであろうということである。他の可能性は、そのN−
メチルトランスフェラーゼ活性に加えて、MitMはまた他の機能、例えば、C9aま
たはC7のO−メチルトランスフェラーゼ活性を有する（それがMB、MDおよびMHと
反応しないが）ことである。
【０３８７】 後期段階のマイトマイシン修飾を考慮すると、C7におけるアミノ交換およびメ
チル化の順序に関して2つのルートが存在する（第42図）。Hornemann（1981）は
、MAが下記の観察に基づいてMCの天然前駆体であることを提案した：1）ストレ
プトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）は主としてMAおよびMBをある培養
条件下に産生し、他の条件下にもっぱらMCを産生し、MAとMCとの間の密接な生合
成的関係を示す（Wakaki他、1958）；2）MCは単にMAをアンモニアで処理するこ
とによってMAから得ることができる；そして3）放射能標識化MFをプロマイシン
に変換する供給実験において、同様な種類のアミノ交換（MAからMCへ）が検出さ
れた（Hornemann、1981）。
【０３８８】 この見解を支持して、Tomohiro他（1983）はMC産生を壊滅させるが、MAおよび
MBをなお蓄積するストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）突然変異
株を選択した。 MM107（mitM）はMA産生をブロックするが、MM108（mitN）はなおMAを産生する
（MA産生は両方突然変異体において検査された。TLCプレート上で、mitM突然変
異体MM107は3つの可視のピンク色のマイトマイシン化合物をなお産生し、1つのR
f値はMCより小さく、そして他の2つはMAより小さい（第43図））。
【０３８９】 MitMおよびMitNの両方はMAをメチル化するが、MCをメチル化しないことが確証
され、これはあるレベルの基質特異性を示す。しかしながら、崩壊およびin vi
troの結果が示すように、MAは多分MitMおよびMitNの両方についての実際の天然
基質ではない。反応速度論的データが明らかにするように、MitMおよびMitNの両
方は精製されたストレプトマイセス（Streptomyces）抗生物質生合成O−メチル
トランスフェラーゼに比較して基質に対してより低いアフィニティーを有するが
、SAMに対して匹敵するアフィニティーを有した。
【０３９０】 これらの特性決定された酵素は下記のものを包含する：ストレプトマイセス・
フラジエ（S. fradiae）におけるチロシン生合成のためのマクロニンO−メチル
トランスフェラーゼ（MOMT）およびデメチルマクロニンO−メチルトランスフェ
ラーゼ（DMOMT）（Bauer他、1988；Kreuzman他、1988）、ストレプトマイセス種
（S. spp.)株C5におけるダウノマイシン生合成のためのカルミノマイシンO−メ
チルトランスフェラーゼ（CMT）（Connors他、1993）、ストレプトマイセス・ヒ
グロスコピクス・バル・アスコミセチクス（S. hygroscopicus var ascomyce
ticus）におけるイムノマイシン生合成のための31−O−デスメチルイミノマイシ
ンO−メチルトランスフェラーゼ（DIMT）（Byme他、1993）、およびストレプト
マイセス種（S. spp.)MA6858におけるFK506生合成のための31−O−デスメチルF
K506 O−メチルトランスフェラーゼ（FKMT）（Shafiee他、1994）。
【０３９１】 MAについてのMitM（169μM）およびMitN（95μM）のKm値は、それらの対応す
る基質についてのMOMT（5μM）、DMOMT（6μM）、CMT（0.5μM）、DIMT（11μM
）、およびFKMT（23μM）のそれよりも非常に高い。SAMについて、MitM（23μM
）のKmはMOMT（23μM）、CMT（25μM）、DIMT（13μM）、およびFKMT（28μM）
に非常に近いが、MitN（87μM）のKmはDMOMT（111μM）に匹敵する。
【０３９２】 本明細書に記載するデータは、MitMおよびMitNの両方の生合成がマイトマイシ
ン生合成についてSAM従属的メチルトランスフェラーゼであることを支持する。
それにもかかわらず、それの両方がアジリジンN−メチルトランスフェラーゼで
あるという結果は予期せざることである。他のマイトマイシンについての仮説の
前駆体であるMAは多数の修飾酵素のための好適な基質であることがありうる。こ
のような酵素の異なる発現レベルおよび反応速度論的均衡は、究極的にマイトマ
イシン産生の多様性を決定するであろう。こうして、結果はアジリジンN−メチ
ルトランスフェラーゼ活性を証明するばかりでなく、かつまた他のマイトマイシ
ンアナローグの生合成を操作する能力を証明する。
【０３９３】 要約すると、MC生合成遺伝子クラスターに以前に帰属された、2つの推定上のS
AM従属的メチルトランスフェラーゼ（mitMおよびmitN）がMCプロデューサースト
レプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）NRRL 2564において欠失された
。MitN破壊突然変異体MM108はMC産生をわずかに増加するが、MitM破壊突然変異
体MM107はMCを産生しないが、他の生物活性中間体を蓄積する。崩壊の結果はMit
MがMC生合成のための主要な酵素であるが、MitNが多分他のマイトマイシンに導
く分岐または改造する酵素として働くことを示す。
【０３９４】 MitMおよびMitNの両方は大腸菌（E. coli）において過剰産生され、均質に精
製された。SAMの存在下に、MitMおよびMitNの両方はマイトマイシンA（MA）をマ
イトマイシンF（MF）に変換することができるが、MB、MC、MDおよびMHと反応し
ない。反応速度論的分析は、MitMがmitNよりもSAMに対して高いアフィニティー
を有するが、MAに対して低いアフィニティーを有することを明らかにした。こう
して、MitMおよびMitNの両方は新規なマイトマイシンアジリジンN−メチルトラ
ンスフェラーゼである。
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【０４３３】 本発明はその好ましい態様に関して記載されたが、多数の変更は当業者にとっ
て容易に明らかであることが理解され、そしてこの出願はそれらの任意の適応ま
たは変動を包含することを意図する。本発明は特許請求の範囲およびその同等の
ものによってのみ限定される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、マイトマイシン抗生物質の生合成経路を示す。
【図２】 図2は、マイトマイシン遺伝子クラスターの組織化を示す。推定されたORFは縮
尺通りに描かれており、そしてそれらの対応する遺伝子はイタリックでマークさ
れている。充填バーはマイトマイシンクラスターの位置を示す。制限酵素の略号
：B：BamHI、S：SphI、P：PstI、E：EcoRI、X：XhoI、K：KpnI。
【図３】 図3において、3つのSAM従属的メチルトランスフェラーゼ保存モチーフは、Mit
M（配列番号1）、MitN（配列番号2）、およびMmcR（配列番号3）の中に見出すこ
とができる。DmpM（配列番号4；Kim他、1998）、TcmN（配列番号5；Shikano他、
1998）、ORF14（配列番号6；August他、1998）、EryG（配列番号7；Hardwickお
よびPelham、1994）は、それぞれ、プロマイシン、テトラセノマイシンC、リフ
ァマイシン、およびエリスロマイシンの生合成のためのO−メチルトランスフェ
ラーゼである。Consen＝コンセンサス配列（配列番号8）。
【図４】 図4は、MitM、MitN、およびMmcRと下記の配列との類似性を示す：O−メチルト
ランスフェラーゼ：DmpM（Kim他、1998）、TcmN（Shikano他、1998）、ORF14（A
ugust他、1998）、EryG（HardwickおよびPelham、1994）、RdmB（Mazodier他、1
989）、DnrK（Devereux他、1984）；およびC−メチルトランスフェラーゼ：SMT
（Schaferjohann他、1993）、ESMTI（Floss、1997）、SMT1（Blattner他、1997
）、およびSED6（GuilfoileおよびHutchinson、1992））。プログラムPILEUP（D
enisおよびBrzezinki、1992）を使用して、デンドログラムを構築した。
【図５】 図5は、MC遺伝子および推定された酵素機能を示す。
【図６】 図6は、細菌株およびプラスミドを示す。株DH5αおよびDH5αF'はGibco BRL
（マリイランド州ガイサースバーグ）から入手可能であり、ATCC 27643およびN
RRL 2564はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）から入手可能であり、そして株S17−1はHidaka他（199
5）に記載されている。プラスミドpNJ1、pUC119、pKC1139、pDHS3001、pKN108、
およびpFD666は、それぞれKuzuyama他（1995）、Madduri他（1993）、Boxer（19
77）、KaganおよびClarke（1994）、Kim他（1998）、およびCoque他（1995）に
記載されている。
【図７】 図7は、マイトマイシンCに導く生合成経路を示す。
【図８】 図8は、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）からのmrdおよび
rifKハイブリダイズ領域のサザンハイブリダイズおよび制限酵素地図を示す。A
）rifK遺伝子プローブを使用するサザンハイブリダイズ（Kim他、1998）。レー
ン1、BamHIで消化したアミコラトプシス・メディテラネイ（A. mediterranei）
ATCC 27643ゲノムDNA；レーン2、BamHIで消化したストレプトマイセス・ラベン
ヅレ（S. lavendulae）NRRL 2564ゲノムDNA；B）mitABC遺伝子を示す物理的地
図。コスミドpDHS7529中のmrdおよびrifKハイブリダイズ遺伝子の位置は充実バ
ーで示されている。酵素：E、EcoRI；B、BamHI。mitA、mitB、mitCを含有する配
列決定された3.8kbのBamHIフラグメントは拡大されている（幅広い矢印）。下の
細い矢印は崩壊実験のための耐性遺伝子の完全性の部位を示す。
【図９】 図9は、mitABCを含有する3.8kbのDNAフラグメントのヌクレオチド配列（配列
番号9）を示す。推定された遺伝子産物はDNA配列の下に1文字コードで示されて
いる（配列番号10、MitA；配列番号11、MitB；配列番号12、MitC）。可能なTリ
ボソーム結合部位はボックス領域においてしるされている。各ORFについての仮
定された翻訳開始部位および転写の向きは矢印により示され、それに応じてしる
されている。
【図１０】 図10は、MitAと3つの他のAHBAシンターゼとの整列。ストレプトマイセス・ラ
ベンヅレ（Streptomyces lavendulae）に由来するAHBAS遺伝子から推定された
アミノ酸配列（配列番号10）を示す。ストレプトマイセス・コリヌス（Streptom
yces collinus）（Z54208；配列番号13）、アクチノシンネマ・プレチオスム（
Actinosynnema pretiosum）（I39657；配列番号14）、およびアミコラトプシス
・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）（I39657；配列番号15）は
、下線が引かれているPLP結合性モチーフにおいて保存されたリシンとともに示
されている。
【図１１】 図11は、mitA突然変異株のサザンブロット分析。A）サザンブロットにおいて
期待されたバンドサイズを示す野生型およびmitA崩壊突然変異体のmitA崩壊突然
変異体の構築および制限地図を示す。地図は縮尺通りに描かれていない。B）野
生型（レーン1および2）および二重交差突然変異体（レーン3および4）からのス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）ゲノムDNAを、それぞれ、Bam
HI（レーン1および3）およびSphI（レーン2および4）で消化した。tsr崩壊mitA
を含有するpDHS2001からの4.9kbのEcoRI−HindIIIをプローブとして使用した。
【図１２】 図12は、mitB突然変異株MM101のサザンブロット分析。A）サザンブロットにお
いて期待されたサイズを示す野生型およびmitB崩壊突然変異体のmitB崩壊突然変
異体の構築および制限地図を示す。B）野生型（レーン1および3）およびmitB突
然変異体（レーン2および4）からのストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lave
ndulae）ゲノムDNAを、それぞれ、BamHI（レーン1および2）およびSacI（レーン
3および4）で消化した。DNAプローブ：pDHS7601からの3.8kgのBamHIフラグメン
トインサート。
【図１３】 図13は、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）野生型および突
然変異体株からの抽出物の化学的分析および生物学的活性を示す。A）野生型ス
トレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）、ストレプトマイセス・ラベ
ンヅレ（S. lavendulae）のmitA（AHBAS）およびmitB（gtf）崩壊突然変異体に
おける真性マイトマイシンC標準、マイトマイシンCの産生のHPLC分析。1mgの粗
製抽出物を注入し、1μgのMCを標準として注入した。B）ストレプトマイセス・
ラベンヅレ（S. lavendulae）のmitA崩壊突然変異株におけるマイトマイシンC
産生の枯草菌（Bacillus subtilis）。フィルターディスク：1）100μgの野生
型の注入−12.5〜13.5分に収集した；2）100μgのmitA（ahbas）崩壊突然変異体
のの注入−12.5〜13.5分に収集した；3）100μgのW.T.を含有するベクター−12.
5〜13.5分に収集した；4）1μgのマイトマイシンCをHPLCから12.5〜13.5分に収
集した；5）Tris緩衝液の陰性対照；6）メタノール溶媒の陰性対照。
【図１４】 図14は、実施例3において使用した株およびプラスミドを示す。BL21（DE3）お
よびpET17bはノバゲン（Novagen、ウイスコンシン州マディソン）から入手可能
である。pDH57006はSheldon他（1997）に記載されている。
【図１５】 図15は、MC生合成遺伝子クラスター内のmctおよびmrd遺伝子の物理的連鎖を示
す遺伝地図を示す。拡張されたボックスはmctORFのラインプロットを示す。
【図１６】 図16は、mctのヌクレオチド配列（配列番号16）を示す。mctの推定されたアミ
ノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に1文字表示で示されている（配列番号17）
。14TMSタンパク質の保存されたモチーフの特徴はボックスで示されているが、
不変ベータ回転のモチーフは破線の下線で表示されている。推定上のリボソーム
結合部位は実線の下線でしるされている。
【図１７】 図17は、mctの推定されたアミノ酸配列と他のアクチノミセテス抗生物質流出
タンパク質とのドットマトリックス整列を示す。整列を発生させるとき、比較で
きるパラメーターを利用した。
【図１８】 図18は、MC−トランスロカーゼの推定されたアミノ酸配列のヒドロパシー分析
。A）KyteおよびDoolittle（1982）の予測から得られたヒドロパシープロットを
示す。B）MC−トランスロカーゼタンパク質のトポロジーの概略的表示。トラン
スメンブランスパニング領域はしるされている（1〜14）。各トランスメンブラ
ンドメインの初期および最終のアミノ酸位置を小さい数で示されている。正（H
、R、K）および負（D、Q）に帯電したアミノ酸の相対的位置を、それぞれ＋およ
び−で示す。
【図１９】 図19は、mct崩壊突然変異体の発生。A）ネオマイシン耐性マーカー（陰影をつ
けた）の挿入により、染色体mct遺伝子（黒色バー）を崩壊した。二重交差組換
え後、野生型株に比較してmct突然変異体ゲノムにおいて、特異的制限酵素バン
ドがシフトすることが予測される。B）mct突然変異体のサザンブロット分析。期
待されるように、pDHS7661からの4.0kbのBamHIインサートでプロービングしたと
き、野生型ストレプトマイセス・ラベンヅレ（S. lavendulae）中の4.0kbのBam
HIハイブリダイズバンドはmctノックアウトにおいて5.4kbにシフトされたが、1.
65kbのハイブリダイズバンドは3.0kbのサイズにシフトされた。レーン1および5
：BamHIで消化した野生型ゲノムDNA。レーン2、3、4、および6：BamHIで消化し
た4つの二重交差コロニーのゲノムDNA。レーン7：SstIで消化した野生型ゲノムD
NA。レーン8：SstIで消化した二重交差クローン6ゲノムDNA。
【図２０】 図20は、株PJS100、PJS102、およびPJS103のMC吸収分析を示す。BL21（DE3）
：pET17bベクター対照株、（黒丸）；株PJS100、（黒正方形）；株PJS102、（黒
ひし形）；株PJS103（×）。
【図２１】 図21は、マイトマイシン遺伝子クラスターの完全なヌクレオチド配列（配列番
号96）を示す。
【図２２】 図22は、ORF1〜9の完全なヌクレオチド配列（配列番号74）を示す。
【図２３】 図23は、ORF11〜22の完全なヌクレオチド配列（配列番号75）を示す。
【図２４】 図24は、種々のアミノ酸のコドンを示す。
【図２５】 図25は、典型的なアミノ酸置換を示す。
【図２６】 図26は、マイトマイシン生合成遺伝子完全なヌクレオチド配列（配列番号76）
を示す。
【図２７Ａ】 図27Aは、選択したマイトマイシンの構造を示す。
【図２７Ｂ】 図27Bは、選択した天然に存在するマイトマイシンの構造を示す。
【図２８】 図28は、合成スキームを示す。
【図２９】 図29は、9a−デメトキシマイトマイシンAの1Hスペクトル（CD3CN、800MHz）を
示す。
【図３０】 図30は、9a−デメトキシマイトマイシンAの1H−1H COSYスペクトル（CD3CN、
800MHz）を示す。
【図３１】 図31は、9a−デメトキシマイトマイシンAのHMQCスペクトル（CD3CN、800MHz）
を示す。
【図３２】 図32は、9a−デメトキシマイトマイシンAのHMBCスペクトル（2.4ppm〜4.9ppm
）（CD3CN、800MHz）を示す。
【図３３】 図33は、9a−デメトキシマイトマイシンAのHMBCスペクトル（1.6ppm〜2.35ppm
）（CD3CN、800MHz）を示す。
【図３４】 図34は、9a−デメトキシマイトマイシンAの低いおよび高い分解能のエレクト
ロスプレーイオン化質量分析を示す。
【図３５】 図35は、9a−デメトキシマイトマイシンAのUVスペクトルを示す。
【図３６】 図36は、9−エピ−マイトマイシンBの1Hスペクトル（CD3CNおよびCD3COD、800
MHz）を示す。
【図３７】 図37は、9−エピ−マイトマイシンBの低いおよび高い分解能のエレクトロスプ
レーイオン化質量分析を示す。
【図３８】 図38は、mitM欠失突然変異体の構築の略図を示す。
【図３９】 図39は、野生型および種々のmitMおよびmitN突然変異体におけるMC産生を示す
。
【図４０】 図40は、MitMおよびMitNの精製を示す。
【図４１】 図41は、MitMおよびMitNによるMAからMFへの変換を示す。
【図４２】 図42は、マイトマイシン生合成における後の段階を示す。
【図４３】 図43は、MM107およびMM108の薄層クロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 9/00 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:465 // Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 17/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マオ，インチン アメリカ合衆国，ミネソタ 55108，セン ト ポール，ノース クリーブランド ア ベニュ 1393 (72)発明者 バログル，マスタファ アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109， サン ディエゴ，エメラルド ストリート 1036 ＃１ (72)発明者 ヘ，ミン アメリカ合衆国，ニューヨーク 10952， モンシー，カーシング パークウェイ 191 エー (72)発明者 シェルドン，ポール シー． アメリカ合衆国，ミネソタ 55102，セン ト ポール，アームストロング アベニュ 771 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA67 CA04 CA11 DA02 DA05 DA08 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 4B050 CC10 DD02 LL05 4B063 QA01 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AE48 CA02 CA04 CA10 CA19 CC24 DA02 4B065 AA01X AA50X AA50Y AA57X AA87X AB01 BA01 BC05 CA18 CA34 CA44

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マイトマイシン生合成遺伝子クラスターを含んでなる核酸配
    列、その変異型またはフラグメントを含んでなる単離、精製された核酸分子。
  2. 【請求項２】 MitT、MitS、MitR、MitQ、MitP、MitO、MitN、MitM、MitL、
    MitK、MitJ、MitI、MitH、MitG、MitF、MitE、MitD、MitC、MitB、MitA、または
    それらの任意の組合わせをコードする、請求項１に記載の単離、精製された核酸
    分子。
  3. 【請求項３】 MmcA、MmcB、MmcC、MmcD、MmcE、MmcF、MmcG、MmcH、MmcI、
    MmcJ、MmcK、MmcL、MmcM、MmcN、MmcO、MmcP、MmcQ、MmcR、MmcS、MmcT、MmcU、
    MmcV、Mct、MmcW、MmcX、MmcY、またはそれらの任意の組合わせをコードする、
    請求項１に記載の単離、精製された核酸分子。
  4. 【請求項４】 ストレプトマイセス（Streptomyces）spp.に由来する、請求
    項１に記載の単離、精製された核酸分子。
  5. 【請求項５】 宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖さ
    れた、請求項１、２または３に記載の核酸分子を含んでなる発現カセット。
  6. 【請求項６】 対応する非組換え細菌宿主細胞に関して変更されたレベルの
    マイトマイシンを産生する組換え宿主細胞を生ずるように、マイトマイシン生合
    成遺伝子クラスターを含んでなる核酸分子の少なくとも一部分が崩壊されている
    、組換え細菌宿主細胞。
  7. 【請求項７】 マイトマイシンレベルが増加されている、請求項６に記載の
    組換え宿主細胞。
  8. 【請求項８】 マイトマイシンレベルが減少している、請求項６に記載の組
    換え宿主細胞。
  9. 【請求項９】 崩壊された核酸分子がMitT、MitS、MitR、MitQ、MitP、MitO
    、MitN、MitM、MitL、MitK、MitJ、MitI、MitH、MitG、MitF、MitE、MitD、MitC
    、MitB、MitA、またはそれらの任意の組合わせをコードする、請求項６に記載の
    宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 崩壊された核酸分子がMmcA、MmcB、MmcC、MmcD、MmcE、Mm
    cF、MmcG、MmcH、MmcI、MmcJ、MmcK、MmcL、MmcM、MmcN、MmcO、MmcP、MmcQ、Mm
    cR、MmcS、MmcT、MmcU、MmcV、Mct、MmcW、MmcX、MmcY、またはそれらの任意の
    組合わせをコードする、請求項６に記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖
    されたマイトマイシン生合成遺伝子クラスターを含んでなる核酸分子の少なくと
    も一部分で増強されているゲノムを有する、組換え宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 マイトマイシンレベルが増加されている、請求項１１に記
    載の組換え宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 マイトマイシンレベルが減少している、請求項１１に記載
    の組換え宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 ゲノムがMitT、MitS、MitR、MitQ、MitP、MitO、MitN、Mi
    tM、MitL、MitK、MitJ、MitI、MitH、MitG、MitF、MitE、MitD、MitC、MitB、Mi
    tA、またはそれらの任意の組合わせをコードする核酸分子で増強されている、請
    求項１１に記載の宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 ゲノムがMmcA、MmcB、MmcC、MmcD、MmcE、MmcF、MmcG、Mm
    cH、MmcI、MmcJ、MmcK、MmcL、MmcM、MmcN、MmcO、MmcP、MmcQ、MmcR、MmcS、Mm
    cT、MmcU、MmcV、Mct、MmcW、MmcX、MmcY、またはそれらの任意の組合わせをコ
    ードする核酸分子で増強されている、請求項１１に記載の宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 組換え核酸がマイトマイシン生合成遺伝子を含まず、そし
    て組換え宿主細胞が対応する非組換え宿主細胞により産生されない生物学的に活
    性な因子を産生する、マイトマイシン生合成遺伝子クラスターを含んでなり、組
    換え核酸分子により増強されたゲノムを有する、組換え宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 対応する非組換え宿主細胞により産生されない、請求項６
    または１１に記載の組換え宿主細胞により産生された産物。
  18. 【請求項１８】 生物学的に活性な因子を含んでなる、請求項１７に記載の
    産物。
  19. 【請求項１９】 マイトマイシンである、請求項１８に記載の産物。
  20. 【請求項２０】 マイトマイシンではない、請求項１８に記載の産物。
  21. 【請求項２１】 核酸配列がハイブリダイズ条件下に配列番号74に対してハ
    イブリダイズする、ポリケタイド生合成酵素をコードする核酸配列またはそのフ
    ラグメントを含んでなる単離、精製された核酸分子。
  22. 【請求項２２】 MitT、MitS、MitR、MitQ、MitP、MitO、MitN、MitM、MitL
    、MitK、MitJ、MitI、MitH、MitG、MitF、MitE、MitD、MitC、MitB、MitA、MmcA
    、MmcB、MmcC、MmcD、MmcE、MmcF、MmcG、MmcH、MmcI、MmcJ、MmcK、MmcL、MmcM
    、MmcN、MmcO、MmcP、MmcQ、MmcR、MmcS、MmcT、MmcU、MmcV、Mct、MmcW、MmcX
    、MmcY、またはそれらの任意の組合わせを含んでなる単離、精製された核酸分子
    。
  23. 【請求項２３】 核酸配列がハイブリダイズ条件下に配列番号75を含んでな
    るDNAに対してハイブリダイズする、糖代謝遺伝子を含んでなる核酸配列または
    そのフラグメントを含んでなる単離、精製された核酸分子。
  24. 【請求項２４】 マイトマイシンを産生するストレプトマイセス（Streptom
    yces）株からのアミノDAHPシンターゼをコードする核酸配列を含んでなる単離、
    精製された核酸分子。
  25. 【請求項２５】 対応する非組換え細胞に関して変更されたポリケタイドレ
    ベルまたは変更された組成のポリケタイドを産生する組換え宿主細胞を生ずるよ
    うに、ポリケタイド生合成酵素をコードする核酸分子の少なくとも一部分が崩壊
    されており、該核酸配列がハイブリダイズ条件下に配列番号74に対してハイブリ
    ダイズする、組換え宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 対応する非組換え細胞に関して変更された糖レベルまたは
    変更された糖組成を有する分子を産生する組換え宿主細胞を生ずるように、糖代
    謝酵素をコードする核酸分子の少なくとも一部分が崩壊されており、該核酸配列
    がハイブリダイズ条件下に配列番号75を含んでなるDNAに対してハイブリダイズ
    する、組換え宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖
    されたポリケタイド生合成酵素をコードする核酸配列の少なくとも一部分で増強
    されたゲノムを有し、該核酸配列がハイブリダイズ条件下に配列番号74に対して
    ハイブリダイズする、組換え宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連鎖
    された糖代謝酵素をコードする核酸配列の少なくとも一部分で増強されたゲノム
    を有し、該核酸配列がハイブリダイズ条件下に配列番号75を含んでなるDNAに対
    してハイブリダイズする、組換え宿主細胞。
  29. 【請求項２９】 配列番号96を含んでなる核酸セグメントに対してハイブリ
    ダイズ条件下にハイブリダイズする核酸配列を含んでなる単離、精製された核酸
    分子。
  30. 【請求項３０】 植物の核酸である、請求項２９に記載の単離、精製された
    核酸分子。
  31. 【請求項３１】 原核生物の核酸である、請求項２９に記載の単離、精製さ
    れた核酸分子。
  32. 【請求項３２】 工程： a） 接合性プラスミドを含んでなる細菌ドナー細胞をストレプトマイセス（S
    treptomyces）細胞と接触させて、プラスミドの少なくとも一部分を含んでなる
    形質転換されたストレプトマイセス（Streptomyces）細胞を産生し、そして b） 形質転換されたストレプトマイセス（Streptomyces）細胞を同定する、
    を含んでなる、外因的DNAを不応性ストレプトマイセス（Streptomyces）株の中
    に導入する方法。
  33. 【請求項３３】 ストレプトマイセス（Streptomyces）株がマイトマイシン
    を産生する、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 工程： a） マイトマイシン遺伝子を含んでなる核酸分子の少なくとも一部分を含ん
    でなるある量のプローブと核酸を含んでなる試料を接触させて複合体を形成し、
    そして b） 複合体の存在または非存在を検出する、 を含んでなる、マイトマイシン遺伝子クラスターを含んでなる核酸分子の少なく
    とも一部分に関係する核酸分子を同定する方法。
  35. 【請求項３５】 工程： a） 核酸を増幅するために有効な条件下に、核酸を含んでなる試料を少なく
    とも1つのオリゴヌクレオチドと接触させて増幅産物を生成し、ここで前記オリ
    ゴヌクレオチドはマイトマイシン遺伝子クラスターを含んでなる核酸に対して特
    異的にハイブリダイズし、そして b） 前記産物の存在または非存在を検出または決定する、 を含んでなる、マイトマイシン遺伝子クラスターを含んでなる核酸分子の少なく
    とも一部分に関係する核酸分子を同定する方法。
  36. 【請求項３６】 試料を植物から得る、請求項３４または３５に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 試料を微生物から得る、請求項３４または３５に記載の方
    法。
  38. 【請求項３８】 MitT、MitS、MitR、MitQ、MitP、MitO、MitN、MitM、MitL
    、MitK、MitJ、MitI、MitH、MitG、MitF、MitE、MitD、MitC、MitB、MitA、MmcA
    、MmcB、MmcC、MmcD、MmcE、MmcF、MmcG、MmcH、MmcI、MmcJ、MmcK、MmcL、MmcM
    、MmcN、MmcO、MmcP、MmcQ、MmcR、MmcS、MmcT、MmcU、MmcV、MmcW、MmcX、MmcY
    、またはそれらの任意の組合わせから選択される遺伝子産物を含んでなる核酸を
    含んでなる単離、精製された核酸分子。
  39. 【請求項３９】 マイトマイシン生合成に必要な少なくとも1つの遺伝子を
    コードする核酸配列を含んでなる単離、精製された核酸分子。
  40. 【請求項４０】 マイトマイシン輸送のための少なくとも1つの遺伝子をコ
    ードする核酸配列を含んでなる単離、精製された核酸分子。
  41. 【請求項４１】 マイトマイシン生合成または耐性を調節するポリペプチド
    をコードする核酸配列を含んでなる単離、精製された核酸分子。
  42. 【請求項４２】 炭素、窒素および無機塩の同化可能な源を含有する培地中
    で請求項６、１１または１６に記載の宿主を好気性発酵条件下に培養して、対応
    する非組換え宿主細胞により産生される化合物のレベルに関して化合物を増加さ
    せることを含んでなる、組換え宿主細胞から化合物またはその薬学上許容される
    塩を製造する方法。
  43. 【請求項４３】 炭素、窒素および無機塩の同化可能な源を含有する培地中
    で請求項６、１１または１６に記載の宿主を好気性発酵条件下に培養して、対応
    する非組換え宿主細胞により産生されるマイトマイシンのレベルに関してマイト
    マイシンを増加させることを含んでなる、組換え宿主細胞からマイトマイシンま
    たはその薬学上許容される塩を製造する方法。
  44. 【請求項４４】 マイトマイシンである、請求項１６に記載の組換え宿主細
    胞により産生された産物。
  45. 【請求項４５】 マイトマイシンではない、請求項１６に記載の組換え宿主
    細胞により産生された産物。
  46. 【請求項４６】 9a−デメトキシマイトマイシンCである、請求項１９に記
    載の産物。
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