KR890003227B1 - Dna 하이브리드 반응용 프로브의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

DNA 하이브리드 반응용 프로브의 제조방법

제1도는 페니실리나제에 관한 유전자를 전기영동상에서 분리하는 방법.

제2도는 플라스미드 피비알 322 함유 대장균과 플라스미드 함유치 않는 미생물을 혼합시켰을 때의 반응도.

제3도는 플라즈미드 함유치 않는 대장균을 엑스자로 배양하였을 때의 반응도.

본 발명은 페닐실렌계 항생제에 대한 저항성이나 유전자 조작 여부를 진단·판정하는 DNA 하이브리드 반응용 프로브의 제조방법에 관한 것이다.

질병과 관련되는 미생물은 일반적으로 항생제 저항성을 나타내는 경우가 있으므로 미생물의 항생제 저항테스트 결과에 따라 신속한 질병치료 방법의 선택을 가능케 한다. 미생물의 항생제 저항성 테스트는 P.Gerhardt등이 편집한 Manual of Methods for General Bacteriology(미국 미생물학회 출판, 1981)의 230면에서 상술하고 있는 경사면 평판배지 방법이나, 디프코사 등에서 판매하고 있는 항생제 디스크 방법에 의해 이루어진다. 그런, 환자의 상처 부위에서 채취된 미생물을 배양하고, 그 뒤 저항성 컴토 실험에 착수해야 하는 3단계 공정이며, 따라서 결과를 얻는데 최소한 3일 이상의 장시간이 소요된다.

항체를 사용하여 미생물을 진단하는 방법도 도입 가능하지만, 페니실린 저항성 형질이 프라스미드 및 알인자(R factor)에 의해 자유롭게 다른 미생물로 형질 전환된다. (S.Misuhashi 등 Drug-Inactivating Enzymes and antibiotic resistance, Springer-verleg,1975)는 점에서 페닐실린계 항생제에서는 항체를 포함한 기존의 혈청학적 진단방법은 그 의미가 감소된다. 페니실린계 항생체 저항성은 페니실리나제라는 효소에 의해 나타나므로 페니실리나제의 유전자를 시료에서 직접 확인하게 되며, 항생제에 대한 저항성을 신속하게 확인할수 있으며, 염색체사이의 유전자 디엔이이블 직접 확인하는 방법이 디엔에이 하이브리디제이션 프르브(이하 DNA probe)로써, 본 발명에서 1982년 개발된 비오틴 표지 방법은 이용하여 동위원소 사용시의 불편한 점도 개선하였다.

페니시리리나제(Penicillinase, or-B-lactamase)의 유전자에 비오틴을 표지시켜 얻은 디엔에이 프로브론써 페니실린계 항생제에 대한 저항성 여부를 확인하려는 본 발명은 1. 디엔에이 프로브의 제조, 2. 대장균 내 플라스미드 피비알 322와의 반응성, 3. 유전자 조작된 미생물과의 미생물과의 비교실험, 4. 병원성 미생물에의 적용으로 되어있다.

[실시예 1. DNA probe의 제조]

가. 플라스미드 및 페니실리나제 유전자의 분리

트립톤 10g, 이스트엑기스 5g을 물 1l에 녹인 배지에 에세리키아콜리에이치비 101/피비알 322를 접종하여 37℃에서 배양한 뒤 550mM에서 흡광도가 0.7에 도달할때 클로람페니콜을 100mg/l 되도록 첨가하고 20시간 배양한 뒤 원심분리하여 균체를 수확한다. 6mg/ml의 리조짐을 함유한 50nM 포도당, 10mM이디티에이를 PH 8.0의 25mM 트리스 완충액에 균체를 분산시켜 상온에서 5분간 방치한 뒤 1% 라우릴 황산타트륨을 함유한 0.2 N 수산화나트륨 용액을 두배 부피로 섞은 뒤 얼음 상태에서 1분간 방치하고 닷 3N 초산나트륨을 첨가하여 15분간 얼음상에서 방치한다.

원심분리하여 세포불순물이 혼입되지 않도록 주의하면서 얻어낸 상층액에 페놀 : 클로로포름(1:1)용액을 첨가하여 진탕하고, 회수한 물층에 에탄올을 2매 가하여 디엔에이를 첨가시켜 회수하였다.

이 방법은 과학기술처 보고서 "DNA hybridization probe에 의한 설사진단제 개발"(1986.9)88-91면에 상술되어 있으며, Birnboim 방법(핵산·7·1512·1979)을 변형시킨 것이다.

이상에서 얻어진 플라스미드 피비알 322를 미국 비알엘사에서 판매하는 코어(Core)완충액에 녹이고, 제한효소 Hinf 과 Tag I을 첨가하여 가수분해시킨뒤 4% 폴리이크릴아미드 전기 영동법을 통해 전기시킨후 (도면제1도), 0.5M 초산암모늄 10mM이디티에이용액에 담가 분자량이 큰 밴드를 회수하고 원심분리후 에탄올을 침전시킴으로써 656베이스(bp)의 페니실리나제 유전자를 준비하였다.

나. 비오틴 표지방법

5g의 페니실리나제 유전자 디엔에이를 0.1nM이디티에이 120mM 소금, 10mM 트리스완충액(PH 7.5)2l에 녹인뒤, 미극 비알엘사이 에이 4용액 10l, 0.4mM 비오틴화 디유티피(dUTP), 증류수 73l울 섞고, 0.4 유니트/1디엔에이 폴리머라제 I, 40pg/l 딩엔에이 분해효소, 150mM 트리스 완충액(PH 7.5), 5mM 초산 마그네슘, 1mM 2-머켑토 에탄올, 0.1mM 페닐메틸설포닐 플로라이드, 50% 글리세로, 헥사분해 효소의 오염이 없는 소혈청 알부민 100g/ml 용액 5l를 서서히 혼합한 뒤, 원심분리하여 갈라앉히고 15℃에서 90분간 방치한 뒤, 1.25l의 5% 라우릴 황산나트륨 용액과 5l의 300mM 이디티에이(PH 8.0)반응정지 용액을 첨가한다. 에스에스씨(SSC)완충액 (조성 : 0.1 M 소금, 0.15M 구연산소다, PH 7.0)에 0.1% 라우릴 황산나트륨을 첨가한 용액으로 전처리한 세파덱스 G-50 충전칼럼을 비오틴 표지된 DNA probe를 정제하였다.

[실시예 2]

가. 하이브리드 반응

디프코사의 브레인하트 인퓨전 브로스에서 배양한 대장균 에이치비 101/피비알 322를 동 브로스트 희석하여 아가가 함유된 동고체 배지 표면에 뿌려 37℃에서 하루 배양하고 냉장고에서 적어도 1시간 정도 방치한다. Schleicher&schnell사의 BA 85 니트로셀룰로스 여과지를 2분간 접속시킨뒤, 0.1N수산화나트륨, 1.5M 소금, 0.2 M 트리스완충액 (PH 7.5)로 콜로니를 가수분해시킨다음 2배의 SSC 완충액으로 30초간 2회 세척하고 공기중에서 건조시킨 후 80℃오분에서 2시간 굽는다. 실시예 1. 나에서 준비한 DNA probe 0.2g와 덱스트란 설페이트 10% 첨가된 하이브리드 반응액 20ml를 니트로 셀룰로스 여과지에 침전시켜 42℃에서 16시간 반응시키고, 0.1% 라우릴 황산 나트륨이 첨가된 2배의 SSC 세척용액으로 여과지를 2회 세척하였다. 하이브리드 반응액의 조성은 45%의 포름아미드, 1% 글리신, 5배의 SSC와 덴할트용액으로써, 덴할트 용액은 폴리피롤리돈-40 20%, 피콜 400 2%, 소혈청알부민 2%, 0.1M트리스 완충액 (PH 7.5)으로써 이를 100배 희석하여 사용한다.

나. 탈색반응

시그마 제품으로써 방사선동위원용 소형청알부민 3g을 0.1M 소금, 2mM 염화마그네슘, 0.05% 트리톤 X-100, 0.1M 트리스 완충액(PH 7.5)100ml 에 녹인 용액으로써 실시예 3에서준비한 반응된 여과지에 흡착시키고 29/ml 되도록 스트렙타비딘을 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 뒤 최종 농도가 1g/ml 되도록 3M 소금, 1mM 염화마그네슘, 0.1 mM 염화아연, 30mM 트리에탄올을 아민(PH 7.6)에 바이오린 표지된 송아지장내 알칼리 포스파타제(비알엘사 제품)을 첨가하여 10분간 방치한 후 세척용액을 사용하여 백그라운드 노이즈를 제거한다. 70% 디메틸포름아미이드에 75mg/ml되도록니트로-블루테트라졸리움을 녹여 33l취하여 7.5ml의 완충액 3에 녹이고 디메틸포름아마이드에 50mg/ml되도록 5-브로모 4-클로로-3-인돌포스페이트를 25l 첨가한 발색시약 7.5ml를 폴리프로필렌 백에 넣은 뒤 여과지를 투여하고 밀봉시킨 뒤 실온에서 4시간 방치하면 스포트가 나타나며, 백을 개봉하여 5mM 이디티에이, 20M 트리스 완충액(PH 7.5)을 여과지에 첨가하여 탈색반응을 중지시키고 직사광선이 없는 곳에서 건조시킨다. 이때, 건조시키기 위하여 진공 오분에서 80°로 유지 시킨후 1-2분동안 구워도 된다.

[실시예 3]

실시예 2가에서 언급된 플라스미드를 갖고 있는 대장균 군주와 플라스미드를 갖고 있지 않은 대장균 에이치비 101을 동일 배지에서 각각 배양한 두 혼합하여 평판배지 배양시키고, 이에 대한 레플리카로써 실시예 2의 과정을 실험한 결과는 제2도와 같으며, 플라스미드를 갖고 있지 않은 대장균을 엑스자 형태로 뱅양시켰을 때의 결과는 제3도와 같다.

[실시예 4]

플라스미드 피비알 322 상에 유전자를 조작한 두 균주 KFCC 1011R(공개번호 86-3341), KFCC 10072(공재번호 86-348)을 대상으로 페니실리나제의 유전자를 확인한 결과 양성, 음성으로 나타났다. KFCC 10114는 페닐알라닌 생합성에 관계된 유전자를 전환시킨 플라스미드를 갖고 있으며, 페니실라나제 유전자가 손상되지 않았고 KFCC 10072은 페니틸리나제 유전자를 제거시키고 페니실린 지 아실라제 유전자를 코노닝한 플라스미드를 갖고 있다.

[실시예 5]

설사 환자의 변을 코튼 스웨브(Cotton Swab)로 적시고 나트로셀룰로스 여과지에 강하지 않게 비벼 준다. 또한 두번째 스웨브로써는 이엠비(EMB)아가 사에 도말하여 녹색의 광태과 검은 빛의 콜로니를 확인하며, 동시에 1.5g/ml 의 암피실린이 첨사된 디프코사 박토 A-1메디움(조성 : 트립톤 20g, 락토스 5g, 소금 5g, 사리신 0.5g, 트리톤엑스-100 ml, 물로 1l만든다. (PH 6.9)에 접종하여, 생장하면 항생제 내성으로 판정하였다. 미생물이 부착되어 있는 니트로셀룰로스 여과지를 실시예 2의 방법으로 DNA probe와 반응시켰을 때 항생제 내성 결과와 일치하였다.

[실시예 6]

임질환제의 뇨를 코는 스웨브에 적시고 니트로 셀룰로스 여과지에 강하지 않게 비벼주며, 두번째 스웨브로써 초코렛아가(디프코사제품)상에 도말하여 배양한 뒤, 페니실린 0.01g/ml 함유 0.35mM의 원형 여과지를 덮어 원형여과지 부조의 생장을 관찰하여 내성을 판정하였다. 미생물이 부착되어 있는 나트로 셀루로스 여과지를 실시예 2의 방법으로 반응시켰을 때 항생제 저항성 실험 결과와 DNA probe 반응성은 일치하였다. 부수적으로 초코렛 브로스에서 배양시킨 각 시료를 8% 설탕, 5%트리톤 엑스-100,50mM 트리스(pH 8) 25l의 1% 리조짐 완충액 0.35ml에 옮겨 10동안 끓이고 원심분리하여 상등액을 취한뒤 에탄올 침전하여 플라스미드를 확인하여 비교한다. 플라스미드를 갖고 있는 사료의 비율은 probe 양성반응 시료 수 보다 물론 많이 나타났으며, 크립틱(Cryptic)플라스미드 존재에 의한다.

Claims (1)

1. 플라스미드 피비알 322상의 페니실리나제 유전자의 디엔에이 조각에 비오틴을 표지시키는 DNA 하이브리드 반응용 프로브의 제조방법

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