SU1750690A1 - Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI - Google Patents

Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI Download PDF

Info

Publication number
SU1750690A1
SU1750690A1 SU894788233A SU4788233A SU1750690A1 SU 1750690 A1 SU1750690 A1 SU 1750690A1 SU 894788233 A SU894788233 A SU 894788233A SU 4788233 A SU4788233 A SU 4788233A SU 1750690 A1 SU1750690 A1 SU 1750690A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
thermostable
enterotoxin
thermolabile
toxin
hours
Prior art date
Application number
SU894788233A
Other languages
English (en)
Inventor
Григорий Вакулович Гнатенко
Юрий Станиславович Сухарев
Original Assignee
Украинский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Украинский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии filed Critical Украинский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии
Priority to SU894788233A priority Critical patent/SU1750690A1/ru
Application granted granted Critical
Publication of SU1750690A1 publication Critical patent/SU1750690A1/ru

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  получени  конъюгированного термостабильного энтеротоксина кишечной палочки. Сущность изобретени : культивирование токси- генных штаммов осуществл ют на среде следующего состава, г/л: перевар Хоттинге- ра 80-250; сернокислый магний 3,0-3.8: однозамещенный фосфорнокислый натрий 6,0-6,8; однозамещенный фосфорнокислый калий 3,0-3.8; глюкоза 5#-7,0; дистиллиро ванна  вода до 1 л, отдел ют токсиносодер- жащий супернатант, термолабильный и термостабильный токсины осаждают сульфатом аммони  при разной степени насыщени , выдерживают преципитаты 18-20 ч при 2-4°С, центрируют осадки термолабильного и термостабильного токсинов, раствор ют в дистиллированной воде и трис-HCI буфере соответственно и диализу- ют, после чего «х объедин ют в соотношении 100:1 и конъюгируют глутаровым альдегидом до конечной концентрации 2 г/л, конъюгат диализуют сначала против фосфатного буфера, а затем против трис- HCI буфера, конъюгат раствор ют в трис- HCI буфере, содержащем бычий сывороточный альбумин. 6 табл. Ън Ё

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  способа получени  конъюгированного термостабильного энтеротоксина кишечной палочки и может быть использовано в производстве вакцинных пре- паратов против колибактериоза и смешанной инфекции (колибактериоз, рота, коронавирусна  инфекци ).
Кишечна  палочка, котора  выдел етс  от больных и павших тел т, в основном продуцирует термостабильный энтеротоксин и в малой степени термолабильный. Термостабильный энтеротоксин не обладает им- муногенными свойствами. Он приобретает эти свойства лишь в сочетании с носителем с большей молекул рной массой.
Наиболее близким техническим решением  вл етс  способ получени  конъюгированного энтеротоксина из термостабильного и термолабильного энтеротоксинов E.coli с помощью 1 этил 3/3 диметиламинопропил/ кар- бодиимида Предварительно очищенный термостабильный и термолабильный энтеро- токсины с помощью хроматографии (амбер- лит НАД-2), ацетонного фракционировани , последовательной гельфильтрации на сефа- дексе G25, конъюгировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 96 часов при 4°С. с последующим диализом против НгО в течение 48 ч при 4 °С.
Однако известный способ имеет следующие недостатки: термостабильный и терХ|
СЛ О Ч) О
молабильный энтеротоксины подвергали длительной очистке с использованием дорогосто щего оборудовани  и реактивов: хроматографии (амберлит НАД-2), ацетонного фракционировани  последовательной гель- фильтрации на сефадексе G25 и ионнооб- менной хроматографии (ДАЕ сефацил), повторной хроматографии на сефадексе G25. Вследствие больших потерь токсинов на этапах очистки, особенно на этапах ион- нообменной и тонкослойной хроматографии не удаетс  собрать достаточного количества токсинов, необходимых дл  проведени  всего комплекса исследований по конъюгированию и дл  иммунизации боль- ших групп животных. Конъюгацию энтеро- токсинов осуществл ют с использованием дорогосто щего реактива 1 этил 3/3 диме- тиламинопропил/ карбодиимида, который в нашей стране не производитс . Метод тре- бует строгого соблюдени  оптимального соотношени  карбодиимида и энтеротокси- нов при конъюгации. Так при повышении этого соотношени  до 100:1 резко снижаетс  антигенность коныогата. Увеличение времени конъюгации существенно не вли ет на увеличение процента содержани  термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате. При сокращении времени конъюгации менее 18 ч резко снижаетс  анти- генность конъюгата. Нз весь процесс конъюгации энтеротоксинов затрачиваетс  более 260 ч.
Цель изобретени  - повышение имму- ногенности целевого продукта, ускорение и упрощение способа.
Поставленна  цель достигаетс  тем, что культивирование штаммов E.cotl, продуцирующих термостабильный и термолабильный энтеротоксины, осуществл етс  на среде, содержащей: перевар Хоттингера 80-250 мл (1000 мг% аминного азота), магний сернокислый 3,0-3,8 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,0-6,8, калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0-3,8, глюкоза 5,0-7,0 (только дл  термостабильного энтеротоксина), вода дистиллированна  до 1 л.
18-24-часовые культуры центрифугируют при 6000-8000 об/мин, в течение 30-40 мин, удал ют биомассу, токсиносодержа- щий материал осаждают сульфатом аммони  из расчета 650 г/л, Осажденный токсиносодержащий материал центрифугируют при 6000-8000 об/мин, в течение 30- 40 мин на холоду, надосадок удал ют, а суммарные белковыэ фракции энтеротоксинов обрабатывают смесью этанол-эфир (1:1) дл  удалени  липидов. Центрифугируют при 6000-8000 об/мин в течение 10-20
мин при 2-4°С. Верхний слой отбрасывали, а осадок перераствор ли в 0,05 М трис-НС буфере из расчета 1/10 от начального объема .
Обессоливание и фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтеротоксина провод т на хрома- тографических колонках с сефадексом G-25, а термолабильного - G-150. Элюцию проводили 0,15 н NaCI. В ходе фракционировани  выдел ют 5 белковых фракций термостабильного и термолабильного энтеротоксинов .
Концентрацию белка в выделенных фракци х определ ют с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.
Дл  электрофоретического контрол  гомогенности выделенных фракций их развод т в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% ДСП. Биологическую активность фракций термостабильного энтеротоксина определ ют с помощью теста анальной пробы на мышатах-сосунах, а термолабильного - с помощью теста отека лап белых мышей и Бикентеста.
Белковые фракции термостабильного и термолабильного энтеротоксинов, обладающие наибольшей биологической активностью , концентрируют против ПЭГ и используют дл  конъюгации.
Готов т смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в соотношении 1001 в фосфатно-солевом буфере (рН 7,0-7,2). К смеси добавл ют 25%-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 1-3 г/л, полученную смесь выдерживают 1-2 ч при 18-20°С, и получают конъюгат. Конъюгат диализируют против фосфатно-солевого буфера (рН 7,0-7,2) в течение ч при 2-4°С. Провод т повторный диализ против 0,05 М трис-HCI буфера (рН 8,0-8,2) в течение 20-24 ч при 2-4°С,
С помощью диализных мешочков происходит задержка всего конъюгированного энтеротоксина и выдел етс  непрореагировавший термостабильный энтеротоксин и глутара/ ьдегид.
Количество св занного термостабильного энтеротоксина в конъюгате определ ют посредством суммировани  возрастани  количества белка (по Лоури), присутствующего в диализате сверх количества термолабильного токсина, первоначально добавленного в конъюгат. Дл  увеличени  имму- ногенной активности полученного конъюгата к нему добавл ют раствор трис-HCI буфера, содержащий бычий сывороточный альбумин из расчета 10 г/л, рН 8,0-8,2.
Полученный конъюгат при необходимости концентрируют до 1/10 объема прошв ПЭГ.
Термостабильный и термолзбильный энтеротоксины концентрируют и очищают с 5 помощью более м гкого способа сульфатом аммони , в отличие от более грубого ацетон- ного фракционировани  в прототипе, что зачастую приводит к значительным потер м активности токсиносодержащего материа- 10 лэ, вследствие денатурации белковых молекул .
Дл  конъюгации термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в предлагаемом способе используют глутаральде- 15 гид, который  вл етс  не только хорошим сдваивающим агентом, но и веществом, значительно снижающим токсические свойства конъюгата, при полном сохранении антигенных детерминант его составл ющих. 20 Использование глутаральдегида дл  конъюгации энтеротоксинов E.coli позвол ет сократить врем  конъюгации почти в 30 раз, по сравнению с прототипом.
Предлагаемый способ позвол ет пол- 25 учать конъюгированный энтеротоксин E.coli в количествах, достаточных дл  иммунизации больших групп животных, а также добитьс  увеличени  на 10-20% выхода конечного продукта,30
Добавление к новому молекул рному образованию, конъюгированному энтеро- токсину E.coli, бычьего сывороточного альбумина позвол ет значительно увеличить его иммуногенную активность.35
Использование в за вл емом решении легкодоступных реактивов и оборудовани  позвол ет ускорить способ получени  конъ- югированного энтеротоксина E.coli более чем в 2 раза.40
Способ осуществл ют следующим образом .
Пример. Культуры кишечной палочки , выделенные от павших животных, продуцирующие термостабильный и 45 термолабильный энтеротоксины, высевают раздельно на питательную среду, содержащую следующие компоненты: перевар Хот- тингера 200 мл (содержание аминного азота 1000 мг%); калий фосфорнокислый одноза- 50 мещенный 3,5 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,5; сульфат магни  3,5; глюкоза 6,0 (только дл  культивировани  термолабильного штамма E.coli), вода дистиллированна  до 1 л, рН 7,14 и культивиру- 55 ют в течение 20 ч при 37°С в услови х аэрации. Бульонные культуры центрифугируют при 8000 об/мин при 4°С в течение 40 мин и получают надосадочную жидкость, содержащую энтеротоксины.
Токсиносочержащий материал осаждают медленным добавлением сульфата аммони  из расчета 650 г/л и оставл ют на 20 ч при непрерывном встр хивании при 4°С. Через 2 ч токсиносодержащий материал осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин на холоду. Осадки суммарных белковых фракций знтеротокси- нов обрабатывают смесью этанол-эфир (1:1) с целью удалени  липидов. Центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин, верхнюю эфирсодержащую фазу удал ют, а осадок перераствор ют в 0-.05 М трис-HCI буфере (рН 8,0) из расчета 1/10 от начального объема .
Материал, содержащий термостабильный энтеротоксин, обессоливают и фракционируют на хроматографической колонке с сефадексом G-25, а термолабильный энтеротоксин - на колонке с сефадексом G-150. Элюцию провод т 0,15 н NaCI (рН 7,0), скорость удалени  жидкости из колонки 2-3 капли в минуту. Элюатсобираютфракци ми по 5 мл. Количество белка в каждой фракции определ ют на спектрофотометре СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.
Дл  электрофоретического контрол  гомогенности выделенных фракций их развод т в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% ДСН.
Биологическую активность выделенных фракций термостабильного энтеротоксина определ ют с помощью теста анальной пробы на мышатах-сосунах, а термолабильного - с помощью отека лап белых мышей и Бик- кентеста.
Белковые фракции, обладающие наибольшей биологической активностью, концентрируют против ПЭГ до 1/10 объема и используют дл  конъюгации.
Готов т смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в фосфатно- солевом буфере рН 7,0 в соотношении 100:1. К смеси добавл ют 25%-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 2 г/л, полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 20°С и получают крнъюгат. Конъюгат диализируют против фосфатно-солевого буфера рН 7,0 в течение 20 ч при 4°С. Провод т повторный диализ против 0,05 М трис-HCI буфера рН 8,0 в течение 20 ч при 4°С.
Количество св занного термостабильного энтеротоксина в конъюгате определ ют посредством суммировани  возрастани  количества белка (по Лоури), присутствующего в диализате сверх количества термолабильного энтеротоксина, первоначально добавленного в конъюгат. Дл  увеличени 
иммуногенной активности полученного конъюгата к нему добавл ют раствор трис- HCI буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин из расчета 10 г/л, рН 8,0.
Полученный конъюгат при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ.
Контроль стерильности и безвредности полученного препарата осуществл ют по общеприн той методике.
Иммуногенность препарата вместе с адъювантом (раствор гидроокиси алюмини ) провер ют на белых мышах массой 16 г. Вакцинирующий материал ввод т двукратно , подкожно в дозе 0,3 и 0,5 мл с интервалом в 7 дней. Через 20 дней после второй прививки животных заражают летальными дозами термостабильного и термолабильного энтеротоксинов и культурами гомологических и гетерологических штаммов E.coli.
Вакцинированные животные в 95% случаев про вл ют устойчивость против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбО культур гомблогичного и в 80% случаев защита оставила против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбо культур гетерологичных штаммов Е.соП.
В контрольных группах мыши, которых заражают 2 ДЛМ токсинов и ЛДво культур, пали в 90% случаев.
Сенсибилизирующую активность пр ё- пйрата исследуют в тесте активной системной анафилаксии на морских свинках по методу Немова.
Пример 2. Культивирование токси- генных штаммов Е.со, получение нативных токсинов, их концентрирование и очистку, контроль гомогенности и определение биологической активности провод т аналогично примеру 1.
Готов т смесь термостабилъното и термолабильного энтеротоксинов в фосфатно- солевом буфере в соотношении 50:1 (рН 7,0). К смеси добавл ют 25%-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 2 г/л, полученную смесь выдерживают при 20°С в течение 2 ч. Полученный конъюгат диализируют против фосфатно-солевого буфера (рН 7,0) в течение 20 ч при 4°С. Повторно диализируют против 0,05 М трис- HCI буфера (рН 8-0) в течение 20 ч при 4°С. В конъюгат добавл ют трис-HCI буфер, содержащий БСА.
Пример 3. Культивирование кишечной палочки продуцирующей термостабильный и термолабильный энтеротоксины, получение и очистку, определение гомогенности и биологической активности осуществл ли как в примере 1. В данном примере готов т смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в соотношении 150:1 в фосфатно-солевом буфере рН 7,0 Конъюгацию провод т аналогично примеру 1.
5Пример 4. В примере 4 изменена
концентраци  глутарового альдегида с 2 г/л до 1,5 г/л. Смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов готов т в соотношении 100:1 в фосфатно-солевом буфере
0 рН 7,0. В дальнейшем конъюгацию провод т аналогично примерам 1-3.
Пример 5. В этом примере концентраци  глутарового альдегида вз та 2,5 г/л. Термостабильный и термолабильный энте5 ротоксины берут в соотношении 100:1. Режим конъюгации тот же, что и в примере 1. Данные, иллюстрирующие выше изложенные примеры, приведены в табл. 1-6. Изменение соотношени  компонентов
0 питательной среды, времени культивировани  бакмассы и изменение температуры культивировани  оказывают существенное значение на содержание энтеротоксинов в культуральной жидкости.
5 П.р и м е р 6. Культуры кишечной палочки , выделенные от павших животных, продуцирующие термостабильный и термолабильный энтеротоксины, высевают раздельно на питательную среду, содержащую сле0 дующие компоненты: перевар Хоттингера - 80 мл (содержание аминного азота 1000 мг%), калий фосфорнокислый однозаме- щенный 3,0 г; натрий фосфорнокислый од- нозамещенный 6,0 г; сульфат магни  3,0 г;
5 глюкоза 5,0 г; вода дистиллированна  до литра, рН 7,14 и культивируют в течение 18 ч при 36°С в услови х аэрации. Бульонные культуры центрифугируют при 6000 об/мин при 2°С в течение 40 мин и получают над0 осадочную жидкость, содержащую энтеротоксины .
Количество белка в на досад очной жидкости , содержащей энтеротоксины, составл ет 9000 мкг/мл.
5
Пример 7, Культуры кишечной палочки высевают раздельно на питательную среду , содержащую следующие компоненты: перевар Хоттингера 250 мл (содержание
0 аминного азота 1000 мг%), калий фосфорнокислый однозамещенный 3,8 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,8 г; магний сернокислый 3,8 г; глюкоза 7,0 г: вода дистиллированна  - до литра, рН сре5 ды 7,14 и культивируют в течение 24 ч при 38°С, в услови х аэрации, Бульонные культуры центрифугируют при 6000 об/мин при 3°С, в течение 40 мин и получают надосадоч- ную жидкость, содержащую энтеротоксины. Количество белка в надосадочной жидкости,
содержащей энтеротоксины, составл ет 7000 мкг/мл.
Максимальное содержание белка в над- осадочной жидкости (11000 мкг/мл) отмечаетс  при оптимальном соотношении компонентов питательной среды, времени и температуре культивировани , как в приме- ре 1, а наименьшее содержание белка - при соотношении компонентов, как в примере 7.
Изменение режима центрифугировани  бульонных культур с 6000 до 8000 об/мин, позвол ет добитьс  более полного осаждени  бактериальных частиц. Увеличение скорости центрифугировани  более 8000 об/мин не оказывает существенного вли ни  на полноту осаждени . Поэтому-оптимальным режимом центрифугировани  выбрана скорость 8000 об/мин.
Пример 8. После центрифугировани  и определени  биоактивности термостабильного и термолабильного энтеротокси- нов, в надосадочной жидкости по методике Романенковой Н.И. и в Биккен-тесте, токси- носодержащий материал осаждают медленным добавлением сульфата аммони  до 65% насыщени  дл  термолабильного и до 90% насыщени  дл  термостабильного зн - теротоксинов и оставл ют на 18 ч при 2аС. Осадок, содержащий термостабильный эн- теротоксин, перераствор ют в 0,05 М трис- НС1 буфере (рН 8,0), а термолабильный - в дистиллированной воде из расчета 1/10 от начального объема. Растворенные осадки диалиэируют против дистиллированной воды в течение 48 ч.
После определени  гомогенности полученных энтеротоксинов с помощью диск- электрофореза в полнакриламидном геле готов  смесь термостабильного и термолабильного энтеротокеинов в соотношении 100:1 в фосфатно-солевом буфере (рН 7,0). К смеси добавл ют 25%-ный раствор глутаро- вого альдегида до конечной концентрации 2 г/ , реакционную смесь выдерживают 1 ч при 25°С. Конъюгационную смесь подвергают диализу против фосфатно-солевого буфера (рН 7) в течение 18ч при 4°С.
Уменьшение времени высаливани  с 20 до 18 ч привадит, в некоторых случа х, к недоосаждению части энтеротоксинов. Диализ перерастворенных осадков токсинов, в течение 48 ч позвол ет добитьс  полного освобождени  материала от сернокислого аммони . Полноту освобождени  от следов сульфат-ионов контролируют в реакции с 10%-ным BaCla.
Выдерживание реакционной смеси, энтеротоксинов и глутарового альдегида, в течение 1 ч, достаточно дл  получени  конъюгата, однако инкубаци  смеси в течение 2 ч позвол ет добитьс  более полного соединени  термостабипьного и термолабильного энтеротоксинов.
Увеличение температуры при реакции 5 конъюгации с 20 до 25°С существенно не вли ет на скорость св зывани  термостэ- бильного и термолабильного энтеротоксинов , однако, увеличение или уменьшение данного режима температур ведет к задер10 жке конъюгации и требует увеличени  времени реакции.
Конъюгат термостабильного и термолабильного энтеротоксинов представл ет собой прозрачную жидкость бурого цвета (рН
5 8,0) без запаха, он не токсичен и безвреден дл  животных, не обладает анафилактоген- ными свойствами. Контроль стерильности и безвредности полученного конъюгата осуществл ют по общеприн той методике.
0 Полученный конъюгат по своей биологической активности значительно превосходит прототип. Предлагаемый способ ускор ет получение препарата в 3 раза (вместо 260 ч, около 70). Он существенно сокра5 щает рабочее врем , зан тое соответствующими операци ми. Число процедур минимально , они лишены трудоемкости. Упрощена и ускорена процедура получени  и очистки энтеротоксинов, а также самой
0 конъюгации.
Предлагаемый способ не нуждаетс  в дорогосто щем и мало доступном оборудовании и реактивах: амберлит НАД-2, сефа- декс G-25. ДАН сефацил, 1 этил 3 /3 диметил5 аминопропил/ карбодиимид и др. Привитые конъюгатом лабораторные животные про в- « л ют высокую активность (95%) против ле- f тальных доз термолабильного и термостабильного энтеротоксинов и культур гомоло0 гичных и гетерологических штаммов кишечной палочки.

Claims (1)

  1. Формула изобретени  Способ получени  конъюгированного
    5 энтеротоксина Eschertchla colt, включающий культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде, отделение ток- синосодержащего супернатанта центрифугированием с последующим осаждением,
    0 очисткой и конъюгацией энтеротоксина сшивающим агентом, отличающийс  тем, что, с целью повышени  иммуногенно- сти целевого продукта, ускорени  и упрощени  способа культивирование осущест5 вл ют в течение 18-24 ч в жидкой питательной среде следующего состава, г/л: перевар Хоттингера 80-250; сернокислый магний 3,0-3,8; однозамещенный фосфорнокислый натрий 6,0-6,8, однозэмещенный фосфорнокислый калий 3,0-3,Р. глюкоза 5 0-7,0;
    дистиллированна  вода до 1 л, токсиносо- держащий супернатант дел т на две части, из одной осаждают термолабильный токсин раствором сульфата аммони  при 60-65% насыщени , из другой - термостабильный токсин при 85-90% насыщени , каждый из полученных преципитатов выдерживают 18-20 ч при 2-4°С в режиме встр хивани , центрифугируют при 6000-8000 об/мин в течение 30-40 мин при 2-4°С, далее осадок термостабильного токсина раствор ют в дистиллированной воде, а осадок термолабильного токсина - в 0,05 М трис-НС буфере из расчета 1/10 от начального объе
    5
    ма, очистку токсинов провод т диализом, затем их объедин ют в объемном соотношении 100:1 соответственно в фисфатном буфере рН 7,0-7,2, конъюгацию провод т 25%-ным раствором глутарового альдегида при конечной концентрации 2 г/л при 20- 25°С в течение 1-2 ч, далее конъюгат двукратно диализуют против фосфатного буфера рН 7,0-7,2 в течение 18-20 ч при 2-4°С, а затем против 0,05 М трис-HCI буфера в течение 18-20 ч при 2-4 С, в полученный конъюгат добавл ют раствор трис-HCI буфера, содержащий бычий сывороточный альбумин в концентрации 10 г/л.
    Таблица 1
    Вли ние соотношени  термостабильный/термола- бильный энтеротоксины на % содержаний термостабильного знтеротоксина в конечном конъюгате.
    Вли ние соотношени  глутаральдегид/общий белок
    на % термостабильного энтеротоксина в конечном
    конъюгате
    Таблица 2
    Иммуногенна  активность конъюгированного энтеро- токсина E.coll в сравнении с энтеротоксинами гомологичных штаммов E.coll и прототипом
    Сравнение токсинообразовани  на предлагаемой
    среде и известных в литературе средах: Финкельштейна , бульоне Хоттингера и среде Альдерете
    Вли ние режимов центрифугировани  на полноту осаждени  бактериальных клеток
    Вли ние времени конъюгации на % термостабильного энтеротоксина E.coli в конечном конъюгате
    Таблица 3
    Таблица 4
    Таблица 5
    Таблица 6
    Продолжение табл.6.
SU894788233A 1989-12-19 1989-12-19 Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI SU1750690A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU894788233A SU1750690A1 (ru) 1989-12-19 1989-12-19 Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU894788233A SU1750690A1 (ru) 1989-12-19 1989-12-19 Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1750690A1 true SU1750690A1 (ru) 1992-07-30

Family

ID=21494537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU894788233A SU1750690A1 (ru) 1989-12-19 1989-12-19 Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI

Country Status (1)

Country Link
SU (1) SU1750690A1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Патент US № 4411888, КЛ.А61 К 39/108, 1983. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5961975A (en) Type I surface antigen associated with staphylococcus epidermidis
FI79024C (fi) Foerfarande foer framstaellning av haemophilus influenzae b-polysackaridexotoxoidkonjugatvaccin.
JPH0789950B2 (ja) ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質の製法
KR19990022748A (ko) 변형된 메닝고코컬 다당류 접합백신
US5667787A (en) Purification of a pertussis outer membrane protein
JP2009173945A (ja) Gbsトキシン/cm101の精製方法
EP0041897B1 (en) Polysaccharide antigen from streptococcus and vaccines
CA1280693C (en) Purification of pertussis antigens
EP1748063B1 (en) Protein A production and purification without using animal derived components
AU2006292700A1 (en) Protein a production and purification without using animal derived components
US5989542A (en) Capsular polysaccharides from enterococci
US4734403A (en) Membrane polysaccharides which are useful as immunostimulants
GB2053233A (en) Vaccinating cyclopeptidic antigenic fraction process for isolating it and vaccines containing it
KR970002614B1 (ko) 백일해 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드 및 그 제조방법
SU1732815A3 (ru) Способ получени гипотриглицеридально-активных полисахаридов
SU1750690A1 (ru) Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI
AU690518B2 (en) Tetanus vaccine production
RU2230325C2 (ru) Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а
JPH04300898A (ja) 新規糖タンパク複合体およびその製造方法
CA1239104A (en) Method for the purification of lpf-ha
RU1835294C (ru) Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI
RU2407792C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IgAl-ПРОТЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ А И ИММУНОГЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕЕ ОСНОВЕ
RU2039823C1 (ru) Способ получения рекомбинантного лимфотоксина человека
JPS632415B2 (ru)
JPS59110626A (ja) B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法