FI79024C

FI79024C - Foerfarande foer framstaellning av haemophilus influenzae b-polysackaridexotoxoidkonjugatvaccin.

Info

Publication number: FI79024C
Application number: FI840874A
Authority: FI
Inventors: Lance K Gordon
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1982-07-06
Filing date: 1984-03-05
Publication date: 1989-11-10
Also published as: FI79024B; IL69165A0; AU1822783A; KR880001098B1; FI840874A0; JPH07121872B2; IE831574L; EP0098581B1; DE3363505D1; JPH0347253B2; DK93584A; DK161013B; JPS59501360A; IE55268B1; CA1210695A; DK161013C; FI840874A; EP0098581A2; DK93584D0; IL69165A

Description

1 79024

Menetelmä Haemophilus influenzae b-polysakkaridi-eksotoksoidikonjugaattirokotteen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uutta Haemophilus influenzae b-polysak-karidi-eksotoksoidi-, esimerkiksi polysakkaridi-kurkkumätä-toksoidikonjugaatti(PRP-D)-rokotetta ja polysakkaridi-jäykkä-kouristustoksoidikonjugaatti(PRP-T)-rokotetta, niiden valmistamiseksi käytettyjä polysakkaridihapteeneja ja menetelmää niiden valmistamiseksi. Keksinnön mukaan saadaan aikaan puhdas Haemophilus influenzae b-polysakkaridi, joka lämpökäsittelyllä on säädetty molekyylikokoon, joka on periaatteessa 200 000 - 2 000 000 daltonia, ja joka polysakkaridi koostuu likimain ekvirnolaarisista määristä riboosia, ribitolia ja fosfaattia ja joka sitten aktivoidaan aktivaattorilla, tyypillisesti syaanibromidilla. Tässä esitetyt molekyylikoot on verrattu dekstraaninormeihin geelipermeaatiokromatografiällä. Aktivoitu polysakkaridi sekoitetaan huolellisesti eksotoksoi-din, etusijassa kurkkumätätoksoidin kanssa konjugoinnin aikaansaamiseksi. Eksotoksoidi on mieluimmin johdannaistettu käyttämällä väliosana 4-8 hiiliatomin siltaa, esimerkiksi kurkkumätätoksoidin (D-AH) adipiinihappohydratsidijohdannainen . Vaihtoehtoisesti käyttökelpoisiin eksotoksoidijohdannaisiin kuuluu jäykkäkouristustoksoidi (T-AH). Eksotoksoidi on liitetty useihin AH-yksikkÖihin.

Tätä menetelmää käyttämällä on saatu aikaan konjugaattirokote, jolla on T-soluriippuvainen reaktio Haemophilus influenzae b-polysakkaridiin.

Tällainen konjugaatti on erikoisen hyödyllinen käytettäväksi Haemophilus-tartuntojen ehkäisemiseksi vauvoissa ja nuorissa lapsissa.

Keksinnön mukaan on myös saatu aikaan konjugaattirokote, jota voidaan käyttää rokottamiseen sairauksia, kuten kurkkumätää ja jäykkäkouristusta vastaan. Tällaisten konjugaattien teho 2 79024 ihmisessä on suurempi kuin tavanomaisten kurkkumätä- ja jäykkäkouristustoksoidivalmisteiden. Menetelmällä saadaan aikaan, säätämällä huolellisesti aktivaattoria ja poistamalla ylimäärä, polysakkaridikonjugaatti, joka koostuu useista eksotoksoidimolekyyleistä liitettyinä yhteen ainoaan polysak-karidimolekyyliin sillan välityksellä ja joka on pääasiassa vapaa silloittuneista tai polymeerisistä johdannaisista.

Kaava voidaan yleisesti esittää muodossa PRP-Xn, jossa X on toksoidi ja n on luku, joka on pienempi kuin 20, ollen tyypillisesti keskimäärin 7-8. (Kurkkumätätoksoidikonjugaatti on tässä merkitty PRP-D ja jäykkäkouristuskonjugaatti PRP-T käyttämättä lukua n).

Piirustuksessa esitetään Haemophilus influenzae b:n kuoripoly-sakkaridin immunogeenisyys, siis vasta-PRP-reaktio. Tämä pylväskaavio esittää esimerkin V pöytäkirjan mukaiset tulokset.

Pysyvän nesteimmuniteetin aikaansaaminen edellyttää, että ainakin kaksi lymfosyyttierää tunnistaa vieraan aineen.

Nämä erät ovat B-lymfosyytit, jotka ovat vasta-aineita synnyttävien solujen edeltäjäaineita, ja T-lymfosyytit, jotka säätävät B-solujen toimintaa. Vaikkakin tietyt antigeenit, mukaanluettuna useat polysakkaridit, kykenevät suoraan kiihottamaan B-soluja tuottamaan vasta-aineita (T-riippumattomat solut), useimmat antigeenit tulee tuoda B-soluun T-lymfosyy-tillä. Tämän keksinnön mukaisten rokotteiden tapauksessa T-solujärjestelmä tunnistaa rokotteen eksotoksoidiosan. Koska proteiinissa on sekä sen omat antigeeniset determinantit että kovalenttisesti sidottu PRP-hapteeni, molemmat determi-nanttierät tulee tuoda T-soluilla B-soluihin. Tämän kantaja-hapteenikonjugaatin antamisen tuloksena on, että PRP tuodaan T-riippuvaisena immunogeeninä. PRP:n T-riippuvainen tuominen saa aikaan suojaavan immuunisuuden vauvoissa, joka on eniten riskialtis ryhmä. Keksinnön mukaiset konjugaattirokotteet ovat täten erikoisen arvokkaita pieniin lapsiin nähden. Tällaisen konjugaatin antaminen naisille saa aikaan suuren 3 79024 määrän rokoteantigeenien IgG-vasta-aineita, jotka tunkeutuvat istukan kalvon läpi raskauden aikana ja täten suojaavat lasta syntymästä alkaen.

T-riippumattomat antigeenit kiihottavat B-soluja terminaali-sesti erilaistumaan vasta-aineita erittäviksi soluiksi (plasmasoluiksi), kun taas T-riippuvaiset reaktiot ovat huomattavasti monimutkaisempia. Saatuaan T-riippuvaisen kiihokkeen B-solupopulaatio alkaa ei vain tuottamaan vasta-aineita, vaan myös lisääntyy ja kypsyy. Tämän johdosta PRP:n vasta-aineita tuottavien B-solujen lukumäärä suurenee ja B-solujen, jotka kykenevät reagoimaan PRP:n toiseen vaikutukseen, lukumäärä suurenee. Toistettu rokotus saa aikaan PRP-spesifis-ten B-solujen lukumäärän suurenemisen ja tästä johtuen suuremmat vasta-ainepitoisuudet eli vahvistusreaktion. Yhteenvetona voidaan sanoa, että kun T-riippumattornia reaktioita rajoittaa reagoivien B-solujen lukumäärä, T-riippuvaisten reaktioiden tuloksena on antigeeniin reagoivien solujen kokonaismäärän kasvu.

Keksinnön mukaisen PRP-eksotoksoidirokotteen on todettu vaikuttavan T-riippuvaisena immunogeeninä laboratorioeläimissä. Kaniryhmän kaikki eläimet, jotka oli rokotettu PRP-D:n vakio-määrällä, osoittivat vahvistetun reaktion. Lisäksi osoittautui, että esirokotus konjugaatissa käytetyillä kantajaproteiineilla, esimerkiksi PRP-D:n kurkkumätätoksoidilla, paransi alkureaktiota PRP-eksotoksoidikonjugaatin PRP-komponenttiin. Vastaavaa PRP-reaktion paranemista ei todettu eläimissä, jotka oli esirokotettu muulla eksotoksoidilla kuin konjugaatissa käytetyllä.

Tämän keksinnön mukainen rokote on PRP-eksotoksoidihapteeni-kantajakonjugaatti. Tällaisissa rokotteissa antigeeninen mutta heikosti immunogeeninen hepteenimolekyyli (PRP) antaa uuden antigeenisen spesifisyyden vahvasti immunogeenisille kantajamolekyyleille, kuten kurkkumätä(D)- ja jäykkäkouristus (T)-toksoideille.

4 79024

Valmisteessa kantajana käytetty puhdistettu kurkkumätätoksoi-di (D) on kaupallinen eksotoksoidi, joka on muunneltu (joh-dannaistettu) liittämällä 4-8-hiilinen siltamolekyyli, kuten adipiinihappodihydratsidi (ADH) käyttämällä vesiliukoisen karbodi-imidin kondensaatiomenetelmää. Modifioitu eksotoksoidi, tyypillisesti adipiinihappohydratsidijohdannainen X-AH, vapautetaan sitten reagoimattomasta ADHrsta. Tämä on liukoinen tuote, joka on pääasiassa vapaa silloituksesta, mikä ilmenee molekyylikoon huomattavan suurenemisen puuttumisena määritettynä geelikromatografiällä ja polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla.

Haemophilus influenzae b:n kuoripolysakkaridi valmistetaan kaupallisista lähteistä, jollaisia käytetään hyväksytyissä polysakkaridirokotteissa ja on saatavissa Connaught Laboratories ilta. Vaikkakin polysakkaridia tavallisesti on puhdistettu kalsiumsuolana, vältetään kuitenkin kalsiumionien käyttöä, koska ne vaikuttavat konjugointimenetelmässä käytettyyn karbonaattipuskuriin. Polysakkaridin molekyylikokoa säädetään sitten lämmittämällä, kunnes saadaan hapteenin haluttu dimensio. Tyypillisesti liukoisen polysakkaridin lämmittäminen 15 min 100°C:ssa riittää varmistamaan, että alle 20 % molekyyleistä ovat molekyylikooltaan alle 200 000 daltonia ja alle 20 % molekyylikooltaan yli 2 000 000 daltonia. Tämä koonsäätötoimenpide on tärkeä sopivan PRP-D- tai PRP-T-konjugaatin saamiseksi.

Täten saatu kooltaan säädetty polysakkaridi aktivoidaan akti-vaattorilla elektrofiilisen ryhmän muodostamiseksi polysakkaridiin, kuten syaanihalogenidilla tai natriumboorihydridillä. Tyypillisesti käytetty aktivaattori on syaanibromidi. Reagoimaton aktivaattori poistetaan täydellisesti, sillä jos jää huomattava jäännös, tämä aiheuttaa proteiinin silloittumista seuraavassa reaktioseoksessa. Syntyvä silloittunut tuote vangitsee polysakkaridia, mistä on tuloksena rokotteen alhaisempi saanto ja suurimolekyylisempi konjugaatti, jonka kemialliset ominaisuudet ja liukoisuus eroavat keksinnön 5 79024 mukaisesti valmistetusta konjugaatista, ja rokote, jolla ei ole keksinnön mukaisen rokotteen haluttuja ominaisuuksia.

Aktivoitu PRP ja X-AH yhdistetään sitten ja niiden annetaan reagoida kylmässä. Johdannaistetun eksotoksoidin muutamat hydratsidiryhmät reagoivat PRP:n aktivoitujen kohtien kanssa muodostaen kovalenssisidoksia. Tuotteena on PRP, joka on 4-8-hiilisen sillan välityksellä kovalenttisesti sidottu johdan-naistettuun eksotoksoidiin. Tämä reaktiotuote puhdistetaan gee 1ipermeaatiokromatografia 1la reagoimattoman proteiinin ja pienimolekyylisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Pääfraktion tyypillinen molekyylikoko on noin 675 000 daltonia dekstraa-ninormin mukaan.Suhteellisen molekyylikoon tyypillinen alue on 140 000 - 4 500 000 daltonia.

Lisätään säilöntäainetta, kuten timerosaalia, ja timerosaalin tapauksessa lopulliseen konsentraatioon 1:10 000. Koko kon-sentraatti suodatetaan 0,2 mikronin kalvosuodattimen läpi ja säilytetään kylmässä.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

PRP-eksotoksoidikonjugaattituote on lämmönkestävä ja vesiliukoinen. Silloittumisen puuttuminen ilmenee siten, että lähtöaineena käytetyn polysakkaridin molekyylikoko ei olennaisesti suurene määritettäessä gee1ipermeaatiokromatografialla ja polyakryy1iamidigeelielektroforeesi11a. Lämmönkeetävyys takaa pitkän säilytysajan ja stabiilin tuotteen jopa epäedullisissa olosuhteissa.

Reaktio voidaan esittää kaavioi1isesti kahdella vaiheella:

<1> PRP + CNBr -> PRP

* <2> PRP + nX -* PRP< -X)n

Jollei syaanihalogenidin poistamista suoriteta tehokkaasti, tapahtuu myös aktivoidun PRP:n ja eksotoksoidin konjugointia muodostaen PRP(-X)n sellaisia ei-haluttuja reaktioita kuin X-Χ·η tai moninkertaisesti sidottujen johdannaisten, esimerkiksi 6 79024

PRP* + CNBr -> nx ♦ XX - PRP - X

N^X - X - PRP

muodostumi sta.

Tyypillinen ihmiselle ihonalaisesti tai ihonsisäisesti annettava annos PRP-eksotoksoidikonjugaattirokotetta on 0,5 ml, joka sisältää 10 mikrogrammaa riboosia eli 40 mikrogramman konjugaattituotetta likimääräisen ekvivalentin. Ampulliliuok-sia valmistetaan laimentamalla konsentraattia fosfaattipus-kuroidulla fysiologisella suolaliuoksella käyttäen timerosaa-lia säilöntäaineena.

Tuote saa ihmisessä aikaan sekä PRP:n että eksotoksoidikompo-nentin vasta-aineiden muodostumista.

Keksintöä havainnollistetaan yksityiskohtaisemmin seuraavilla esimerkeillä. Ne eivät rajoita keksinnön ajatusta tai laajuutta.

Esimerkki I: PRP:n valmistus A. Organismi

Haemophilus influenzae b:n kuoripolyribosyyliribitolifosfaat-tia (PRP) valmistettiin Eagan-kannasta. Viljelmä siirrettiin toistuvasti ja valmistettiin pakkaskuivattu ymppäysliuos. Tästä pakkaskuivatusta ymppäysliuoksesta tehtiin vielä yksi siirto käyttöymppäysliuosten valmistamiseksi (säilytettiin -60°C:ssa). Ymppäysliuoksesta valmistettiin bakteerisolujen käymisastiaeriä.

Viljelmän puhtaus todetaan seuraavilla kriteerioilla: 1. negatiiviset Gram-värjäysominaisuudet; 2. kasvu agarilla, joka sisältää NAD (difosfopyridiininuk-leotidia) ja hemiiniä (naudan tyyppiä I olevaa ferrihee-min kiteistä suolaa); 3. kasvun puuttuminen agarilla ilman NAD tai hemiiniä; ja 4. agglutinaatio spesifisillä antiseerumeilla (tyyppiä b oleva Haemphilus influenzae b, Hyland Laboratories).

7 79024 B. Viljely ja väliaineet

Bakteerin viljelemiseksi, siis ennen käymisastian ymppäystä, käytettiin BHI-agaria (litraa kohti: 37 g BHI Difco, 15 g Bacto-agaria Difco, 0,6 ml NAD Sigma-Grade III ja 6 ml 0. 2 % hemiiniä (Sigma-Bovine Type 1). Agarin pinnalta pestyt solut (20 h) käytettiin Haemophilus influenzae b:n (Hib) nes-tevällaineiden ymppäämiseen (1 litran tasaerät); nämä viljelmät inkuboidaan ravistamalla, kunnes bakteeri saavuttaa kas-vukiertonsa log-faasin. Tällöin käytettiin 2 litraa viljelmää ymppäämään kulloinkin 40 litraa nestemäistä Hib-väliainetta käymisastiassa ja lisättiin 300 ml 8 % UCONia (Union Carbiden voiteluainetta). 16-18 tunnin kuluttua käymisastian viljely on valmis korjattavaksi.

Hib-nesteväliaineen koostumus 1000 ml kohti on seuraava:

Hiivauutedialysaatti, Difco 5,0 g

Kasaminohappoja, Difco 22,5 g

Natriumfosfaatti, kaksiemäksinen 14,4 g

Dekstroosi 5,59 g

Hemiini 20 g

Ammoniumhydroksidi (30 %) 0,1534 ml NAD 5 % 0,6 ml Käymisastian korjuussa todetaan viljelmän puhtaus sopivalla Gram-värjäys- ja viljelytekniikalla (ks. A 1-4 edellä). Viljelmään lisätään Cetavlonia (heksadekyylitrimetyyliammonium-bromidia) lopulliseen konsentraatioon 0,1 %. 30 minuutin kuluttua, jossa ajassa bakteerit ovat tulleet inaktiiveiksi, kiinteä tahna otetaan talteen linkoamalla. Märkä tahna säilytetään -70°C:ssa seuraavaa käsittelyä varten.

C. Puhdistettu polysakkaridi PRP:n uuttaminen ja seuraava puhdistaminen suoritetaan käyttäen seuraavaa menettelyä : 1. Dissosiaatio detergentistä

Tahnan märkäpainon kutakin grammaa kohti lisätään 10 ml 0,4 M

8 79024

NaCl. Suspensiota sekoitetaan tavanomaisessa sekoittajassa 30 sek. Seos lingotaan 15 min 17 000 Xg:lla kylmässä (4°C). Supernatantti otetaan talteen ja lisätään etanolia 25 %:n konsentraatioon. Tämä materiaali lingotaan sitten 2 tuntia 17 000 Xg:lla (4°C) ja supernatantti otetaan talteen. Materiaaliin lisätään etanolia nelinkertaisesti supernatant in tilavuuteen nähden ja materiaali pidetään yli yön 4°C:ssa.

2. Nukleiinihappojen poistaminen

Materiaali lingotaan 5 min 2800 Xg:lla (4°C). Sedimentti otetaan talteen ja suspendoidaan uudelleen Tris-MgSO^-puskuriin neljäsosaan alkuperäisestä tahnan uuttamiseksi käytetystä tilavuudesta. Tris-puskurin koostumus on seuraava tislatun veden litraa kohti: tris-hydroksimetyyliamino-metaani (Sigma) 6 g

MgS04 · 7 H20 246 mg timerosaali (Elanco) 50 mg pH säädetään arvoon 7,0 + 0,2 väkevällä suolahapolla.

Lisätään deoksiribonukleaasia i 1,5 mg (Sigma D-0876) ja ribo-nukleaasia-A 0,75 mg (Sigma-Type 1-AS, R-5503) 100 g kohti alkuperäistä märkää tahnaa. Materiaali sijoitetaan dialyysi-pusseihin ja inkuboidaan 18 tuntia 37°C:ssa 18 litraa Tris-MgSO^-puskuria vastaan.

3. Proteiinien poistaminen

Materiaalia käsitellään edelleen proteiinikomponenttien poistamiseksi lisäämällä yhtä suuri tilavuus fenoli-asetaatti-liuosta _/135 ml 10 % (paino/tilavuus) natriumasetaattia yhdessä 454 g:n kanssa fenolia/. Materiaalia ravistellaan sitten 30 min (4°C), lingotaan 15 min 17 000 Xg:lla ja vesifaasi otetaan talteen. Suoritetaan vielä kaksi fenoliuuttoa ja sen jälkeen viimeisen vesifaasin dialyysi tislattua vettä vastaan.

Tässä vaiheessa materiaalin muodostaa nestemäisen kuoripoly- 9 79024 sakkaridin (PRP) pääosa ja sitä säilytetään -20°C:ssa jatkokäsittelyä varten (jakso D jäljempänä).

4. Polysakkaridin laadun määritys PRP:n pääosan laatu määritetään otetun nestemäisen näytteen analyysin perusteella. Lisätään etanolia (4 tilavuutta), sitten CaCl2 (lopullinen konsentraatio 0,02 M) ja PRP saoste-taan. PRP saatetaan laskeutumaan linkoamalla ja kuivataan tyhjössä vedenpoistoaineen yllä. Kosteuspitoisuuden määrittämiseksi käytetään lämpögravimetristä analyysiä (TGA). Muut analyysit lasketaan kuiva-aineen perusteella.

Hyväksymiskriteeriot käsittävät: (a) riboosin analyysi (Orcinol-menetelmä): yli 30 %, (b) proteiinin analyysi (Lowry-menetelmä): alle 1 %, (c) nukleiinihappojen analyysi (UV-absorptio): alle 1 %, ja (d) saostaminen spesifisillä immuuniseerumeilla (vastaimmu-noelektroforeesimenetelmä).

Lisäksi määritetään molekyylikoko sopivalla geelipermeaatio-kromatografiällä. Polysakkaridia tutkitaan endotoksiiniin nähden Limulus-lysaattikokeella ja koestamalla kuumeen aiheuttamista kanissa.

Tyypillisellä erällä oli seuraavat tunnusmerkit: (a) Proteiinipitoisuus, 0,5 % (b) Nukleiinihappopitoisuus, 0,35 % (c) Naudan jäännösantigeenit: puhdistetussa PRP:ssa ei ollut naudan RNA-aasin ja DNA-aasin epäpuhtauksia, joita käytettiin polysakkaridia valmistettaessa, mitattuna radio-immunokokeella

(d) Endotoksiinipitoisuus mitattiin Limulus-ameebasyytti-lysaattikokeella (LAL): 200 ng/mg PRP

(e) Kd CL-4B Sepharosella: 0,30. Arvo 0,30 vastaa likimain molekyylipainoa 1 125 000 dekstraaninormin mukaan.

10 79024 D. Polysakkaridi(PRP)reagenssin valmistaminen Polysakkaridi puhdistetaan siis nesteenä, mutta kalsiumia ei käytetä puhdistuskäsittelyssä. (Tavanomainen polysakkaridin puhdistus antaa kalsiumsuolan, mutta kalsium voi reagoida konjugoinnissa käytetyn karbonaattipuskurin kanssa muodostaen saostuman).

Polysakkaridin kokoa säädetään lämmittämällä lOO°C:ssa sellaisen ajan, joka on verrannollinen haluttuun koon muutokseen. Polysakkaridin kokoa säädetään siten, että alle 20 % tilavuudesta eluoituu CL-4B Sepharose-kolonnista ja alle 20 % eluoituu, jonka Kd on yli 0,5. Pääfraktion molekyylikoko on 200 000 - 2 000 000 daltonia.

Esimerkki II PRP:n aktivointi A. Tämä polysakkaridi jäähdytettiin jäähauteella 4°C:een reaktioastiassa, joka on varustettu magneettisekoittimella. Rekisteröidään PRP:n, jonka konsentraatio on 25 mg/ml (20-30 mg/ml alue) tislatussa vedessä, alkuperäinen tilavuus. Sitten lisätään natriumkloridia 0,85 % konsentraatioon.

‘B. Saadun polysakkaridin natriumsuolan liuoksen pH kohotetaan arvoon 10,5-11,0 lisäämällä IN natriumhydroksidia. (Tämä alue valitaan sen vuoksi, että alhaisemmalla pH-arvolla reagointi syaanibromidin kanssa on vähäisempää ja suuremmalla pH-arvolla polysakkaridi hajoaa).

C. Kuivaa syaanibromidia liuotetaan 0,005N natriumbikarbo-naattipuskuriin, jonka pH on 10,5-11,0, ja lisätään välittömästi (10 minuutin kuluessa valmistuksesta) reaktioastiaan määrässä 0,4 mg/mg PRP.

D. Seoksen pH säädetään arvoon 10,5-11,0 ja pidetään siinä 6 minuuttia lisäämällä natriumhydroksidia.

E. pH alennetaan sitten arvoon 6,0 IN HCl:lla. (Hapan pH stabiloi syaanibromidin polysakkaridiin aikaansaamat aktii- 11 79024 viset kohdat. pH:n alentaminen enemmän aiheuttaa PRP:n hydrolysoitumista).

G. Lisätään yhtä suuri tilavuus fysiologista suolaliuosta, pH 6,0, esijäähdytetty 4°C:een.

H. Syaanibromidi-polysakkaridiseos siirretään väkevöinti-laitteeseen ja väkevöidään, kunnes saadaan vaiheessa A rekisteröity alkuperäinen tilavuus.

I. Vaiheet G ja H toistetaan yhteensä 10 kertaa. Näin ollen noin 99,9 % kulumattomasta syaanibromidista poistetaan poly-sakkaridikonsentraation pysyessä 25 mg/ml:na. Jollei syaani-bromidia poisteta, se reagoi jäljempänä käytetyn kurkkumätä-eksotoksoidin kanssa.

Esimerkki III. D-AH-kantajän valmistus A. Kaupallinen kurkkumätäeksotoksoidi (D) tislatussa vedessä väkevöidään 20-40 mg/ml:aan, tyypillisesti 35 mg/mlaan, kalvon kautta, joka pidättää molekyylit yli 10 000 daltonia, paineella sekoitetussa väkevöintilaitteessa.

B. Kuiva seos, jossa on 8 mg adipiinihappodihydratsidia mg proteiinia kohti ja 0,75 mg l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyy- li)karbodi-imidiä (EDAC) mg proteiinia kohti, pannaan reak-tioastiaan, joka on varustettu tehokkaalla sekoittimella ja pH-mittarilla, joka mahdollistaa pH:n valvonnan ja säätämisen.

C. Kurkkumätäeksotoksoidi lisätään sitten reaktioastiaan niin, että reagenssien suhde on: kurkkumätäeksotoksoidi = 35 mg proteiinia/ml ADH = 8,0 mg/mg proteiinia EDAC = 0,75 mg/mg proteiinia (Asetaattipuskurin käytön tuloksena lisättäessä peräkkäin ADH ja EDAC on pysyvä höytälemäinen saostuma. Reagensseilla on sellaisenaan riittävä puskurointivaikutus).

12 79024 D. pH säädetään välittömästi arvoon 4,7 ja pidetään arvossa 4,7 + 0,2 vähintään 2 tuntia.

1. Kemiallisen reaktion tapahtumista voidaan seurata pH-mittarin piirturista. Tarvittaessa reaktion annetaan jatkua yli 2 tuntia, kunnes pH on pysyvä ainakin 15 minuutin ajan (siis 15 minuuttia tarvitsematta lisätä HC1 pH:n säätämiseksi).

2. Kulunut HCl:n määrä rekisteröidään prosessin tarkistuksena.

3. Valvotaan myös lämpötilan muuttumista reaktioastiassa.

E. Reaktiotuote dialysoidaan 4°C:ssa kahta erää fysiologista suolaliuosta vastaan, vähintään 100 tilavuutta ja 8 tuntia erää kohti.

F. Se dialysoidaan sitten kahta erää fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan, vähimmäistilavuuden, ajan ja lämpötilan ollessa samoja kuin vaiheessa E.

G. Tuote (D-AH) väkevöidään takaisin konsentraatioon 25 mg/ml proteiinia painelaitteessa käyttäen 10 000 MW kalvoa.

H. Konsentraatti suodatetaan steriilisti (0,2 ^u) ja säilytetään 4°C:ssa.

Tällaisen D-AH-kantajän tyypillisen erän analyysi osoitti 38,3 ^,ug ADH/mg DT. Tämän näytteen kromatografia antoi CL-4B Sepharosella Kd-arvon 0,75, joka vastaa likimääräistä mole-kyylipainoa 139 000 proteiininormin mukaan.

Esimerkki IV Kovalenttisen polysakkaridi-kurkkumätätoksoidi-konjugaatin (PRP-D) muodostaminen A. Esimerkin III mukaista kurkkumätätoksoidi-adipiinihappo-hydratsidikantajaa (D-AH), jonka konsentraatio on 25 mg/ml, käsitellään natriumbikarbonaatilla 0,5M konsentraatioon ja pH säädetään arvoon 8,5. (Merkittävästi pienemmät suolakon-sentraatiot aiheuttavat geelin muodostumisen lopullisessa reaktioseoksessa aktivoidun polysakkaridin kanssa).

13 79024 B. Reaktioastiaan, joka voidaan sulkea/ lisätään yhtä suuri määrä esimerkin II mukaan valmistettua pestyä PRP-liuosta ja pH:n tulee olla pysyvä arvossa 8,4-8,6. (Ellei CNBr ole poistettu, pH laskee nopeasti ja melkoinen saostuma syntyy.

Tämä reaktio tapahtuu jopa polysakkaridin poissaollessa. Reagenssien fysikaalinen ulkonäkö ei saisi muuttua merkittävästi niitä yhdistettäessä).

C. Reaktioseosta pyöritetään rummussa 15-18 tuntia 4°C:ssa.

D. Konjugaatti puhdistetaan geelipermeaatiokromatografiällä Sephakryl-300:ssa joka on tasapainotettu fosfaattipuskuroi-dussa fysiologisessa suolaliuoksessa reagoimattoman proteiinin ja molekyylikooltaan 140 000 daltonia pienemmän aineen poistamiseksi. (Jos lähtöainepolysakkaridi on kooltaan liian pieni, ei ole mahdollista erottaa konjugaattia vapaasta proteiinista tällä tavalla).

E. Otetaan näytteitä tästä puhdistetusta konjugaatista kemiallista analyysiä varten, kuten selostetaan tämän esimerkin seuraavassa jaksossa.

F. Puhdistettuun konjugaattiin lisätään timerosaalia 1:10 000 konsentraatioon ja tuote säilytetään 4°C:ssa kunnes se analysoidaan.

G. Tuote suodatetaan steriilisti, 0,2 ^um. (Ellei polysakkaridin kokoa ole säädetty esimerkissä 1(D) esitetyllä tavalla, siis jos se on kooltaan liian suuri, syntyvää konjugaattia ei voida suodattaa).

Analyysi

Esimerkin IV konsentraatilla suoritetut kokeet antoivat seu-raavat tulokset: a) Riboosipitoisuus: 156,5 .ug/ml.

(PRP-arvojen laskemiseksi esimerkissä V käytetään muuttoker- 14 79024 rointa 2 polysakkaridin nimelliskonsentraation laskemiseksi empiirisesti määritetyn riboosikonsentraation perusteella).

b) Proteiinipitoisuus: 330 ^ug/ml.

c) Riboosi/proteiini-suhde: 0,47 (rajat 0,25-1,0).

d) Kromatografinen analyysi Sepharose CL-2B:llä antoi kromatografisen profiilin, joka osoittaa konjugaattimolekyylien homogeenisen jakautuman yhtenä ainoana piikkinä.

e) Kd (polysakkaridi): 0,36 käytettäessä Sepharose C1-4B, 0,77 käytettäessä C1-2B.

Määritettiin PRP:n yksittäisen fraktion riboosikokeella. Arvo 0,36 C.l-4B:llä vastaa likimääräistä molekyylikokoa 674 000 dekstraaninormin mukaan.

f) Kd (proteiini): 0,34 käytettäessä C1-4B, 0,71 käytettäessä C1-2B.

Määritettiin proteiinin yksittäisen fraktion Lowry-kokeella. Kurkkumätäeksotoksoidin Kd-arvon muutos arvosta 0,75 arvoon 0,34 Cl-4B:llä osoittaa, että proteiinin konjugointi polysakkaridin kanssa muodostaa molekyylin, joka kromatografisesti eroaa kummastakin raaka-aineesta.

: g) Vapaa proteiini: alle 5 %.

Vapaa proteiini edustaa johdannaistettua kurkkumätäkantaja-proteiinia, joka ei ole sitoutunut PRP:iin. Se määritetään vertaamalla proteiinin se määrä, joka eluoituu kurkkumätä-eksotoksoidinäytteen kohdalla eluoituneen proteiinin kokonaismäärään .

h) Endotoksiinipitoisuus: 1 ^ug/ml.

Endotoksiini määritettiin Limulus-ameebasyytti-lysaatti-kokeel-la (LAL). Endotoksiinipitoisuus on 64 ng 10 yug riboosia kohti PRP-D:n ihmisannoksessa.

i) Pyrogeenisyys: konsentraatti täyttää Yhdysvaltojen normit ei-pyrogeenisyvdestä käytettäessä painoekvivalenttista (ihmis)annosta 0,15 ^ug riboosia millilitraa kohti ja kanin ruumiinpainon kilogrammaa kohti-

II

15 79024 j) Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE): PAGE-analyysi suoritettiin lisätietojen saamiseksi puhtaudesta ja polysakkaridin ja proteiinin kovalenttisesta sidonnasta. Kun vapaan kantajan nauha esiintyi juuri yli sauvageelin puolitien likimain katalaasin kohdalla (60 000 MW), PRP-D-konjugaatti ei kyennyt tunkeutumaan geeliin (ennen tyroglobuliinin kohtaa 330 000 MW). PRP-D osoitti alkuperäisesti yhden ainoan nauhan.

k) Syaanibromidi: vaikkakin syaanibromidia (CNBr) käytetään ensimmäisissä vaiheissa ennen kuin PRP-D-konjugaatti valmistetaan, se poistetaan myöhemmin tuotteesta. Menetelmän useammat vaiheet myötävaikuttavat CNBr-pitoisuuden vähenemiseen. Rokotteen lopullinen puhdistus geelipermeaatiokromato-grafiällä poistaa kuitenkin kaikki epäpuhtaudet alle 100 000 MW. Tämä puhdistus ehkäisee vapaan CNBr:n tai sen hajoamistuotteiden jäljellä olevien jälkien aiheuttamat epäpuhtaudet.

l) Lämpöstabiilisuus: suoritettiin PRP-D-konjugaattirokot-teen lämmönkestävyyden tutkimus. Pääerämateriaali väkevöitiin 40-kertaisesti ja otettiin kolme 3 ml:n näytettä. Ensimmäinen pidettiin 4°C:n vesihauteella 16 tuntia ja kolmas lämmitettiin vesihauteella 100°C:ssa 30 minuuttia. Suoritettiin kokeet proteiini- ja riboosipitoisuuteen nähden geelipermeaa-tiokromatografiällä Sepharose Cl-4B:llä ja SDS-polysakkaridin geelielektroforeesilla (PAGE).

Tulokset eivät osoittaneet merkittävää muutosta riboosi- ja proteiinipitoisuudessa verrattujen näytteiden ja edellä kokeissa (a) ja (b) saatujen tulosten välillä. Kromatografiset analyysit osoittivat konjugaattimateriaalin molekyylikoon vähäistä pienenemistä, kun käytettiin yhä vaikeampia olosuhteita. Näiden näytteiden fraktiointianalyysissa mittaamalla absorptio 154 nm:ssa materiaalilla oli kuitenkin yksi ainoa piikki, joka yhtyi polysakkaridipiikkiin eikä vapaan proteiinin piikkiä esiintynyt. Tulokset ovat näin ollen verrattavissa edellä kohdissa (d) ja (g) saatuihin. Tämä osoittaa, että proteiinin ja polysakkaridin välinen sidonta ei katkennut, vaan molekyylikoon pieneneminen johtui lineaarisen 16 79024 polysakkaridin sisällä tapahtuneista sidontojen katkeamisista. Tämän osoitti edelleen näiden näytteiden PAGE-analyy-s±n vertailu edellä kohdassa (j) esitettyihin tuloksiin: vapaata proteiinia ei voitu osoittaa missään näytteessä, ei edes detergentin (natriumdodekyylisulfaatin) läsnäollessa.

Tämä vahvistaa painavasti johdannaistetun proteiini-polysak-karidisidonnan kovalenttisuuden ja sen stabiilisuuden käsittelyssä korkeassa lämpötilassa.

Esimerkki V PRP-D:n immunogeenisyyden tutkimus Tämä koe tehtiin T-soluriippuvuuden osoittamiseksi seuraa-vista johtuvaksi: kantajariippuvuus, kantajan spesifisyys, vahvistusvaikutus ja muutos Ig-luokassa. Tämä koe suoritettiin kahtena osana: 1) alustava esikäsittely kahdella ruiskeella; 2) varmistuskäsittely kahdella ruiskeella.

Aineet:

1. PRP-D:n pääeräkonsentraatti, esimerkki IV

2. Jäykkäkouristustoksoidi (T) 3. Kurkkumätätoksoidi (D) 4. H. influenzae b:n kuoripolysakkaridi (PRP).

5. PRP/D, seos, jossa on 20 yug PRP (10 ^ug riboosia) ja 20 ^ug D.

6. PRP/D-AH, seos, jossa on 20 ^,ug PRP (10 ^.ug riboosia) ja 20 yUg D-AH.

Menetelmä

Kaikki rokotteet annettiin ihonalaisesti ilman apuainetta 1 ml:n annoksina. Kaikki PRP sisältävät annokset säädettiin sisältämään 10 yug riboosia annoksen ml kohti. Konjugoimatto-mat eksotoksoidiannokset säädettiin sisältämään 20 ^ug proteiinia annoksen ml kohti. Käytettiin kiertävää ohjelmaa rokotusten tapahtuessa 14 päivän välein. Jokaisen rokotuksen jälkeen otettiin 10 päivää myöhemmin verinäyte. Kaikki preparaatit laimennettiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 0,01 % timerosaalia. Valmistettiin tasaerä käsittäen neljän annoksen ampulleja, ja nämä säilytettiin -20°C:ssa. Jokaisessa ryhmässä rokotettiin kolme kania.

79024

Serologia

Seerumeita tutkittiin kiinteätaasiradioimmunokokeella (SPRIA) vasta-PRP:iin, vasta-D-AH :iin, vasta-W:iin ja vastaisiin nähden esitetyllä tavalla. Vasta-ainetasot määritettiin mikrogrammoina IgG ja IgM ml kohti.

Pöytäkirja SPRIA

Ryhmä Primäärinen Sekundäärinen PRP DT-AH DT TT

1 PRP PRP + 2 T PRP-D + + + + 3 D PRP-D + + + + 4 PRP/D PRP/D + + 5 PRP/D-AH PRP/D-AH + + 6 PRP-D PRP-D + + +

Ohjelma

Kaneista otettiin esiverinäyte ja ne rokotettiin ryhmittäin joka 14 päivä. Jokaisen rokotuksen jälkeen otettiin jälki-verinäyte 10 päivää myöhemmin. Kaksi ensimmäistä ruisketta tehtiin primäärisellä immunogeenillä, kun taas kolmas ja neljäs ruiske tehtiin sekundäärisellä immunogeenillä.

Vasta-PRP-reaktio on esitetty piirustuksessa. Haemophilus influenzae b:n kuoripolysakkaridin IgG-vasta-aineen keskimääräinen taso kanien kuudessa koeryhmässä (kolme eläintä ryhmää kohti) on esitetty graafisesti. Ryhmät on piirustuksessa merkitty edellä esitetyn pöytäkirjan mukaisesti. Esinäyt-teiden taso oli kaikilla kaneilla alle 1 ^ug/ml ja selvyyden vuoksi niitä ei ole esitetty kuvassa.

Avoimet pylväät edustavat IgG-tasoa kahden peräkkäisen primäärisellä immunogeenillä suoritetun ruiskeen jälkeen. Täytetyt pylväät edustavat IgG-tasoja kolmannen ja neljännen ruiskeen jälkeen, jotka suoritettiin sekundäärisellä eli varmis-tusimmunogeenillä.

IgG-reaktioita todettiin ainoastaan PRP-D-konjugaattirokot-teella suoritetun rokotuksen jälkeen. Ryhmä 3:n kanien esi- 18 79024 rokotus kurkkumätätoksoidilla kiihdytti reaktiota PRP-D:iin, kun taas esirokotus jäykkäkouristustoksoidilla (ryhmä 2) oli ilman vaikutusta.

Jäykkäkouristustoksoidi

Esimerkki VI. T-AH-kantajän valmistus ja kovalentin muodostaminen

Polysakkaridi-jäykkäkouristustoksoidikonjugaatti (PRP-T) Esimerkin III mukaisessa menetelmässä käytetään kaupallista jäykkäkouristustoksoidia kurkkumätätoksoidin asemesta adipii-nihappohydratsiinijohdannaisen valmistamiseksi.

T-AH-kantajän tyypillisen erän analyysi osoitti 53,9 ^ug ADH/mg T. Saman näytteen kromatografia antoi Kd-arvon 0,66 CL-4B Sepharosella, mikä vastaa likimääräistä molekyylipainoa 227 000 proteiininormin mukaan.

Muodostetaan polysakkaridikonjugaatteja jäykkäkouristustoksoi-din adipiinihappohydratsidikohdannaisen kanssa käyttämällä samaa menettelyä kuin D-AH:lla, kuten esimerkissä IV on esitetty .

PRP-T:n tyypillisen erän analyysi osoitti 142,6 ^ug polysakkaridia ja 260 yug proteiinia ml kohti. Konjugaatti oli liukoista ja suodatettavissa 0,2 mikronin kalvon läpi. Kromato-grafoituna CL-4B:lla proteiinikomponentin Kd oli 0,30 ja polysakkaridikomponentin Kd oli 0,37.

i9 79024

Taulukko 1 Vasta-PRP-reaktio

IgM:n ja IgH:n kiinteäfaasi-radioimmuunikoe PRP Kurkkumätä- Jäykkäkouristus- toksoidi_ toksoidi_

IgG* IgM IgG IgM IgG IgM

Ryhmä 1 Esi 0,0 0 ND^ ND

jälki 1 0,33 0 "0,58 jälki 2 0,8 0 "1,39 jälki 30 0 jälki 40 0

Ryhmä 2 Esi 0 0 0 0 0,5 0 ”0,87 jälki 10 000 25,1 113,1 "15,10 "129,,54 jälki 20 000 112,00 44,60 "0 "36,90 jälki 3 4,82 26,3 0 0 112,00 8,50 "2,59 "45,55 "0 "14,72 jälki 4 36,1 74,57 0 0 151,60 2,00 "17,43 ”28,81 "52,64 "3,46

Ryhmä 3 Esi 0,2 0 0 27,07 0,8 65,00 "0,35 "46,88 “1,39 "112,58 jälki 1 0,2 0 0 0 0,8 0 "0,35 "1,39 jälki 2 0 14,6 6,47 0 0,67 0 "25,29 "5,98 "0,59 jälki 3 19,4 130,33 10,63 0 0,37 0 "13,4 "89,49 "8,08 "0,65 jälki 4 74,2 82,63 29,03 0 1,30 0 "76,73 "5,16 "26,59 ”2,25

Ryhmä 4 Esi 0 0 0 21,77 ND

"18,85 jälki 1 0 15,6 2,67 30,87 "27,02 "0,85 "27,14 jälki 20 0 37,2 26,2 "10,94 "24,30 2° 79024

Taulukko 1 (jatkoa) pRp Kurkkumätä- Jäykkäkouris- - toksoidi___ tustoksoidi

IgG* IgM IgG IgM IgG IgM

jälki 30 0 210,00 19,63 "0 "17,06 jälki 40 0 298,27 0 "207,70

Ryhmä 5 Esi 0 0 ND

jälki 10 0 jälki 20 0 jälki 30 0 jälki 40 0

Ryhmä 6 Esi 00 00 jälki 1 6,23 135,00 0 0 "2,56 "81,41 jälki 2 54,2 182,00 0,93 0 "14,73 "0 "1,62 jälki 3 57,6 182,00 3,05 0 "22,91 "0 "4,31 iälki 4 39'0 91'20 5'95 0 :alXl 4 "25,17 "0 "8,41 * IgG ja IgM on ilmaistu ,ug:na vasta-ainetta seerumin ml kohti. Kaikki arvot ovat keskiarvoja vakiovirhein.

# Ig-tasot alle kokeen herkkyysrajan merkittiin arvona nolla (0). Jos taso oli kokeen alueen yläpuolella, tämä on esitetty arvona, joka on sama kuin kokeen yläraja.

% ND = Ei suoritettu.

Claims

21 7 ? O 2 4

1. Menetelmä vesiliukoisen kovalenttisen polysakkaridi-kurkkumätä- tai jäykkäkouristuetoksoidikonjugaatin valmistamiseksi, joka konjugaatti kykenee saamaan aikaan T-soluriippuvai-sen vasta-ainereaktion Haemophilus influenzae b:n polysakkaridille, ja jonka konjugaatin molekyylikoko on 140 000 ja 4 500 000 daltonin välillä dekstraaninormin mukaan geeliper-meaatiokromatografiällä, ja jonka riboosi/proteiinisuhde on 0,25 - 1,00, tunnettu siitä, että (a) lämmitetään Haemophilus influenzae b:n kuoripolysakkari-dia, joka koostuu likimain ekvimolaarisista määristä riboosia, ribitolia ja fosfaattia, kunnes polysakkaridista alle 20 X on molekyylikooltaan alle 200 000 daltonia ja alle 20 X on mole-kyy1ikooltaan yli 2 000 000 daltonia määritettynä dekstraaninormin mukaan geelipermeaatiokromatografiällä, <b) saatu kooltaan säädetty polysakkaridi aktivoidaan syaa-nibromidilla, (c) pääasiassa kaikki reagoimaton syaanibromidi poistetaan, <d> aktivoitu tuote saatetaan reagoimaan 4-8 -hiilisellä dikarboksyy1ihappohydratsidi1la johdannaietetun eksotoksoidin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dikarboksyy1ihappo on adipiinihappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toksoidi on kurkkumätätoksoidi. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toksoidi on jäykkäkouristustoksoidi.