JPS60130389A - 新規微生物及びそれを用いるｌ−アスパラギン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高アスパルターゼ活性を有し、かっカタボライ
ト抑制の解除された新規微生物並びに該微生物を用いる
Ｌ−アスパラギン酸の製法に関する。

従来、セラチア・マルセッセンスがアスパルターゼ活性
を有しており・この微生物を用いてフマール酸アンモニ
ウム（又はフマール＃七アンモニラム塩）　ｈｈらＬ−
アズバラギン酸を酵素的に製造する方法が知られている
（特公昭５４−１２５５３号、特公昭５７−１８８６７
号）。しかしながう上記方法で用いらｒしているセラチ
ア・マルセッセンスのアスパルターゼ活性は工業的に充
分満足し得るほど高いとは云えないという問題があり。

加えてアスパルターゼ活性を有するセラチア・マルセ、
アセンスがグルコースの如キ資化されやすい炭素源の存
在下においては他の炭素源利用に関与する酵素の生成が
抑制さｎる。所謂カタボライト抑制をうけること（Ｂｉ
ｏａｈｅｍ、　Ｊ、　、旦、　６］９　ｔ　１９４２）
Ｊからセラチア属微生物を培養するに際し、グルコース
等の資化されやすい炭素源を培地に加えるとアスパルタ
ーゼ活性が充分に上昇せず、従ってＬ−アスパラギン酸
の生成醗が減少するという問題もあった。

かＤ）る状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を重ねた結果
、セラチア属に属しカタボライト抑制をうける微生物を
処理して、当該カタボライト抑制の解除さｎた微生物を
調製し、この微生物中にアスパルターゼ活性を有するセ
ラチア属微生物のアスパルターゼの遺伝情報を担うＤＮ
Ａとベクタープラスミドからなるハイブリッドプラスミ
ドＤ　Ｎ　Ａを移入することによって極めて高いアスパ
ルターゼ活性を一有する微生物を取得することに成功す
るト共に、　ｔ、＋＞　＜　Ｌ、て得られる微生物を用
いることによりＬ−アスパラギン酸を極めて効率よく製
造し得ることをも見出し本発明を完成するに至った。

即ち０本発明はセラチア属に属する微生物から採取した
アスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸とベ
クタープラスミドからなるハイブリッドプラスミドを、
高アスパルターゼ活性を有し、かつカタボライト抑制の
解除さｎたセラチア属微生物に含有せしめた微生物及び
該微生物の培養液、該培養液から採取した菌体もしくは
該菌体の処理物をフマール酸とアンモニアに作用させる
ことを特徴とするし一アスパラギン酸の脚注である。

〔本発明微生物の調製」 （染色体ＤＮＡＢよびその調製］ 本発明においてアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキ
シリボ核酸（以下、染色体ＤＮＡと称する］の供給源と
なる微生物としては、セラチア属に属しアスパルターゼ
活性を有するものであればいかなる微生物であってもよ
く１例えばセラチア・マルセッセンスＳｒ　４］　（Ｉ
ｌ工ｆＪＨＣｆｆｉＪＫ　７０１４号）、セラチア・マ
ルセッセンス０ＵＴ８２５９等を用いることができる。

これらの微生物から染色体ＤＮＡを採取する方法として
は例えば微生物菌体をリゾチーム処理、ＳＤＳ処理した
のち、除蛋白しついでエタノール沈殿せしめるＡｔ法〔
Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、　３　、２０８　、　（］　９
６１　］　。

Ｂｉｏａｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　＝　
７２−６１９　（１９中に３いて復硯可能なプラスミド
であれは時に限定されないが例えばｐ　Ａ　ＣＹ　Ｃ１
７７ＣＪ−Ｂｐ＋ｃｔｅｒｉａ１．　、］３４．ｌ］４
］　（１９７８）　Ｊ。

ｐＡｆｌ：ＹＣ１８４［：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ９．
１　３４．１１４１（１９７８）Ｊもしくｉ；ｔｐ１５
ＡｃＪ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、上３４．１１４］　（１９７
８）３゜或いはＰＢ　Ｒ３２２ＣＧｅｎｅ　、　２　、
９５　、　（１９７７）Ｊ　、ｐＢＲ３１３ｃＧｏｎｅ
、２　．７５　、（１９７７）Ｊ　、ｐＢＲ３２５［Ｇ
ｅｎｅ、４．１２１（１９７８）ＪもしくはＰ　Ｍ　Ｂ
　Ｉ　ＣＦｅｄ、Ｐｒｏツ、　、　３５．２０３７［］
９７６ＪＪ等を用いることができ、こｎ　Ｉ；藝りｖス
ミドは−は七チア１１生物に移入したのち１店法により
抽出したものを用いればより好ましい結果が得らｎる。

Ａからハイブリッドプラスミドを凋ＢｆるＶこは制のＤ
ＮＡ鎖を切断したのら、リガーゼ（例えば。

Ｔ　４０　Ｎ　Ａ　Ｕガーゼ、大腸（ａｏＮＡ＋＋ガー
ゼ等）で処理するか、或いはその切断末端によってはタ
ーミナルトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で
処理したのちりガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する
等の常法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｌ］ｌ（＋＋ｚｙ＋ｎｏ
ｌｏｇｙ・６８．４１（１９７９）、遺伝子操作実験法
１３５頁（高木康敬編著、１溝談肚サイエンティフィッ
ク＜１９８０＞）Ｊにより実施することができる。

Ｄ）＜シて染色体ＤＮＡ１遥シζデスミドに組み込んだ
ハイブリッドプラスミドを得ることができ乙。

又・本発明においては上記で得られたハイブリッドプラ
スミドを形Ｒ転換可能なセラチア属微生物ニ含有すしめ
た微生物１例えばセラチア・マルセ、、　セフＸ’ｒ　
Ａ　５００１　Ｃ’＠工研菌寄＠７０１５リン。セラチ
ア・マルセッセンスＴＡ５００２（６＆工研Ｗ寄第７０
１６号）からアスパルターゼの遺伝＠報を担うハイブリ
ッドプラスミドをとり出し用いることもどきる。ハイブ
リッドプラスミドのとり出しはＣ１ｅａｒｅｄ　１ｙｓ
ａｔｅ法　〔遺伝子操作実験法１２５頁（高木康散編著
、講談社サイエンティフィック＋　１９８０　）　；　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｌｏｒｙｉｎｇ　。

Ｐ　８６　（Ｍａｎｉａｔｉｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　ｅ
ｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　＊　］　９８２　）　ＪあるいはＢ
ｉｒｎｂｏｉｒｎとＤｏｌｙの方法（Ｎｕａｌｅｉｏ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｇ、。

７．１５１３（１９７９）コ等によって実施すにとがで
きる。

（ｉ１主へ生物およびその調・要） 店主微生物はセラチア属に１萬しカタボライト抑制の解
除さｎた微生物であれば特に限定されないが３例えば的
記セラチア・マルレッセンスＳｒ　４１、セラチア・マ
ルセッセンスＯＵ　Ｔ　８２５９　等のセラチア６４に
４し、ｒスパルターピ活性をばする微生物を変異誘起処
理したのち、Ｌ−アスパラギン酸を唯一の窒素源とする
培地で良好に生丁ｆ　Ｌ　得る菌株であればいかなるも
のであっても用いることができる。

υ）ｈ）る微生勿としては％ｌえはセラチア・マルセッ
センスＡＰｃ−４９４（微工研条Ｒあ３９２号）、セラ
チア・マルセッセンスＡＰＣ−１０９４微玉研条寄第３
９１号〕等があげられる。こｎら主 の微壬物の調・刀１は具体的には（３１えは変異誘起処
理方法としてＮ−メナルーＮ′−ニトローＮ−ニトロン
グアニジン処理、紫外線照射の如き常法を採用すること
ができる。

変異処理菌の培養に際し用いられる培地中のＬ−アスパ
ラギンＱｆ　ｉは培岨中濃度として約０．００５〜５％
でおるのが適当である。又、この場合には炭素源として
グルコース、シュクロース、Ｌ−アスパラギン酸等を用
いることがＣき、その濃度は例えばグルコースであわば
約０１〜１０外が適当である。更−゛、培地には通常の
栄淫培地に用いられる各種塩類、微」元Ａ等を添加ｆる
こともできる。

培谷方法は１贋法でよく特に限定さｎないか具体的にそ
の１例を示せば、フラスコに変異処理菌を植菌後＋　−
ｊに速度（例えばａ沢率０．０５〜０．５／時〕で培地
を注入しつつ、培養液を人き取りｅの条件下で速く生育
する１１体を濃縮分離する。所謂１車続培養法〔［細菌
、）Ｔ−ジ実億法」（蛋白質核酸酵素側Ｉｌｌ　）　３
５頁（１９７２）」を好適に採用することができる。つ
いで該ｔｇｉｎ液を連続培逼辻Ｔｍ　ｌ　１４−１立１
Ｍ　（Ｉ＋　：；Ｆ　Ｉｆｆ　＆ｙ　＋、％イ１．−　
”ｒ　フッ４扁ゼソＪｉｍを約０．１〜５％にした培地
平板で生育した大きなコロニーを採取することにより高
いアスパルターゼ活性を有し、かつカタボライト抑制の
解除された微生物を得ることができる。

（形質転換） つづく形質転換方法は例えば低温下に言上微生物細胞を
塩化カルシウム溶液で処理し、菌体膜の透過性を増大さ
せ、ハイブリッドＤＮＡを６主微生物中にとり込ませる
方法［ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、　５ユ、１５９（１９
７０）、遺伝子操作実験法、１６０頁（高木康敬編著、
講談社廿イエンテイフイック＊　１９３　Ｑ　）　、　
Ｍｏ１ｓａｕｌａｒ　Ｃｌｏａｋｉｎｇ　Ｐ　２４９　
（１Ｊａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａ令、、　ａｄｌＣｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｄｏｒＬａｂｏｒｏｔｏｒｙ
　、　１９８２　）　Ｊ等の常法を採用することができ
る。

かくして得らｔした形質転換株のうち、アスパルターゼ
の遺伝情報を担うハイブリッドプラスミドが移入された
菌株の選択はＬ−アスパラギン酸を唯一の窒素源として
良好に生育しつる菌株を釣菌・分離することにより実施
できる。又・形質転換に際しハイブリッドプラスミドを
各種の変異を有する変異株に移入して目的とするハイブ
リッドプスミドを保持する菌株を予め選択したのち抽出
し、これを言上微生物に移入することもできる。

かかる変異株としては例えばセラチア属、ニジエリシア
属に属する微生物であってアスパルターゼ欠損性、アン
ピシリン感受性、カナマイシンＡｉｌ性等の変異の一部
又は全部を有する変異株があげられる。

かくすることにより本発明に係る微生物、即ち、セラチ
ア１戚に属する微生物から採取したアスパルターゼの遺
伝清報を担うデオキシリボ核酸とベクタープラスミドか
らなるハイブリッドプラスミドを、高アスパルターゼ活
性を有し、かつカタボライト抑制の解除さｎたセラチア
属微生物に含有せしめた微生物を得ることができる。

かかる微生物として具体的には例えはセラチア・マルセ
ッセンスＴＡ５０］０（ｉ工１ｔｌＴ１１Ｗ！７３１２
号）等があげられる。これらの微生物は親株に比べて約
２８倍の高いアスパルターゼ活性を有する。

〔Ｌ−アスパラギン酸の製法Ｊ 本発明に係る微生物は前述の如く親株に較べて顕著に優
れたアスパルターゼ活性を有しているの主 で・該微生物を用いてフマール酸トアンモニアからＬ−
アスパラギン酸を好適にＶ造することができる。

即ち１本発明に係る微生物の培往液、該培養液から採取
した菌体もしくは該菌体の処理物をフマール酸とアンモ
ニアに作用させることによりＬ−アスパラギン酸を製造
することができる。

埼 本発明に係る微生物を一１ｔｖるに際しては炭素１源、
窒素源、ｎ機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培
地が使用できる。培養は書法により行なうことができ１
例えば培地のｐ［＋を５．０〜９．０に調整し、微生物
を接種したのら］０〜４５℃、好ましくは２８〜３７ｃ
で吐気的に培１ｖｎばよい。又、上記培地ＶｃＢいてＬ
　−−アスパラギン酸を炭素、窒素源として用いること
ができその際の添加量は約０．１〜５％であるのが適当
である。

酵素反応に際しては上記の如くして得られる培養液のほ
かに該培痒液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては例えば洗
浄菌体、乾燥菌体、閃体磨砕物・菌体の自己消化物、菌
体の超音波処理物。

菌体抽出物又はこれらをゲル包括法や吸着法等のそｎ自
体公知の固定化方法により固定化したものがあげられる
。固定化したものの呉体例としては菌体等を例えばポリ
アクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、
７アーセレラン等）。

コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、寒天ゲルで固定化したものがあげらｎ、ポリア
クリルアミドゲルによる場合は例えば特公昭５３−１８
３１号記載の方法により、又、含流多糖頌による場合は
例えば特開昭５３−６４８３号記載の方法により固定化
することができる。コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、
ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲル等による場合も１
例えば特開昭５１−１４４７８０号、特開昭４９−３０
５８２号、Ｃ待１ｊＦ昭４９−８０２８５号、特開昭５
１−１３３４８４号記載の方法に従って固定化すること
ができる。

基質りる７マール酸とアンモニアは１々の形で反応系に
供給することができ９例えばフマール酸アンモニウム塩
として供給してもよく、史にはフマール酸もしく（まそ
の塩と研（幾アンモニウム塩として供給してもよい。

フマール酸塩としては例えばフマール酸ナトリウム、７
マール酸カリウムを好適に用いることができ＋　ｆｊｊ
［戊アン七ニウム塩として（ま伝えば塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム又はこれらの
混合物を好適に用いることができる。

７−ｙ　−７＋／　酸もしくはその塩と無機アンモニウ
ム塩を用いる場合には、これら２成分のモル比はｊ：１
．５〜１：２の間ｅこあるのか適当である。

薗 酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範呉て実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４５
℃で実施するのが好ましい。又・酵素反応に際してその
ｐｌ＋は６〜１０と′ｆ、【るよう実施するのが奸ヰし
い。尚、ＪＺ２酵素反応に際してはカルシウム、マグネ
シウム、マンガン、ストロン子カム等の２イ曲金川イオ
ンを添加するのが好ましい。こわ、らの２価金属イオン
の濃度はＯ，］〜１０ミリモル程度でよく、こｒｌ、に
より酵素の安定性を高めることができる。

反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ましく、培養後集菌した微生＠菌体を前記した如
き基６／８液にけん濁しかくはんすることによってＬ−
アスパラギン１恢が生１戊する。

又、固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物が
水に不溶性であるため、バッチ法によるのみならず、力
うム法によって連続的に実施することもできる。ｆ！ｌ
えは固定化微生物をカラムに充填し、このカラムに基質
溶液を適当な速度で流下すれば、Ｌ−アスパラギン酸の
みを含む流出液が得られる。またバッチ法による場合は
基質溶液に固定化微生物をけん濁させ、かくはんするこ
とによってＬ−アスパラギン酸が生成する。この場合に
は反応終了液力）ら固定化微生物を口過或いは遠心分離
することにより取楔・すれば丙びこγ１を反覆使用する
ことができる。上記反応を実施するにあたっては反応進
行率は微生物のｔ、温度１反応時間基質の流速（特に線
速度）その他により影響さｎる。例えば、カラム法によ
る場合は使用する固定化微生物の晰に従い基質溶液の流
下速度を、またバッチ法による場合はその反応時間を適
当に調整することにより反応進行率を１００呪にまで高
める至適条件を見出すことも容易である。

かくして反応液中に生成蓄積したＬ−アスパラギン酸の
分離精Ｖは、ＩＪＩ常のイオン交換樹脂法やその他の公
知方法を組合せて容易に行なうことが゛　セラチア属微
生物の 有するアスパルターゼ活性より格段に高いアスパルター
ゼ活性を有する。−−一 、　−更に本発明によればかかる高ア スパルターゼ活性のセラチアｆＦ、　微生ＩＩを７７−
　ル酸とアンモニアに作用させた場合には極めて高収率
かつ短時間にＬ−アスパラギン酸を製造するこ解除され
ているのでグルコースの如き資化されやすい炭素源が存
在してもアスパルターゼ活性は低下しないという特徴を
も併せ有する。換言すｒＬば炭素源によって微生物のア
スパルターゼ活性の発現が左右されず、常に高アスパル
ターゼ活性を発現させ得るのでＬ−アスパラギン酸の製
造に際しては炭素源に留意する必要かないという好まし
い特徴を何するものである。

以下、寿施例により本発明を史に詳細に説明する。

＋ｒＹ３１　’Ｊ　施例中のアスパルターゼ活性は１Ｍ
フマル酸アンモニウム（ρ１１８．５　、１　ｍＭ塩化
マグネシウム含有）と菌体又は菌体処理物とを接触させ
、３７℃で１５汁間もしくは１時間反応後反応液中のＬ
−アスパラキン酸をロイコ／ストックφメセンテロイデ
スＰ−６０を用いるバイオアッセイ法〔、Ｔ　ｌ（４，
１１＋！ｈｇＩｍ　、　１７’Ｊ　、　ＩＩ：ｌｌ　１
Ｑ４只１　Ｉｖｒより測定して行なった。

実施例　１ （１）＠主機生物の調製 グルコース３．０＜、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム０
．０１！１．リン酸第１カリウム０．３　＜　、リン酸
第２カリウム０．７＜、硫酸マグネシウム・７水和物０
．０１４からなる培地５０ｍ１を含む５０ｍ１容ヘルコ
社製スピナーフラスコにセラチア・マルセッセンスＳｒ
　４　］の］Ｎ−メチルーＮ′−二トローＮ−二トロソ
グ丁ニシン処理をｓ　Ｘ　］　０１０１ｉｉ菌し。

希釈率０．１／時、３０℃で８日間連続培養した。

ついて該培養液を１０５〜ｌＯ８倍に生理食塩水で希釈
したのち、上記培地組成にふいてＬ−アスパラギン酸ナ
トリウムを０．５％とし史に広大ｔ、５＜を含む培地平
板に塗布し１〜２日間で出現した大コロニーから釣菌す
るＣとにより、カタボライト抑制の解除さｔした微生物
・セラチア・マルセツセンスＡＰｃ−４９４（微工研条
寄第３９２号〕を得た。

（２）　ハイブリッドプラスミドの調製ｇ　−Ｐ　５＋
　１で得たセラチア・マルセッセンスＴＡ５００　？　
（ｒ＜工１ｉ１Ｆ￥ｊ寄ＭＳ　７０３６　Ｆ５１　ヲ１
．−　）ｎス（ペプトン１幅、酵母エキス０５％、塩化
ナト’ｌ　ラム０．５　％　、ｐｌ！　７．０　）　１
１　Ｋ接種して３０℃で１８時１’ｌ振とう培養した後
、菌体を遠心分離して集菌した。ついで該菌体をリゾチ
ール処理、ＳＵＳ処理により溶菌させ、最終１Ｍになる
ように塩化ナトリウムを加えた後、］　０００００ｘ５
’　、３０分間の遠心分離を行なった。上清を採取し、
フェノール処理した後、エタノールヲ加えＤＮＡを遠心
分離により集めた。沈殿したＤＮＡをｌＱｍｌＪトリス
塩酸−］　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ）ｌ　７．５　
）に溶解し。

塩化セシウム・エチジウムブロマイド平＃密度勾配遠心
法によりプラスミドＤＮＡを分離精ツした。

かくして０６■のハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ
５ｃ’２を得た。

（３）　ハイブリッドプラスミドによる形質転換＠紀Ｊ
で得たセラチア・マルセッセンスＡＰｃ４９４をＬ〜プ
ロス３０ａＪに接種し、３０’Ｃで振とう培養しその対
数増殖期の中期まで生ｎせしめた菌体を集菌した。つい
で水冷した０、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５ｍ１にけ
ん濁したのち集菌し。

水冷した０、１Ｍ塩化カルシウム溶液１５ｍ／にけん濁
した。Ｃ”Ｃで３０分間放置したのち集菌し・水冷した
０、１Ｍ塩化カルシウム溶液３−にけん濁した。この細
胞けん濁液に（２）で得たＤＮＡ１♂液を加えて３０分
間水冷したのち、４２℃で３分間加熱処理することによ
ってＤＮＡを細胞内にとりこませた。ついでこのけん濁
液［Ｌ−フロス］５−を加え３０℃で２時間振とう培養
した後、この培養液・２アンピシリン５０μｇ／ｉを含
むＬ−ブロス寒天平板培地上に０，１〜０，５−宛塗布
し３０℃で一夜培養した。生じたコロニーを會じ菌、カ
離することによって、アスパルターゼ活性の高いセラチ
ア・マルセー７−＋＝ンスＴＡ５０］０（！工１ｊＴＩ
ｆｊ寄７３１２号）を得た。

かくして得らｒしたセラチア・〜マルセッ七ンスＴＡ５
０１０とｆｉ株たるセラチア・マルセッセンスＳｒ４］
のアスパルターゼ活性を下記表に示す。

ッセ７ス５ｒ４１に比較して約２８倍のアスパルターゼ
活性を有することが明らＤ）であった。

又・セラチア・マルセッセンスＴＡ５０１０からハイブ
リッドプラスミドＤＮＡを抽出し、制限エンドヌクレア
ーゼＦｉａｏＲＩとＳａｌ　Ｉで同時に縦片とからなり
、約４Ｋｂの断片はｐＨＲ３２２プラスミドＤＮＡを上
記制限エンドヌクレアーゼで切断して生じる人きい方の
ＤＮＡ断片であり、約３Ｋｂの断片はアスパルターゼ遺
伝子を担うＤＮＡ断面であることがわかった。

実施例２ フマール酸アンモニウム０．５幅、フマール酸１゜１４
％、リン酸第１カリウム０，２％、硫酸マグネシウム・
７７１１物０．０５％、コーンスナープリ力−２％、ミ
ースト２鴫を含む培地（ｐＨ７，０３５０ＯｆｆＩ／に
セラチア・マルセッセンスＴＡ５０１０を植菌し３０℃
で２４時間培養した。この堵養液のＲ１１をアンモニア
水でｐＨ８，５としてフマール酸アンモニウム６５ｇお
よびトリトンＸ−１００の５００ＩＩｖを添加してさら
に３７℃で３時間静置反応を行なった。反応終了液をろ
過、濃縮しｐＨ２，３に調整した。析出晶をろ取するこ
とによりＬ−アスパラギン酸の粗結晶を得、ついでこγ
Ｌを水から再結晶することによりＬ−アスパラギン酸４
７．３５’を得た。

実施例　３ ｔ」、ｌ　フマール酸アンモニウム０．５％、フマール
酸１．１４％、リン酸第１カリウム０．２％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物０．０５％、コーンスチーブリ力−
２％、ミースト２鴫を含む培地（ρ１］７、Ｏ）５００
ｍｌＫセラチア・マルセッセンスＴＡ５０］０を植菌し
’、３Ｑ℃で２４時間振とぅ培養した。この培養液から
遠心分離により集菌した菌体を生理食塩水１６ｍ１にけ
ん副し、あらかじめ４０℃に保Ｙｍ　Ｌ　だ３．２％ゲ
ニューゲルＷＧ（コペンハーゲンペクチンファクトリー
社製のカラギーナン）７ｋｆＳ液６４ｍ／を加え４０℃
のｃ温浴中で混合した。この混合液を１Ｍフマール酸ア
ンモニウム水ｍ　液（ｐｔ１８．５．１ｍＭ塩化マグネ
シウム含有）中に滴下することにより球状ゲル（直ｔｌ
＝　３　ｍｎ　ｌのアスパルターゼ活性をＮＴる固定化
セラチア・マルセッセンス６０ｇ（湿唄喰］を得た。こ
の１８定化菌体Ｉグのアスパルターゼ活性はａ、　９　
ｍ　ｍｏｌｅｓＡ、ｒであった。

（２）　上記ｆｉｔで得らちだ固定化セラチア・マルセ
ッセンス６０Ｆを外套管付きカラム（４引Ｘ８（？１ｌ
）Ｋつめ、３７℃にて２４時間インキュベーションして
活性化（アスパルターゼ活性５７００ｒ。

Ｉｎ　０１ｆ３　ｇ／））ｒ）後、同温度にて１ｈ（７
マール酸アンモニウム溶液（ρ８３，５．１ｍＭ塩化マ
グネシウム含イｆ）１０００ＷＪ、を７５　ｍｌ／ｈｒ
の流速で４１℃シた。流出液をｐｒ＋　２．８に調整し
、析出晶をろ取することＫよりＬ−アスパラギン酸１２
９ｆＪを得た。

実施例　４ （１）　セラヂ′ア・マルセッセンスＴＡ５０１０の菌
体８ｙを生理的食塩水５ｄ（（けん濁し、こ２”Ｌを予
め４０℃に保温した２、２％ゲニューゲルＷＧ水力 ＭＭＣ１％ローｔストビーンガム含再〕８０−を加えて
混合しｆこ。この混合液を冷却してゲル化させ、さらに
２％塩化カリウム水ｒ容、夜２５ｍ１を静かに加え３０
分間静置した。ｉｖられるゲルを１辺３ｍの立方体に成
型し２％塩化ｙｙ　ＩＩウム水溶液で洗度０．４９鴨に
な名ように加え、水冷下に１５号間静置して硬化処理を
行なった。ついでゲルをろ取し２％盲化カルシウム水溶
液で洗浄した後１Ｅ、質ｍ液中で４８時間インキュベー
ションして活性化することにょリアスパルターゼ活性を
汀する固定化セラチア・マルセッセンス８６９（湿＠ｌ
、２３ｍｍｏｌｅｓ／ｌｌｒ／９閑イ木ンをｉｌた。

（２）　上記（１）で得られた固定化セラチア・マルセ
ッセンス１１ｙを外套管付きカラム（１，６ｃ＋ｘＸ＋
２１）に充ｊ貞し３７℃にて１Ｍフマール酸アンモニウ
ム水溶液（ｐｌ’ｌ　８．５　、　ｌ　ｍＭ塩化マグネ
シウムｊ有）を７　ｗｌｋｒの流速で連続してＩＩＬ適
時サンすＩＪ　ングしてアスパルターゼ活性を測定する
ことにより安定性を調べたところ２０日間経過喚も活性
の低下は認められなかった。

実施例　５ セラチア・マルセッセンスＴＡ５０　］　０の菌体１０
　Ｆヲ０．０５　Ｍ　＋）　ン酸緩衝液［ｐ）Ｉ　８．
５　）　５０．１ニケんｒ蜀し、９めで１０分間音波処
理を行なった。

遠心分離して得られ、る上澄液４ｏ−を弱塩基性陰イオ
ン交換樹脂デュオライｌ−−Ａ　７　（米［ｉ、　９’
イアモンドシヤムロツクケミカルｕ製）ｆｉｏ、ｄを充
填したカラムに３０　ｍｌ／ｌＬｒで室温Ｆに導通した
。ついで０．１ＭＩｊン酸緩衝液（ｐＨ８，５３３０（
Ｊｗｔと０゜４＜グルタルアルデヒド３００ｍＺを含む
溶液で３０分間架橋し、グルタルアルデヒドを十分洗浄
して固定化酵素を調製した。該固、１化酵素を５０ｒｎ
ｌ容計のカラムに充填し１Ｍフマール酸アンモニウム（
ｐＨ８，５、ＩｍＭｍ化マグネシウム含有Ｊ５００−を
３７．５　ｍｌ／ｈｒの流速で導；ｍした。流出液を合
わせｐＨ２，８に調整したのち析出する結晶をろ取する
ことによりＬ−アスパラギンＷ５６Ｐを得た。

実施例　６ セラチア・マルセッセンスＴＡ５０１０を用いて実施例
５と同様にして喝らｎた上澄液を硫安分画（３０〜５０
％飽和）ｔｉｌｌられた社殿を水５ｍｌに溶かしたのち
、水に対して一夜透析し透析内液を酵素液（アスパルタ
ーゼ標品）とした。この酵素液２１を３．２％ゲニュー
ゲルＷａ水溶液１２−と３７　’Ｃの温浴中にて混合し
た。この混合を夜を２％塩化カリウムｔｋｍ液中に（・
１℃丁することにより球状ゲル（直径約３酬〕を得た。

ＩＩらｒした固定化アスパルターゼの活性は７　ｄ　＋
ｎ　ｒｎ　ｏｌ　ｅ／Ｊ）、ｒ／９　であった。

参考例　１ （１）染色体ＤＮＡの調製 セラチア・マルセッヒンス５ｒ４１を１１のＬ−ブｌ：
Ｉス（ペプトン１＜、酵附エキス０．５％、塩化ナトリ
ウム０．５％、ｐＨ７，２）に接種し、　３０　”Ｃで
４時間振とう培養し対数増殖期の菌体を遠心力ＦＩＩＩ
により集めた。この菌体をリゾチーム処理、ＳＯ８処理
し千溶菌し、フエ／−ル処即により除蛋白したのちエタ
ノール処理して染色体ＤＮＡを沈殿させた。ついで盾法
により染（ｇｌＡＤＮＡを抽出精製することにより染色
体ＤＮＡ２．８〜を出た。

（２）　プラスミドＤＮＡの調製 セラチア・マルセッセンスＳｒ　４１をＬ−ブロス５０
、ｄに接腫し、３０℃で振とう培養し対数増殖閘まで生
ａせしｙ）だ菌体を集菌した。ついで菌体を水冷した０
、１Ｍ塩化マグネシウム溶液５０−にけん濁したのち集
菌し、水冷し１こＯ，１Ｍ塩化カルシウム−０，５）Ｊ
シｇ塘溶液２５ｒｎ！、にけん濁した。

０℃で３０分間放置したのち集菌し、水冷した０゜１Ｍ
塩化カルシウム−〇、５Ｍショ糖溶液５ｒｎｌにけん濁
した。このけん濁液０．２−にニジエリシア・：ｌ　Ｉ
Ｉ　Ｋ　−］　’ｌから採取したプラスミドｐＡＣＹＣ
１７７の０ＮＡＩμりを加え、０℃で１時間放置した。

４２℃で２分間処理したのちＬ−ブロス２−を加え３０
℃で９０分間培養した。この培養液０１４−をアンピシ
リン５００ｆ〜を含むＬ−ブロス寒天培地に塗布し、３
０℃で１日培養した。生じたコロニーを釣菌・分離する
ことにより・ｐＡＣｙｃｉ７７を含有するセル千ア・マ
ルセッセンス５ｒ４１を得た。

このｐＡｃ：ＹＣ１７７を含有せしめたセラチア・マル
セッセンスＳｒ　４１を１１のＬブロスに接種して３０
℃で１８時間振とう培養した後・菌体を遠心分離により
傷めた。ついで該菌体をリゾチーム処理・ＳＯ３処理に
より溶菌させ・最終１ＭＫなるように塩化ナトリウムを
加えた１、ｌ　０αＯＱＱ’ＸＳ１．３０ｔｌ＋の濾心
分離を行なった。上清を採取し、フェノール処理した後
エタノールを加えＤ、ＮＡを遠心′ｆ）離により集めた
。沈殿したＤＮＡを］ＱｍｌＪ）リス塩酸−１ｍＭ　Ｅ
ｔ　ＤＴ　Ａ　（ｐＨ７，５３に溶解し・塩化セシウム
・エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法によりプラ
スミドＤＮＡを分離精製した。かくして０．５”ｌＩ？
のｐＡＣＹＣ１７７プラスミドＤＮＡを得た。

（３１Ｐ　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｃ１７７をベクターとするハイ
ブリッドプラスミドの調製 上、？ｅ　（１１で得た染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　］　０，１
．（２１で得たプラスミドＤＮＡ５ｐｇの各々に制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　［［を通常の条件で作用さ
せＤＮＡ鎖を完全に切断した。６５Ｃ，］０汁１…の熱
処理後・両反応液を准合しＴ４ファージ由来のＤ　Ｎ　
Ａ　＋）ガーゼを通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を
連結させた。

（４）　ハイブリッドプラスミドによる形質転換ｉａｌ
　セラチア・マルセッセンス５ｒ４１を文献［Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　、　１２４．１９７　（１９７
３）　。

Ｍｏ）、、’　Ｇｅｍ、Ｃｅｎｅｔ、　、　１５２．６
５（１９７７）　Ｊ記載方法に準じて変異誘導処理して
細胞外ヌクレアーゼ欠４Ｍ性、制限エンドヌクレアーゼ
欠損性の変異株を調製し、ついでこの変異株をＮ−メチ
ル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジンで変異誘導
処理し・アンビシリジン５μ附を含むＬ−ブロス寒天培
地にプレートあたり約１００コロニーが生じるように塗
布した。３０℃で１日培養したのち・生じたコロニーの
うちで小さいコロニーを釣菌・分離して細胞外ヌクレア
ーゼ欠損性、制限工とう培痒しその対数増殖期中期まで
生育せしめた菌体を集菌した。ついで水冷した０、１Ｍ
塩化マグネシウム溶液５０−にけん濁したのち集菌し、
水冷した０、１Ｍ塩化カルシウム−０，５Ｍショ傭溶液
２５−にけん濁した。０℃で３０分間放置したのち集菌
し、水冷した０、１＆！塩化カルシウム−０，５Ｍショ
糖５ｍｌにけん濁した。この細胞けんｄ液に（３）で得
たＤＮＡ溶液を加えて３０分間水冷した後、４２℃で２
分間熱処理することによってＤＮＡを細晧内にとりこま
ぜた。ついでこのけん濁液にＬ−ブロス５０．ｎＩを加
え３０℃で２時間振とう培養した後、培養液の少（ａを
Ｌ−ブロス寒天培地（アンピシリン５０μｍＮ、寒天１
．５％含有）に唇布し、３０℃で２４時間培６した。生
じたコロニーのうちアンピシリン耐性、カナマイシン感
受性のものをハイブリッドプラスミドによる形Ｒ転換株
として得た。ｐ）くシて得らノＪ、た形質転祷株をＬ−
ブロス１１で培養したの′ら（２）と同様ｔこしてハイ
ブリッドプラスミドＤ　Ｎ　Ａを採取した。

（ｂｌ　このＤＮＡをニジエリシア・コリｌ＜　−１２
カ）らＮ−メチル−Ｎ′−ニトローＮ−ニトロソゲＴニ
シンで変異誘起処理して１Ｇら７１．６アスパルタ一ゼ
欠損性変異株ＴＫ２３７＆ζ上記ｔａｌと同様にしてと
りこませ、培地（Ｌ−グルタミン酸１％、リン酸第二カ
リウノ、０．７％、リン酸第−カリウム０．３％、硫酸
アンモニウム０．１％−１０ｆ酸マグネシウム・７．１
１＜和物０．０１呪、寒天１．５％、アンピシリン２５
μ９／ｍ／）上に塗布して３０℃で５日間培養し、形質
転換株を得た。この形質転換株を（２）と同様に処ｉｆ
ｆ　してハイブリ・ソドブラスミトｒ＋〕：ｔｈｑｐ、
潤ＨｊｐＪ　ｕた。

（ｃｌ　ブ））＜丁１５ことにより１！４らｌ〕だハイ
ブリッドプラスミドＤ　ＩＮ　Ａとセラチア・マル１＜
ッセンス５ｒ４１・？Ｌ記Ｊａｌと同様に処理Ｉ７て形
質転換株を調朽し、アンビシ１１ン５００μｐＡｄをか
むＬ−フロス寒天培１也で培養することによりアスパル
ターゼの＋１伝Ｐｆ＝ｑするハイブリッドプラスミド（
ｐＴＡ５０１）を含み高アスパルターゼ活性を有「る形
百転”ｑ　ｎ−Ｚラチア・マルヒ・ノセンスＴＡ５００
１（機工（ＪＦ菌寄Ｉπ７０１５号）をｉ５た。。

（５１ｐ　Ｂ　Ｒ３２２をベクターとするハイブリッド
プラスミドの調狗 前記１２）においてプラスミドｐＡｃ：ＹＣ１７７に代
スてｐＢＲ３２２を用い、思Ｆｉｏ１−噴１てして処理
することによりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｐ　Ｂ　１１３
２２０．８即を得た。他方、上記＋４）　−（ｃｌで碍
たセラチア・マルセッセンスＴＡ５００］をｆｆ１ｌ　
’、Ｆ２　＋’、ｌ　トｒ　Ｘ’＜　ｉＣして処理する
ことによりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｐ　Ｔ　ＡＦ＋０１
０．６りＩ７を得た。

（６）　ハイフリットプラスミドの調製上記（５）て得
たＰＢＲ３２２５１４′とｐＴＡ５Ｑ１のプラスミドＤ
　Ｎ　Ａ　Ｓｌ＆に各々制限エンドヌクレアーゼＦ＋ｒ
、ｏＲＩと５ａｌＩを同時Ｙｃ曲通常条件で作ＮＡリガ
ーゼを通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎮を連結さゼた
。

（７）ハイブリッドプラスミドによる形質転換前Ｋｔ　
ｉ４）　ト１ｒ＋１　様にしてセラチア・マルセツセン
スＳｒ　４　ｌを（６）で得たＤＮＡ溶液で形質転換し
、アンピシリン５００　＄ｉｙｍｌを含むＬフロス寒天
培地を用いて生育する菌株を採取し高アスパルターゼ活
性を有する微生物を選択することによりアス／へ′ルタ
一ゼの遺伝子を有するハイブリッドプラスミドを含ｔｊ
　形ｊｆ転換株セラチア・マルセッセンスＴＡ５００２
（機工研菌寄＠７０１６号］を得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　セラチア属に属する微生物から採取したアスパ
   ルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸とベクター
   プラスミドからなるハイブリッドプラスミドを、商アス
   パルターゼ活性を有し、かつカタボライト抑制の解除さ
   ｒしたセラチア属微生物に含有せしめた微生物。
2. （２）高アスパルターゼ活性を有し、　７１）つカタボ
   ライト抑制の解除さｎたセラチア属微生物がセラチア属
   に属し、アスパルターゼ活性を有し・かつカタボライト
   抑制をうける微生物を変異誘起処理したのち、Ｌ−アス
   パラギン酸を唯一の窒素源とする培地中で培養シ、該培
   地で生育する微生物を採取することにより碍らｒＬる微
   生物である特許端（３）　セラチア属に属する微生物か
   ら採取したアスハルタ−セ（Ｄ　遺伝１ＦＪ　報を担う
   デオキシリボ核酸とベクタープラスミドからなるハイブ
   リッドプラスミドを、高アスパルターゼ活性を有し、か
   っカタボライト抑制の解除されたセラチア属微生物に含
   有せしめた微生物の培養液・該培養液から採取した菌体
   もしくは該菌体の処理物を７マール酸とアンモニアに作
   用させることを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製法。 ＋４１　７マール酸とアンモニアをフマール酸アンモニ
   ウムとして供給する特許請求の範囲第３項記載の方法。