JP2004298105A - L−ラムノースイソメラーゼの固定化法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】L−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは精製結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするL−ラムノースイソメラーゼの固定化法。前記の方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化L−ラムノースイソメラーゼ。前記の固定化L−ラムノースイソメラーゼのD−アロースの連続製造方法への使用。
【選択図】 なし
Description
【産業の属する技術分野】
本発明は、D−アロースという希少糖研究の中で、特に各種生理活性を有することが判明してきた希少糖を製造する場合に使用するバイオリアクターを作るのに利用するL−ラムノースイソメラーゼの固定化法に関する。
【0002】
【従来の技術】
D−プシコース等のD−アロースへの変換に関する酵素反応法による本発明者らによるこれまでの製造法は、商業的生産には完全に満足できるものではなく、今までのところ、固定化系による系は安定性(活性維持)の点で連続生産には耐えられないという問題があった。
従って、産業的に希少糖を大量に生産するには、安定な、高活性の固定化法に関して、改良する必要性が残っている(特許文献1参照)。
【0003】
【特許文献1】
特開2002−17392号公報
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らのD−アロースという希少糖研究の中での従来例の特徴と問題点は、従来は固定化にイオン交換法を用いており活性が安定ではなく数週間で活性が低下するという問題点を持っていた。
本発明の目的は、こうした基質をD−アロースに変換することに関する従来技術の不利な点を克服することであり、安定な、高活性の固定化法を開発し、産業的に希少糖を大量に生産することを実現しようとするものである。本発明の技術はバイオ産業の分野に属するもので、希少糖をバイオテクノロジーを用いて生産する技術の中で、バイオリアクターとして安定なものを作ることは基本的に重要な解決課題である。本発明は、安定な、高活性の固定化L−ラムノースイソメラーゼを提供することにより、この課題を解決して希少糖D−アロースを生産できる基盤を作ろうとするものである。
本発明の目的は、低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質溶液の流速が速い固定化L−ラムノースイソメラーゼを提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、L−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、L−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを、好ましくはポリエチレングリコールを用いて結晶化したものを固定化することを特徴とする方法を要旨とする。
【0006】
また、本発明は、L−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、L−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを、好ましくはポリエチレングリコールを用いて結晶化したものを、まず分子内架橋させ、ある程度分子内架橋が進行した段階で、L−ラムノースイソメラーゼ同士を分子間架橋させて固定化することを特徴とする方法を要旨とする。
【0007】
本発明は、L−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするL−ラムノースイソメラーゼの固定化法を要旨とする。
【0008】
また、本発明は上記のいずれかの方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液時の圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化L−ラムノースイソメラーゼを要旨とする。
【0009】
また、本発明は、上記の固定化L−ラムノースイソメラーゼのD−アロースの連続製造方法への使用を要旨とする。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化の対象とするL−ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング(Journal of Fermentation and Bioengineering)」第85巻、539乃至541頁(1998年)で発表された公知酵素である。L−ラムノースからL−ラムニュロースへの異性化反応ならびにL−ラムニュロースからL−ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。L−ラムノースイソメラーゼは、D−アロースとD−プシコースの間の異性化にも作用するので、D−プシコースからD−アロースを生産することができる酵素である。
L−ラムノースイソメラーゼは、Pseudomonas stutzerii 由来の酵素を好ましいものとして例示できるが、その由来、起源を問わず、天然であろうと遺伝子組換え型であろうと、何れの酵素も利用できる。上記のPseudomonas stutzeriiに属する菌株 Pseudomonas stutzerii LL172a は、上記文献に記載された公知菌であり、香川大学農学部生物資源食糧化学科の何森健研究室に保存されている。財団法人発酵研究所から同一のPseudomonas stutzerii は得られる。Pseudomonas stutzerii IFO 3773, Pseudomonas stutzerii IFO 13596 が同一の活性を持っていると思われる。L−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物から容易に入手が可能であり、L−ラムノースが存在する培養条件の時に、誘導的に生産される。通常、L−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養して得ることができる。
例えば、L−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物をL−ラムノースを炭素源として培養すると、L−ラムノースが誘導剤となって菌体内に生産される。酵素を大量に構成的に産生する変異株を用いることは、L−ラムノースなどの高価な炭素源を必要としないので特に有利である。
【0011】
得られた培養菌体からL−ラムノースイソメラーゼを抽出したもの、または菌体そのものを用いる。L−ラムノースイソメラーゼは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記のL−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。
本発明では特定の固定化法による固定化酵素または固定化菌体の形態で用いることにより、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能なリアクターを構築することができる。
【0012】
本発明の特定の固定化法について、従来法と対比しながら説明する。
L−ラムノースイソメラーゼの固定化法について、従来のイオン結合法を用いた固定化法では十分な活性を保ったままの固定化酵素を得ることができない。イオン結合法によると、固定化による活性収率が10%以下である。十分な活性を得るためには大量の酵素を用意する必要があるが、精製酵素は価格の点で現実的ではなく、粗酵素を用いる場合は、酵素以外の蛋白質も大量に固定化されるため高活性が得られない。
【0013】
そこで、定法の架橋法の適用が考えられるが、酵素を結晶化させずリジンを用いない定法の架橋法では活性収率が低く均一な固定化酵素の粒子が得られない。
安定で均一な粒子を得るための至適化が必要である。まず、架橋に用いる酵素は溶液の状態で架橋すると固まりになって沈殿するので、酵素をPEG20000で結晶化させる。均一な結晶を得るためにPEG20000溶液を徐々に加えて静置する(最終濃度4−5.5%)。得られた結晶を分子内架橋させると安定な固定化酵素は得られるが、バイオリアクターを構築すると固定化酵素の大きさが小さいため送液に高い圧力が必要である。
【0014】
本発明では、安定なバイオリアクターを構築するべく、さらに粒子を大きくすることとした。そこで、ある程度分子内架橋が進行した段階でリジン溶液を添加し、架橋試薬で酵素同士を分子間架橋させ、高活性であり、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能な形態に不溶化した固定化酵素を得た。固定化菌体についても同様に得られた。
【0015】
高活性であり、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能なバイオリアクターの構築について説明する。L−ラムノースイソメラーゼおよび/または菌体の固定化粒子を用いてバイオリアクターを構築する。D−アロースに変換可能な基質であるD−プシコースを含む溶液を通液する。前記基質の一部をD−アロースに変換するために、前記基質を含む溶液と固定化粒子を前記基質をD−アロースに変換するのに適当な条件下で、例えば反応時は42℃と温度をコントロールした条件下で接触させる。通液後の前記基質の約30%をD−アロースに変換した溶液からD−アロースのアルコールに難溶性の性質を利用してD−アロースを結晶化させる。結晶化後、D−アロース結晶を分離回収し、そのろ液に基質を追加した後、アルコール除去、濃縮することなしにバイオリアクターに再添加する。高純度D−アロースを連続的に製造することができるバイオリアクターを構築できる。
【0016】
本発明の固定化L−ラムノースイソメラーゼおよび/または菌体は、低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質溶液の流速が速い前記カラムのバイオリアクターを用いて、D−アロースを連続的に製造することができる。送液圧力が低いためかなり高い供給速度で溶液を供給することができるし、安定であるため長期間連続使用が可能である。D−アロースを連続的に製造することができることは、本発明の固定化L−ラムノースイソメラーゼの顕著な効果である。
【0017】
【作用】
ある程度分子内架橋が進行した段階でリジン溶液を添加し分子間架橋させることにより、バイオリアクターを構築した場合に流速が速く、安定で長期間連続使用可能な固定化酵素となる。
すなわち、上記の方法で得られる固定化酵素は、
(1)PEG20000を用いた結晶化による部分精製と架橋試薬による架橋を同時に進行させるため、簡単で高い活性の固定化酵素が得られる。イオン結合法では高い活性で、安定な固定化酵素が得られない。
(2)イオン結合法に比べコストが非常に安い。イオン結合法では¥15,000/reactorに対し、架橋法では¥3,000/reactor程度のコストである。
(3)一般には架橋法は過激な固定化条件を必要とするが、本発明が採用する特定の固定化法は架橋法の中では酵素活性の損失が少ない、すなわち70%維持できるという利点がある。これはイオン結合法(10%の活性を固定化)と比較して大である。
(4)速い流速が得られるという利点がある。
(5)pHの変化がない。この点はイオン結合法より優れる。
(6)高い温度で使用できる。この点はイオン結合法より優れる。
(7)長期間の使用が可能で粒子が崩れたり酵素が脱離することがない。この点はイオン結合法より優れる。
(8)固定化菌体を用いた場合でも安定に反応する。この点はイオン結合法では不可能である。
【0018】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【0019】
参考例
(従来の固定化酵素の作製例)
I 従来の固定化(イオン結合法)
(1)菌体200gを破砕し粗酵素液を得る。
(2)1M塩化マンガンを全量の1%添加した後30分間撹拌する。
(3)ポリエチレングリコール(PEG)6000を終濃度10%になるように徐々に加え撹拌する。
(4)生じた沈殿を遠心分離(12000rpm、4℃、30min)により除去し、さらに終濃度が20%になるようにPEGを徐々に添加する。
(5)生じた沈殿を遠心分離(12000rpm、4℃、30min)により回収後、0.05Mグリシン‐NaOH緩衝液に懸濁して部分精製酵素を得る。
(6)100gの陰イオン交換樹脂キトパールBCW2503(富士紡績社製)を0.05Mグリシン‐NaOH緩衝液(pH9)で洗浄した後、同緩衝液中で一晩浸し平衡化する。
(7)緩衝液を除き樹脂に部分精製酵素を加え、室温で固定化する。随時サンプリングを行い、上清のタンパク量の減少を確認し、固定化を確認する。
以上の条件で活性回収率は約80%が得られる。
【0020】
II 従来の固定化酵素の評価
一般的なイオン交換法による酵素の固定化は、活性の最大で約80%を固定化できる。しかし、このイオン交換法をL−ラムノースイソメラーゼに用いると活性の約10%しか固定化できないという大きな問題があった。しかも、固定化酵素を用いたD−アロースの生産活性は約2週間のバイオリアクターの反応で活性はほぼ0となりD−アロースの連続生産には使用できない。
従来のイオン交換法による酵素の固定化は、固定化できる活性が低いこと、及びバイオリアクターとして連続運転することが不可能であった。
【0021】
実施例
(本発明の固定化酵素の作製例)
I 新規の固定化(グルタルアルデヒド−リジン架橋法)
(A) 酵素結晶の固定化
(1)菌体10gを破砕し粗酵素液を得る。
(2)4−5.5%のPEG20000を撹拌しながら徐々に添加し酵素の均一な結晶が得られるまで静置する(24−48時間)。
(3)結晶を生じた粗酵素液に12.5%グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度1%になるように添加し30分間撹拌した後、3時間以上放置する。
(4)20%L−リジンを終濃度1%になるように添加し30分間撹拌し、3時間以上放置する。
(5)遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐NaOH緩衝液で2回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約70%が得られる。
【0022】
(B)微生物菌体の固定化
(1)菌体10gを適量のリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁させる。
(2)結晶を生じた粗酵素液に12.5%グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度1%になるように添加し30分間撹拌した後、3時間以上放置する。
(3)20%L−リジンを終濃度1%になるように添加し30分間撹拌し、3時間以上放置する。
(4)遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐NaOH緩衝液で2回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約70%が得られる。
【0023】
II 本発明の固定化酵素の評価
(A)固定化酵素結晶、(B)固定化微生物菌体とも、活性の約70%を固定化することができ、1ヶ月以上バイオリアクターに使用できる。すなわち、L−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに、従来最も広く用いられているイオン交換法と比較するとD−アロースなど希少糖の生産法として大きな改善が進んだ。
イオン交換法による固定化法では、活性は約10%しか固定化できず、しかもバイオリアクターを用いるD−アロースの生産には約2週間のみの使用で活性がなくなった。
一方、本発明による固定化法では活性の約70%が固定化することが可能であり、50%D−プシコースをpH9グリシン緩衝液中でのバイオリアクター反応において一ヶ月以上の安定した反応を行うことが可能であった。また、本発明によるL−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに粒の大きさが従来法に比べて大きいため、バイオリアクターの送液時の圧力が低いものであった。これらのことよりD−アロースをD−プシコースから連続生産が可能となった。
【0024】
【発明の効果】
産業的に希少糖を大量に生産するのに有効に利用できる安定な、高活性の固定化固定化L−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。
低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質の流速が速い固定化L−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。
Claims (6)
- L−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、L−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを固定化することを特徴とする方法。
- L−ラムノースイソメラーゼをポリエチレングリコールを用いて結晶化させる請求項1のL−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
- L−ラムノースイソメラーゼの結晶をまず分子内架橋させ、ある程度分子内架橋が進行した段階で、L−ラムノースイソメラーゼ同士を分子間架橋させる請求項1または2のL−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
- L−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするL−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
- 請求項1ないし4のいずれかの方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液時の圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化L−ラムノースイソメラーゼ。
- 請求項6の固定化L−ラムノースイソメラーゼのD−アロースの連続製造方法への使用。
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JP2003095827A JP2004298105A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | L−ラムノースイソメラーゼの固定化法 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109536479A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-03-29 | 清华大学 | 一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法 |
WO2022114207A1 (ja) * | 2020-11-30 | 2022-06-02 | 国立大学法人香川大学 | 新規l-ラムノースイソメラーゼ |
-
2003
- 2003-03-31 JP JP2003095827A patent/JP2004298105A/ja active Pending
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WO2022114207A1 (ja) * | 2020-11-30 | 2022-06-02 | 国立大学法人香川大学 | 新規l-ラムノースイソメラーゼ |
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