SU1232261A1 - Способ получени ДНК-полимеразы- @ из дер печени крыс - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к медицине, в частности к биохимическим способам очистки белков.

Цель изобретени  - упрощение способа и стабилизаци  ползгчаемого, препарата за счет сокращени  количества этапов и присутствии соли высокой концентрации.

Способ осуществл етс  следующим образом.

Получают хроматин из печени крыс. Экстракт хроматина используетс  дл  извлечени  целевого продукта. Очищают целевой продукт от примеси нуклеиновых кислот путем хроматографии на колонне с ДЕАЕ сефадексом А-25 в 0,3 М NaCl. Очищают от примесных белков: фракционируют белки сульфатом аммони ; .очищают целевой продукт от белков путем гель-Фильтрации на сефадексе G-75; очищают целевой продукт от примесей нуклеаз с помощью обработки элюата гидроксилапатитом.

П Р и м е р. Ткань печени крыс любой породы, пола и возраста (60 г) измельчают ножницами и гомогенизируют в стандартном лабораторном (отечественном) гомогенизаторе при 8000 q в 560 мл среды, состава:

руют при 6000q 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представл ет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогени5 заторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 тМ трис-НС1, рН 8,0.

Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС1, 10 М

10 трис-HCl, рН 8,0 в гомогенизаторе Даунса. Затем центрифугируют при eOOOq 10 мин. Осадок отбрасывают. Супернатант используют дл  дальнейшей очистки целевого продукта из матина.-Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М NaCl, ЮгаМ трис-HCl, рН 8,0. Экстрат хрома20 тина пропускают через колонку. При этом отбрасывают элюирующий буфер, составл ющий свободный объем колонки и равный 1/3 объема набивки. После этого собирают объем злюата, рав25 ный объему нанесенного препарата. К препарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-25, добавл ют при смешивании за 30 мин сульфат аммони  до 50%-ного насьш1ени .

0,25 М сахароза, 5 шМ трис-HCl,рН7,8; 30 Перемешивают 30 мин, после чего цент35

40

1 тМ ЭДТА и 3 тМ MgCl,после чего фильтруют через 8 слоев марли. Получают 600 мл гомогената. Гомоге- нат центрифугируют при 2000 q 15 мин Супернатант отбрасывают. Осадок  дер один раз промывают в 200 мл той же среды. Отмывка состоит в следующем. Осадок ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в слабо притертом гомогенизаторе Даунса (стекЛо/стекло). Затем центрифугируют при 2000 q 5 мин Промывную среду отбрасывают. Осадок ресуспендируют тем же способом в 50 мл среды дл  гомогенизации.

К ресуспендированным в среде дл  гомогенизации  драм прибавл ют при Посто нном перемешивании стекл нной палочкой равный объем 1%-ного раствора тритона Х-100 в той же среде и осторсвкно (чтобы не разрушались  дра) 50 перемешивают в течение 1 мин. Затем центрифугируют при 6000 q 10 мин и Супернатант отбрасывают.

Осадок ресуспендируют в 100 мл среды состава: 1%-ный тритон Х-100, ЮшМ трис-HCl, рН 8,0; 2тМ ЭДТА и гомогенизируют 15 раз в гомогенизаторе Даунса, после чего центрифугирифугируют 10 мин при 6000 q и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавл ют сульфат аммони  до концентрации 80% насьш1ени  и оставл ют до утра. Затем центрифугируют при 6000q 30 мин. Осадок раствор ют в 20 мл буфера состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр Сынпор-2. Осадок с фильтра объедин ют с осадком после центрифугировани .

Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300-) уравновешивают буфером состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, j)H 8,0. Полученный осадок нанос т на колонку и элюируют со скоростью 50-30 мл/ч. Отбрасьюают первые 45% элюата (% от общего объема колонки) и собирают последующие 15% элюата. Стадию вьтолн ют без определени  ферментативной активности. Элюат диа- 55 лизируют от NaCl к буферу состава: 20idi KHjP04, 10%-ный глицерин, рН7,5.

К отдиализовакному элюату в стакане добавл ют 10-15 мл гидроксилапа45

руют при 6000q 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представл ет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогенизаторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 тМ трис-НС1, рН 8,0.

Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС1, 10 М

трис-HCl, рН 8,0 в гомогенизаторе Даунса. Затем центрифугируют при eOOOq 10 мин. Осадок отбрасывают. Супернатант используют дл  дальнейшей очистки целевого продукта из хроматина .-Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М NaCl, ЮгаМ трис-HCl, рН 8,0. Экстрат хроматина пропускают через колонку. При этом отбрасывают элюирующий буфер, составл ющий свободный объем колонки и равный 1/3 объема набивки. После этого собирают объем злюата, равный объему нанесенного препарата. К препарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-25, добавл ют при смешивании за 30 мин сульфат аммони  до 50%-ного насьш1ени .

Перемешивают 30 мин, после чего цент

рифугируют 10 мин при 6000 q и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавл ют сульфат аммони  до концентрации 80% насьш1ени  и оставл ют до утра. Затем центрифугируют при 6000q 30 мин. Осадок раствор ют в 20 мл буфера состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр Сынпор-2. Осадок с фильтра объедин ют с осадком после центрифугировани .

Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300-) уравновешивают буфером состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, j)H 8,0. Полученный осадок нанос т на колонку и элюируют со скоростью 50-30 мл/ч. Отбрасьюают первые 45% элюата (% от общего объема колонки) и собирают последующие 15% элюата. Стадию вьтолн ют без определени  ферментативной активности. Элюат диа- лизируют от NaCl к буферу состава: 20idi KHjP04, 10%-ный глицерин, рН7,5.

К отдиализовакному элюату в стакане добавл ют 10-15 мл гидроксилапа

тита и в .течение 30 мин перемешивают Затем центрифугируют при 6000 q 5 мин Супернатант отбрасывают. Осадок ре- суспендируют в 25 мл буфера состава: 70тМ , 10%-ный глицерин,рН 7,5 10.мин перемешивают и центрифугируют при 6000 q 5 мин. Супернатант отбрасывают . Осадок отмывают таким же образом , тем же буфером еще два раза. При этом р-полимераза не смьюаетс  с гидроксилапатита. Осадок после третьей отмывки ресуспейдирзпот в 20 мл буфера состава: ЗООшМ KHjPO, 10%-ный глицерин, рН 7,5; перемешивают 30 мин, центрифугируют при 6000 q 5 мин. Супернатант представл ет собой препарат р-полимеразы.

Фермент хран т в 50%-ном глицерине , 0,1 М NaCl, 0,05mM трис-HCl, йН 8,0 при 20 С. Препарат сохран ет свою активность в течение 6 мес.Услови  хранени  значительно проще (тем- пература 20 С, отсутствуют растворы, загр зн ющие препарат).

В таблице представлены результа- ты очистки целевого продукта на разГомогенат печени 600

Экстракт хроматина

в 0,3 М NaCl 90

Сульфат аммони  50-80%-ного на- сьщен  20

26 15600 0,0075 117

90 1,1

2,5 50 0,375

Составитель М.Позн к Редактор Е. Папц Техред И.Попович Корректор Л. Пштипенко

Заказ 2722/6 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

личнь1х стади х. Из сопоставлени  значений первой и последней стадий видно , что активность возрастает с 0,0075 до 50,0 ед.на 1 мг белка. Выход целевого продукта по общей ферментативной активности составл ет 80%.

За 1 единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего вкл1рченив в ДНК 1 нТ моль общего НТФ за t ч при 37 С в оптимальных услови х инкубации.

В известном способе достигаетс  очистка целевого продукта в 800 раз по сравнению с  драми из гомогената печени.

Упрощение способа происходит за счет сокращени  количества этапов (известный способ - 10, предлагае- - 7), времени выделени  конечного продукта в результате отсутстви  длительных этапов диализа и многочасового высокоскоростного центрифугировани .

90 1,1

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ- p ИЗ ЯДЕР ПЕЧЕНИ КРЫС с помощью хроматографии и центрифугиро- вания, отличающийся тем, что, с целью упрощения и стабилизации получаемого препарата, ядра печени крыс обрабатываются 1%-ным раствором тритона Х-100, экстрагируют 0,.3 М раствором хлористого натрия, очищают от примесей хроматографией на ДЕАЕ сефадексе А-25 и осаждением сульфатом аммония при 50%-ном насыщении, высаливают сульфатом аммония при 80%-ном насыщении, подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-75 и обрабатывают гидроксилапатитом. <g £

   0Э