Procédé pour la préparation de la streptomycine.
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Les préparations A, Bl et Al, aussi bien que la préparation B, sont aptes à fournir, après traitement; subséquent, de la strepto mycine sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure.
La nature de l'acide employé ne doit pas avoir un effet qualitatif 'sur l'extraction, et des acides inorganiques (entre autre l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique) et. des acides organiques (par exemple l'acide citri que) peuvent être utilisés; cependant, les acides citrique et sulfurique (ce dernier spé cialement) sont préférés, parce qu'ils facilitent la filtration des extraits. L'extraction à l'acide de la streptomycine peut aussi être effectuée à diverses valeurs de pH, l'extraction à -Lus pH dé 5,6 ou 1,1, par exemple, ayant fuse pleine efficacité.
En général, l'activité de l'extrait augmente au fur et à mesure de la diminution du pH, l'extraction à un pH d'environ 1 à 3 (spécialement à un pH d'environ 1,5-2) étant préférée.
La durée requise pour l'extraction de la streptomycine à partir des solides dépend de la température de l'extraction; par exemple, en général, plus la température est élevée, moins il faut de temps. Ainsi, l'activité obtenue par extraction à<B>500</B> C pendant une heure est presque deux fois celle obtenue par extraction à la température ambiante pendant 18 heures. Une courte extraction (par exemple d'environ 1/2 à 3 heures) à une température relativement élevée (par exemple d'environ 45 à<B>550</B> C) est préférée du point de vue du rendement en produit antibiotique.
Les exemples suivants vont illustrer l'in vention. L'unité de potentiel mentionnée est définie par la quantité de streptomycine né cessaire pour inhiber complètement la multi plication de 500-1000 cellules de K. pneu- moniae, dans des conditions standardisées et dans un milieu de culture contenant 111/o de tryptone.
Exemple <I>1:</I> 1800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5% de farine de soja, 1,0% de dextrose, 0,5 % d'extrait de viande et 0,
5 % de chlorure de sodium sont placés dans un bac de 6000 litres et ensemencés avec des spores d'Actinomyces griseus, et le milieu est soumis à une incubation à<B>250</B> C sous une pression de 50 à 75 cm (air passant à travers le milieu), tout en agitant (à une vitesse de 130 t/min.).
Au bout de 120 heures d'incubation, la cul ture (qui a un<B>pH</B> de 7,0 et un potentiel de 120 unités/ml.) est ajustée à un pH de 3,5 en ajoutant de l'acide chlorhydrique à 37%, et la culture acidifiée est agitée pendant mie nouvelle période de 48 heures à<B>50</B> C (sans aération). La culture (dont le potentiel a été élevé, par ce traitement, à 173,5 unités/ml.) est centrifugée; la fraction qui surnage (I) est utilisée pour en extraire la streptomycine.
D'autre part, le sédiment (mycelium, spores et autres solides dans le milieu) recueilli est lavé deux fois à l'eau distillée par centrifu gation. Les solides lavés sont alors traités avec de l'acide chlorhydrique N/10 (qui a été réglé à un pH 2,0 avec de l'hydroxyde de sodium) en secouant le mélange pendant 16 heures à la température ambiante (24o C); l'extrait (II) est séparé par centrifugation. L'extrac tion récupère 20 unités d'activité par mg de solides secs (séchés à<B>1000</B> C) et une nouvelle extraction portant, sur les solides dans les mêmes conditions (extrait III) récupère en core 5 unités supplémentairés par mg. de so lides secs.
Ces extraits (II et III) peuvent être traités à part pour en récupérer la strepto mycine, ou ils peuvent être combinés avec la fraction I obtenue à partir de la même cul ture. Ces liquides peuvent encore être traités selon les méthodes de purification décrites ci-après, pour obtenir la streptomycine sous une forme très purifiée ou sensiblement pure.
Le liquide contenant la streptomycine est. neutralisé, et celle-ci est alors purifiée comme suit 1 Traitement de l'extrait neutralisé avec. un charbon activé, qui adsorbe sélectivement la streptomycine.
2 Elution de la streptomycine du char bon, avec de l'acide chlorhydrique dilué, à en viron<B>700</B> C. 3 Traitement de l'Éluat avec de l'acide phosphotungstique.
4 Décomposition fractionnée du phospho- t.ungstate précipité avec de l'hydroxyde de baryum.
La solution de streptomycine partiellement purifiée ainsi obtenue (ou le solide obtenu à partir de cette solution par séchage par con gélation) peut être utilisée comme agent chi- miothérapeutique sans nouvelle purification, ou peut être purifiée à nouveau comme indiqué ci-après. En utilisant un extrait ayant un po tentiel de 220 unités/ml., on peut obtenir un produit séché par congélation ayant un poten tiel de 345 unités/mg.
Ce produit partiellement purifié peut être purifié à nouveau par: 1 Réaction du produit. avec de l'acide pi crique dans une solution aqueuse.
2 Dissolution dans l'acétone du picrate résultant de la réaction.
3 Passage de la solution à travers une co lonne d'adsorption chromatographique à alu mine activée.
4 Elut,ion des parties riches en strepto mycine du chromatogramme avec de l'acétone aqueux.
5 Décomposition de 1.'éluat avec de l'acide sulfurique.
6 Séparation de l'acétone et de l'acide pi crique du sulfate de streptomycine.
On peut ainsi préparer, à partir de la strepto mycine obtenue conformément à l'invention, un sulfate de streptomycine fortement purifié, ayant un potentiel de 490 unités/mg; ce sul fate peut être utilisé comme agent chimio- thérapeutique sans nouvelle purification, ou transformé en base libre en vue de son emploi, ou encore il peut être purifié à nouveau comme indiqué ci-après.
De ce sulfate fortement purifié, on peut obtenir un dérivé cristallisé par réaction avec un sel de Reinecke dans une solution aqueuse et, par récupération, du Reineckate pur cris tallisé (groupes de folioles fines ayant un po tentiel de 240 unités/mg et se décomposant à 159-1610C [non corrigé] ).
Une analyse du Reineckate cristallisé (après séchage dans le vide à 700C pendant deux heures) révèle la présence de 27,09% de carbone, 4,65% d'hy- drogène, 21,431)/o d'azote, 20,821/o de soufre et 8,53% de chrome.
De ce Reineckate cristallisé pur, on peut obtenir la base sensiblement pure et les déri vés de la streptomycine par 1 Décomposition du Reineekate avec du sulfate d'argent en solution aqueuse.
2 Séparation du Reineckate d'argent pré cipité.
3 Récupération du sulfate de strepto mycine sensiblement pur résultant de la ré action.
Le sulfate sensiblement pur ainsi obtenu peut être utilisé comme agent chimiothérapeu- tique, ou peut être transformé en base libre sensiblement, pure, ou peut encore être trans formé en divers autres dérivés sensiblement purs de la streptomycine.
<I>Exemple 2:</I> 1800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5% de farine de soja, 1,0% de dextrose et 0,
5% de chlorure de sodium sont placés dans un bac de 6000 litres et ensemencés avec un mélange de spores et de mycelium d'Actino- myces griseus, puis le milieu ensemencé est, soumis à une incubation à 25 C sous une pres sion de 50-75 cm (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de 130 t/min.).
Au bout de 100 heures d'incubation, une portion de<B>100</B> ml. de culture (qui a un po tentiel de 27,6 unités/ml.) est ajustée à un px de 3,5, en ajoutant' de l'acide chlorhydrique à 371/o, et la. culture acidifiée est agitée pen dant 24 heures à 40 C. La culture (dont le potentiel est élevé, par ce traitement, à 38,6 unités/ml.) est centrifugée, et la fraction qui surnage est utilisée pour en extraire la strepto mycine.
Le reste de la culture est centrifugé. La fraction qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine. Le sédiment est recueilli et lavé avec deux portions d'un litre d'eau distillée, par centrifugation. (Les eaux de lavages ont. un potentiel inférieur à 4,5 uni- tés/ml., et peuvent être écartés pour cette rai son.) On ajoute un litre d'eau distillée au sédiment lavé, et le mélange est agité pour for mer une bouillie lourde homogène, contenant environ 3,7 mg de solides par ml.
Une portion de 100 ml. de la bouillie lourde ainsi obtenue est ajustée à un pH de 0,8 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 5N, et le mélange est agité à la température ambiante (240 C) pendant environ 16 heures (le<B>pli</B> étant, alors 2,4). Le mélange est ensuite cen- trifugé pour obtenir un sédiment et une frac tion qui surnage (dont le potèntiel est de 88 Lmités/ml.) ; la fraction qui surnage est utilisée pour en extraire la streptomycine.
Dans des conditions, par ailleurs identi ques, des extractions à des pH de 5,0 à 5,4, 3,1 à 3,9 et 1,1 à 1,22 donnent des fractions qui surnagent (extraits) dont le potentiel est de 35-59, 67 et 72 unités/ml. respectivement.
Le sédiment obtenu comme indiqué ci-des sus est mis à nouveau en suspension dans une quantité d'eau distillée suffisante pour rame ner son vol-Lune à 100 ml.; la suspension est ajustée à im pg de 2,55 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 5N, puis est agitée pendant 16 heures à la température ambiante.
La por tion qui surnage, obtenue par centrifugation, a un potentiel de 35,5 unités/ml. et peut être combinée avec l'extrait obtenu dans le para graphe précédent, ou être traitée pour elle- même. Les extraits combinés ont une activité totale de 6,175 unités, représentant une récu pération de 33,1 unités par mg de solides sé chés extraits.
La seconde extraction peut aussi être effec tuée à un pg de 5,62 ou 1,88 et, dans ces cas, les portions qui surnagent (extraits) ont des potentiels respectivement de 15,2 et 23,9 unités/ml.
D'autre part, une portion de 75 ml. de la bouillie lourde mentionnée puis haut est ajus tée à -un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique- 5N, et le mélange est agité à 500 C pendant une heure. Le mélange est alors centrifugé; la portion qui surnage, dont le potentiel est de 98,5 unités/ml. (représentant une récupéra- Lion de 26,5 unités par mg des solides séchés), est traitée pour en récupérer la streptomycine.
Dans des conditions par ailleurs identi ques, l'extraction pendant 18 heures à 40 C et <B>370</B> C donne des portions qui surnagent (extraits) titrant<B>31,0</B> et 41,4 unités/ml. res pectivement.
Enfin, une portion de 50 ml. de ladite bouillie lourde est ajustée à un pH de 2,15 avec de l'acide sulfurique<B>5N,</B> et le mélange est. agité à<B>500</B> C pendant. une heure. Le mélange est alors centrifugé, et la portion claire qui surnage (extrait), dont le potentiel est de 96,2 unités/ml. (représentant une récupération de 25,8 unités par mg de solides séchés), est traitée pour en récupérer la streptomycine.
Dans des conditions par ailleurs identi- ques, mais en utilisant, 40 % d'acide citrique à la place de l'acide sulfurique<B>5N,</B> l'extrac tion donne une portion qui surnage ayant un potentiel de 93,6 unités/ml.
Exemple <I>3:</I> 3600 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5% de farine de soja, 1,0% de dextrose, 0,25% d'extrait de viande et 0,51/o de chlo rure de sodium sont placés dans -Lui bac de 6000 litres, et ensemencés avec un mélange de spores et de mycélium d'Actinomyces griseus; le milieu ensemencé est soumis à une incuba tion à 250 C sous une pression de<B>50-75</B> cm (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à 130 t/min.).
Au bout de 120 heures d'incubation, la cul ture (qui a un potentiel de 55 unités/ml.) est ajustée à un p$ de 1,5 en ajoutant de l'acide sulfurique à 1000%; on. ajoute 4% de terre de diatomées et 1% d'un charbon activé; ensuite le mélange est agité à la température ambiante pendant une demi-heure à une heure.
La cul ture (dont le potentiel s'est élevé, par ce trai- tement, d'environ 60 à 70%) est centrifugée; la portion qui surnage est traitée pour en récupérer la streptomycine.
Lors de l'extraction avec de l'acide chlor hydrique à -Lui pA inférieur à 3, la portion qui surnage (extrait) peut être extrêmement trou ble; dans ce cas, l'extrait peut être clarifié en ajustant son pH à environ 3,5, en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 5 N et en séparant par filtration le précipité lourd et floconneux qui en résulte (des protéines de soja probable- i ent) .