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" Procédé pour la préparation de.produits antibiotiques "
L'invention a trait à un procédé pour la préparation de produits antibiotiques.
Il a déjà été établi que :
1 - Un produit à pouvoir antibiotique, appelé streptomycine, existe dans un liquide de culture obtenu lorsque l'organisme Actinomyces griseus est cultivé dans ou sur certains agents liquides (Schatz, Bugie & Waksman, Proc. Soc.
Exp. Biol. & Med., 1944, 55,66 ); 210 Un second facteur antibiotique, soluble dans l'éther, existe largement dans le mycelium de l'organisme (Schatz & Waksman, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 1944, 57, 244).
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Il a été actuellement établi que les solides (Les mycelia, spores et autres solides susceptibles de sédimentation) d'une culture de Actinomyces griseus qui a produit de la streptomycine contiennent un ou des produits antibiotiques, analogues à la streptomycine, fortement actifs et insolubles dans l'éther (à pH 2,0 ou pH 8,8).
L'invention a pour objet de préparer un produit antibiotique, analogue à la streptomycine, fortement actif et insoluble dans l'éther, et d'indiquer les modes de préparation du produit; un autre objet de l'invention réside dans l'indication de procédés pour augmenter l'activité antibiotique de liquides de culture contenant de la streptomycine.
Les procédés faisant l'objet de l'invention consistent essentiellement à soumettre les solides d'une culture de Actinomyces griseus, qui a produit de la streptomycine, à une extraction avec un acide aqueux, et à récupérer le produit antibiotique dans l'extrait. (par "culture de Actinomyces griseus qui a produit de la streptomycine" il faut entendre, bien entendu, la culture obtenue en traitant l'Actimomyces griseus dans des conditions et dans un agent appropriés pour la production de streptomycine ).
L'extraction des solides peut être effectuée soit lorsqu'ils sont encore dans la culture, soit après leur séparation de la culture liquide, soit à ces deux stades.
Ainsi l'extraction peut être effectuée en acidifiant la culture (en totalité), de préférence après qu'a été atteinte la production sensiblement maxima de streptomycine, et en amenant en contact intime les constituants solides et liquides de la culture. Dans ce cas, le produit antibiotique dans les solides est extrait dans le
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liquide contenant la streptomycine; puis, lors de la séparation des solides, on.obtient un liquide de culture (A) contenant de la streptomycine et à activité augmentée.
Suivant une alternative, les solides sont d'abord séparés du liquide de culture, par exemple par centrifugation ou filtration, auquel cas ce qui surnage ou filtrat (B) correspond au liquide de culture contenant de la streptomycine et obtenu dans des conditions connues avant l'invention; puis les solides séparés sont extraits avec un acide aqueux ; cet extrait (B1), peut être obtenu un produit antibiotique fortement actif.
Suivant une autre alternative, les solides sont d'abord extraits lorsqu'ils se trouvent encore dans la culture, puis sont séparés du liquide de culture (A) à activité augmentée, et les solides séparés sont traités avec un aide aqueux pour obtenir un extrait (A1) contenant un produit antibiotique fortement actif.
Les préparations A, B1, et A1, aussi bien que la préparation B, peuvent être utilisées ou être traitées ultérieurement comme un liquide de culture contenant de la streptomycine, c'est-à-dire être traitées pour obtenir, sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure,de la streptomycine et/ou un produit antibiotique analogue à la streptomycine, fortemant actif et insoluble dans l'éther.
La nature de l'acide employé ne doit pas avoir un effet qualitatif sur l'extraction, et des acides inorgani- ques (entre autres l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique) et des acides organiques (par exemple l'acide citrique) sont susceptibles d'être utilisés; cependant, les acides citrique et sulfurique (ce dernier spécialement) sont préférés, parce qu'ils facilitent la filtration des extraits.
L'extraction à l'acide du produit antibioti-
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que peut aussi être effectuée à diverses valeurs de pH, l'extraction à un pH de 5, 6 ou 1, 1, par exemple, ayant une pleine efficacité .En général, l'activité de l'extrait augmente au fur et à mesure de la diminu- tion du pH, l'extraction à un pH d'environ 1 à 3 (spécia- lement à un pH d'environ 1, 5-2) étant préférée.
La durée requise pour l'extraction, des solides, du produit antibiotique dépend de la température de l'extraction; par exemple, en général, plus la température est élevée, moins il faut de temps. Ainsi, l'activité obtenue par extraction à 50 C pendant une heure est presque deux fois celle obtenue par extraction, à la température ambiante pendant 18 heures . ?ne courte extraction (par exemple d'environ 1/2 à 3 heures) à une température relativement élevée (pas exemple d'environ 45 à 55 C) est préférée du point de vue du rendement du produit antibiotique .
Les exemples suivants vont illustrer l'invention (l'unité de potentiel mentionnée dérivant de la quantité de streptomycine nécessaire pour provoquer complètement la multiplication de 500-1000 cellules de K. pneumo- niae se cultivant dans des conditions standardisées dans un milieu de culture contenait 1% de tryptone ):
EXEMPLE 1 a) 1800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja, 1,0 % de dextrose, 0,5 % d'extrait de viande et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6000 litres sont ensemencés avec des spores de
Actinomyces griseus, et le milieu est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 50 à 75 cm (air passant à travers le milieu), tout en agitant (à une vitesse de 130 rpm). b) Au bout de 120 heures d'incubation, la culture (qui a un pH de 7,0 et un potentiel de 120 unités/ml.)
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est réglée à un pH 3,5 en ajoutant 37% d'acide chlorhydrique ,et la culture acidifiée est agitée pendant une nouvelle période de 48 heures à 5 C (sans aération).
La culture (dont le potentiel a été élevé, par ce traitement, à 173,5 unités/ml.) est centrifugée ; ce qui surnage (I) est utilisé ou est traité à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 2 a) Le sédiment (mycelium, spores et autres solides dans le milieu) recuelli dans l'exemple 1 (b) est lavé deux fois à l'eau distillée par centrifugation. Les solides lavés sont alors extraits avec de l'acide chlorhydrique N/10 (qui a été réglé à un pH 2,0 avec de l'hydrate de sodium) en secouant le mélange pendant 16 heures à la température ambiante (24 C); et l'extrait (II) est séparé .par centrifugation. L'extraction récupère 20 unités d'activité par mg. de solides secs (séchés à 100 C); et une nouvelle extraction des solides dans les mêmes conditions (extrait III) récupère 5 unités supplémentaires par mg. de solides secs.
Ces extraits (II et III) peuvent être utilisés ou traités à nouveau comme des liquides de culture contenant de la streptomycine; ou ils peuvent, être combinés avec ce qui surnage (I) obtenu de la même culture (voir exemple 1 b) en vue de l'emploi ou'd'un nouveau traitement comme un liquide de culture contenant de la streptomycine .
Ces liquides peuvent encore être traités par le procédé de purification décrit dans le paragraphe suivant, pour obtenir, sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure, une préparation analogue à la streptomycine . b) Un extrait tel que II obtenu dans le paragraphe précédent est neutralisé, et le produit antibiotique analogue à la streptomycine est alors purifié par :
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1 - traitement de l'extrait neutralisé avec un charbon activé, qui adsorbe sélectivement le produit antibiotique ;
2 - élution, du charbon, du produit antibiotique avec de l'acide chlorhydrique dilué à environ 70 C;
3 - traitement de l'éluat avec de l'acide phosphotunsgtique ;
4 - décomposition fractionnée du phosphotungstate précipité avec de l'hydrate de baryum.
La solution ainsi obtenue du produit antibiotique analogue à la streptomycine et partiellement purifié (ou le solide obtenu de cette solution par séchage à congélation) peut être utilisée comme agent chimiothérapeutique sans nouvelle purification, ou peut être purifiée à nouveau comme indiqué ci-après. En utilisant un extrait ayant un potentiel de 220 unités/ml, on peut obtenir un produit séché à congélation ayant un potentiel de 345 unités /mg.
Ce produit partiellement purifié peut être purifié à nouveau par
1 - réaction du produit avec de l'acide picrique dans une solution aqueuse,
2 - dissolution dans l'acétone du picrate résultant de la réaction,
3 - passage de la solution à travers une colonne d'adsorption chromatographique à alumine activée,
4 - élution des parties riches en substance antibiotique du chromatogramme avec de l'acétone aqueux,
5 - décomposition de l'éluat avec de l'acide sulfurique,
6 - séparation de l'acétone et de l'acide picrique du sulfate du produit antibiotique formé.
On peut ainsi obtenir un sulfate fortement purifié d'un produit antibiotique analogue à la streptomycine
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ayant un potentiel de 490 unités/mg.; ce sulfate peut être utilisé - ou transformé dans la base libre en vue de son emploi - comme agent chimiothérapeutique sans nouvelle purification ,ou il peut être purifié à nouveau comme indiqué ci-après.
De ce sulfate fortement purifié du produit antibiotique, un dérivé cristallisé peut être obtenu par réaction avec un sel de Reinecke dans une solution aqueuse, et par récupération du Reineckate pur cristallisé (groupes de folioles fines ayant un potentiel de 240 unités/mg et se décomposant à 159-161 C sans correction) . Une analyse du Reineckate cristallisé (après séchage dans le vide à 70 C pendant deux heures) révèle la présence de 27,09 % de carbone, 4,65 % d'hydrogène, 21,43 % d'azote, 20,82 % de soufre et 8,53 % de chrome.
De ce Reineckate cristallisé pur , on peut obtenir la base sensiblement pure et les dérivés du produit antibiotique analogue à la streptomycine par :
1 - décomposition du Reineckate avec du sulfate d'argent en solution aqueuse;
2 - enlèvement du Reineckate d'argent précipité ;
3 - récupération du sulfate sensiblement pur du produit antibiotique analegge à la streptomycine, sulfate résultant de la réaction.
Le sulfate sensiblement pur ainsi obtenu peut être utilisé comme agent chimiothérapeutique, ou peut être transformé en la base libre sensiblement pure pour son emploi comme agent chimiothérapeutique, ou peut encore être transformé en divers autres dérivés sensiblement purs du produit antibiotique analogue à la streptomycine.
EXEMPLE 3 a) 1800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5 %
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de farine de soja, 1,0 % de dextrose et 8,5 % de chlorure de sodium dàns un bac de 6000 litres sont ensemencés avec un mélange de spores et de mycelium de Actinomyces griseus, et le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 50-75 cm (de l'air passant à travers le milieu), tout en agitant (à une vitesse de
130 rpm).
Au bout de 100,heures d'incubation, une portion de
100 ml. de la culture (qui a un potentiel de 27,6 unités/ml. est réglée à un pH de 3,5 en ajoutant 37 % d'acide chlorhy- drique ,et la culture acidifiée est agitée pendant 24 heures à 4 C. La culture (dont le potentiel est élevé, par ce traitement, à 38,6 unités/ml) est centrifugée, et ce qui surnage est utilisé ou subit un nouveau traitement comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 4 a) La culture décrite dans l'exemple 3 (a), après incubation pendant 100 heures et enlèvement de la portion de 100 ml mentionnée ci-dessus dans le paragraphe (b) de l'exemple 3, est centrifugée . (ce qui surnage est utilisé ou est traité à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine ). Le sédiment est recueilli et lavé avec deux portions d' 1 litre d'eau distillée par centrifugation. (Ces lavages ont un potentiel inférieur à 4,5 unités/ml., et peuvent être écartés pour;cette rai- son).
Au sédiment lavé, est ajouté 1 litre d'eau distillée, et le mélange est agité pour former une bouillie lourde homogène contenant environ 3,7mg. de solides par ml. b) Une portion de 100 ml. de la bouillie obtenue dans le paragraphe précédent est réglée à un pH de 0,8 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 5N, et le mélange est agité à la température ambiante (24 C) pendant environ 16 heures (le pH étant alors 2,4). Le mélange est ensuite
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centrifugé pour obtenir un sédiment. et une partie qui surnage (dont le potentiel est de 88 unités/ml.) ce qui surnage est utilisé ou traité à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
(Dans des conditions autrement identiques, des extractions à des pH de 5,0-5, 4, 3,1-3,9 et I,I- 1,22 donnent des parties qui surnagent (extraits) de 35-59,67 et 72 unités/ml. respectivement). c) Le sédiment obtenu dans le paragraphe précédent est mis à nouveau en suspension dans une quantité d'eau distillée suffisante pour ramener son volume à 100 ml.; la suspension est réglée à un pH 2,55 en ajoutant de l'acide chlorhydrique 5N, puis est agité pendant 16 heures à la température ambiante . La portion qui surnage, obtenue par centrifugation, a un potentiel de 35,5 unités/ml., et peut être combinée avec l'extrait obtenu dans le paragraphe précédent , ou être utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
Les extraits combinés ont une activité totale de 6,175 unités,représentant une récupération de 33,1 unités par mg. de solides séchés extraits.
(La seconde extraction peut aussi être effectuée à un pH de 5,62 ou 1,88, et dans ces cas les portions qui surnageant (extraits) ont des potentiels respectivement de 15,2 et 23,9 unités /ml.)
EXEMPLE 5
Une portion de 75 ml. de la houille obtenue dans l'exemple 4(a) est réglée à un pH 2 avec de l'acide chlorhydrique 5N, et le mélange est agité à 50 C pendant une heure. Le mélange est alors centrifugé ; portion qui surnage, dont le potentiel est de 98,5 unités/ml. (représentant une récupération de 26,5 unités par mg. des solides séchés), est utilisée ou traitée à nouveau comme un liqui- de-culture contenant de la streptomycine.
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(Dans des conditions autrement identiques, l'extraction pendant 18 heures à 4 C et 37 C donne des portions qui surnagent (extraits) de 31,0 et 41,4 unités/ml, respec- tivement .)
EXEMPLE 6
Une portion de 50 ml. de la bouillie obtenue dans l'exemple 4 (a) est réglée à un pH 2,15 avec de l'acide sulfurique 5N, et le mélange est agité ù 50 C pendant une heure . Le mélange est alors centrifugé, et la portion claire qui surnage (extrait), dont le potentiel est de 96,2 unités/ml. (représentant une récupération de 25,8 unités par mg. de solides séchés), est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
(Dans des conditions autrement identiques, mais en utilisant 40 % d'acide citrique à la place de l'acide sul- ùrique 5N, l'extraction donne une portion qui surnage ayant un potentiel de 96,6 unités/ml.
EXEMPLE 7 a) 3600 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja, 1,0 % de dextrose, 0,25 % d'extrait de viande et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6000 litres, sont ensemencés avec un mélange de spores et de mycé-lium de Actinomyces griseus; le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 50-75 cm. (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à 130 rpm.). b) Au bout de 120 heures d'incubation, la culture (qui a un potentiel de 55 unités/ml.) est réglée à un pH 1,5 en ajoutant 100 % d'acide sulfurique; 4 % de célite xxx (filtre auxiliaire de terre diatomaceique ) et 1% de Nuchar (un charbon activé) sont ajoutés; ensuite le mélange est agité à la température ambiante pendant xxx une demi-
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heure à une heure .
La culture (dont le potentiel s'est élevé, par ce traitement, d'environ 60 à 70 %) est centrifugé ; la portion qui surnagé 'est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de. la streptomycine .
Lors de l'extraction avec de l'acide chlorhydrique à un pH inférieur à 3, la portion qui surnage (extrait) obtenue peut être extrêmement trouble; dans ce cas, l'extrait peut être clarifié en réglant son pH à environ 3,5 , en ajoutant de l'hydrate de sodium 5N, et en séparant par filtration le précipité lourd et floculeux qui en résulte (des protéines de soja à présumer).
Il est bien entendu que le produit analogue à la streptomycine mentionné dans le mémoire peut être ,en fait, de la streptomycine ou un dérivé de celle-ci.
L'invention peut recevoir diverses variantes de mise en oeuvre du procédé décrit sans sortir du cadre de l'invention.