WO1993010153A1 - Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire - Google Patents

Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire Download PDF

Info

Publication number
WO1993010153A1
WO1993010153A1 PCT/FR1992/001063 FR9201063W WO9310153A1 WO 1993010153 A1 WO1993010153 A1 WO 1993010153A1 FR 9201063 W FR9201063 W FR 9201063W WO 9310153 A1 WO9310153 A1 WO 9310153A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bactericidal
product according
bactericidal product
product
hemoglobin
Prior art date
Application number
PCT/FR1992/001063
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Dabard
Françoise RAMARE
Pierre Raibaud
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique
Priority to EP93900252A priority Critical patent/EP0613484A1/fr
Priority to JP5509034A priority patent/JPH07501328A/ja
Priority to CA002123587A priority patent/CA2123587A1/fr
Publication of WO1993010153A1 publication Critical patent/WO1993010153A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to new bactericidal substances having a broad spectrum of activity.
  • Antiseptics are chemical agents that stop and destroy microorganisms. Mention may be made, for example, of chlorhexidine, halogens, heavy metal salts, quaternary ammoniums, salicyic acid and its derivatives.
  • Antibiotics are originally defined as chemicals produced by microorganisms that have the power to inhibit or destroy bacteria and other microorganisms, in dilute solution. A large number of these molecules are currently prepared by hemisynthesis or chemical synthesis.
  • These molecules can have a bacteriostatic or bactericidal action.
  • beta-lactams penicillins and cephalosporins
  • aminoglycosides aminoglycosides
  • cyclins aminoglycosides
  • phenicolics macrohdes
  • polymyxins polymyxins and quinolones.
  • Another group of antibacterial products is sulfa drugs.
  • One of the advantages of the product according to the present invention is to present an interesting activity on bacteria involved in disorders of the digestive system, in particular Clostridium. Indeed, it has been discovered that porphyritic derivatives have bactericidal activity.
  • the present invention relates to a bactericidal product, characterized in that it comprises a porphine nucleus.
  • the invention relates to porphyrin derivatives, for their application as therapeutically active substances, in particular as bactericidal products.
  • bactericidal products which are particularly suitable according to the invention are the products comprising at least one molecule chosen from hemin and hematine; the invention also relates to a bactericidal product which comprises at least part of the heme group, or at least one molecule derived from chlorophyllins, which are salts of the various chlorophylls.
  • the bactericidal product according to the invention can be prepared by synthesis, at least for its porphyritic part; this has advantages both for security reasons and for specific action.
  • the bactericidal product can be prepared by incubating a substrate containing hemoglobin with an enzymatic mixture containing at least one protease (then recovery of the solution of the product obtained).
  • the bactericidal product can be obtained from various substrates containing hemoglobin, in particular from whole blood, red blood cells, erythrocyte content or purified hemoglobin.
  • An enzyme mixture containing at least one protease, in particular trypsin, is made to act on this substrate; however, better results are obtained by combining trypsin with other enzymes, such as those found in pancreatic juice or in feces supernatants from axenic animals.
  • the bactericidal product can also be obtained by incubation of a substrate containing hemoglobin with proteinase K.
  • the hydrolysis is then preferably carried out at a temperature of the order of 50 ° C.
  • the conditions for incubation will depend on the activity of the enzyme mixture and the origin of the substrate, but digestion is preferably carried out at 37 ° C for about 24 hours, but it is possible to use lower temperatures up to at 20 ° C, and durations of the order of 1 hour to 72 hours.
  • the product according to the present invention can be prepared in particular by the following process:
  • a mammalian whole blood sample is centrifuged, and the pellet containing the erythrocytes is collected, b) after washing (for example with an isotonic buffer solution), the pellet is placed in the presence of distilled water to cause hemolysis of the erythrocytes,
  • step c) the supernatant obtained at the end of step c) is incubated with pancreatic juice
  • Blood can come from different mammals. It is collected on an anticoagulant such as heparin.
  • the erythrocytes are isolated, for example by centrifugation at 2000 rpm, 10 min at + 4 ° C, then washed in the same volume of buffer, preferably PBS buffer; they are then hemolyzed by adding the same volume of distilled water, and the cell debris is separated from the erythrocyte content by centrifugation, for example at 13,000 rpm, 10 min at + 4 ° C.
  • the extract obtained can be stored at +4 ° C or frozen at -20 ° C, if it is not immediately subjected to the action of enzymes.
  • Incubation in the presence of the enzyme mixture is more particularly carried out at 37 ° C. for 24 hours, aerobically, after dilution of the substrate in the enzyme preparation.
  • the bactericidal product can be obtained by incubating purified human or animal hemoglobin with pancreatic juice. This product can be sterilized by filtration.
  • pancreatic juice pancreatic pork juice, diluted to 2%, will preferably be used.
  • the bactericidal activity of the product is carried by the porphyritic fraction, which is insoluble in water.
  • Products solubied in water therefore comprise the porphine nucleus optionally substituted and / or complexed by a metal, and associated with a residue of 3 to 10 amino acids, more particularly amino acids originating from the chains of globin.
  • Such a compound has good bactericidal activity, favored by a solubility allowing good distribution in biological fluids.
  • this product shows that the activity of the product is maintained in the intestinal contents. It is therefore a product which is not absorbed and remains in the lumen of the digestive tract; furthermore, this product is not degraded by digestive enzymes.
  • the bactericidal product can contain a greater number of amino acids, which increases its solubility and allows its possible passage through the digestive barrier to have systemic activity.
  • the active molecules have as a common structure the porphyrinic group and different by the residues of amino acids maintained associated with the porphyry nucleus.
  • the bactericidal product according to the invention is a product having a substantial part of a peptide nature which can come from globin.
  • the product obtained is certainly made up of a mixture of molecules which differ in their number of amino acids.
  • the bactericidal product according to the invention is active on strict anaerobic gram bacteria, in particular on bacteria of the genus Clostridium, such as Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, and sporules isolated from the human flora. It is not active on several Clostridium difficile strains. It is active on other strains of the dominant flora of adult humans, such as bifides, peptostreptococci, and Eubacterium.
  • This product is therefore particularly interesting since it is a product of natural origin, active on germs responsible for particularly dangerous infections; for example Clostridium butyricum is involved in ulcerative necrotizing enterocoiitis of the newborn. This product therefore gives birth to a new generation of inhibitory substances, lyophilizable, sterilizable by filtration.
  • This purified product can be used in particular as a food additive, for example to avoid the disorders observed during the weaning of the piglet.
  • the bactericidal products according to the invention can also be used as preservatives.
  • the present invention therefore relates to medicinal compositions comprising, as active principle, a product according to the present invention with an excipient compatible with a therapeutic application, in particular by the oral route.
  • They may especially be compositions such as tablets, tablets, powder or other form which can be administered orally.
  • the present invention also relates to tablets intended for food, in particular animal feed, containing its concentrates of the product according to the invention intended to be added to food proper, thirst in drinking water or else premixtures of animal feed containing the product according to the invention.
  • the freshly prepared or stored blood substrates are diluted 1 / 10th and 1 / 20th in the enzyme preparations, they are incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • pancreatic enzymes Incubation of whole human blood, a pellet of washed red blood cells or the soluble fraction of hemolyzed red blood cells with pancreatic enzymes generates bactericidal activity in vitro.
  • the production of inhibitory substances is the result of an enzymatic process: the blood substrates and enzymes alone have no effect.
  • the substrates are not the constituents of serum and plasma.
  • the enzymatic activity is exerted on the red blood cells, not on the wall, but on the erythrocyte content.
  • the bactericidal effect is less strong with whole blood; this is probably linked to the presence of tryptic inhibitors.
  • the bactericidal activity is stronger after the action of enzyme mixtures such as those present in the faeces of axenic animals or in pancreatic juice than with trypsin alone.
  • Heglobins preferably purified (H) of human (H1) or animal (H2) origin are treated with any type of protease, not necessarily digestive.
  • H1 or H2 origin are treated with any type of protease, not necessarily digestive.
  • purified proteinase K which hydrolyzes proteins, glycoproteins, peptides and esters of amino acids.
  • H1 purified human hemoglobin (Sigma H7379). H1 is diluted and used at the same concentration as that of the blood of an adult man. 12.5 to 15 g of hemoglobin are diluted in 100 ml of 0.01 M PBS.
  • H2 crude or purified bovine hemoglobin (Sigma H2625- H2500). H2 is prepared as H1 but diluted 10 times, ie 1.2 to 1.5 g / 100ml of PBS. b) Enzymatic preparation
  • Proteinase K is used at several concentrations, preferably at the final concentration of 0.1 mg / ml of hemoglobin to be hydrolyzed.
  • the hydrolysis is preferably carried out at 50 ° C with slow stirring.
  • the hydrolysis time is variable from 1 hour to 24 hours.
  • the hydrolysates obtained after 2 hours of incubation generate good antibiotic activity.
  • the hydrolysate results obtained show that the erythrocyte content or the purified hemoglobin treated with proteinase K at 0.1 mg / ml generates an inhibiting substance on BFR effective up to 1 / 128.
  • the amount of bactericidal substance produced depends on the hemoglobin concentration to be hydrolyzed.
  • the hydrolyzate of the erythrocyte content by the pancreatic juice produces a more diffusible and therefore more soluble substance.
  • the inhibitory effect obtained either with a porphine (hematoporphyrin) or with substitution derivatives combined with iron (hemin, hematine) or with magnesium (chlorophylline) confirms that the porphyry nuclei are involved in bactericidal activity.
  • the nature of the metal complex alone (Fe or Mg) or chemically combined (FeCl, FeOH) is not. decisive.
  • the nuclei are insoluble in water but they can be chemically dissolved (case of chlorophyllin) or obtained more or less soluble (case of hydrolysates) depending on the degree of denaturation of the associated globin, depending on the efficiency of the protease used ( pancreatic juice and proteinase K for example).
  • Bacillus subtilis the BFR strain isolated from a canned food which has the distinction of being easy to handle: mesophilic strain, strict aerobic, capable of initiating an abundant population in 6 hours of culture at laboratory temperature .
  • mesophilic strain strict aerobic, capable of initiating an abundant population in 6 hours of culture at laboratory temperature .
  • This strain does not spore in the above culture medium.
  • This strain is very sensitive to different types of antibiotics and will be used to test the various hydrolysates, the controls on the one hand, and, on the other hand to research and control the fate of the active fractions in the purification treatments.
  • the hydrolyzate ES used pure and diluted up to 1/32, prevents bacterial multiplication and kills bacteria in the inoculum.
  • the 1/32 dilution represents the minimum inhibitory concentration from which the bactericidal effect appears.
  • Bactericidal test techniques on bacterial strains The optional anaerobic strains are tested like the control strain Bacilius FR.
  • EOS very sensitive to oxygen
  • Freter an anaerobic chamber
  • - the anaerobic strains less sensitive to oxygen are seeded outside in the agar mass. They are incubated for 48 hours at 37 ° C in an anaerobic jar (Gaspack system).
  • the antibiotic in the raw hydrolyzate is not absorbed. It passes through the digestive tract of the axenic mouse and is found active on BFR in all the contents and faeces 3 h 30 after the first ingestion.
  • the appearance of a small area of antibiosis in IG3 could correspond to the inhibitory effect of digestive substances secreted in the small intestine and reabsorbed in the cecum.
  • the purified fraction HPLC.C 18 studied in Sephadex LH20 filtration gel is eluted in a single active fraction absorbing at 214 and 380 nm at a corresponding molecular weight between 600 and 1000 daitons.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un produit bactéricide, caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine. Elle concerne également une composition pharmaceutique ainsi qu'un additif alimentaire contenant un tel produit.

Description

PRODUIT BACTERICIDE, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET ADDITIF ALIMENTAIRE.
La présente invention concerne de nouvelles substances bactéricides, possédant un spectre d'activité étendu.
Parmi les substances bactéricides connues, on distingue notamment un certain nombre d'antibiotiques, et les antiseptiques.
Les antiseptiques sont des agents chimiques qui s'opposent à la prolifération des microorganismes et les détruisent. On peut citer par exemple la chlorhexidine, les halogènes, les sels de métaux lourds, les ammoniums quaternaires, l'acide salicyiique et ses dérivés.
Les antibiotiques sont définis à l'origine comme des substances chimiques produites par des microorganismes et ayant le pouvoir d'inhiber ou de détruire les bactéries et d'autres microorganismes, en solution diluée. Un grand nombre de ces molécules sont actuellement préparées par hémisynthèse ou synthèse chimique.
Ces molécules peuvent avoir une action bactériostatique ou bactéricide.
On distingue plusieurs grandes familles d'antibiotiques, en fonction de leur structure et de leur mode d'action. Les principales sont les béta-lactamines (pénicillines et céphalosporines), les aminosides, les cyclines, les phénicolés, les macrohdes, les polymyxines et les quinolones.
Les sulfamides constituent un autre groupe de produits antibactériens.
Cependant, l'émergence constante de souches présentant une résistance aux substances bactéricides connues et la propagation rapide de ce caractère, conduisent à rechercher en permanence de nouveaux produits actifs.
En outre, on recherche de plus en plus des antibiotiques présentant des spectres limités ou destinés à des applications spécifiques, de façon à ne pas bouleverser, notamment au niveau digestif, l'équilibre microbiologique naturel.
L'un des intérêts du produit selon la présente invention, est de présenter une activité intéressante sur des bactéries impliquées dans les désordres du système digestif, en particulier les Clostridium. En effet, on a découvert que des dérivés porphyriques possèdent une activité bactéricide.
La présente invention a pour objet un produit bactéricide, caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine.
Le noyau porphine est le noyau fondamental des porphyrines, constitué par quatre noyaux pyrroliques reliés par quatre chainons -CH= , et se trouve représenté ci-dessous :
Figure imgf000004_0001
avec R=R1=R2=H
L'invention se rapporte aux dérivés des porphyrines, pour leur application en tant que substances thérapeutiquement actives, en particulier en tant que produits bactéricides.
Parmi les produits bactéricides selon l'invention, on peut notamment citer les produits comportant une molécule d'hématoporphyrine, pour laquelle R= CH3, R 1=CHOH-CH3 et R2=CH2CH2COOH.
D'autres produits bactéricides particulièrement adaptés selon l'invention sont les produits comportant au moins une molécule choisie parmi i'hémine et l'hematine ; l'invention concerne également un produit bactéricide qui comporte au moins une partie du groupement hème, ou au moins une molécule dérivée des chlorophyllines, qui sont des sels des différentes chlorophylles.
Par fixation complexante d'un groupement métallique aux quatre atomes d'azote du squelette de base, on obtient une série de groupements prosthétiques qui conviennent à la mise en oeuvre de l'invention. Cependant, la présence de ce groupement métallique n'apparaît pas essentielle, et sa nature peut être variable, avec conservation de l'activité bactéricide des dérivés. Ces paramètres seront adaptés par l'homme du métier.
Le produit bactéricide selon l'invention peut être préparé par synthèse, tout au moins pour sa partie porphyrique ; ceci présente des avantages tant pour des raisons de sécurité que de spécificité d'action.
Selon un autre aspect de l'invention, le produit bactéricide peut être préparé par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec un mélange enzymatique contenant au moins une protéase (puis récupération de la solution du produit obtenue).
Le produit bactéricide peut être obtenu à partir de différents substrats contenant de l'hémoglobine, notamment à partir de sang total, de globules rouges, du contenu érythrocytaire ou d'hémoglobine purifiée.
On fait agir sur ce substrat un mélange enzymatique contenant au moins une protéase, notamment de la trypsine ; toutefois, de meilleurs résultats sont obtenus en associant la trypsine à d'autres enzymes, tels que celles trouvées dans le suc pancréatique ou dans les surnageants de fecès d'animaux axéniques.
Le produit bactéricide peut également être obtenu par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec de la protéinase K. L'hydrolyse est alors conduite de préférence à une température de l'ordre de 50° C.
Les conditions de l'incubation dépendront de l'activité du mélange enzymatique et de l'origine du substrat, mais la digestion est conduite de préférence à 37° C pendant environ 24 heures, mais il est possible d'utiliser des températures inférieures jusqu'à 20° C, et des durées de l'ordre de 1 heure à 72 heures.
Après incubation, le produit est récupéré en solution après élimination des éléments solides résiduels.
Le produit selon la présente invention peut être préparé notamment par le procédé suivant :
a) on centrifuge un échantillon de sang total de mammifère, et on recueille le culot contenant les érythrocytes, b) après lavage (par exemple avec une solution tampon isotonique), on met le culot en présence d'eau distillée pour provoquer l'hémolyse des érythrocytes,
c) on centrifuge,
d) on fait incuber le surnageant obtenu à l'issue de l'étape c) avec du suc pancréatique,
e) la solution de produit bactéricide obtenue est stérilisée par filtration (0,45 μm).
Le sang peut provenir de différents mammifères. Il est recueilli sur un anticoagulant comme l'héparine.
Les érythrocytes sont isolés, par exemple par centrifugation à 2000 rpm, 10 min à +4º C, puis lavés dans le même volume de tampon, de préférence du tampon PBS ; ils sont ensuite hémolysés par addition du même volume d'eau distillée, et les débris cellullaires sont séparés du contenu érythrocytaire par centrifugation, par exemple à 13000 rpm, 10 min à +4° C. L'extrait obtenu peut être conservé à +4° C ou congelé à -20° C, s'il n'est pas soumis immédiatement à l'action des enzymes.
L'incubation en présence du mélange enzymatique est plus particulièrement effectuée à 37° C pendant 24 heures, en aérobiose, après dilution du substrat dans la préparation enzymatique.
Selon un autre des aspects de l'invention, le produit bactéricide peut être obtenu par incubation d'hémoglobine purifiée humaine ou animale avec du suc pancréatique. Ce produit peut être stérilisé par filtration.
Dans le cas où l'incubation est réalisée avec du suc pancréatique, on utilisera de préférence du suc pancréatique de porc, dilué à 2 %.
L'action d'un mélange enzymatique tel qu'il a été défini ci-dessus, sur le sérum issu de la coagulation, le plasma des sangs héparinés séparé par centrifugation, ou les parois érythrocytaires séparées après hémolyse, conduit à un produit dépourvu d'activité bactéricide. De même, l'incubation du mélange enzymatique avec la globine seule conduit à un produit inactif, démontrant la nécessité de la présence de Thème lors de la réaction. L'action du mélange enzymatique sur le sang total conduit à un produit bactéricide ayant une activité inférieure à celle du produit obtenu à partir du contenu érythrocytaire.
De manière générale, l'activité bactéricide du produit est portée par la fraction porphyrique, qui est insoluble dans l'eau.
Des produits solubies dans l'eau, préférés selon l'invention, comportent donc le noyau porphine éventuellement substitué et/ou complexé par un métal, et associé à un résidu de 3 à 10 acides aminés, plus particulièrement des acides aminés provenant des chaînes de globine.
L'analyse par chromatographie d'hydrolysats d'hémoglobine brute par la protémase K permet de séparer et de purifier la plus petite molécule soluble en eau portant l'activité bactéricide. Il s'agit d'un composé absorbant à 21 4 nm et 380 nm, qui possède un poids moléculaire apparent compris entre 600 et 1000 daltons.
Un tel composé présente une bonne activité bactéricide, favorisée par une solubilité permettant une bonne répartition dans les liquides biologiques.
L'administration per os de ce produit à une souris axénique permet de constater que l'activité du produit est maintenue dans le contenu intestinal. Il s'agit donc d'un produit qui n'est pas absorbé et reste dans la lumière du tractus digestif ; en outre ce produit n'est pas dégradé par les enzymes digestives.
Si on le souhaite, le produit bactéricide peut comporter un nombre plus grand d'acides aminés, ce qui augmente sa solubilité et permet son passage éventuel à travers la barrière digestive pour avoir une activité systémique.
Les molécules actives ont comme structure commune le groupement porphyrinique et différent par les résidus d'acides am inés maintenus associés au noyau porphyre.
Elles sont autoclavabies. Le produit bactéricide selon l'invention est un produit ayant une partie substantielle de nature peptidique pouvant provenir de la globine. Le produit obtenu est certainement constitué par un mélange de molécules qui diffèrent par leur nombre d'acides aminés.
II s'agit d'un produit résistant, dont l'activité persiste après un traitement à 60° C, pendant 15 heures. Ce produit est lyophilisable.
Il résiste en outre à l'action de la protéase K, 24 heures à 50° C.
Ce produit est sans doute dérivé de l'hémoglobine comportant tout ou partie de l'hème. Le produit bactéricide selon l'invention est actif sur des bactéries gram anaérobies strictes, en particulier sur des bactéries du genre Clostridium, tel que Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, et des sporulés isolés de la flore humaine. II n'est pas actif sur plusieurs souches de Clostridium difficile. Il est actif sur d'autres souches de la flore dominante de l'homme adulte, tel que bifides, les peptostreptocoques, et Eubacterium.
Son activité s'exerce également sur les bactéries du genre Bacillus.
Ce produit est donc particulièrement intéressant puisqu'il s'agit d'un produit d'origine naturelle, actif sur des germes responsables d'infections particulièrement dangereuses ; par exemple Clostridium butyricum est impliqué dans l'entérocoiite ulcéronécrosante du nouveau-né. Ce produit donne donc naissance à une nouvelle génération de substances inhibitrices, lyophilisables, stérilisables par filtration. Ce produit purifié pourra être utilisé notamment comme additif alimentaire, par exemple pour éviter les troubles observés lors du sevrage du porcelet.
Les produits bactéricides selon l'invention peuvent également être utilisés comme conservateurs.
La présente invention concerne donc des compositions médicamenteuses comportant à titre de principe actif un produit selon la présente invention avec un excipient compatible avec une application thérapeutique notamment par voie orale. Il pourra s'agir notamment de compositions telles que des tablettes, comprimés, poudre ou autre forme administrable per os.
La présente invention concerne également des comprimés destinés à l'alimentation, notamment animale, contenant son des concentrés du produit selon l'invention destinés à être ajoutés aux aliments proprement dits, soif à l'eau de boisson ou bien des pré-mélanges d'aliments animaux contenant le produit selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent.
Figure 1 : Mise en évidence de l'effet bactéricide des substances înhibiτrices produites par l'hydrolysat ES
EXEMPLE 1 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR
DE SANG TOTAL
Du sang total ou ses fractions (globules rouges lavés, contenu érythrocytaire) sont traités par des enzymes digestives. a) Préparation des substrats sanguins
On utilise le sang de n'importe quel mammifère, homme ou animai, soit ses différentes fractions obtenues par les techniques classiques de fractionnement du sang :
le sérum issu de la coagulation,
- . le plasma : surnageant de sang héparine centrifugé 2000 tours, 10 min,
+4° C,
- les globules rouges ; culot de centrifugation des sangs héparinés lavés 3 fois en PBS 0,01 M,
- les parois des globules rouges obtenues après hémolyse dans l'eau distillée des globules rouges lavés centrifugés ( 13000 tours, 10 min,
+4°C),
- le contenu érythrocytaire (E) surnageant de centrifugation de l'hémolysat des globules rouges. b) Préparations enzymatiques
On utilise : - le surnageant des féces fraichement collectées sur rat ou souris axéniques (sans germe) diluées au 4/10è,
- le suc pancréatique lyophilisé de porc (S) à raison de 2 g/100 ml de PBS 0,01 M,
- la trypsine purifiée de bovin (Sigma T8642) à 5 mg/ml de PBS.
Suc pancréatique et trypsine sont préparés extemporanément. c) Incubation des substrats dans les préparations enzymatiques
Les substrats sanguins fraîchement préparés ou stockés, aliquotés à la température ambiante ou au froid, sont dilués au 1/10è et au 1/20è dans les préparations enzymatiques, ils sont incubés pendant 24h à 37° C.
EXEMPLE 2 : ACTIVITE BACTERICIDE DE PRODUITS OBTENUS A l'EXEMPLE I
Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
Figure imgf000011_0001
L'incubation de sang humain total, d'un culot de globules rouges lavés ou de la fraction soluble de globules rouges hémolyses avec les enzymes pancréatiques génère in vitro une activité bactéricide. La production des substances inhibitrices est le résultat d'un processus enzymatique : les témoins substrats sanguins et enzymes seuls sont sans effet.
Les substrats ne sont pas les constituants du sérum et du plasma. L'activité enzymatique s'exerce sur les globules rouges, non pas sur la paroi, mais sur le contenu érythrocytaire.
L'effet bactéricide est moins fort avec le sang total ; ceci est sans doute lié à la présence d'inhibiteurs trypsiques. L'activité bactéricide est plus forte après l'action de mélanges enzymatiques comme ceux présents dans les fèces des animaux axéniques ou dans le suc pancréatique qu'avec la trypsine seule.
EXEMPLE 3 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR
D'HEMOGLOBINE
Des hémoglobines brutes, de préférence purifiées (H) d'origine humaine (H1) ou animale (H2) sont traitées par n'importe quel type de protéase, pas nécessairement digestive. On utilisera de préférence la protéinase K purifiée qui hydrolyse les protéines, glycoprotéines, peptides et esters d'acides aminés. a) Préparation des solutions d'hémoglobine
H1 : hémoglobine humaine purifiée (Sigma H7379). H1 est diluée et utilisée à même concentration que celle du sang d'un homme adulte. On dilue 12,5 à 15 g d'hémoglobine dans 100 ml de PBS 0,01 M.
H2 : hémoglobine bovine brute ou purifiée (Sigma H2625- H2500). H2 est préparée comme H1 mais diluée 10 fois soit 1,2 à 1,5 g/100ml de PBS. b) Préparation enzymatique
Une solution mère de protéinase K à 10 mg/ml est préparée en tampon Tris 0,01 M-pH=7,9. Cette solution est stabilisée avec 2 mM de Ca++ sous forme de CaCl2. c) Conditions d'hydrolyse
La protéinase K est utilisée à plusieurs concentrations, de préférence à la concentration finale de 0,1 mg/ml d'hémoglobine à hydrolyser. L'hydrolyse est conduite de préférence à 50° C sous agitation lente. La durée d'hydrolyse est variable de 1 heure à 24 heures. Les hydrolysats obtenus après 2 heures d'incubation génèrent une bonne activité antibiotique.
EXEMPLE k : EFFICACITE INHIBITRICE DE DIFFERENTS TYPES
D'HYDROLYSATS
Les résultats d'hydrolysats obtenus montrent que le contenu érythrocytaire ou l'hémoglobine purifiée traités par la protéinase K à 0, 1 mg/ml génère une substance inhibitrice sur BFR efficace jusqu'au 1 / 128. La quantité de substance bactéricide produite dépend de la concentration d'hémoglobine à hydrolyser. L'hydrolysat du contenu érythrocytaire par le suc pancréatique produit une substance plus diffusible donc plus soluble.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
Figure imgf000014_0001
EXEMPLE 5 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR DES FRACTIONS DE L'HEMOGLOBINE a) Extraction chimique de l'hème de l'hémoglobine Hl
On utilise la méthode de F. Ascoli et col. (Methods in enzymology vol 76.5.1981 ) qui consiste à extraire la globine des hémoprotéines en enlevant l'hème. Le principe consiste, dans les conditions décrites, à mélanger 2,5 mi d'hémoglobine à 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique et d'acétone. Le précipité ou culot de centrifugation contient la globine que l'on peut solubiliser en PBS. Le surnageant contient l'hème. Pour tester l'activité de ce surnageant et parce que le mélange alcool acétone est inhibiteur de la croissance des cellules cibles BFR, il est évaporé par Speed Vac. Le concentrât est insoluble en PBS mais peut être partiellement solubilisé en acétonitrile, 60 % dans 40 % d'acide trifluoroacétique à 0, 1 % inactif sur les cellules BFR.
b) Effet bactéricide des fractions de l'hémoglobine humaine purifiée, traitée par un mélange HCl
Les résultats, présentés dans le tableau 3, montrent que le principe actif de l'inhibition est loca lisé dans la fraction du sang fortement colorée : la fraction héminique. La fraction globinique est inactive alors que la fraction héminique conduit à un produit bactéricide insoluble en PBS donc différent dans sa structure chimique des hydrolysats actifs déjà utilisés.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
L'effet inhibiteur obtenu soit avec une porphine (l'hématoporphyrine) soit avec des dérivés de substitution combinés au fer (hémine, hématine) ou bien au magnésium (chlorophylline) confirme que les noyaux porphyres sont impliqués dans l'activité bactéricide. Dans cet essai, la nature du complexe métallique seul (Fe ou Mg) ou chimiquement combiné (FeCl, FeOH) n'est pas. déterminante. Les noyaux sont insolubles en eau mais ils peuvent être chimiquement solubilisés (cas de la chlorophylline) ou obtenus plus ou moins solubles (cas des hydrolysats) suivant le degré de dénaturation de la globine associée, en fonction de l'efficacité de la protéase utilisée (suc pancréatique et protéinase K par exemple).
Toutes les chromoprotéides porphyriques peuvent générer une substance inhibitrice à partir de leur groupement prosthétique. Dans le cas de l'hémoglobine, mieux que l'extraction chimique, l'hydrolyse enzymatique moins coûteuse et plus spécifique conduit suivant le type de protéase, à la production de molécules héminiques actives qui diffèrent entre elles par leur niveau d'efficacité et leur solubilité en eau (exemple hydrolysat ES et HK).
EXEMPLE 7 : MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE ANTIBIOTIQUE SUR
DES CELLULES CIBLES BACTERIENNES
1. Principe et réalisation du test d'antibiose
108 cellules végétatives et viables d'une souche bactérienne utilisée comme cible sont ensemencées en masse ou a la surface de 15 ml du milieu de culture suivant : - milieu coeur-cervelle (Difco 0037) 37 g/l
- extrait de levure (Difco 0127) 5 g/l
- gélose Biteck agar (Difco 0138) 14 g/l Des puits, ouverts dans l'épaisseur de la gélose coulée en boîte de Pétri, sont remplis avec 30 μl de l'antibiotique à tester. Après incubation, l'activité antibiotique est mesurée par le rayon en mm de la plage de lyse totale développée autour des puits.
2. Souche cible de référence
On utilise une souche de Bacillus subtilis, la souche BFR isolée d'une conserve alimentaire qui a la particularité d'être facile à manipuler : souche mésophile, aérobie stricte, capable d'initier une population abondante en 6 heures de culture à température du Laboratoire. Cette souche ne sporule pas dans le milieu de culture précité. Cette souche est très sensible aux différents types d'antibiotiques et sera utilisée pour tester les divers hydrolysats, les témoins d'une part, et, d'autre part rechercher et contrôler le devenir des fractions actives dans les traitements de purification.
3. Effet de divers traitements physiques et chimiques sur Tactivité de l'hydrolysat ES
Figure imgf000020_0001
4. Mise en évidence de l'effet bactéricide des substances inhibitrices produites par l'hydrolysat ES
Des tubes de 9 ml de milieu de culture sans gélose contenant des dilutions croissantes de l'hydrolysat brut ES sont ensemencées avec 1 ml d'une population de 3.107 cellules végétatives de BFR. Après 8 heures de contact à 37° C, on mesure dans chaque tube le nombre de cellules vivantes et le rayon de la zone d'antibiose. Les résultats sont présentés à la figure 1.
L'hydrolysat ES utilisé pur et dilué jusqu'au 1/32, empêche la multiplication bactérienne et tue les bactéries de l'inoculum. La dilution au 1/32 représente la concentration minimale inhibitrice à partir de laquelle apparaît l'effet bactéricide.
EXEMPLE 8 : SPECTRE D'ACTIVITE DE L'HYDROLYSAT ES SUR
DIFFERENTES SOUCHES BACTERIENNES
Origine des souches
A l'exception des souches de collection ou en provenance de Belgique, toutes les souches ont été isolées au Laboratoire de la microflore dominante de l'intestin d'enfants et d'adultes. Les prélèvements d'enfants viennent du service de neonatologie d l'hôpital A. Béclère : les enfants prématurés étaient âgés de 1 à 2 mois et n'avaient pas de trouble pathologique intestinal. Les prélèvements d'adultes concernent des individus sains non hospitalisés ou malades (pouchite ou colite).
Caractérisation des souches isolées au Laboratoire
Elles sont classées par leur morphotype. Un certain nombre ont été caractérisées sur 20 réactions biochimiques différentes (API 20A) et sur les produits finaux de leur métabolisme fermentaire (acides fixes et acides gras volatils).
Techniques du test de bactéricidie sur les souches bactériennes Les souches anaérobies facultatives sont testées comme la souche témoin Bacilius FR.
Pour les souches anaérobies strictes, deux techniques ont été utilisées : - les souches très sensibles à l'oxygène (EOS) sont cultivées dans une chambre anaérobie (Freter). Elles sont ensemencées à la surface de la gélose et incubées 48 heures à 37° C dans la chambre anaérobie. - les souches anaérobies moins sensibles à l'oxygène sont ensemencées à l'extérieur dans la masse de la gélose. Elles sont incubées 48 heures à 37° C en jarre anaérobie (Gaspack system).
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
EXEMPLE 9 DEVENIR DE L'ANTIBIOTIQUE H2K DANS LE TUBE DIGESTIF DE LA SOURIS AXENIQUE (SANS GERME)
0,5 ml de l'hydrolysat brut H2K lyophilisé et concentré 10 fois, stérilisé à 100° C pendant 30 minutes est administré par sonde gastrique à des souris axéniques selon le protocole suivant :
Figure imgf000029_0001
Les contenus intestinaux, dilués au 1 / 10è en PBS sont contrôlés sur cellule cible BFR ; les résultats sont présentés au tableau 7.
L'antibiotique contenu dans l'hydrolysat brut n'est pas absorbé. Il transite dans le tube digestif de la souris axenique et est retrouvé actif sur BFR dans tous les contenus et les fèces 3h 30 après la première ingestion.
Dans la souris témoin, l'apparition d'une petite zone d'antibiose dans l'IG3 pourrait correspondre à l'effet inhibiteur de substances digestives sécrétées dans l'intestin grêle et réabsorbées au niveau du caecum.
Figure imgf000030_0001
EXEMPLE 10 PURIFICATION ET DEBUT DE CARACTERISATION DE
LA SUBSTANCE BACTERICIDE SOLUBLE PRODUITE DANS L'HYDROLYSAT H1K a) Purification par fractionnement de la partie soluble en eau
L'hydrolysat brut est élue dans une colonne Fractogel Butyl TSK 650. S. On recherche les fractions actives par test d'antibiose sur BFR. Les résultats du chromatogramme montrent qu'après la fraction non retenue (fraction I), la première fraction retenue, éluée en eau (fraction II) contient l'effet antibiotique. La fraction active, éluée en méthanol 20% correspond probablement à la partie insoluble de l'antibiotique H1 K. b) Purification de la fraction active soluble en eau
Les chromatogrammes comparés en HPLC.C 18 de l'hydrolysat brut, des fractions I et II du système Fractogel Butyl montrent que seule la fraction éluée à 100% de tampon B, absorbant à la fois à 214 et 380 nm est active.
Cette fraction active est obtenue purifiée à partir de l'éluat II
Fractogel Butyl. c) Détermination du poids moléculaire
La fraction purifiée HPLC.C 18 étudiée en gel filtration Sephadex LH20 est éluée en une seule fraction active absorbant à 214 et 380 nm à un poids moléculaire correspondant situé entre 600 et 1000 daitons.
* * * * *
LEGENDE DE LA FIGURE 1
Conditions du test :
- 9 ml LBHI [ES]
- 1 ml 3.107 BFR
- aucune spore
- 8H de contact

Claims

REVENDICATIONS
1. Produit bactéricide, caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine.
2. Produit bactéricide, caractérisé en ce qu'on peut le préparer par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec un mélange enzymatique contenant au moins une protéase, puis récupération de la solution du produit obtenue.
3. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le mélange enzymatique contient au moins la trypsine ou une enzyme équivalente.
4. Produit selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le mélange enzymatique est le suc pancréatique.
5. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la protéase est la protéinase K.
6. Produit selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat est constitué par le contenu erythrocytaire.
7. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une partie du groupement hème.
8. Produit bactéricide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une molécule d'hématoporphyrine.
9. Produit bactéricide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une molécule choisie parmi l'hémme et l'hematine.
10. Produit bactéricide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une molécule de chlorophylline.
11. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 et 7 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins trois acides aminés, liés au noyau porphine.
12. Produit bactéricide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire d'environ 1000 daitons.
13. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 à 7, 1 1 et 12, caractérisé en ce qu'on peut le préparer par les étapes suivantes : a) on centrifuge un échantillon de sang total de mammifère, et on recueille le culot contenant les érythrocytes,
b) après iavage, on met le culot en présence d'eau distillée pour provoquer l'hémolyse des érythrocytes,
c) on centrifuge,
d) on fait incuber le surnageant obtenu à l'issue de l'étape c) avec du suc pancréatique,
e) on récupère le produit bactéricide, qui peut être stérilisé par filtration.
14. Produit bactéricide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on peut le préparer par incubation d'hémoglobine avec du suc pancréatique.
15. Produit selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il est sous forme lyophilisée.
16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un produit selon l'une des revendications 1 à 15.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est formulée pour l'administration par voie orale.
18. Additif alimentaire, caractérisé en ce qu'il contient un produit selon l'une des revendications 1 à 15.
PCT/FR1992/001063 1991-11-15 1992-11-16 Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire WO1993010153A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93900252A EP0613484A1 (fr) 1991-11-15 1992-11-16 Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire
JP5509034A JPH07501328A (ja) 1991-11-15 1992-11-16 殺菌性生成物、これを含む医薬組成物および食品添加物
CA002123587A CA2123587A1 (fr) 1991-11-15 1992-11-16 Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR91/14090 1991-11-15
FR9114090A FR2683724A1 (fr) 1991-11-15 1991-11-15 Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993010153A1 true WO1993010153A1 (fr) 1993-05-27

Family

ID=9418976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1992/001063 WO1993010153A1 (fr) 1991-11-15 1992-11-16 Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0613484A1 (fr)
JP (1) JPH07501328A (fr)
AU (1) AU3163093A (fr)
CA (1) CA2123587A1 (fr)
FR (1) FR2683724A1 (fr)
WO (1) WO1993010153A1 (fr)
ZA (1) ZA928679B (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033463A2 (fr) * 1994-06-02 1995-12-14 Bar-Ilan University Compositions antibiotiques synergique contenant une porphyrine et un antibiotique
EP0824213A2 (fr) * 1996-08-15 1998-02-18 Tsukasa Matsumoto Méthode pour le fractionnement des globules rouges et matériaux antibactériens ou inhibiteurs de prolifération bactérienne ainsi produit

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101547691A (zh) * 2006-06-29 2009-09-30 悠哈味觉糖有限公司 动脉硬化抑制剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0061556A1 (fr) * 1979-11-16 1982-10-06 AB Pripps Bryggerier Préparation d'acides aminés enrichie en fer hématinique et procédé pour la confection de préparations d'acides aminés enrichies en fer hématinique à partir d'hémoprotéines
FR2628118A1 (fr) * 1988-03-07 1989-09-08 Centre Nat Rech Scient Fractions peptidiques issues d'hemolysats de cruor, leur obtention et leurs applications
EP0438750A2 (fr) * 1990-01-23 1991-07-31 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Utilisation d'un hydrolysat de lactoferrine comme agent antibactérien

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0061556A1 (fr) * 1979-11-16 1982-10-06 AB Pripps Bryggerier Préparation d'acides aminés enrichie en fer hématinique et procédé pour la confection de préparations d'acides aminés enrichies en fer hématinique à partir d'hémoprotéines
FR2628118A1 (fr) * 1988-03-07 1989-09-08 Centre Nat Rech Scient Fractions peptidiques issues d'hemolysats de cruor, leur obtention et leurs applications
EP0438750A2 (fr) * 1990-01-23 1991-07-31 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Utilisation d'un hydrolysat de lactoferrine comme agent antibactérien

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS vol. 79, no. 8 , 1985, Philadelphia, PA, US; abstract no. 65685, F.R. VENEZIO ET AL. 'BACTERICIDAL EFFECTS OF PHOTORADIATION THERAPY WITH HEMATOPORPHYRIN DERIVATIVE.' page AB-169 ; *
BIOLOGICAL ABSTRACTS vol. 82, no. 6 , 1986, Philadelphia, PA, US; abstract no. 57414, P. MARTINETTO ET AL. 'BACTERICIDAL EFFECTS INDUCED BY LASER IRRADIATION AND HEMATOPORPHYRIN AGAINST GRAM-POSITIVE AND GRAM-NEGATIVE MICROORGANISMS.' page AB-856 ; *
BIOLOGICAL ABSTRACTS vol. 90, no. 11 , 1990, Philadelphia, PA, US; abstract no. 119702, Z. MALIK ET AL. 'THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF A DEUTEROPORPHYRIN-HEMIN MIXTURE ON GRAM-POSITIVE BACTERIA: A MICROBIOLOGICAL AND SPECTROSCOPIC STUDY.' page AB-175 ; *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 96, no. 19, 10 Mai 1982, Columbus, Ohio, US; abstract no. 159141, F.I. BUROVAYA ET AL. 'STUDY OF THE EFFECT OF CONDITIONS OF HYDROLYSIS OF AN ERYTHROCYTE MASS (BYPRODUCTS OF PRODUCTION) ON THE COMPOSITION OF HYDROLYZATES.' page 436 ; *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033463A2 (fr) * 1994-06-02 1995-12-14 Bar-Ilan University Compositions antibiotiques synergique contenant une porphyrine et un antibiotique
WO1995033463A3 (fr) * 1994-06-02 1996-05-17 Univ Bar Ilan Compositions antibiotiques synergique contenant une porphyrine et un antibiotique
EP0824213A2 (fr) * 1996-08-15 1998-02-18 Tsukasa Matsumoto Méthode pour le fractionnement des globules rouges et matériaux antibactériens ou inhibiteurs de prolifération bactérienne ainsi produit
EP0824213A3 (fr) * 1996-08-15 1998-06-17 Tsukasa Matsumoto Méthode pour le fractionnement des globules rouges et matériaux antibactériens ou inhibiteurs de prolifération bactérienne ainsi produit

Also Published As

Publication number Publication date
JPH07501328A (ja) 1995-02-09
ZA928679B (en) 1993-05-11
CA2123587A1 (fr) 1993-05-27
AU3163093A (en) 1993-06-15
EP0613484A1 (fr) 1994-09-07
FR2683724A1 (fr) 1993-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8629181B2 (en) Biologically active oils
US11241470B2 (en) Phaseolus vulgaris extracts, their use and formulations containing them
WO2012004522A1 (fr) Complexe macromoleculaire d'origine bacterienne et utilisation dudit complexe macromoleculaire pour prevenir et traiter les rhumatismes inflammatoires
EP2326708B1 (fr) Microorqanismes photosynthétiques enrichis en sélénium à partir de composés séléno-hydroxyacides, leurs applications en nutrition, cosmétique et pharmacie
JP6741280B2 (ja) Ａｃｅ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物、及びその製造方法
WO1993010153A1 (fr) Produit bactericide, composition pharmaceutique le contenant et additif alimentaire
SU1732815A3 (ru) Способ получени гипотриглицеридально-активных полисахаридов
CH620691A5 (fr)
FR2481927A1 (fr) Composition anti-allergique et son procede de preparation a partir d'une bacterie lactique du genre streptococcus
WO2020260356A1 (fr) Bacterie de la famille des christensenellacees et composition en contenant pour la prevention et/ou le traitement de l'insuffisance renale
JPH07285881A (ja) アルコール代謝促進剤
FR2884829A1 (fr) Procede d'obtention d'un extrait bacterien d'aeromonas hydrophila provenant de sangsues, et compositions pharmaceutiques les contenant
EP1194154B1 (fr) Utilisation de bacteries propioniques pour la production d'acide propionique et/ou de propionates dans le colon
CA1122526A (fr) Substance biologiquement active, sa preparation et les medicaments qui la contiennent
FR2536281A1 (fr) Compositions pharmaceutiques permettant de reguler les fonctions phagocytaires
FR2834292A1 (fr) Extraits bacteriens de sangsues a effet notamment thrombolytique
FR2640281A1 (fr) Concentre enzymatique liquide stable et procede pour sa production
FR2655267A1 (fr) Nouveau derive sulfate du galactanne extrait de klebsiella, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant.
LU86418A1 (fr) Polysaccharides azotes et leur procede d'obtention
BE566435A (fr)
JPH0494682A (ja) グルタチオンペルオキシダーゼの製造法およびその用途
JPS5922517B2 (ja) 抗腫瘍性多糖類ｃ↓−４５の製造法
JPH03240495A (ja) 新規生理活性物質サイクロオクタチン、その製造法およびその用途
FR2796555A1 (fr) Utilisation de bacteries propioniques pour la production d'acide propionique et/ou de propionates et, le cas echeant, d'acide acetique et/ou d'acetates au niveau du colon

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR CA CS FI HU JP KR NO PL RO RU UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)

Free format text: PL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993900252

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2123587

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 1994 244065

Country of ref document: US

Date of ref document: 19940516

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993900252

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1993900252

Country of ref document: EP