CN101547691A - 动脉硬化抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有下述式(1)或式(2)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯衍生物作为有效成分的动脉硬化抑制剂和含有该动脉硬化抑制剂的食品或医药组合物。该卟啉类衍生物化合物或其酯衍生物显示抑制氧化LDL与血管内皮细胞、巨噬细胞等中被表达的LOX－1的结合的作用和具有氧化LDL通过LOX－1摄入细胞内的抑制能力的拮抗作用，而且安全性高。式(1)中，R1、R2分别表示具有1～4个碳原子的烃基等，R3～R8分别表示具有1～2个碳原子的烃基、甲酰基等。式(2)中，R1、R2分别表示具有1～4个碳原子的烃基等，R3～R8分别表示具有1～2个碳原子的烃基、甲酰基等。

Description

动脉硬化抑制剂
技术领域
本发明涉及动脉硬化抑制剂和含有该动脉硬化抑制剂的食品组合物或含有该动脉硬化抑制剂的医药组合物。
背景技术
动脉硬化症是位于代谢综合征的下游的症状，而以过度食用脂肪和运动不足为主要原因的肥胖症位于代谢综合征的最上游，这一认识近年来达成共识，该动脉硬化症进一步发展、形成血栓，成为心脑血管疾病的原因。
但是，根据日本厚生劳动省最近的人口动态统计，在日本的疾病类别死亡者的第1位是恶性新生物(肿瘤和癌)、第2位是心脏病、第3位是脑血管疾病，心脏病和脑血管疾病死亡者的合计是全部的约28％，这几乎与恶性新生物死亡者约30％相匹敌(平成17年(2005年))。关于恶性新生物的应对方法，从其发病过程考虑，早期发现·早期治疗是重要的，希望有临床学途径。但是，如上述那样，位于起因于生活习惯病的肥胖症·动脉硬化症下游的心脑血管疾病，从食品的预防学上的方法是可能的过程，希望有能够通过使用日常的可能摄取形态进行应对的方法。
按照上述来说，在动脉硬化症中，包含饮食生活的食品上的方法是重要的，但在复杂·多变的过程中，以怎样的作用机理作为目标是重要的。动脉硬化症以由氧化应力等引起的低密度脂蛋白(Low-densityLipoprotein：LDL)的变性、向血管内皮细胞摄入引起的血管内皮功能障碍作为发病的开端，作为此后的时序过程，呈现由巨噬细胞和血管平滑肌分化·脱分化引起的泡沫化现象。然后，最终经过狭窄性病变而形成为血栓。就是说，如果从预防学的观点考虑，抑制由初期病变的氧化应力等引起的脂质变性、或由变性LDL被摄入血管内皮细胞引起的功能障碍是重要的。
报告有：在载脂蛋白E缺陷的小鼠中，如果敲出作为巨噬细胞的清道夫受体的SR-A(Class A scavenger receptor)，可以抑制动脉硬化，然而血中的胆固醇值上升(例如非专利文献1)。另外，报告有：相反地，如果使SR-A过量表达，即使向巨噬细胞内的胆固醇摄入被促进，动脉硬化也不被促进(例如非专利文献2)。即，可以认为血中胆固醇上升和向巨噬细胞等脂质积累，对动脉硬化症的进展是2次性的。另外，在2个心血管病人中、1个病人的血清脂质正常，另外，以预防脂质变性为目的的预防效果，称为除维生素E以外、没有充分的物质(例如非专利文献3)。即，通过改善血中脂质，并不能预防·改善全部的动脉硬化症。
另一方面，报告有：在脂质变性的同时、成为动脉硬化症初期原因的血管内皮细胞的功能障碍依存于，变性LDL、特别是氧化LDL通过氧化LDL受体LOX-1(凝集素样氧化低密度脂蛋白受体—1：Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1)摄入血管内皮细胞(例如非专利文献4)。在人的清道夫受体中存在着从A类到H类的至少8类(例如非专利文献5)，认为在血管内皮细胞中，包含LOX-1、至少6类清道夫受体发挥着功能(例如非专利文献6)，起因于通过这些受体的变性LDL摄入的血管内皮细胞功能障碍，引起抑制各种接合因子的表达亢进和一氧化氮产生等，与单球·巨噬细胞的集积·泡沫化或平滑肌细胞的游走·扩增·转化有关联。然后，作为结果，可以认为使动脉硬化症发病。
LOX-1不仅在血管内皮细胞、而且在如上述与动脉硬化症相关的巨噬细胞、平滑肌细胞中也表达(例如非专利文献7)，作为动脉硬化症的标的因子非常受到注目。例如在过量表达LOX-1的载脂蛋白E欠缺小鼠中，巨噬细胞的集积数增加、接合因子体统的表达上升、粥瘤样部位的增大等、由LOX-1的过量表达引起血管内皮细胞功能障碍，确认使动脉硬化症亢进(例如非专利文献8)。这样，虽然预想LOX-1对动脉硬化症发病给予非常大的影响，但是到现在还未知关于抑制LOX-1和改性LDL结合的市售药剂。
另一方面，在内皮细胞和平滑肌细胞中也存在称之为是进行内吞作用的膜区域的小窝。作为小窝以外的代表性的内吞作用通路，也存在称为覆盖网格蛋白的坑。近年来出现由小窝引起的与脂质代谢的关系的报告，也进行着以与动脉硬化症的关系为对象的研究。例如，由通过小窝的内吞作用，不仅白蛋白(例如非专利文献9)、胰岛素(例如非专利文献10)，而且也报告关于向LDL或变性LDL的输送(例如非专利文献11)。小窝作为其外壳蛋白，具有caveolin-1，但如果使遗传学性欠缺caveolin-1的小鼠与欠缺载脂蛋白E的小鼠交配，制作双敲除小鼠，就确认伴随作为清道夫受体一种的CD36表达低下的高抗动脉硬化作用(例如非专利文献12)。即，以抑制由经过小窝引起脂蛋白向细胞内输送为标的的食品·药剂的开发，预想与LOX-1的拮抗物同样地作为抗动脉硬化抑制剂利用。因此，如果能够同时抑制这些，可以期待成为非常优异的抗动脉硬化抑制剂。
但是，以卟啉为基本骨架的物质，不论生物种类、作为代谢物质是广泛存在的。以δ-氨基乙酰丙酸为前体物质，通过8个分子形成环状结构而构筑四吡咯骨架，在下游的原卟啉IX中派生成作为光合成构成要素的叶绿素和作为血红蛋白构成要素的亚铁血红素。另外，从作为上游的代谢中间体的尿卟啉III，不仅可以合成上述物质群、也可以合成维生素B12等。
在植物中，叶绿素是ROS(reactive oxygen species：活性氧种)的发生源，不仅是叶的老化(senescence)、也伴随组织的损伤而被积极地代谢，同时也暗示着该代谢过程控制植物的多种防御反应(例如非专利文献13)，在叶绿素的分解中，依靠叶绿素酶(chlorophyllase)和Mg-螯合酶(Mg-dechelatase)，经过脱叶绿醇化和脱Mg化，形成脱镁叶绿酸a。
近年，脱镁叶绿酸a作为是ABC(ATP-binding cassette：ATP结合卡式)输送体一种的ABCG2/BCRP(breast cancer resistant protein：乳癌耐性蛋白质)的标志而被关注(例如非专利文献13)。该ABCG2也是多药耐性的原因因子，以脱镁叶绿酸a为指标的ABCG2阻碍剂的开发，以及抗癌相关物质开发的研究也在进行中。另外，脱镁叶绿酸a也称为是光过敏症的原因因子，是在高浓度摄取时引起的现象(人是500mg/日以上(非专利文献15)、小鼠是220mg/日以上(非专利文献16))，现在的小球藻中的配合量如果也是在100g商品中60～80mg以下、就不成为问题。另外，在实际中，在静脉注射脱镁叶绿酸a时在皮肤蓄积量少，细网内皮系统成为主要的蓄积对象(非专利文献17)。
非专利文献1：Suzuki H.et al.Nature(1997)；386：292-6
非专利文献2：Van Eck M.et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol(2000)；20：2600-6
非专利文献3：Ross R.N Engl J Med(1999)；340：115-26
非专利文献4：Sawamura T.et al.Nature(1997)；386：73-7
非专利文献5：Murphy J.E.et al.Atherosclerosis(2005)；182：1-15
非专利文献6：Adachi H.and Tsujimoto M.Prog Lipid Res(2006)；45：379-404
非专利文献7：Chen M.et al.Pharmacol Ther(2002)95：89-100
非专利文献8：Inoue K.et al.Circ Res(2005)；97：176-84
非专利文献9：Ghitescu L.et al.J Cell Sci.(1986)；102：1304-11
非专利文献10：Bendayan M.et al.J Cell Sci.(1996)；109：1857-64
非专利文献11：Kim M-J.et al.Atherosclerosis(1994)；108：5-17
非专利文献12：Philippe G.F.et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol(2003)；24：98-105
非专利文献13：Kariola T.et al.Plant cell(2005)；17：282-94
非专利文献14：Robey R.W.et al.Cancer Res(2004)；64：1242-6
非专利文献15：Kimura S.et al.Photomed.Photobiol.(1981)；3：73
非专利文献16：Matsuura E et al.Kitasato Arch.Exp.Med.(1988)；61：201-13
非专利文献17：Aprahamian M.et al.Anti-Cancer Drug Design(1993)；8：101-14
发明内容
本发明从以上观点出发，提供能够抑制氧化LDL与血管内皮细胞、平滑肌细胞等中被表达的LOX-1的结合、并且具有能够抑制氧化LDL通过LOX-1摄入细胞内的拮抗作用、高安全性的动脉硬化抑制剂，以及含有这些的食品和医药组合物。
另外，本发明也提供具有抑制氧化LDL通过LOX-1以外的其他清道夫受体的摄入的能力，以及能够抑制脂蛋白经由小窝内吞于细胞内，发挥多种效果的动脉硬化抑制剂，以及含有这些的食品和医药组合物。
本发明人为了解决上述课题，由筛选深入探索对LOX-1具有拮抗作用，包括LOX-1以外的清道夫受体的氧化LDL摄入抑制能力优异的成分。其结果，发现具有卟啉骨架的化合物具有显著的拮抗作用，至此完成了本发明。在该化合物中还发现具有抑制由内吞产生的脂蛋白摄入细胞内的作用。
即，本发明的要点在于：
[1]一种动脉硬化抑制剂，含有下述式(1)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用，
式(1)：
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自氢或者直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基。
[2]一种动脉硬化抑制剂，含有下述式(2)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用，
式(2)：
Figure A200780032217D00101
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基、羧甲基、羧乙基。
[3]如上述[1]所述的具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用的动脉硬化抑制剂，所述式(1)所示的卟啉类衍生物化合物是脱镁叶绿酸a和脱镁叶绿酸a乙酯。
[4]如上述[2]所述的动脉硬化抑制剂，所述式(2)所示的卟啉类衍生物化合物是血卟啉和尿卟啉III。
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的动脉硬化抑制剂，具有抑制氧化LDL通过LOX-1以外的清道夫受体摄入细胞的作用。
[6]如上述[1]～[4]中任一项所述的动脉硬化抑制剂，具有抑制氧化LDL经由小窝摄入细胞内的作用。
[7]一种食品组合物，含有上述[1]～[6]中任一项所述的动脉硬化抑制剂。
[8]一种医药组合物，含有上述[1]～[6]中任一项所述的动脉硬化抑制剂。
[9]一种组合物，含有上述式(1)或(2)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类作为有效成分，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用。
另外，在本发明中，所谓拮抗作用，在以后述实施例中记载的方法进行评价时，意指抑制氧化LDL与LOX-1的结合、并且抑制氧化LDL摄入细胞内。
发明效果
通过使用本发明的化合物，可以发挥能够显著抑制氧化LDL通过与动脉硬化症初期病变深刻相关的氧化LDL受体(LOX-1)摄入细胞内的效果。
附图说明
图1是表示使用脱镁叶绿酸a乙酯(Ethyl pheohorbide a)、脱镁叶绿酸a(Phephorbide a)、叶绿素a(Chlorophyll a)、叶绿素b、氰钴胺素(Cyanocobalamin)、氯高铁血红素(Haemin)、羟高铁血红素(Hematin)、血卟啉(Hematoporphyrin)、尿卟啉III(Uroporphyrin III)、胆色素原(Porphobilinogen)、脱镁叶绿素a(Pheophytin a)、脱镁叶绿素b、Mg2+时，氧化LDL与bLOX-1的结合率的结果的图表。图表的纵轴以相对值表示氧化LDL与在片上固定的LOX-1的结合量，对照以不含化合物的处理区值为100、以不含氧化LDL的处理区值为0进行换算。另外，添加各化合物，使最终浓度为16μM。
图2是表示在后述的实施例1～4中关于具有高拮抗活性的脱镁叶绿酸a研究浓度依存性的结果的图表。在全部稀释系列中，添加相同浓度的DMSO(dimethyl sulfoxide；和光纯药)。
图3表示氧化LDL与hLOX-1的的结合率的结果。图表的纵轴以相对值表示氧化LDL与在片上固定的LOX-1的结合量，对照以不含化合物的处理区值为100、以不含氧化LDL的处理区值为0进行换算。另外，添加各化合物，使最终浓度为16μM。
图4是表示在实施例6中进行的、表达了bLOX-1的CHO细胞的氧化LDL摄入量的结果。关于表示摄入细胞内的氧化LDL量的荧光量，在全部处理区中减去了不含化合物和荧光标识的氧化LDL的负对照的值。另外，纵轴表示以用细胞溶解液的蛋白质量除上述荧光量而得的对照值作为100％进行换算的值。
图5是表示在实施例6中进行的、表达了hLOX-1的CHO细胞的氧化LDL摄入量的结果。关于表示摄入细胞内的氧化LDL量的荧光量，在全部处理区中减去了不含化合物和荧光标识的氧化LDL的负对照的值。另外，纵轴表示以用细胞溶解液的蛋白质量除上述荧光量而得的对照值作为100％进行换算的值。
图6表示与后述的实施例6同样、关于各抑制剂验证相对COS-1细胞、bLOX表达CHO细胞、hLOX表达CHO细胞、SR-A II表达COS-1细胞、正常大动脉内皮细胞的各细胞，Dil-OxLDL的摄入、作为网格蛋白小泡输送的特异标记的运铁蛋白(Transferrin)、作为小窝通路的输送标记的CTB的各标记的摄入的结果。另外，作为CTB的特异的抑制剂，使用制霉菌素(Nystain)。
图7表示相对平滑肌细胞的氧化LDL摄入抑制能力的结果。关于表示摄入细胞内的氧化LDL量的荧光强度，除以来自Dil-OxLDL的荧光强度和同一视野内的来自DAPI染色的核数，表示全部12个视野的平均值。对照是不含抑制剂的处理区。
具体实施方式
在本发明中可以使用的卟啉类衍生物化合物，以下述式(1)或式(2)表示，
式(1)
Figure A200780032217D00121
(式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自氢或者直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基。)
式(2)：
Figure A200780032217D00131
(式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基、羧甲基、羧乙基。)
在式(1)中，从优异效果(特别是拮抗作用)的观点出发，R1优选氢原子、碳原子数1～2的直链状饱和烃基，更优选氢原子或乙基。另外，R2、R3、R4、R6、R7、R8优选碳原子数1～2的直链状饱和烃基，优选甲基、乙基。R5优选碳原子数2～4的直链状不饱和烃基，更优选亚乙基。
在式(2)中，从优异效果(特别是拮抗作用)的观点出发，R1、R2优选氢原子、碳原子数1～2的直链状饱和烃基，更优选氢原子。另外，R3、R4、R6、R8优选碳原子数1～2的直链状饱和烃基、羧甲基，更优选甲基、羧甲基。R5、R7优选碳原子数2～4的直链状不饱和烃基、羧乙基，更优选亚乙基、羧乙基。
从优异效果(特别是拮抗作用)的观点出发，以上述式(1)表示的卟啉类衍生物化合物优选脱镁叶绿酸a和脱镁叶绿酸a乙酯。
从优异效果(特别是拮抗作用)的观点出发，以上述式(2)表示的卟啉类衍生物化合物优选血卟啉和尿卟啉III。
以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物，不仅具有氧化LDL受体(LOX-1)拮抗作用，而且也抑制氧化LDL通过其他清道夫受体的摄入，作为还具有抑制向细胞内的氧化LDL经过小窝摄入细胞内的作用的结果，具有抑制内皮细胞功能障碍或抗动脉硬化作用。
以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物，可以用公知的方法由叶绿素等市售的原料合成。
在本发明中，以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物也包括酯类。在酯类中，可以列举甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等。
另外，从动脉硬化抑制效果更加提高的观点出发，以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物，优选也具有抑制氧化LDL通过上述LOX-1以外的清道夫受体摄入细胞的作用。在这里，所谓LOX-1以外的清道夫受体是在血管内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等中存在的LOX-1以外的受体，是能够与LDL结合摄入上述细胞内的受体。作为这样的清道夫受体，例如大致区分为SR-A I/II、SR-B1、CD36、MARCO、CD68、SRECs、SR-PSOX、FEEL-1等的类型A、B、C、D、E、F、G、H，但不特别限定。
在本发明中，如后述的实施例所记载，向细胞内的氧化LDL摄入抑制活性量如果大于从清道夫受体中的LOX-1比例换算的抑制活性量，就成为能够抑制氧化LDL通过LOX-1以外的清道夫受体摄入细胞。
在本发明中，可以使用以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物等，但这些卟啉类衍生物化合物具有与叶绿素、氰钴胺素、氯高铁血红素、羟高铁血红素、胆色素原等结构类似的卟啉类化合物不同的拮抗活性。作为在卟啉类化合物之间拮抗活性不同的理由还不明确，但例如为式(1)所示的卟啉类衍生物化合物时，因为酯链的碳原子数比其它类似化合物的短，所以可以认为酯链越短、活性越提高。
另外，为式(2)所示卟啉类衍生物化合物时，因为在环上没有与金属原子螯合，所以可以认为在活性表达中不需要与金属原子的螯合。
另外，如后述的实施例所记载，脱镁叶绿酸a也抑制氧化LDL经由小窝摄入细胞内。
本发明的动脉硬化抑制剂含有以上述式(1)或式(2)表示的卟啉类衍生物化合物，但也可以只含有上述卟啉类衍生物化合物，如果不妨碍拮抗活性，也可以含有其它成分。作为其它成分，没有特别限定。
另外，本发明的动脉硬化抑制剂，可以使用公知的技术配合到食品、医药等组合物中。此时，既可以原样使用上述组合物，也可以配合在各种基材中。基材种类没有特别限定，可以适当设定，但从可以简易地配合到食品等中的观点出发，例如优选片剂、胶囊、麦芽糖、橡皮糖或饮剂等经口投与基材。但是，因为脱镁叶绿酸a也称为是光过敏症的原因因子，所以希望其配合量为每100g组合物100mg以下。
另外，作为食品，一般食品是在各种食品原料中加入上述化合物的期望量、利用通常的制造方法进行加工，另外作为健康食品、功能食品，可以将上述化合物原样使用或做成容易食用的状态而使用。
另外，作为医药，可以列举片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂、液剂等，这些可以按照通常方法与增量剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、结合剂、矫味矫臭剂等一起进行制剂。
在这些组合物中，上述动脉硬化抑制剂的1日的投与量，根据症状、身高、体重、年龄等而不同，但优选按照成人每人的摄取量为0.1mg/kg·日以下，分成1次或几次向被检验体投与。
另外，在本发明中，作为标的的LOX-1，不仅在人或非人的哺乳动物(例如猴、牛、猪、马、羊、山羊、驴、骆驼、兔、狗、猫、鼠、小鼠、土拨鼠、鸡、鸭、鹅等哺乳动物等)的血管内皮细胞，而且在巨噬细胞、平滑肌细胞中也存在，可以认为在各种细胞中，氧化LDL的摄入在动脉硬化症发作时起着重要作用。因此，本发明的动脉硬化抑制剂因为在血管内皮细胞等动脉硬化症相关的多数细胞群中具有显著抑制氧化LDL摄入的作用，所以可以期待多方面而且显著地抑制动脉硬化症，还因为安全性优异、所以也可以期待动脉硬化的预防效果。
以下，基于实施例详细说明本发明，但本发明不被这些实施例限定。
实施例
另外，在实施例中使用的试样如下操作配制。
1.bLOX-1、hLOX-1的cDNA
上述bLOX-1、hLOX-1的cDNA克隆根据上述非专利文献4中记载的方法进行。
即，关于bLOX-1，将由血管内皮细胞的cDNA文库各自分离出来的克隆导入表达载体中，在COS-7中进行瞬时表达。此后，在与Dil-OxLDL的共同培养后，由细胞分选仪进行Dil阳性细胞的分离，回收质粒。反复3次该筛选方法，分离单克隆。
另外，关于hLOX-1，利用随机引物和寡聚dT引物，从人肺的cDNA文库进行扩增。使用全长bLOXcDNA，进行阳性筛选，取得部分片段的hLOXcDNA后，通过5’-RACE取得上游序列。
(向TetOn载体中的插入)
用Prel、BamHI消化pcDNA31-hLOX1-V5质粒(Journal ofMolecular and Cellular Cardiology 39(3)553—561(2005))，供给琼脂糖凝胶电泳，切出、提取凝胶，回收h-LOX-1片段。用EcoRV、BamHI消化pTRE2hyg质粒，供给琼脂糖凝胶电泳，切出、提取凝胶，回收Tet应答载体片段。将回收的h-LOX-1片段和Tet应答载体片段连接，转化大肠杆菌。从大肠杆菌回收、精制导入质粒，将得到的质粒DNA作为pTRE-hLOX1(B)。
使用Lipofectoamine2000(Invitrogen生产)，向CHO-K1 Tet-On CellLine(Clontech)中导入由FspI直链化的pTRE-hLOX1(B)，进行潮霉素的选择培养，使之形成细胞集落。挑取单细胞集落，取得12株细胞株。对各细胞株，在培养基中添加强力霉素，配制进行了表达诱导的细胞提取液，通过使用抗V5抗体的免疫印迹，得到3株诱导效率更高的细胞株。
(SR-AII表达细胞株的制作)
人SR-A II的cDNA克隆，以来自人正常脾脏cDNA(Invitrogen)为模板，由PCR取得全长序列(1077个碱基对)。另外，在上游侧的引物中，在5’侧额外附加CACC序列。在pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)中插入这样扩增的PCR产物，转化入Mach1细胞(Invitrogen)中。利用细胞集落PCR法等通常方法，从得到的转化体中挑选预想具有正确插入SR-AII全长序列的质粒的克隆，进行该质粒序列的测序。对于由测序确认为正确序列的质粒，进一步在作为动物细胞表达用载体的pDEST26(Invitrogen)中，按照手册，进行位点特异重组反应。将得到的具有SR-AII全长序列的pDEST26载体转染入COS-1细胞(Health Science Research Resources Bank)中，培养48小时后，取得瞬时表达株。
2.抗LOX-1抗体
抗LOX-1抗体根据在非专利文献4中记载的方法制造。
即，用5mM EDTA-PBS处理(室温、5分钟)表达bLOX-1或hLOX-1的CHO细胞后，在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液(25mM的HEPES(pH7.4)、10mM的氯化镁、0.25M的蔗糖和蛋白酶抑制剂(10U/mL的Aprotinine，2μg/mL的Pepstatin、50μg/mL的Leupeptin和0.35mg/mL的APMSF)中悬浊，以Potter式均化器破碎，低速离心(1500rpm、10分钟、4℃)。接着，回收上清液，超离心(100000g、1小时、4℃)，回收沉淀的膜部分，在磷酸缓冲液中悬浊，在—20℃下保存。将该悬浊液用作牛或人抗体的制作(免疫源)。
将得到的细胞膜部分在正常小鼠上免疫，配制对牛或人LOX-1的小鼠单克隆抗体。
单克隆抗体的制作，按照在实验医学(别册)Cell EngineeringHandbook(黑木登志夫等编集、羊土社发行、p66-74、1992年)和单克隆抗体实验操作入门(安东民卫等著作、讲谈社发行、1991年)中记载的一般方法配制。
另外，所谓抗LOX-1抗体，是以LOX-1作为抗原的特异抗体，称为由抗原抗体反应、作为LOX-1的拮抗发挥作用。
3.PBS缓冲液
关于PBS缓冲液，在精制水中混合137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠十二水合物、1.8mM磷酸二氢钾，用适量盐酸将pH配成7.4。
4.氧化LDL
氧化LDL的配制如下述进行。在离心管中加入健康人的血浆，加入溴化钾，将比重调整为1.019后，用Beckman L-80超离心机离心(20小时、58000rpm)，在另外的管中回收下层。测定回收的液量，加入溴化钾，将比重调整为1.063。接着，用Beckman L-80超离心机离心(20小时、58000rpm)，在另外的管中回收上层。磷酸缓冲液(将外液交换2次以上)回收的部分，得到精制的人LDL。
为了从得到的精制LDL配制氧化LDL，将精制LDL和硫酸铜浓度分别配制成3mg/mL和75μM，将得到的溶液在CO2恒温箱内恒温20小时。接着，在含有EDTA的0.15M的氯化钠溶液中透析(将外液交换2次以上)，得到人氧化LDL。
(实施例1)
脱镁叶绿酸a乙酯，使用公知的方法由脱镁叶绿酸a(pheophorbidea，Frontier Scientific社生产)进行衍生。即，将脱镁叶绿酸a(20mg)和二叔丁基二碳酸酯(di-tert-butyl dicarbonate，0.32mmol)和二甲基氨基吡啶(dimethylaminopyridine，4mg)搅拌10分钟后，加入乙醇(ethanol，0.32mmol)，再搅拌1小时。生成物在顺相柱色谱中用氯仿—甲醇(25∶1)精制，得到6mg(33％)脱镁叶绿酸a乙酯。
(试验例1)
关于在上述各实施例中得到的动脉硬化抑制剂的LOX-1拮抗活性，关于氧化LDL的LOX-1结合抑制率，使用由大肠杆菌得到的重组LOX-1蛋白质进行评价。
关于重组LOX-1，将在来自牛的LOX-1(bLOX-1)或来自人的LOX-1(hLOX-1)的cDNA中除去跨膜区域的直到C末端的序列，以符合翻译框架的序列插入在N末端具有6个组氨酸标签序列(6×His)的pQE30载体(Qiagen社生产)中。将该载体在能够用T5启动子控制的大肠杆菌中进行转化，在1mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷酶(IPTG)诱导下进行各LOX-1的表达诱导。37℃、3小时的表达诱导后，从不溶性部分得到重组LOX-1，因此在含有6M胍盐酸盐的缓冲液中溶解大肠杆菌，利用Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen社生产)以6×His为指标进行亲和性柱精制(溶剂：磷酸缓冲液)。还对含有各LOX-1的洗脱部分，在含有20mM Tris缓冲液(pH9.0)、8M尿素的缓冲液中透析，使用作为阴离子交换体的HiTrap Q柱(Amersham社生产)，由NaCl的线性浓度梯度进行洗脱、精制。这样操作而得到的含有各LOX-1的部分，在含有过量的DTT(二硫苏糖醇)的缓冲液中进行还原处理，此后，由利用低分子硫醇化合物的氧化型(GSH)和还原型(GSSG)混合物的氧化还原体系，进行分子内S-S键的卷起。这样操作得到的各LOX-1具有对氧化LDL的结合能力，作为利用以下的平板测定(plateassay)的试验用LOX-1标准品使用。
平板测定加入MaxiSorp Immuno板(商品名，96孔板、NUNC社生产)进行。用PBS缓冲液将上述精制的各LOX-1配制成5μg/mL，在各孔中各加入100μL。在4℃静置1晚后，用PBS缓冲液以400μL×2次洗净各孔，在各孔中加入含有25％BlockAce(大日本住友制药社生产)的PBS缓冲液300μL。在4℃静置1晚后，用PBS缓冲液以400μL×2次洗净各孔，在各孔中加入以含有1％牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液稀释成适当稀释倍率而配制的脱镁叶绿酸a乙酯各100μL。在4℃静置1晚后，用PBS缓冲液以400μL×3次洗净各孔，在各孔中加入以PBS缓冲液配制成5μg/mL的氧化LDL各100μL。在4℃静置1晚后，用PBS缓冲液以400μL×3次洗净各孔，用PBS缓冲液将结合了来自西洋辣根的过氧物酶的抗载脂蛋白B抗体(TheBinding Site社生产)稀释成1000倍，在各孔中各加入100μL。在室温下静置2小时后，用PBS缓冲液以400μL×5次洗净各孔，在各孔中加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧物酶-酶免疫测定(EIA)—基质—试剂盒试剂(Bio-Rad社生产)各100μL。在适当的反应时间后，在各孔中加入50μL的2M H2SO4、使反应停止。最终在450nm处进行检测，定量LOX-1拮抗活性(相对LOX-1的氧化LDL结合抑制率)。
(实施例2)
使用与试验例1同样的方法，进行脱镁叶绿酸a(Frontier Scientific社生产)的评价。
(实施例3)
使用与试验例1同样的方法，进行血卟啉(hematoporphyrin，和光纯药工业生产)的评价。
(实施例4)
使用与试验例1同样的方法，进行尿卟啉III(uroporphyrinIII，Frontier Scientific社生产)的评价。
(比较例1)
使用与试验例1同样的方法，进行叶绿素a(chlorophyll a，和光纯药工业生产)的评价。
(比较例2)
使用与试验例1同样的方法，进行叶绿素b(chlorophyll b，和光纯药工业生产)的评价。
(比较例3)
使用与试验例1同样的方法，进行氰钴胺素(cyanocobalamin，和光纯药工业生产)的评价。
(比较例4)
使用与试验例1同样的方法，进行氯高铁血红素(haemin，AlfaAesar社生产)的评价。
(比较例5)
使用与试验例1同样的方法，进行羟高铁血红素(hematin，AlfaAesar社生产)的评价。
(比较例6)
使用与试验例1同样的方法，进行胆色素原(porphobilinogen，Frontier Scientific社生产)的评价。
(比较例7)
使用与试验例1同样的方法，进行脱镁叶绿素a(pheophytin a，和光纯药工业生产)的评价。
(比较例8)
使用与试验例1同样的方法，进行脱镁叶绿素b(pheophytin b，和光纯药工业生产)的评价。
(比较例9)
使用与试验例1同样的方法，进行Mg2+(来自MgCl2)的评价。
另外，以下表示在实施例和比较例中进行评价的各化合物的结构。
在上述式(1)所示的化合物中，脱镁叶绿酸a乙酯(R1＝R7＝CH2CH3，R2＝R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2)、脱镁叶绿酸a(R1＝H，R2＝R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2，R7＝CH2CH3)、叶绿素a(R1＝叶绿基，R2＝R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2，R7＝CH2CH3，N与Mg螯合)、叶绿素b(R1＝叶绿基，R2＝R3＝R4＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2，R6＝CHO，R7＝CH2CH3，N与Mg螯合)、脱镁叶绿素a(R1＝叶绿基，R2＝R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2，R7＝CH2CH3)、脱镁叶绿素b(R1＝叶绿基，R2＝R3＝R4＝R8＝CH3，R5＝CH∶CH2，R6＝CHO，R7＝CH2CH3)。
在上述式(2)所示的化合物中，氯高铁血红素(R1＝R2＝H，R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝R7＝CH∶CH2，N与Fe螯合，Cl结合在Fe上)，羟高铁血红素(R1＝R2＝H，R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝R7＝CH∶CH2，N与Fe螯合，OH结合在Fe上)，血卟啉(R1＝R2＝H，R3＝R4＝R6＝R8＝CH3，R5＝R7＝CH∶CH2)，尿卟啉III(R1＝R2＝H，R3＝R4＝R6＝R8＝CH2COOH，R5＝R7＝CH2CH2COOH)。
另外，“叶绿基”表示CH2CH＝C(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)2。
在图1中表示上述实施例1～4、比较例1～9的结果中相对bLOX-1的氧化LDL的结合率的结果。关于各抑制剂，都以最终浓度16μM进行试验。可知脱镁叶绿酸a乙酯、脱镁叶绿酸a、血卟啉、尿卟啉III都有意地抑制结合。
其中，脱镁叶绿酸a乙酯、脱镁叶绿酸a、血卟啉显示高的抑制活性。
另外，关于抑制活性特别高的脱镁叶绿酸a，调查浓度依存性。在图2中表示其结果。这样，从本试验得到的IC50约是0.1μM。
在图3中表示相对hLOX-1的氧化LDL的结合率的结果。添加各化合物，使最终浓度为16μM。即使在人型LOX-1中也显示与相对牛LOX-1的抑制形式同样的倾向，来自人的LOX也被确认活性。
(实施例5)
为了验证由上述实施例1～4、比较例1～9的化合物引起的细胞毒性，如下测定活细胞数。作为测定活细胞数的方法，广泛采用利用向由线粒体内脱氢酶引起的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑溴化物)向甲臢(作为难溶性沉淀物生成)的还原的MTT法等。因此，使用利用上述MTT法的变形方法的“Cell counting Kit-8”(同仁化学研究所生产，取代MTT、使用生成水溶性甲臢的WST-8)，进行活细胞数的测定。具体地，以3.0×104cells/mL，在96孔板(Falcon社生产)的板中心部分的60孔中进行每100μL细胞的接种(在外侧的36孔中为了没有温度变化，只添加100μL培养基)。培养(37℃)2日后，除去50μL培养上清液，添加以适当稀释倍率含有各化合物的50μL新培养液。在添加含有化合物的新培养液后，进行7小时的培养。7小时后，用不含化合物的100μL的培养基进行3次各孔的洗净后，在各孔中添加含有作为“Cell counting Kit-8”溶液的“WST-8”的培养基各3μL。培养1小时后，测定上述培养液的450nm吸光度，换算为活细胞数。另外，因为中途进行了3次的洗净操作，所以可以认为没有由外来液体的化合物引起的对吸光度的影响。
(实施例6)
关于与实施例5同样的化合物，通过使用来自稳定地表达bLOX-1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞，评价抑制荧光标记氧化LDL通过bLOX-1摄入CHO细胞内的能力。另外，关于hLOX-1，评价在使用四环素基因表达诱导体系的CHO细胞中荧光标记氧化LDL通过hLOX-1摄入的抑制能力。
关于依存于四环素浓度表达hLOX-1的CHO细胞，使用以公知的方法导入下述质粒的细胞。导入质粒是在pcDNA3.1-hLOX1-V5(Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39(3)553-561(2005))中导入的hLOX-1编码区域，导入四环素应答载体，依存于四环素或强力霉素浓度进行hLOX-1的表达调整的体系。
关于使用上述CHO细胞的化验，如下进行。在24孔板(Falcon社生产)中，以2.0×104cells/mL，在各孔中加入各500μL的含有10％胎牛血清(FBS、但是不含四环素)的HamF12培养基(GIBCO社生产)，进行细胞的接种，在37℃、5％的CO2浓度环境下培养1日。培养1日后，除去250μL培养上清液，以200μg/mL的浓度，添加含有强力霉素的250μL的新培养液(强力霉素的最终浓度是100μg/mL)。再培养1日后、除去培养上清液，在各孔中添加各500μL以适当稀释倍率含有各化合物的新培养液。在添加含有各化合物的新培养液后，通过在上述环境下进行1小时的前处理，进行提取物与LOX-1的结合反应。此后，以5μg/mL在各孔中使用作为羰花青荧光色素的1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(Dil：Invitrogen社生产)标记的氧化LDL，在上述环境下进行4小时荧光标记氧化LDL向CHO细胞内的摄入处理。在进行了这些处理后，用1mL PBS缓冲液3次洗净各孔，通过0.1％SDS进行细胞溶解。溶解后，回收一定量的溶解液，分别注入96孔的黑板(NUNC社生产)，使用Dil作为标记测定摄入的氧化LDL。荧光测定仪器使用Molecular Devices社的“SPECTRA MAXGEMINI EM”，以激发波长540nm、检测波长585nm、遮断波长570nm进行。
将bLOX-1稳定表达的CHO细胞，按照现有的方法进行继代·维持(Nature，Vol.385，p73-77，1997)。关于使用了细胞的化验，如下进行。在24孔板(Falcon社生产)中，以3.0×104cells/mL在各孔中添加500μL的含有10％胎牛血清(FBS)的HamF12培养基，进行细胞的接种，在37℃、5％的CO2浓度环境下培养2日。培养2日后，除去250μL培养上清液，添加250μL以适当的稀释倍率含有各化合物的新培养液。在添加了含有各化合物的新培养液后，通过在上述环境下进行1小时的前处理，进行提取物向LOX-1的结合反应。此后，以5μg/mL在各孔中使用作为羰花青荧光色素的1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(Dil：Invitrogen社生产)标记的氧化LDL，在上述环境下进行6小时向CHO细胞内的荧光标记氧化LDL的摄入处理。在进行了这些处理后，用1mL PBS缓冲液3次洗净各孔，通过0.1％SDS进行细胞溶解。溶解后，回收一定量的溶解液，分别注入96孔的黑板(NUNC社生产)，使用Dil作为标记，测定摄入的氧化LDL。荧光测定仪器使用Molecular Devices社的“SPECTRAMAX GEMINI EM”，以激发波长540nm、检测波长585nm、遮断波长570nm进行。
图4、5分别表示在实施例6中进行的表达bLOX-1、hLOX-1的CHO细胞的氧化LDL的摄入量的结果。bLOX-1、hLOX-1都确认活性的有数种，但特别是脱镁叶绿酸a在hLOX-1中显示比抗hLOX抗体更强的摄入抑制。
另外，在图中没有表示，但由在实施例5进行的以线粒体活性为指标的细胞毒性试验，可知该抑制效果都不是因细胞毒性而引起。同样地，在脱镁叶绿酸a乙酯、血卟啉和尿卟啉III显示有效的抑制活性的浓度下未见细胞毒性。
(实施例7)
关于与实施例1、2同样的化合物，与实施例6同样地关于各抑制剂验证相对于来自非洲绿猴肾脏的(COS-1)细胞(Health ScienceResearch Resources Bank)、bLOX表达CHO细胞、hLOX表达CHO细胞、SR-A II表达CHO细胞、正常大动脉内皮细胞(BAEC、CellApplications Inc.社生产)的各细胞，Dil-OxLDL的摄入、结合作为网格蛋白小泡输送的特异标记的Alexa568的运铁蛋白(激发波长548nm、检测波长605nm、Molecular Probes社)的摄入、结合作为小窝通路的输送标记的Alexa488的CTB(cholera toxin subunit B、激发波长480nm、检测波长530nm、Molecular Probes社)的摄入。另外，制霉菌素(Wako社生产)作为小窝输送的特异抑制剂使用。
图6表示由实施例7的方法得到的各标记的摄入量的结果。由在COS-1细胞的摄入结果，因为脱镁叶绿酸a也显著抑制小窝输送通路，可以确认脱镁叶绿酸a具有脂蛋白经由小窝内吞于细胞内而产生的氧化LDL摄入抑制能力。另外，因为Dil-OxLDL在bLOX表达CHO细胞中由制霉菌素与CTB同等程度地被抑制，所以Dil-OxLDL的输送通路其大多依存于小窝输送通路，暗示脱镁叶绿酸a具有称为LOX-1拮抗活性和小窝输送抑制的2个抑制活性。从该结果也暗示在正常大动脉内皮细胞中、脱镁叶绿酸a具有抗LOX-1抗体以上的抑制活性，具有比单纯的拮抗作用更强的摄入抑制能力。令人惊奇的是该脱镁叶绿酸a不仅具有由LOX产生的氧化LDL摄入的抑制能力，而且也明确具有由SR-A产生的氧化LDL摄入的抑制能力。因此，合并SR-A和内皮细胞的结果，因为该脱镁叶绿酸a具有对各种清道夫受体的改性LDL摄入抑制能力得到暗示，所以对作为摄入改性LDL的细胞的平滑肌细胞也进行了验证。
另外，对脱镁叶绿酸a乙酯、血卟啉和尿卟啉III也可见与脱镁叶绿酸a类似的抑制倾向。
(实施例8)
关于实施例1、2和比较例6的化合物，以与实施例6同样的方法进行相对平滑肌细胞的氧化LDL摄入抑制能力的评价。
以1×105cells/mL配制平滑肌细胞，向96孔板接种。培养2日后，以与实施例6同样的方法由各抑制剂进行处理。抑制剂处理后，由PBS进行3次洗净，在室温·暗处以10％甲醛溶液进行10分钟固定。用超纯水2次洗净进行了固定处理的细胞，由DAPI进行核染色。将这些细胞由“IN Cell Analyzer”(GE Healthcare Bio-Sciences株式会社生产)，算出以核数除Dil标记氧化LDL向平滑肌细胞的摄入。另外，每1孔测定4个视野、每1个处理用n＝3测定。
图7表示由实施例8得到的试验结果。使用胆色素原(Porphobillinogen)。这样，与内皮细胞同样、在平滑肌细胞中，脱镁叶绿酸a也表示非常强的摄入抑制能力，而且显示抗LOX-1抗体以上的抑制效果。因此，从这些结果可以暗示：脱镁叶绿酸a即使在与内皮细胞、巨噬细胞同样进行改性LDL的摄入、与动脉硬化症初期病变有深刻关联的平滑肌细胞中，具有LOX-1的拮抗活性、输送抑制或氧化LDL通过其它清道夫受体摄入的抑制能力，由此是多方面的抑制剂。
另外，关于血卟啉和尿卟啉III也可见和脱镁叶绿酸a类似的抑制倾向。
上述动脉硬化抑制剂向食品组合物、医药组合物中的添加量，优选每100g上述组合物是100mg以下，具体地，考虑有效浓度等之后，以5～10mg添加，可以兼顾安全性和有效性。例如，作为食品组合物、医药组合物的配合例，可以列举以下的例子。
(实施例9)
向糖果中的配合例
在150℃加热溶解砂糖64g、麦芽糖35g，冷却到120℃后，添加柠檬酸1g、动脉硬化抑制剂5～10mg，搅拌后，将均匀后的物质成型，冷却后得到糖果。
(实施例10)
向橡皮糖中的配合例
以110℃加热溶解砂糖45g、麦芽糖50g，添加另外膨润溶解的明胶8g，再添加混合柠檬酸2g、动脉硬化抑制剂5～10mg。流入模具，静置一昼夜后，从模具卸下，得到橡皮糖。
(实施例11)
向片剂中的配合例
均匀混合糊精20g、乳糖10g、帕拉金糖15g、马铃薯淀粉40g、硬脂酸镁5g、动脉硬化抑制剂5～10mg，将得到的组合物用流动法造粒后干燥，再用压片机压片得到片剂。
(实施例12)
向胶囊剂中的配合例
混合搅拌三十碳六烯20g、亚麻酸三甘油酯20g、小麦胚芽油10g、精制沙丁鱼油20g、生育酚0.2g，做成均匀的组合物。在该组合物中加入脱脂大豆粉39.8g和动脉硬化抑制剂5～10mg，由捏合机充分混炼。将得到的混炼物用胶囊填充机进行胶囊化，得到胶囊剂。
产业上的可利用性
本发明的动脉硬化抑制剂，抑制氧化LDL与作为氧化LDL受体的LOX-1的结合的拮抗作用、通过LOX-1和LOX-1以外的清道夫受体的脂质摄入作用、或利用小窝经由向细胞内的内吞引起的氧化LDL摄入抑制能力优异，另外，氧化LDL向相关于血管内皮细胞等动脉硬化症的细胞的摄入继续被抑制，结果人或非人动物中的动脉硬化症发作被抑制，另外，可以期待缓和症状。
在上述中叙述了本说明书所包含的本发明的许多优点，但该公开只不过在多方面例示而理解。如果不脱离本发明的范围，在细节方面，特别是关于部件形状、大小和配置等事项，能够进行各种变更。
当然，本发明的范围由附加的请求保护的范围中涉及的文字所限定。

Claims (9)

1.一种动脉硬化抑制剂，其特征在于：含有下述式(1)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用，
式(1)：
Figure A200780032217C00021
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自氢或者直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基。
2.一种动脉硬化抑制剂，其特征在于：含有下述式(2)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用，
式(2)：
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基、羧甲基、羧乙基。
3.如权利要求1所述的动脉硬化抑制剂，其特征在于：所述式(1)所示的卟啉类衍生物化合物是脱镁叶绿酸a和脱镁叶绿酸a乙酯。
4.如权利要求2所述的动脉硬化抑制剂，其特征在于：所述式(2)所示的卟啉类衍生物化合物是血卟啉和尿卟啉III。
5.如权利要求1～4中任一项所述的动脉硬化抑制剂，其特征在于：具有抑制氧化LDL通过LOX-1以外的清道夫受体摄入细胞的作用。
6.如权利要求1～4中任一项所述的动脉硬化抑制剂，其特征在于：具有抑制氧化LDL经由小窝摄入细胞内的作用。
7.一种食品组合物，其特征在于：含有权利要求1～6中任一项所述的动脉硬化抑制剂。
8.一种医药组合物，其特征在于：含有权利要求1～6中任一项所述的动脉硬化抑制剂。
9.一种组合物，其特征在于：含有下述式(1)或式(2)所示的卟啉类衍生物化合物或其酯类作为有效成分，并具有凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)拮抗作用，
式(1)：
Figure A200780032217C00041
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自氢或者直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基，
式(2)：
Figure A200780032217C00042
式中，R1、R2分别选自氢或者直链状或支链状的饱和或不饱和的具有1～4个碳原子的烃链；R3至R8分别选自直链状的饱和或不饱和的具有1～2个碳原子的烃基或者甲酰基、羧甲基、羧乙基。
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