WO2008001884A1 - Agents anti-artériosclérose - Google Patents

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WO2008001884A1
WO2008001884A1 PCT/JP2007/063094 JP2007063094W WO2008001884A1 WO 2008001884 A1 WO2008001884 A1 WO 2008001884A1 JP 2007063094 W JP2007063094 W JP 2007063094W WO 2008001884 A1 WO2008001884 A1 WO 2008001884A1
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group
lox
carbon atoms
formula
cells
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PCT/JP2007/063094
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English (en)
French (fr)
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Akinobu Kishi
Koji Yuasa
Taiji Matsukawa
Takeki Matsui
Yasumasa Yamada
Ichiro Yamada
Original Assignee
Uha Mikakuto Co., Ltd.
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to an arteriosclerosis inhibitor and a food composition containing the same, or a pharmaceutical composition containing the same.
  • Arteriosclerosis has recently become a consensus that obesity, which is mainly caused by overfat diet and lack of exercise, is a symptom located downstream of the most common metabolic syndrome. Further progression of arteriosclerosis forms a thrombus, causing heart disease and cerebrovascular disease.
  • Atherosclerosis begins with the onset of low-density lipoprotein (LDL) degeneration due to oxidative stress, etc., and vascular endothelial dysfunction due to uptake into vascular endothelial cells, and subsequent sequential processes include macrophages and blood.
  • LDL low-density lipoprotein
  • vascular endothelial dysfunction due to uptake into vascular endothelial cells
  • subsequent sequential processes include macrophages and blood.
  • Differentiation of vascular smooth muscle ⁇ Presents foaming phenomenon due to dedifferentiation.
  • thrombus formation occurs through a stenotic lesion.
  • lipid degeneration due to oxidative stress which is an early lesion, or modified LDL is taken up by vascular endothelial cells. It is important to suppress the functional dysfunction.
  • Non-Patent Document 1 SR-A (Class A scavenger receptor), a macrophage scavenger receptor, suppresses arteriosclerosis, but rather reports an increase in blood cholesterol levels.
  • Non-Patent Document 2 it has been reported that when SR-A is overexpressed, cholesterol uptake into macrophages is promoted but arteriosclerosis is not promoted (for example, Non-Patent Document 2). In other words, elevated blood cholesterol and lipid accumulation in macrophages are considered secondary to the progression of arteriosclerosis.
  • Non-Patent Document 3 it is said that one out of every two people with cardiovascular disease has normal serum lipids, and that the preventive effect for preventing lipid degeneration is not sufficient other than vitamin E (for example, Non-Patent Document 3). In other words, not all arteriosclerosis can be prevented or improved by improving blood lipids.
  • vascular endothelial cell dysfunction which is the initial cause of arteriosclerosis together with lipid degeneration, is caused by denatured LDL, particularly oxidized LDL is an oxidized LDL receptor LOX-l (lectin-like oxidized low density i3 ⁇ 4 Riho Pro Ain receptions grayed 1 - 1: Lectin- like oxidized low -density lipoprotein rec mark there is a report that tor-1) depends on be incorporated into endothelial cells via (for example, non-Patent Document 4).
  • vascular endothelial cells contain at least 6 types including LO X-1. It is thought that scavenger receptors are functioning (for example, Non-Patent Document 6), and the dysfunction of vascular endothelial cells caused by the uptake of denatured LDL via these receptors is the expression of various adhesion factors. It causes upregulation and suppression of nitric oxide production, leading to monocyte / macrophage accumulation / foaming or smooth muscle cell migration-proliferation transformation. As a result, it is thought to develop arteriosclerosis.
  • LOX-1 is expressed not only in vascular endothelial cells, but also in macrophages and smooth muscle cells involved in arteriosclerosis as described above (Non-patent document 7). It has attracted a great deal of attention as a factor. For example, in apolipoprotein E-deficient mice overexpressing LOX-1, increased macrophage accumulation, increased adhesion factor expression, It has been confirmed that arteriosclerosis is promoted through dysfunction of vascular endothelial cells caused by overexpression of LOX-1, such as an increase in the site-like site (eg, Non-patent Document 8). Although LOX-1 is expected to have a very large impact on the development of arteriosclerosis, there are currently no commercial drugs that inhibit the binding of LOX-1 to denatured LDL. unknown.
  • endothelial cells and smooth muscle cells also have a so-called force viola, which is a membrane domain that performs endocytosis.
  • force viola is a membrane domain that performs endocytosis.
  • clathrin-coated pit is also a typical end-site cis-path other than the force beola.
  • endocytosis via force beola not only albumin (for example, Non-patent Document 9) and insulin (for example, Non-Patent Document 10) but also involvement in the transport of LDL or modified LDL has been reported. (For example, Non-Patent Document 11).
  • Force beola has its strength as a coat protein.
  • a mouse that is genetically deficient in force beolin-1 is crossed with an apolipoprotein E deficient mouse to create a double knockout mouse, the scavenger receptor A high level of anti-arteriosclerotic action accompanied by a decrease in the expression of CD36, which is one of the above, is confirmed (for example, Non-Patent Document 12).
  • the development of food 'drugs that target the inhibition of lipoprotein transport into cells via force veora can be used as an anti-arteriosclerosis inhibitor, similar to LOX-1 antagonists. It is expected to be connected. Therefore, if these can be suppressed at the same time, it can be expected to be a very excellent anti-arteriosclerosis inhibitor.
  • Chlorophyll is a source of ROS (reactive oxygen species) and is actively metabolized not only with leaf senescence but also with tissue damage. However, at the same time, this metabolic process has been suggested to control multiple defense reactions in plants (eg, Non-Patent Document 13), and chlorophyllase and Mg-dequilatase in the degradation of chlorophyll. By (Mg-dechelatase), pheophorbide a is formed through dephytolation and demagnetization.
  • ROS reactive oxygen species
  • ABCG2 cancer resistance protein
  • BCRP breast cancer resistance protein
  • ABC ATP-binding cassette
  • Non-patent document 14 ABCG2 is also a causative factor of multidrug resistance, and research has been conducted to develop anticancer substances by developing ABCG2 inhibitors using pheophorbide a as an index.
  • pheophorbide a is a force S, which is said to be a causative factor of photosensitivity, which is a phenomenon that occurs when a high concentration is consumed (500 mg / day or more in humans (Non-patent Document 15)).
  • Non-patent Document 16 220mg / kg or more (Non-patent Document 16)), and the current blending amount in Chlorella is considered to be no problem if it is 60-80mg or less in 100g of product.
  • the reticuloendothelial system which accumulates in the skin when intravenously injected with pheophorbide a, is the main accumulation target (Non-patent Document 17).
  • Non-Patent Document 1 Suzuki H. et al. Nature (1997); 386: 292-6
  • Non-Patent Document 2 Van Eck M. et al. Arterioscler Thromb Vase Biol (2000); 20: 2600-6
  • Non-Patent Document 3 Ross R. N Engl J Med (1999); 340: 115-26
  • Non-Patent Document 4 Sawamura T. et al. Nature (1997); 386: 73-7
  • Non-Patent Document 5 Murphy J. E. et al. Atherosclerosis (2005); 182: 1-15
  • Non-Patent Document 6 Adachi H. and Tsujimoto M. Prog Lipid Res (2006); 45: 379-404
  • Non-Patent Document 7 Chen M. et al. Pharmacol Ther (2002); 95: 89-100
  • Non-Patent Document 8 Inoue K. et al. Circ Res (2005); 97: 176-84
  • Non-Patent Document 9 Ghitescu et al. J Cell Sci. (1986); 102: 1304-11
  • Non-Patent Document 10 Bendayan S. et al. J Cell Sci. (1996); 109: 1857-64
  • Non-Patent Document 11 Kim M-J. Et al. Atherosclerosis (1994); 108: 5-17
  • Non-Patent Document 12 Philippe G. F. et al. Arterioscler Thromb Vase Biol (2003); 24: 98-1
  • Non-Patent Document 13 Kariola T. et al. Plant Cell (2005); 17: 282-94
  • Non-Patent Document 14 Robey R. W. et al. Cancer Res (2004); 64: 1242-6
  • Non-Patent Document 15 Kimura S. et al. Photomed. Photobiol. (1981); 3: 73
  • Non-patent literature 16 Matsuura E et al. Kitasato Arch. Exp. Med. (1988); 61: 201-13
  • Non-patent literature 17 Aprahamian S. et al. Anti-Cancer Drug Design (1993); 8: 101- 14 Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made from the above viewpoint, and is expressed in vascular endothelial cells, smooth muscle cells and the like, inhibits the binding of oxidized LDL to LOX-1, and inhibits LOX-1. It is an object of the present invention to provide an arteriosclerosis inhibitor having an antagonistic action having an ability to suppress the uptake of oxidized LDL into cells and having high safety, and a food or pharmaceutical composition containing the same.
  • the present invention has an ability to suppress the uptake of oxidized LDL via other scavenger receptors other than LOX-1, and further inhibits lipoprotein endocytosis via intracellular force ola. It is an object of the present invention to provide an arteriosclerosis inhibitor that exhibits multifaceted effects when it is suppressed, and a food or pharmaceutical composition containing the same.
  • the present inventor has eagerly searched for a component having an antagonistic effect on LOX-1 and having excellent ability to suppress oxidized LDL uptake including scavenger receptors other than LOX_l. did.
  • a compound having a porphyrin skeleton has a remarkable antagonistic action, and the present invention has been completed.
  • this compound was also found to have an effect of inhibiting lipoprotein uptake into cells by endocytosis.
  • the gist of the present invention is as follows:
  • R and R are each hydrogen, linear or branched, saturated or unsaturated.
  • R and R are hydrogen, linear or branched, saturated or unsaturated, respectively.
  • R force R is
  • a food composition containing the arteriosclerosis inhibitor according to any one of [1] to [6] [8] A pharmaceutical composition containing the arteriosclerosis inhibitor according to any one of [1] to [6] [9] A lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor (L ⁇ ) comprising a porphyrin derivative compound represented by the above formula (1) or (2) or an ester thereof as an active ingredient.
  • L ⁇ lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor
  • the antagonistic action in the present invention refers to the inhibition of the binding of oxidized LDL to LOX-1 and the uptake of oxidized LDL into cells, when evaluated by the method described in the Examples below. Means to inhibit.
  • Fig. 1 shows Ethyl pheohorbide a, Pheophorbide a, Chlorophyll a, Chlonophylla, and Cyano cobalamin. , Heemin, Hematin (Hematoporphyrin), uroporphyrin m (Uropo ⁇ hyrin III), vorhobilinogen, Pheophytin a, pheophytin a
  • Fig. 4 is a graph showing the results of the binding rate of oxidized LDL to bLOX-1 when Mg 2+ is used, and the vertical axis of the graph indicates the oxidized LDL to LOX-1 immobilized on the plate.
  • the amount of binding is shown as a relative value, and the control is calculated by setting the value of the treatment group not containing the compound as 100 and the value of the treatment group not containing the oxidized LDL as 0. Each compound has a final concentration of 16 It added so that it might become / M.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the concentration dependence of pheofluoride a having high antagonist activity among Examples 1 to 4 described later. In all dilution series, DMSO (dimethyl sulfoxide) is added at the same concentration.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FIG. 3 shows the results of the binding rate of oxidized LDL to hLOX_l.
  • the vertical axis of the graph is The amount of oxidized LDL bound to LOX-1 immobilized on the plate is shown as a relative value.
  • the control value is 100 for the treatment group containing no compound, and the control group containing no oxidized LDL is shown in FIG. The value is converted as 0. Each compound was added to a final concentration of 16 / M.
  • FIG. 4 shows the results of the amount of oxidized LDL uptake in CHO cells expressing bLOX-1 performed in Example 6.
  • the amount of fluorescence indicating the amount of oxidized LDL incorporated into the cells was subtracted from all treatments, and the value of the negative control was subtracted from those containing no compound and fluorescently labeled oxidized LDL.
  • the vertical axis represents a value converted with the control value obtained by dividing the fluorescence amount by the protein amount of the cell lysate as 100%.
  • FIG. 5 shows the results of the amount of oxidized LDL uptake in CHO cells expressing hLOX-1 performed in Example 6.
  • the amount of fluorescence indicating the amount of oxidized LDL incorporated into the cells was subtracted from all treatments, and the value of the negative control was subtracted from those containing no compound and fluorescently labeled oxidized LDL.
  • the vertical axis represents a value converted with the control value obtained by dividing the fluorescence amount by the protein amount of the cell lysate as 100%.
  • Fig. 6 shows the uptake of Dil-OxLDL and the small amount of clathrin in COS-1 cells, bLOX-expressing CHO cells, hLOX-expressing CHO cells, SR-AII-expressing COS-1 cells, and normal aortic endothelial cells.
  • transferrin transferrin
  • CTB transport marker for the force vector pathway for each inhibitor in the same manner as in Example 6 described below.
  • Nystatin was used as a specific inhibitor of CTB.
  • FIG. 7 shows the results of the ability to inhibit oxidized LDL uptake in smooth muscle cells.
  • the fluorescence intensity indicating the amount of oxidized LDL incorporated into the cells is divided by the fluorescence intensity derived from Dil-OxLDL and the number of nuclei derived from DAPI staining in the same field, and the average of all 12 fields is shown. Yes.
  • the control indicates that the treatment group does not contain an inhibitor.
  • the porphyrin derivative compound used in the present invention has the formula (1):
  • R and R are each hydrogen, linear or branched, saturated or unsaturated
  • R and R are each hydrogen, linear or branched, saturated or unsaturated.
  • Each is selected from a straight chain saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 2 carbon atoms or a group power consisting of a forminore group, a carboxymethyl group, and a carboxyethyl group.
  • R is water
  • R, R, R, R, R, and R are straight-chain saturated carbonized carbon atoms:! ⁇ 2
  • R is a straight chain having 2 to 4 carbon atoms
  • Ethylene groups are preferred because unsaturated hydrocarbon groups are preferred.
  • Hydrogen atom more preferably a hydrogen atom, preferably a straight-chain saturated hydrocarbon group having 1 to 2 carbon atoms.
  • R, R, R, and R include straight-chain saturated hydrocarbon groups having from 2 to
  • a methyl group and a carboxymethyl group are preferred, with a cymethyl group being preferred.
  • C 2-4 linear unsaturated hydrocarbon groups and carboxyethyl groups are preferred. Of these, a carbonyl group and a carboxyethyl group are more preferred.
  • porphyrin-based derivative compound represented by the formula (1) pheopheofluoride a and ethyl pheopheofluoride a are preferable from the viewpoint of excellent effects (particularly the antagonist action).
  • porphyrin-based derivative compound represented by the formula (2) hematoporphyrin and uroporphyrin III are preferable from the viewpoint of excellent effects (particularly the antagonist action).
  • the porphyrin derivative compound represented by the formula (1) or (2) not only has an oxidative LDL receptor (L 0X-1) antagonistic action but also oxidizes via other scavenger receptors. It also suppresses LDL uptake, and further has the effect of suppressing the uptake of oxidized LDL into the cell via a force beola into the cell. As a result, it has the effect of inhibiting endothelial cell dysfunction or anti-arteriosclerosis.
  • porphyrin-based derivative compound represented by the formula (1) or (2) can be synthesized by a known method using commercially available raw material strength such as chlorophyll.
  • the porphyrin derivative compound represented by the formula (1) or (2) includes esters.
  • Esters include methyl esters, ethyl esters, propyl esters, butyl esters and the like.
  • the porphyrin derivative compound represented by the above formula (1) or (2) has a higher scavenger receptor other than LOX-1 from the viewpoint of further improving the arteriosclerosis suppressing effect. What has the effect
  • the scavenger receptor other than LOX-1 is a receptor other than LOX-1 present in vascular endothelial cells, macrophages, smooth muscle cells, etc., and binds to LDL and is taken into the cells. It is a receptor that can be incorporated.
  • scavenger receptors examples include SR-A 1/11, SR_B1, CD36, MARCO, CD68, SRECs, SR_PSOX, FEEL-l, etc., types A, B, C, D, E, F, G, Although it is divided roughly into H, there is no limitation in particular.
  • LOX if the amount of activity to inhibit the incorporation of oxidized LDL into cells is greater than the amount of inhibitory activity converted from the ratio of LOX-1 in the scavenger receptor, LOX Suppose that the uptake of oxidized LDL into cells via a scavenger receptor other than -1 is inhibited.
  • These porphyrin derivative compounds are chlorophyll, cyanoconamine, hemin, hematin. It has an antagonist activity that is different from porphyrin compounds having similar structures such as vorfubilinogen.
  • the reason why the antagonistic activity is different between the porphyrin compounds is not clear, but for example, in the case of the porphyrin derivative compound represented by the formula (1), the number of carbon atoms in the ester chain is other similar. Therefore, the shorter the ester chain, the better the activity. In addition, in the case of the porphyrin derivative compound represented by the formula (2), since it is not chelated with a metal atom in the porphyrin ring, it is considered that chelation with the metal atom is not necessary for the expression of activity.
  • pheophorbide a further inhibits the uptake of oxidized LDL into cells via force veora.
  • the arteriosclerosis inhibitor of the present invention contains the porphyrin derivative compound represented by the formula (1) or (2), but it may be only the porphyrin derivative compound, and does not hinder the antagonist activity. If it is, you may contain another component. Other ingredients are not particularly limited.
  • the arteriosclerosis inhibitor of the present invention can be used to combine a food product and a pharmaceutical composition with a known technique.
  • the composition may be used as it is, but may be blended with various base materials.
  • the type of base material is not particularly limited, and may be set as appropriate.
  • the blending amount is 100 mg or less per 100 g of the composition.
  • the desired amount of the compound is added to various food raw materials and processed by a normal production method, and the compound is used as a health food or a functional food. It can be used as it is or in an easy-to-eat state.
  • Examples of pharmaceuticals include tablets, powders, granules, capsules, suppositories, injections, liquids, and the like, and these include bulking agents, excipients, lubricants, disintegrants, binders, taste masking agents. Along with flavoring agents What is necessary is just to formulate according to a normal method.
  • the daily dosage of the above-mentioned arteriosclerosis inhibitor in these compositions varies depending on symptoms, height, weight, age, etc.
  • the intake per adult is 0.1 mg / kg'day.
  • LOX-1 targeted in the present invention is a non-human mammal (eg, monkey, urchin, pig, horse, hidge, goat, ronoku, latada, usagi, inu , Cats, mice, mice, guinea pigs, birds, mammals such as ducks, geese, etc.) as well as macrophages and smooth muscle cells, and each cell takes up oxidized LDL.
  • the arteriosclerosis inhibitor of the present invention has an action of remarkably inhibiting the uptake of oxidized LDL in a plurality of cell groups involved in arteriosclerosis such as vascular endothelial cells.
  • it can be expected to suppress arteriosclerosis, and since it is excellent in safety, it can also be expected to prevent arteriosclerosis.
  • bLOX-1 was transiently expressed in COS-7 by incorporating each independent clone from the cDNA library of vascular endothelial cells into the expression vector. Then, after co-culture with DiI_Ox LDL, Dil positive separation was performed using a cell sorter, and the plasmid was recovered. This screening method was repeated three times to isolate a single clone.
  • hLOX-1 human lung cDNA library was amplified with random primers and oligo dT primers. Perform positive screening using full-length bLOX cDNA, obtain hLOX cDNA of a partial fragment, and then obtain upstream sequences using 5'_RACE. [0042] (Insertion into TetOn vector)
  • the pcDNA31-hLOXl-V5 plasmid (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39 (3) 553-561 (2005)) was digested with Prel and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel was excised and extracted. One fragment was recovered.
  • the pTRE2hyg plasmid (Clontech, Tet * n) was digested with EcoRV and BamHI, subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel was excised and extracted to recover the Tet response vector fragment.
  • the recovered h-LOX_l fragment and a single Tet response vector fragment were ligated to transform E. coli.
  • the introduced plasmid was recovered from E. coli and purified, and the resulting plasmid DNA was designated as pTRE-hLOXl (B).
  • a full-length sequence (1077 base pairs) was obtained by PCR using human normal spleen-derived cDNA (Invitrogen) as a template.
  • an extra CACC sequence was added to the upstream primer on the 5 'side.
  • the PCR product thus amplified was inserted into a pEN TR / D-TOPO vector (Invitrogen) and transformed into Machl cells (Invitrogen). From the obtained transformant, a clone that was predicted to have a plasmid in which the full-length SR-AII full-length sequence was correctly inserted was selected by a conventional method such as colony PCR, and the plasmid sequence was sequenced.
  • a site-specific recombination reaction was further performed according to the manual for pDEST26 (Invitrogen), an animal cell expression vector.
  • the resulting pDEST26 vector having the full-length SR-AII sequence was transformed into COS-1 cells (Human Science Resource Bank), and after 48 hours of culture, a transient expression strain was obtained.
  • Anti-LOX-1 antibody was produced according to the method described in Non-Patent Document 4. Specifically, CHO cells expressing bLOX-1 or hLOX-1 were treated with 5 mM EDTA-PBS (room temperature, 5 minutes), and then a protease inhibitor-containing buffer (25 mM HEPES (pH 7.4)), 10 mM Of magnesium chloride, 0.25 M sucrose, and protease inhibitors ( ⁇ mL Aprotinine, 2 ⁇ g / mL Pepstatin, 50 ⁇ g / mL Leupeptin, and 0.35 mg / mL APMSF).
  • a protease inhibitor-containing buffer 25 mM HEPES (pH 7.4)
  • 10 mM Of magnesium chloride 0.25 M sucrose
  • protease inhibitors ⁇ mL Aprotinine, 2 ⁇ g / mL Pepstatin, 50 ⁇ g / mL Leupeptin, and 0.35 mg / mL A
  • the mixture was crushed with a potter type homogenizer and centrifuged at a low speed (1500 rpm, 10 minutes, 4 ° C). Subsequently, the supernatant was collected and ultracentrifuged (100,000 g, 1 hour, 4 ° C.), and the precipitated membrane fraction was collected, suspended in a phosphate buffer and stored at 20 ° C. This suspension was used as a mouse or human antibody preparation (immunogen).
  • the obtained cell membrane fraction was immunized to normal mice, and mouse monoclonal antibodies against ushi or human LOX-1 were prepared.
  • the anti-LOX-1 antibody is a specific antibody having LOX-1 as an antigen, and acts as an antagonist of LOX-1 by an antigen-antibody reaction.
  • PBS buffer 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 1.8 mM potassium dihydrogen phosphate were mixed with purified water, and the pH was adjusted to 7.4 with an appropriate amount of hydrochloric acid. .
  • Preparation of oxidized LDL was performed as follows. Put healthy human plasma in a centrifuge tube, add potassium odor and adjust the specific gravity to 1.019, then centrifuge in a Beckman L-80 ultracentrifuge (20 hours, 58000 rpm) and collect the lower layer in a separate tube . The recovered liquid volume was measured, and potassium bromide was added to adjust the specific gravity to 1.063. Subsequently, the mixture was centrifuged with a Beckman L-80 ultracentrifuge (20 hours, 58000 ⁇ m), and the upper layer was collected in another tube. The collected fraction was subjected to phosphate buffer solution (external solution was exchanged at least twice) to obtain purified human LDL.
  • oxidized LDL from the obtained purified LDL, a solution prepared so that the concentrations of purified LDL and copper sulfate were 3 mg / mL and 75 ⁇ M, respectively, was prepared in a CO incubator. Incubated for hours. Subsequently, the mixture was dialyzed against 0.15M sodium chloride solution containing EDTA (external solution was exchanged twice or more) to obtain human oxidized LDL.
  • Ethyl pheophorbide a was derived from pheophorbide a (manufactured by Frontier Scientific) using a known method. That is, pheofluoride a (20 mg) was stirred for 10 minutes with di-tert-butyl dicarbonate, 0.32 mmol and dimethylaminopyridine, 4 mg, and then ethanol (ethanol, 0.32 mmol) was added, and the mixture was further stirred for 1 hour. The product was purified by normal-phase column chromatography with chloroform-form methanol (25: 1) to obtain 6 mg (33%) of ethyl pheofluoride a.
  • the inhibition rate of LOX-1 binding to oxidized LDL was evaluated using the recombinant LOX-1 protein obtained from E. coli.
  • Recombinant LOX-1 is an N-terminal sequence of the C-terminal excluding the transmembrane region in the cDNA of Lushi-l (bLOX-l) or human-derived LOX-l (hLOX-l).
  • the pQE30 vector (Qiagen) with 6 histidine tag sequences (6 X His) on the side was inserted with a sequence that aligned the translation frame.
  • This vector was transformed into E. coli that can be controlled by the T5 promoter, and expression of each LOX-1 was induced under the induction of ImM isopropyl:! _ Thio- ⁇ -D-galactosidase (IPTG).
  • LOX-1 LOX-1 was obtained from the insoluble fraction.
  • E. coli was dissolved in a buffer containing 6M guanidine hydrochloride, and a Ni-NTA agarose column (Qiagen) was used. Affinity column purification using 6 X His as an index was performed (solvent: phosphate buffer). Furthermore, the elution fractions containing each LOX-1 were dialyzed in a buffer containing 20 mM Trisnofer (pH 9.0) and 8 M urea, and applied to a HiTrap Q column (Amersham), which is an anion exchanger, Elution and purification with a linear concentration gradient of NaCl was performed.
  • each LOX-1 thus obtained are reduced in a buffer containing an excess amount of DTT (dithiothreitol), and then the oxidized form of the low molecular thiol compound.
  • DTT dithiothreitol
  • GSSG reduced
  • the intramolecular s—S bond was unwound by the redox system.
  • Each LOX-1 obtained in this way has the ability to bind to oxidized LDL, and it was decided to use it as a test LOX-form for the following plate assembly.
  • the plate assembly was carried out using a maxi-soap immun plate (96 ⁇ nore type, manufactured by NUNC). Each LOX-1 purified as described above was prepared in PBS buffer so as to be 5 ⁇ g / mL, and 100 zL was applied to each well. Four. After leaving still for 1 minute in C, wash each well with PBS buffer at 400 ⁇ L x 2 times, and apply 300 ⁇ L of PBS buffer containing 25% Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) to each well. did.
  • each tool was washed twice with PBS buffer at 400 z LX, and adjusted to an appropriate dilution ratio with PBS buffer containing 1% ushi serum albumin (BSA). 100% each of Jerulueoff Orbide a was applied to each well.
  • BSA 1% ushi serum albumin
  • TMB 5,5'-tetramethylpendidine
  • EIA peroxidase-enzyme immunoassay
  • LOX-1 antagonist activity inhibition rate of oxidized LDL binding to LOX-1
  • Hematoporphyrin (hematopo ⁇ hyrin, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was evaluated using the same method as in Test Example 1. [0056] (Example 4)
  • chlorophyll a (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was evaluated.
  • Chlorophyll b (chl OTO phyll b, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was evaluated using the same method as in Test Example 1.
  • Hemin (haemin, manufactured by Alfa Aesar) was evaluated using the same method as in Test Example 1.
  • Hematin (hematin, manufactured by Alfa Aesar) was evaluated using the same method as in Test Example 1. [0062] (Comparative Example 6)
  • phrophytin a (Petrophytin a, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • phrophytin b (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • CH CH CH CH CH Represents CH CH (CH).
  • ethyl pheofluoride &, pheofluoride &, and hematophyllin showed high inhibitory activity.
  • FIG. 3 shows the result of the binding rate of oxidized LDL to hLOX-1.
  • Each compound is The final concentration was 16 / iM.
  • the human type LOX-1 showed the same tendency as that of the inhibition pattern against LOX-1, and the activity was also confirmed in human LOX-1.
  • the number of viable cells was measured as follows.
  • a method for measuring the number of viable cells is to form MTT (3_ (4,5-Dimethy 2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium Bromide) into formazan (generated as a sparingly soluble precipitate) by mitochondrial dehydrin enzyme
  • MTT 3_ (4,5-Dimethy 2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium Bromide) into formazan (generated as a sparingly soluble precipitate) by mitochondrial dehydrin enzyme
  • the MTT method using reduction is widely used. Therefore, using “Cell counting Kit_8” (manufactured by Dojindo Laboratories, using WST-8, which produces water-soluble formazan instead of MTT), which uses a modification of the above MTT method, Went.
  • 100 ⁇ L of cells were poured into a 60 well, which is the central part of the plate, so that the cell volume was 3.0 X 10 4 cells / mL on a 96-well plate (Falcon) (outside).
  • 100 ⁇ L of medium alone was added to the 36 wells.
  • 50 / L of the culture supernatant was removed, and 50 / L of a new culture solution containing each compound at an appropriate dilution ratio was added. After adding a new culture solution containing the compound, the cells were cultured for 7 hours.
  • CHO cells expressing hLOX_l in a tetracycline concentration-dependent manner those into which the following plasmid was introduced by a known method were used.
  • the introduced plasmid is integrated into pcDNA3.1-hLOXl-V5 (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39 (3) 553-561 (2005))
  • HLOX-1 coding region is incorporated into a tetracycline responsive vector, and the tetracycline-retained system is a system that can regulate the expression of hLOX-1 depending on the doxycycline concentration.
  • the assembly using the CHO cells was performed as follows.
  • FBS fetal bovine serum
  • Fanorecon fetal bovine serum
  • Cells were cultured under the conditions of GIBCO, and cultured for 1 day in an environment of 37 ° C and 5% CO concentration. After 1 day of culture, remove 250 ⁇ L of culture supernatant and add 250 ⁇ L of fresh medium containing doxycycline at a concentration of 200 ⁇ g / mL (final concentration of doxycycline is 100 ⁇ g / mL) .
  • each compound was added at a suitable dilution ratio, and 500 ⁇ L of each culture solution was added to each well.
  • the binding reaction of the extract to LOX-1 was performed by performing a pretreatment for 1 hour in the above environment.
  • SPECTRA MAX GEMINI EM manufactured by Molecular Devices was used, and the measurement was performed at an excitation wavelength of 540 nm, a detection wavelength of 585 nm, and a cutoff wavelength of 570 nm.
  • CHO cells stably expressing bLOX-1 were maintained for generations according to a previously reported method (Nature, Vol. 385, p73-77, 1997).
  • the assembly using cells was carried out as follows. Inoculate cells in HamF12 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 500 ⁇ L per well on a 24-well plate (Falcon) to 3.0 x 10 4 cells / mL. The cells were cultured for 2 days in an environment of 37 ° C and 5% CO. After 2 days of culture, 250 ⁇ L of the culture supernatant was removed, and 250 ⁇ L of a new culture solution containing each compound at an appropriate dilution ratio was added.
  • FBS fetal bovine serum
  • SPECT RA MAX GEMINI EM manufactured by Molecular Devices was used, and the measurement was performed at an excitation wavelength of 540 nm, a detection wavelength of 585 nm, and a cutoff wavelength of 570 nm.
  • African green monkey kidney-derived (COS-1) cells Human Science Research Resource Bank
  • bLOX-expressing CHO cells hLOX-expressing CHO cells
  • SR --- expressing CHO cells normal aortic endothelial cells Transfer cells conjugated with Alexa 568 as a specific marker for DiI_OxLDL uptake and clathrin vesicle trafficking (BAEC, Cell Applications Inc.) (excitation wavelength 548 nm, detection wavelength 605 nm, molecular Probes) and CTB (cholera toxin subunit B, excitation wavelength 480 nm, detection wavelength 530 nm, molecular probe) conjugated with Ale xa 488 as a transport marker for the force vector pathway for each inhibitor Verification was performed in the same manner as in Example 6.
  • Nystatin manufactured by Tomoko Co., Ltd.
  • FIG. 6 shows the results of the amount of each marker uptake obtained by the method of Example 7.
  • pheoiofluoride a also significantly inhibits the forceola transport pathway. It can be confirmed that it has an ability to inhibit the oxidation of LDL uptake by endocytosis.
  • DiI_OxLDL is inhibited by nystatin to the same extent as CTB in bL ⁇ X-expressing CH ⁇ cells, and many of Dito OxLDL's transport pathways depend on the strechola transport pathway.
  • LO X-1 It was suggested that pheophorbide a has two inhibitory activities: antagonist activity and inhibition of force transport.
  • pheophorbide a In normal aortic endothelial cells, pheophorbide a has an inhibitory activity higher than that of anti-LOX-1 antibody, and this result suggests that it has a stronger uptake suppression ability than a simple antagonistic action. Surprisingly, it has been clarified that this phorforide a has not only the ability to suppress the uptake of oxidized LDL by LOX but also the ability to suppress the uptake of oxidized LDL by SR-A. Therefore, combined with the results of SR-A and endothelial cells, it was suggested that this pheophorbide a has the ability to suppress modified LDL uptake for various scavenger receptors, and is therefore a cell that further incorporates modified LDL. Smooth muscle cells were also verified.
  • Example 6 For the compounds of Examples 1 and 2 and Comparative Example 6, the ability to inhibit oxidized LDL uptake into smooth muscle cells was evaluated in the same manner as in Example 6.
  • pheophorbide a used for Poho hobillino gen.
  • pheophorbide a showed a very strong uptake-suppressing ability in smooth muscle cells as well as endothelial cells, and showed an inhibitory effect over anti-LOX-1 antibody. Therefore, these results also indicate that pheophorbide a, like endothelial cells and macrophages, uptakes denatured LDL, and even in smooth muscle cells closely related to the early lesions of arteriosclerosis, antagonist activity of LOX-1.
  • hematoporphyrin and uroporphyrin III showed an inhibition tendency similar to that of pheophorbide a.
  • the amount of the arteriosclerosis inhibitor added to the food composition or pharmaceutical composition is preferably 10 mg or less per 100 g of the composition, specifically considering an effective concentration and the like. ! Omg can be added to achieve both safety and effectiveness. For example, the following are mentioned as a compounding example of a food composition and a pharmaceutical composition.
  • the arteriosclerosis inhibitor of the present invention has an antagonistic action that inhibits the binding of oxidized LDL to LOX-1, which is an oxidized LDL receptor, and lipid uptake through scavenger receptors other than LOX-1 and LOX-1. It has excellent inhibitory action or inhibition of oxidized LDL uptake by endocytosis into cells via force veora, and continuous uptake of oxidized LDL into cells related to arteriosclerosis such as vascular endothelial cells As a result, it can be expected that the onset of arteriosclerosis in humans or non-human animals can be suppressed and the symptoms can be alleviated.

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Description

明 細 書
動脈硬化抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、動脈硬化抑制剤、及びこれを含む食品組成物、又はこれを含む医薬組 成物に関する。
背景技術
[0002] 動脈硬化症は、近年、過脂肪食や運動不足を主な要因とする肥満症が最上流で あるメタボリックシンドロームの下流に位置する症状であるとの認識がコンセンサスに なりつつあり、この動脈硬化症がさらに進行することにより血栓を形成し、心疾患'脳 血管疾患の原因となる。
[0003] ところで、 日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、 日本における疾患 別死亡者の 1位が悪性新生物 (腫瘍及び癌）、 2位が心疾患、 3位が脳血管疾患とな つているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約 28%であり、これ は悪性新生物の死亡者割合である約 30%にほぼ匹敵する（平成 17年 (2005年)）。 悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見-早 期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。ところが上述のよう に、生活習慣病に起因する肥満症 ·動脈硬化症の下流に位置する心疾患 ·脳血管 疾患については、食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、 日常 的に摂取可能な形態を用いることでの対処方法が望ましい。
[0004] 動脈硬化症において、食生活を含めた食品学的なアプローチが重要であることは 上述の通りである力 複雑 ·多岐なプロセスにおいてどの作用機序をターゲットにする かは重要である。動脈硬化症は酸化ストレス等による低密度リポ蛋白質 (Low-density Lipoprotein: LDL)の変性、血管内皮細胞への取り込みによる血管内皮機能障害を 発症の端緒としており、その後のシーケンシャルなプロセスとしてマクロファージゃ血 管平滑筋の分化 ·脱分化による泡沫化現象を呈する。そして最終的には狭窄性病変 を経て血栓形成となる。つまり、予防学的観点から考えれば、初期病変である酸化ス トレス等による脂質の変性、あるいは変性 LDLが血管内皮細胞に取り込まれることに よる機能障害を抑制することが重要である。
[0005] アポリポプロテイン E欠損マウスにおいて、マクロファージのス力ベンジャー受容体 である SR-A (Class A scavenger receptor)をノックアウトすると動脈硬化は抑えられる が、むしろ血中のコレステロール値は上昇することが報告されている（例えば、非特許 文献 1)。また、逆に SR-Aを過剰発現させるとマクロファージ内へのコレステロールの 取り込みは促進されても、動脈硬化は促進しないことが報告されている（例えば、非 特許文献 2)。つまり、血中コレステロールの上昇とマクロファージ等への脂質蓄積は 、動脈硬化症の進展に対して 2次的なものであるとも考えられる。さらに心血管疾患 者の 2人に 1人は血清脂質が正常であり、また、脂質の変性を防ぐ目的での予防効 果はビタミン E以外に十分なものはなレ、とも言われている（例えば、非特許文献 3)。つ まり、血中脂質を改善することで全ての動脈硬化症が予防 ·改善できるわけではない
[0006] 一方で、脂質の変性とともに動脈硬化症の初期原因とされる血管内皮細胞の機能 障害は、変性 LDL、特に酸化 LDLが酸化 LDL受容体である LOX-l (レクチン様酸化 低密 i¾リホプロアインレセプグ1— 1： Lectin— like oxidized low-density lipoprotein rec 印 tor-1)を介して血管内皮細胞に取り込まれることに依存するという報告がある（例え ば、非特許文献 4)。ヒトのスカベンジャー受容体には、タイプ Aからタイプ Hまでの少 なくとも 8種類のクラスが存在するが（例えば、非特許文献 5)、血管内皮細胞では LO X-1を含め、少なくとも 6種類のスカベンジャー受容体が機能していると考えられてい る（例えば、非特許文献 6)、これらの受容体を介した変性 LDLの取り込みに起因する 血管内皮細胞の機能障害は、様々な接着因子の発現亢進や一酸化窒素産生の抑 制等を引き起こし、単球 ·マクロファージの集積 ·泡沫化あるいは平滑筋細胞の遊走- 増殖'形質転換に繋がる。そして結果として動脈硬化症を発症するものと考えられて いる。
[0007] LOX-1は血管内皮細胞のみならず、上述のように動脈硬化症に関与するマクロフ ァージ、平滑筋細胞にも発現していることから (非特許文献 7)、動脈硬化症の標的因 子として非常に注目されている。例えば LOX-1を過剰発現させたアポリポプロテイン E欠損マウスでは、マクロファージの集積数の増カロ、接着因子系の発現上昇、ァテロ ーム様部位の増大等、 LOX-1の過剰発現によって惹起された血管内皮細胞の機能 障害を介した動脈硬化症の亢進が確認されている（例えば、非特許文献 8)。このよう に LOX-1が動脈硬化症の発症に対して非常に大きな影響を与えていることは予想さ れるものの、 LOX-1と変性 LDLの結合を阻害する市販の薬剤については現在のとこ ろ知られていない。
[0008] 一方で、内皮細胞や平滑筋細胞にはエンドサイト一シスを行う膜ドメインである力べ オラと呼ばれるものも存在する。力べオラ以外の代表的なエンドサイト一シス経路とし ては、クラスリン被覆ピットと呼ばれるものも存在する。近年になり、力べオラによる脂 質代謝との関係が報告されるようになり、動脈硬化症との関係を対象とした研究も行 われてきている。例えば、力べオラを介したエンドサイト一シスにより、アルブミン (例え ば、非特許文献 9)、インスリン (例えば、非特許文献 10)のみならず、 LDLあるいは変 性 LDLの輸送への関与も報告されている（例えば、非特許文献 11)。力べオラはその コートタンパク質として力べォリン- 1を有する力 遺伝学的に力べォリン- 1を欠損した マウスをアポリポプロテイン E欠損マウスと交配させダブルノックアウトマウスを作製す ると、スカベンジャー受容体の一種である CD36の発現低下を伴った高レ、抗動脈硬化 作用が確認される（例えば、非特許文献 12)。つまり、力べオラ経由によるリポプロテ インの細胞内への輸送を抑制することを標的とした食品'薬剤の開発は、 LOX-1のァ ンタゴ二ストと同様に抗動脈硬化抑制剤としての利用に繋がることが予想される。よつ て、これらを同時に抑制することが可能であれば、非常に優れた抗動脈硬化抑制剤 になることが期待できる。
[0009] ところで、ポルフィリンを基本骨格とする物質は、生物種を問わず代謝物質として広 く存在する。 δ -アミノレブリン酸を前駆物質として、 8分子が環状構造を形成すること によりテトラピロール骨格が構築され、下流のプロトポルフィリン IXにおいて、光合成 構成要素であるクロロフィルとヘモグロビン構成要素であるヘムへと派生する。また、 上流の代謝中間体であるゥロポルフィリノゲン ΠΙからは上記物質群のみならず、ビタミ ン B12なども合成される。
植物にぉレ、てクロロフィルは ROS (reactive oxygen species：活性酸素種）の発生源 でもあり、葉の老化（senescence)のみならず、組織の損傷に伴い積極的に代謝され ているが、同時にこの代謝過程は植物の複数種の防御反応を制御することも示唆さ れており（例えば、非特許文献 13)、クロロフィルの分解においてクロロフイラーゼ（chl orophyllase)及び Mg—デキラターゼ（Mg-dechelatase)により、脱フィトール化と脱 M gィ匕を経てフエオフオルバイド aが形成される。
近年、フヱオフオルバイド aは ABC (ATP-binding cassette : ATP結合カセット）輸送 体の一種である ABCG2/BCRP (breast cancer resistance protein :乳癌耐性蛋白質） のマーカーとして着目されてきている（例えば、非特許文献 14)。この ABCG2は多剤 耐性の原因因子でもあり、フエオフオルバイド aを指標とした ABCG2阻害剤を開発す ることで、抗癌物質の開発に繋げる研究も行われてきている。また、フエオフオルバイ ド aは光過敏症の原因因子であるとも言われている力 S、これは高濃度摂取した場合に 起こる現象であり（ヒトで 500mg/day以上 (非特許文献 15)、ラットで 220mg/kg以上 (非 特許文献 16) )、現在のクロレラにおける配合量も商品 100g中に 60- 80mg以下であれ ば問題ないとされている。また実際にラットにおいては、フエオフオルバイド aを静脈注 射した場合での皮膚への蓄積量は少なぐ細網内皮系が主な蓄積ターゲットとされる (非特許文献 17)。
非特許文献 1 : Suzuki H. et al. Nature (1997); 386: 292-6
非特許文献 2 : Van Eck M. et al. Arterioscler Thromb Vase Biol (2000); 20: 2600-6 非特許文献 3 : Ross R. N Engl J Med (1999); 340: 115-26
非特許文献 4 : Sawamura T. et al. Nature (1997); 386: 73-7
非特許文献 5 : Murphy J. E. et al. Atherosclerosis (2005); 182: 1-15
非特許文献 6 : Adachi H. and Tsujimoto M. Prog Lipid Res (2006); 45: 379-404 非特許文献 7 : Chen M. et al. Pharmacol Ther (2002); 95: 89-100
非特許文献 8 : Inoue K. et al. Circ Res (2005); 97: 176-84
非特許文献 9 : Ghitescuし et al. J Cell Sci. (1986); 102: 1304-11
非特許文献 10 : Bendayan Μ· et al. J Cell Sci. (1996); 109: 1857-64
非特許文献 11 : Kim M-J. et al. Atherosclerosis (1994); 108: 5-17
非特許文献 12 : Philippe G. F. et al. Arterioscler Thromb Vase Biol (2003); 24: 98-1
05 非特許文献 13 : Kariola T. et al. Plant Cell (2005); 17: 282-94
非特許文献 14 : Robey R. W. et al. Cancer Res (2004); 64: 1242-6
非特許文献 15 : Kimura S. et al. Photomed. Photobiol. (1981); 3: 73
非特許文献 16 : Matsuura E et al. Kitasato Arch. Exp. Med. (1988); 61 : 201-13 非特許文献 17 : Aprahamian Μ· et al. Anti-Cancer Drug Design (1993);8: 101-14 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、上記観点からなされたものであり、血管内皮細胞、平滑筋細胞等で発 現されてレ、る LOX-1への酸化 LDLの結合を阻害し、かつ LOX-1を介した酸化 LDLの 細胞内への取り込み抑制能を有するアンタゴニスト作用を有し、かつ安全性が高い 動脈硬化抑制剤及びこれを含有する食品又は医薬組成物を提供することを課題と する。
また、本発明は、 LOX-1以外の他のスカベンジャー受容体を介した酸化 LDLの取り 込み抑制能をも有し、さらに力べオラを経由した細胞内へのリポプロテインのエンドサ イト一シスをも抑制するとレ、う、多面的な効果を奏する動脈硬化抑制剤及びこれを含 有する食品又は医薬組成物を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者は、上記課題を解決するために、 LOX-1に対するアンタゴニスト作用を有し 、LOX_l以外のスカベンジャー受容体を含めた酸化 LDL取り込み抑制能に優れた成 分をスクリーニングにより鋭意探索した。その結果、ポルフィリン骨格を有する化合物 に顕著なアンタゴニスト作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さら に、この化合物にはエンドサイト一シスによる細胞内へのリポプロテインの取り込みを も抑制するという作用も見出した。
[0012] すなわち、本発明の要旨は、
〔1〕式 ( 1 ) :
[0013] [化 1]
Figure imgf000009_0001
[0014] (式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の:!〜 4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; Rから Rはそれ
3 8 ぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の:!〜 2個の炭素原子を有する炭化水 素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）で表されるポルフィリン系誘導 体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体 (L〇X— 1)アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤、
〔2〕式 (2) :
[0015] [化 2]
Figure imgf000010_0001
(式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の 1〜4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; R力 Rはそれ
3 8 ぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の 1〜2個の炭素原子を有する炭化水素基若しく は、ホルミル基、カルボキシメチル、カルボキシェチル基からなる群から選択される） で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様 酸化低密度リポ蛋白質受容体 (LOX-1)アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤
〔3〕 前記式（1)で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフエオフオルバイド a及び ェチルフエオフオルバイド aである前記〔1〕記載のレクチン様酸化低密度リポ蛋白質 受容体 (LOX-1)アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤、
〔4〕 前記式（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物がへマトポルフィリン及びゥ 口ポルフィリン IIIである前記〔2〕記載の動脈硬化抑制剤、
〔5〕 LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化 LDLの取り込み抑 制作用を有する前記〔1〕〜〔4〕 V、ずれか記載の動脈硬化抑制剤、
〔6〕 力べオラを経由した細胞内への酸化 LDLの取り込み抑制作用を有する前記〔1 〕〜〔4〕レ、ずれか記載の動脈硬化抑制剤、
〔7〕 前記〔1〕〜〔6〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する食品組成物、 〔8〕 前記〔1〕〜〔6〕いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する医薬組成物、 〔9〕 前記式（1 )あるいは（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエス テル類を有効成分として含有してなる、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体 (L〇
X_l)アンタゴニスト作用を有する組成物
に関する。
[0017] なお、本発明においてアンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載の方法で評価 した場合に、 LOX- 1への酸化 LDLの結合を阻害し、かつ酸化 LDLの細胞内への取り 込みを阻害することを意味する。
発明の効果
[0018] 本発明の化合物を用いることで、動脈硬化症の初期病変に関わりの深い酸化 LDL 受容体 (LOX- 1 )を介する酸化 LDLの細胞内への取り込みを顕著に阻害することが できるという効果が奏される。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、ェチルフエオフオルバイド a(Ethyl pheohorbide a)、フエオフオルバイド&( Pheophorbide a)、クロロフィノレ a(Chlorophyll a)、クロロフイノレ 、シァノコバラミン (Cyano cobalamin)、ヘ ン (Haemin)、へマテン (Hematin入へマトホノレフィリン (Hematoporphyri n)、ゥロポルフィリン m(Uropo卬 hyrin III),ボルフオビリノ一ゲン (Po卬 hobilinogen)、フエ オフイチン a(Pheophytin a)、フエオフイチン 、 Mg2+を用いた場合の酸化 LDLの bLOX - 1、への結合率の結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、プレート上に固定化さ れた LOX-1への酸化 LDLの結合量を相対値で示しており、コントロールは化合物を 含まない処理区の値を 100として、酸化 LDLを含まない処理区の値を 0として換算し ている。また、各化合物は、終濃度 16 / Mになるように添加した。
[図 2]図 2は、後述の実施例 1〜4のうち高いアンタゴニスト活性を有したフエオフオル バイド aについて濃度依存性を検討した結果を示すグラフである。全ての希釈系列に おいて、同濃度の DMSO(dimethyl sulfoxide;和光純薬)が添加されている。
[図 3]図 3、 hLOX_lに対する酸化 LDLの結合率の結果を示している。グラフの縦軸は 、プレート上に固定化された L〇X— 1への酸化 LDLの結合量を相対値で示しており 、コントロールは化合物を含まない処理区の値を 100として、酸化 LDLを含まない処 理区の値を 0として換算している。また、各化合物は、終濃度 16 / Mになるように添 加した。
[図 4]図 4は、実施例 6で行った、 bLOX-1を発現した CHO細胞の酸化 LDLの取り込 み量の結果を示している。細胞内へ取り込まれた酸化 LDL量を示す蛍光量について は、全ての処理区にぉレ、て化合物及び蛍光標識した酸化 LDLを含まなレ、ネガティブ コントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量 で除したコントロールの値を 100%として換算した値を示す。
[図 5]図 5は、実施例 6で行った、 hLOX-1を発現した CHO細胞の酸化 LDLの取り込 み量の結果を示している。細胞内へ取り込まれた酸化 LDL量を示す蛍光量について は、全ての処理区にぉレ、て化合物及び蛍光標識した酸化 LDLを含まなレ、ネガティブ コントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量 で除したコントロールの値を 100%として換算した値を示す。
[図 6]図 6は、 COS-1細胞、 bLOX発現 CHO細胞、 hLOX発現 CHO細胞、 SR-AII発現 COS-1細胞、正常大動脈内皮細胞の各細胞に対する、 Dil-OxLDLの取り込み、クラ スリン小胞輸送の特異的マーカーとしてのトランスフェリン (Transferrin),力べオラ経路 の輸送マーカーとしての CTBの各マーカーの取り込みを各阻害剤について後述の 実施例 6と同様に検証した結果を示す。なお、 CTBの特異的阻害剤としてナイスタチ ン (Nystatin)を使用した。
[図 7]図 7は、平滑筋細胞に対する酸化 LDL取り込み抑制能の結果を示している。細 胞内へ取り込まれた酸化 LDL量を示す蛍光強度については、 Dil-OxLDL由来の蛍 光強度と同一視野内の DAPI染色由来の核数で除しており、全 12視野の平均を示し ている。コントロールは阻害剤を含まない処理区であることを示している。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明に用いられるポルフィリン系誘導体化合物は、式（1 )：
[0021] [化 3]
Figure imgf000013_0001
[0022] (式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の:!〜 4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; Rから Rはそれ
3 8 ぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の:!〜 2個の炭素原子を有する炭化水 素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
[0023] 又は式（2) :
[0024] [化 4]
Figure imgf000014_0001
[0025] (式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の:!〜 4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; Rから Rはそれ
3 8 ぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の 1〜2個の炭素原子を有する炭化水素基若しく は、ホルミノレ基、カルボキシメチル、カルボキシェチル基からなる群力 選択される） で表される。
[0026] 式（1)において、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点から、 Rとしては、水
1 素原子、炭素数 1〜2の直鎖状飽和炭化水素基が好ましぐ水素原子又はェチル基 力 り好ましい。また R、 R、 R、 R、 R、 Rとしては、炭素数:!〜 2の直鎖状飽和炭化
2 3 4 6 7 8
水素基が好ましぐメチル基、ェチル基が好ましい。 Rとしては炭素数 2〜4の直鎖状
5
不飽和炭化水素基が好ましぐエチレン基がより好ましい。
式（2)において、優れた効果（特にアンタゴニスト作用）の観点から R、 Rとしては、
1 2 水素原子、炭素数 1〜2の直鎖状飽和炭化水素基が好ましぐ水素原子がより好まし レ、。また、 R、 R、 R、 Rとしては、炭素数:!〜 2の直鎖状飽和炭化水素基、カルボキ
3 4 6 8
シメチル基が好ましぐメチル基、カルボキシメチル基がより好ましい。 R、 Rとしては
5 7
、炭素数 2〜4の直鎖状不飽和炭化水素基、カルボキシェチル基が好ましぐェチレ ン基、カルボキシェチル基がより好ましい。
[0027] 前記式（1)で表されるポルフィリン系誘導体化合物としては、優れた効果（特にアン タゴニスト作用）の観点から、フエオフオルバイド a及びェチルフエオフオルバイド aが 好ましい。
前記式（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物としては、優れた効果（特にアン タゴニスト作用）の観点から、へマトポルフィリン及びゥロポルフィリン IIIが好ましい。
[0028] 前記式（1)又は（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物は、酸化 LDL受容体 (L 〇X-1)アンタゴニスト作用を有するのみならず、他のスカベンジャー受容体を介した 酸化 LDLの取り込みについても抑制しており、さらに細胞内への力べオラを経由した 細胞内への酸化 LDLの取り込み抑制作用を有する結果として内皮細胞の機能障害 抑制あるいは抗動脈硬化作用を有する。
[0029] 前記式（1)又は（2)で表さえるポルフィリン系誘導体化合物は、クロロフィルなどの 市販されている原料力 公知の方法で合成することができる。
[0030] 本発明において、前記式（1)又は（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物には 、エステル類も含まれる。エステル類には、メチルエステル、ェチルエステル、プロピ ルエステル、ブチルエステル などが挙げられる。
[0031] また、前記式（1)又は（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物は、動脈硬化抑 制効果がより向上するとレ、う観点から、前記 LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介 した細胞への酸化 LDLの取り込みも抑制する作用を有するものが好ましい。ここで、 L OX-1以外のスカベンジャー受容体とは、血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細 胞等に存在する LOX-1以外の受容体であって、 LDLと結合して前記細胞内に取り込 むことができる受容体である。このようなスカベンジャー受容体としては、例えば、 SR- A 1/11、 SR_B1、 CD36、 MARCO, CD68、 SRECs、 SR_PSOX、 FEEL—l等のタイプ A、 B 、 C、 D、 E、 F、 G、 Hに大別されるが、特に限定はない。
本発明では、後述の実施例に記載のように、細胞内への酸化 LDLの取り込み阻害 活性量が、スカベンジャー受容体中の LOX-1の割合から換算される阻害活性量より も多ければ、 LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化 LDLの取り 込みが阻害されているとする。 [0032] 本発明においては、前記式（1)又は（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物な どが用いられる力 これらのポルフィリン系誘導体化合物は、クロロフィル、シァノコノく ラミン、へミン、へマチン、ボルフオビリノ一ゲンなどの構造が類似しているポルフィリン 系化合物とは相違したアンタゴニスト活性を有する。このようにポルフィリン系化合物 間でアンタゴニスト活性が相違している理由としては、明確ではないが、例えば、式（ 1)で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、エステル鎖の炭素数が他の類似 の化合物と比べて短いため、エステル鎖が短いほど活性が向上すると考えられる。 また、式（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物の場合、ポルフィリン環に金属 原子とキレートしていないため、活性の発現に金属原子とのキレートは必要ないと考 られる。
また、後述の実施例に記載のようにフエオフオルバイド aは、さらに力べオラを経由し た細胞内への酸化 LDLの取り込みも阻害する。
[0033] 本発明の動脈硬化抑制剤は、前記式（1)又は（2)で表されるポルフィリン系誘導体 化合物を含有するが、前記ポルフィリン系誘導体化合物のみでもよいし、アンタゴニ スト活性を妨げないのであれば、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、特 に限定はない。
[0034] また、本発明の動脈硬化抑制剤は、食品'医薬品などの組成物に、公知の技術を 用いて、酉己合すること力 Sできる。この場合、前記組成物をそのまま用いてもよいが、各 種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなぐ適時設定す ればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材 力 食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。ただし、フエオフオルバイド aは 光過敏症の原因因子とも言われていることから、その配合量としては組成物 100gあ たり lOOmg以下が望ましい。
[0035] また、食品としては、一般食品として、種々の食品原料に前記化合物の所望量を加 え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、 前記化合物をそのまま、あるいは食べ易い状態にして使用することができる。
[0036] また、医薬品としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤等が 挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤等と共に 通常の方法に従って製剤すればよい。
[0037] これらの組成物における、上記動脈硬化抑制剤の 1日あたりの投与量は、症状、身 長、体重、年齢等により異なる力 成人 1人あたりの摂取量が 0. lmg/kg'日以下と なるように、 1回なレ、し数回に分けて被検体に投与するのが好ましレ、。
[0038] なお、本発明において標的としている LOX-1は、ヒトゃ非ヒトの哺乳動物（例えば、 サル、ゥシ、ブタ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ロノく、ラタダ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ネズミ、マウス 、モルモット、ニヮトリ、ァヒル、ガチョウ等の哺乳動物など）の血管内皮細胞のみなら ず、マクロファージ、平滑筋細胞にも存在しており、それぞれの細胞に酸化 LDLが取 り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。した がって、本発明の動脈硬化抑制剤は、血管内皮細胞などの動脈硬化症に関与する 複数の細胞群において酸化 LDLの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから 、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れ ることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。
[0039] 以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。
実施例
[0040] なお、実施例で用いた試料は、以下のようにして調製した。
1. bLOX-1, hL〇X_lの cDNA
前記 bLOX_l、 hLOX-1の cDNAクローニングは、前記非特許文献 4に記載の方法 に準じて行った。
即ち、 bLOX-1については、血管内皮細胞の cDNAライブラリーより各独立したクロ ーンを発現ベクターに組み込み、 COS-7での一過性発現を行った。その後、 DiI_Ox LDLとの共培養後にセルソーターによる Dilポジティブの分離を行レ、、プラスミドを回 収した。このスクリーニング方法を 3回繰り返し、シングルクローンを単離した。
[0041] また、 hLOX-1については、ランダムプライマーとオリゴ dTプライマーによりヒト肺の c DNAライブラリ一力 増幅を行った。全長 bLOXcDNAを用いてポジティブスクリーニン グを行い、部分断片の hLOXcDNAを取得後、 5'_RACEによる上流配列の取得を行つ [0042] (TetOnベクターへの挿入）
pcDNA31-hLOXl-V5プラスミド (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39(3) 553-561 (2005))を Prel、 BamHIで消化し、ァガロースゲル電気泳動に供して、ゲルを 切り出し '抽出して h- LOX-1断片を回収した。 pTRE2hygプラスミド（クロンテック、 Tet 〇n)を EcoRV、 BamHIで消化し、ァガロースゲル電気泳動に供して、ゲルを切り出し. 抽出して Tet応答ベクター断片を回収した。回収した h-LOX_l断片と Tet応答べクタ 一断片を、ライゲーシヨンして大腸菌を形質転換した。大腸菌から導入プラスミドを回 収 '精製し、得られたプラスミド DNAを pTRE-hLOXl(B)、とした。
[0043] Lipofectoamine2000 (インビトロジェン製）を用いて CHO- Kl Tet- On Cell Line (クロ ンテック）へ Fsplにより直鎖化した pTRE-hLOXl(B)を導入し、ハイグロマイシンによる 選択培養を行い、コロニーを形成させた。シングノレコロニーをピックアップして細胞株 12株を取得した。それぞれの細胞株について、ドキシサイクリンを培地に添加して発 現誘導を行った細胞抽出液を調製し、抗 V5抗体を用いたウェスタンブロッテイングに より誘導効率の高レ、細胞株を 3株得た。
[0044] (SR-AII発現細胞株の作製）
ヒト SR- Allの cDNAクローニングは、ヒト正常脾臓由来 cDNA (インビトロジェン）をテン プレートとして、全長配列（1077塩基対）を PCRにより取得した。なお、上流側のプライ マーには CACC配列を 5'側に余分に付加した。このように増幅した PCR産物を、 pEN TR/D- TOPOベクター（インビトロジェン）に挿入し、 Machl細胞（インビトロジェン）に 形質転換した。得られた形質転換体より、正しく SR-AII全長配列が挿入されたプラス ミドを持つことが予想されたクローンをコロニー PCR法など常法により選抜し、そのブラ スミド配列のシーケンスを行った。シーケンスにより正しレ、配列が確認されたプラスミド については、さらに動物細胞発現用ベクターである pDEST26 (インビトロジェン）にマ ニュアルに従レ、部位特異的組換え反応を行った。得られた SR-AII全長配列を持つ p DEST26ベクターを COS-1細胞（ヒューマンサイエンス資源バンク）に形質転換し、 48 時間培養後、一過性発現株を取得した。
[0045] 2.抗 LOX-1抗体
抗 LOX-1抗体は非特許文献 4に記載の方法に準じて製造した。 即ち、 bLOX-1あるいは hLOX-1を発現している CHO細胞を 5mM EDTA-PBSで処 理（室温、 5分間）した後、プロテアーゼ阻害剤含有緩衝液（25mMの HEPES(pH 7.4) )、 10mMの塩化マグネシウム、 0· 25Mのシユークロース、及びプロテアーゼ阻害剤（ ΙΟϋΖ mLの Aprotinine, 2 μ g/mLの Pepstatin、 50 μ g/mLの Leupeptin、及び 0. 35 mg/mLの APMSF)中に懸濁し、ポッター式ホモゲナイザーで破砕し、低速遠心（150 0rpm、 10分、 4°C)した。次いで、上清を回収し、超遠心（100, 000g、 1時間、 4°C) し、沈殿した膜画分を回収しリン酸緩衝液中に懸濁し一 20°Cで保存した。この懸濁液 をゥシあるいはヒト抗体の作製 (免疫源）として用いた。
得られた細胞膜画分を正常マウスに免疫し、ゥシあるいはヒト LOX-1に対するマウス モノクローナル抗体を調製した。
[0046] モノクローナル抗体の作製は、実験医学 (別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫 ら編集、羊土社発行、 P66-74, 1992年)及び単クローン抗体実験操作入門（安東民 衛ら著作、講談社発行、 1991年）に記載される一般的方法に従って調製した。
なお、抗 LOX-1抗体とは、 LOX-1を抗原とした特異抗体であり、抗原抗体反応によ り LOX-1のアンタゴニストとして作用するものをいう。
[0047] 3. PBSバッファー
PBSバッファーについては、 137mM塩化ナトリウム， 2.7mM塩化カリウム、 10mMリン 酸水素ニナトリウム十二水和物、 1.8mMリン酸二水素カリウムを精製水に混合し、適 量の塩酸で pHを 7.4とした。
[0048] 4.酸化 LDL
酸化 LDLの調製は下記の通りに行った。健常人の血漿を遠心チューブに入れ、臭 化カリウムを加えて、比重を 1.019に調製した後に、 Beckman L-80超遠心機で遠心し (20時間、 58000rpm)、下層を別のチューブに回収した。回収した液量を測定し、臭 化カリウムを加えて比重を 1.063に調製した。次いで、 Beckman L-80超遠心機で遠心 し（20時間、 58000卬 m)、上層を別のチューブに回収した。回収した画分をリン酸緩 衝液 (外液を 2回以上交換)し、精製ヒト LDLを得た。
[0049] 得られた精製 LDLから酸化 LDLを調製するために、精製 LDL及び硫酸銅の濃度が 、各々 3mg/mL及び 75 μ Mとなるように調製した溶液を、 COインキュベーター内で 20 時間インキュベートした。次いで、 EDTAを含有する 0.15Mの塩化ナトリウム溶液にて 透析し (外液を 2回以上交換)、ヒト酸化 LDLを得た。
[0050] (実施例 1)
ェチルフエオフオルバイド aは、公知の方法を用いてフエオフオルバイド a (pheophor bide a, Frontier Scientific社製）から誘導を行った。すなわち、フエオフオルバイド a ( 20 mg)をジターシヤノレブチノレジ力ノレボナート (di-tert-butyl dicarbonate, 0.32mmol) とジメチルァミノピリジン（dimethylaminopyridine, 4mg)を 10分間撹拌後、エタノール（ ethanol, 0.32mmol)をカ卩えさらに 1時間撹拌した。生成物は、順相カラムクロマトダラ フィ一でクロ口ホルム一メタノール（25 : 1)で精製し、ェチルフエオフオルバイド aを 6m g (33%)得た。
[0051] (試験例 1)
上記各実施例で得られた動脈硬化抑制剤の LOX-1アンタゴニスト活性に関して、 酸化 LDLに対する LOX-1結合阻害率について大腸菌より得られた組換え LOX-1蛋 白質を用いて評価を行った。
[0052] 組換え LOX-1は、ゥシ由来 LOX-l (bLOX-l)あるいはヒト由来 LOX-l (hLOX-l)の cDNAにおいて膜貫通領域を除いた C末端までの配列を、 N末端側に 6個のヒスチ ジンタグ配列（6 X His)を持つ pQE 30ベクター（キアゲン社製）に、翻訳フレームを揃 える配列で挿入した。このベクターを T5プロモータで制御可能な大腸菌にトランスフ ォーメーシヨンし、 ImMのイソプロピル：!_チォ- β -D-ガラクトシダーゼ（IPTG)誘導下 で各 LOX-1の発現誘導を行った。 37°C、 3時間の発現誘導後、不溶性画分から組 換え LOX-1は得られたので、 6Mグァニジン塩酸塩を含むバッファ一中で大腸菌を溶 解し、 Ni-NTAァガロースカラム（キアゲン社製）による 6 X Hisを指標としたァフィニテ ィーカラム精製を行った (溶媒:リン酸バッファー)。さらに各 LOX-1を含む溶出画分 について、 20mMトリスノ ッファー（pH9. 0)、 8M尿素を含むバッファ一中で透析し、 陰イオン交換体である HiTrap Qカラム（アマシャム社製）にアプライし、 NaClの直線 濃度勾配による溶出 ·精製を行った。このようにして得られた各 LOX-1を含む画分は 、過剰量の DTT (ジチオスレィトール）を含むバッファ一中で還元処理を行レ、、その 後、低分子チオール化合物の酸化型 (GSH)及び還元型 (GSSG)の混合物を利用 した酸化還元システムによる分子内 s— S結合の巻き戻しを行った。このようにして得 られた各 LOX-1は、酸化 LDLに対する結合能力を有し、以下のプレートアツセィによ る試験用 LOX- 票品として用レ、ることにした。
[0053] プレートアツセィは、マキシソープ'ィムノプレート（96ゥヱノレタイプ、 NUNC社製）を 用いて行った。上記のように精製した各 LOX-1を 5 μ g/mLとなるように PBSバッファ 一で調製し、 100 z Lずつ各ゥエルにアプライした。 4。Cで 1晚静置した後に、 PBSバ ッファーで各ゥヱルを 400 μ L x 2回で洗浄し、 25%ブロックエース（大日本住友製薬 社製）を含む PBSバッファー 300 μ Lを各ゥエルにアプライした。 4°Cで 1晚静置した 後に、 PBSバッファーで各ゥヱルを 400 z L X 2回で洗浄し、 1 %ゥシ血清アルブミン（ BSA)を含む PBSバッファーで適当な希釈倍率となるように調製したェチルフエオフ オルバイド aを 100 ずつ各ゥエルにアプライした。 4。Cで 1晚静置した後に、 PBSノ ッファーで各ウエノレを 400 μ L x 3回で洗浄し、 5 μ g / mLとなるように PBSノ ッファー で調製した酸化 LDLを、 100 /i Lずつ各ゥエルにアプライした。 4°Cで 1晚静置した後 に、 PBSバッファーで各ゥエルを 400 /i L x 3回で洗浄し、西洋ヮサビ由来ペルォキ シダーゼをコンジュゲートした抗ァポリポプ口ティン B抗体（The Binding Site社製）を P BSバッファーで 1000倍希釈し、 100 しずつ各ゥエルにアプライした。室温で 2時間 の静置後、 PBSバッファーで各ゥエルを 400 /i L x 5回で洗浄し、 3，3' ,5,5'-テトラメチ ルペンヂジン (TMB)ペルォキシダーゼ-酵素免疫測定 (EIA)—基質—キット試薬（ バイオラッド社製）を 100 / Lずつ各ゥエルにアプライした。適当な反応時間後に、 2M H SOを 50 /i Lずつ各ゥエルにアプライして反応を停止させた。最終的に 450nmで
2 4
検出を行い、 LOX- 1アンタゴニスト活性 (LOX-1に対する酸化 LDL結合阻害率）を定 量した。
[0054] (実施例 2)
試験例 1と同様の方法を用いてフエオフオルバイド a (Frontier Scientific社製）の評 価を行った。
[0055] (実施例 3)
試験例 1と同様の方法を用いてへマトポルフィリン （hematopo卬 hyrin,和光純薬ェ 業製)の評価を行った。 [0056] (実施例 4)
試験例 1と同様の方法を用いてゥロポルフィリン m (uropo卬 hyrin III、 Frontier Scient ific社製）の言平価を行った。
[0057] (比較例 1)
試験例 1と同様の方法を用いてクロロフィル a (chlorophyll a,和光純薬工業製）の評 価を行った。
[0058] (比較例 2)
試験例 1と同様の方法を用いてクロロフィル b (chlOTOphyll b,和光純薬工業製)の 評価を行った。
[0059] (比較例 3)
試験例 1と同様の方法を用いてシァノコバラミン（cyanocobalamin,和光純薬工業製 )の評価を行った。
[0060] (比較例 4)
試験例 1と同様の方法を用いてへミン（haemin, Alfa Aesar社製）の評価を行った。
[0061] (比較例 5)
試験例 1と同様の方法を用いてへマチン（hematin, Alfa Aesar社製）の評価を行つ [0062] (比較例 6)
試験例 1と同様の方法を用レ、てボルフオビリノーゲン（po卬 hobilinogen, Frontier Sci entific社製）の評価を行った。
[0063] (比較例 7)
試験例 1と同様の方法を用いてフヱオフイチン a (pheophytin a,和光純薬工業製） の言平価を行った。
[0064] (比較例 8)
試験例 1と同様の方法を用いてフヱオフイチン b (pheophytin b,和光純薬工業製） の言平価を行った。
[0065] (比較例 9)
試験例 1と同様の方法を用いて Mg2+ (MgCl由来）の評価を行った。 [0066] なお、実施例及び比較例で評価を行った各化合物の構造を以下に示す。
前記式（1)で表される化合物において、ェチルフエオフオルバイド a (R =R =C
1 7
H CH , R =R =R =R =R =CH , R =CH:CH ), フエオフオノレノくイド a
2 3 2 3 4 6 8 3 5 2
(R =H, R =R =R =R =R =CH , R =CH:CH R =CH CH ) , クロ口
1 2 3 4 6 8 3 5 2, 7 2 3 フィノレ a (R =phytyl, R =R =R =R = R =CH , R =CH:CH R =C
1 2 3 4 6 8 3 5 2, 7
H CH Nが Mgとキレートしている）， クロロフィノレ b (R =phytyl, R =R =R
2 3, 1 2 3 4
=R =CH , R =CH:CH R =CHO, R =CH CH Nが Mgとキレートして
8 3 5 2, 6 7 2 3,
いる）， フエオフィチン a (R =phytyl, R =R =R =R = R =CH , R =C
1 2 3 4 6 8 3 5
H:CH R =CH CH )， フエオフィチン b (R =phytyl, R =R =R =R =C
2, 7 2 3, 1 2 3 4 8
H， R =CH:CH R =CHO, R =CH CH )0
3 5 2, 6 7 2 3
[0067] 前記式（2)で表される化合物において、へミン （R =R =H， R =R =R =R
1 2 3 4 6 8
= CH， R =R =CH:CH Nが Feとキレートして、 Feに CIが結合している）， へ
3 5 7 2,
マチン （R =R =H, R =R =R =R =CH , R =R =CH:CH Nが Feと
1 2 3 4 6 8 3 5 7 2,
キレートして、 Feに〇Hが結合している）， へマトポルフィリン （R =R =H, R =
1 2 3
R =R =R =CH , R =R =CH:CH ), ゥロポゾレフィリン III (R =R =H, R
4 6 8 3 5 7 2 1 2
=R =R =R =CH C〇〇H, R =R =CH CH CO〇H)。
3 4 6 8 2 5 7 2 2
[0068] なお、「phytyl」は CH CH = C(CH )CH CH CH CH(CH )CH CH CH CH(
2 3 2 2 2 3 2 2 2
CH )CH CH CH CH(CH )を表してレヽる。
3 2 2 2 3 2
[0069] 前記実施例:!〜 4、比較例：!〜 9の結果のうち bLOX-1に対する酸化 LDLの結合率 の結果を図 1に示す。各阻害剤については、いずれも終濃度 16 /2 Mで試験を行った 。ェチルフエオフオルバイド&、フエオフオルバイド&、へマトフィリン、ゥロポルフィリン III はいずれも結合を有意に阻害していることがわかる。
中でも、ェチルフエオフオルバイド&、フエオフオルバイド&、へマトフィリンは高い阻 害活性を示した。
[0070] また、特に阻害活性の高かったフエオフオルバイド aについて、濃度依存性を調べ た。その結果を図 2に示す。このように、本試験から得られた IC は、約 0.1 μ Μであつ た。
[0071] 図 3には、 hLOX-1に対する酸化 LDLの結合率の結果を示している。各化合物は、 終濃度 16 /i Mになるように添加した。ヒト型 LOX-1においてもゥシの LOX-1に対する 阻害様式と同様の傾向を示しており、ヒト由来の LOXでも活性が確認された。
[0072] (実施例 5)
前記実施例 1〜4、比較例：!〜 9の化合物による細胞毒性を検証するために以下の ように生細胞数を測定した。生細胞数を測定する方法としては、ミトコンドリア内脱水 素酵素による MTT (3_(4，5-Dimethy 2-thiazolyl)-2，5-diphenyltetrazolium Bromide) のホルマザン (難溶性の沈殿物として生成）への還元を利用した MTT法等が汎用さ れる。よって上記 MTT法の変法を利用している、「Cell counting Kit_8」（同仁化学研 究所製、 MTTの代わりに水溶性ホルマザンを生成する WST-8を用いる）を用いて生 細胞数の測定を行った。具体的には、 96ゥヱルプレート（ファルコン社製）に 3. 0 X 1 04cells/mLとなるようにプレートの中心部分である 60ゥエルに 100 μ Lずつ細胞の蒔 き込みを行った（外側の 36ゥエルには温度変化をなくす為に培地のみ 100 μ Lを添 加した)。 2日間の培養（37°C)後、培養上清 50 / Lを除去し、各化合物を適当な希 釈倍率で含む 50 / Lの新しい培養液を添加した。化合物を含む新しい培養液を添 加した後に、 7時間の培養を行った。 7時間後に、化合物を含まない 100 しの培地 で 3回ずっ各ゥエルの洗浄を行った後に、各ゥエルに 3 μ Lずっとなるように「Cell cou nting Kit-8」溶液である「WST-8」を含む培地を添加した。 1時間の培養後、前記培 養液の 450nmの吸光度を測定し、生細胞数として換算した。なお、途中 3回の洗浄 操作を行っているので、外液の化合物による吸光度への影響は無いと考えられた。
[0073] (実施例 6)
実施例 5と同様の化合物について、 bLOX-1を安定的に発現しているチャイニーズ ハムスター卵巣由来（CH〇）細胞を用レ、、 bLOX-1を介した CHO細胞内への蛍光標 識酸化 LDLの取り込み抑制能を評価した。また、 hLOX_lについてはテトラサイクリン 遺伝子発現誘導系を用レ、た CHO細胞での、 hLOX- 1を介した蛍光標識酸化 LDLの 取り込み抑制能を評価した。
[0074] hLOX_lをテトラサイクリン濃度依存的に発現する CHO細胞については、下記ブラ スミドを公知の方法で導入したものを用いた。導入プラスミドは、 pcDNA3.1-hLOXl- V5 (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 39(3) 553-561 (2005))に組み込ま れている hLOX-1コーディング領域がテトラサイクリン応答ベクターに組み込まれてお り、テトラサイクリンあるレヽはドキシサイクリン濃度依存的に hLOX- 1の発現調整が可能 なシステムである。
前記 CHO細胞を用いたアツセィについては、次のように行った。 24ゥエルプレート (ファノレコン社製）に 2. 0 X 104 cells / mLとなるように各ウエノレに 500 μ Lずつ 10% 牛胎児血清（FBS、ただしテトラサイクリンを含まなレ、）含有 HamF12培地（GIBCO社 製）のもとで細胞の蒔き込みを行レ、、 37°C、 5%の CO濃度の環境下で 1日間培養し た。 1日間の培養後、培養上清 250 μ Lを除去し、 200 μ g/mLの濃度でドキシサイク リンを含む 250 μ Lの新しい培養液を添加した（ドキシサイクリンの終濃度は 100 μ g/ mL)。さらに 1日間の培養後、培養上清を除去し、各化合物を適当な希釈倍率で含 む新しレ、培養液を 500 μ Lずつ各ゥエル添加した。各化合物を含む新しレ、培養液を 添加した後に、 1時間の前処理を上記環境下で行うことにより、 LOX-1への抽出物の 結合反応を行った。その後、カルボシァニン蛍光色素である 1,1'-ジォクタデシル -3,3 ，3', 3'-テトラメチルインドカルボシァニンパーコレート（Dil:インビトロジェン社製）で標 識した酸ィ匕 LDLを 5 /i g I mLとなるように各ゥエルにアプライし、上記環境下で 4時間 の CHO細胞内への蛍光標識酸化 LDLの取り込み処理を行った。これらの処理を行 つた後に、 1 mL PBSバッファーで 3回各ゥエルを洗浄し、 0. 1% SDSによる細胞溶解 を行った。溶解後に一定量の溶解液を回収し、 96ゥエルのブラックプレート（NUNC 社製）に分注し、 Dilを指標に取り込まれた酸化 LDLの測定を行った。蛍光測定機器 は、 Molecular Devices社の「SPECTRA MAX GEMINI EM」を用いており、励起波長 5 40nm、検出波長 585nm、遮断波長 570nmで行った。
bLOX-1を安定的に発現している CHO細胞は、既報の方法に従って経代'維持を 行った（Nature, Vol.385, p73- 77, 1997)。細胞を用いたアツセィについては、次のよ うに行った。 24ゥヱルプレート（ファルコン社製）に 3. 0 X 104 cells / mLとなるように 各ウエノレに 500 μ Lずつ 10%牛胎児血清（FBS)含有 HamF12培地のもとで細胞の蒔 き込みを行い、 37°C、 5%の C〇濃度の環境下で 2日間培養した。 2日間の培養後、 培養上清 250 μ Lを除去し、各化合物を適当な希釈倍率で含む 250 μ Lの新しい培 養液を添加した。各化合物を含む新しい培養液を添加した後に、 1時間の前処理を 上記環境下で行うことにより、 LOX-1への抽出物の結合反応を行った。その後、カル ボシァニン蛍光色素である 1，1，-ジォクタデシル -3，3,3',3'-テトラメチルインドカルボシ ァニンパーコレート（Dil:インビトロジヱン社製）で標識した酸化 LDLを 5 μ g / mLとな るように各ゥエルにアプライし、上記環境下で 6時間の CH〇細胞内への蛍光標識酸 化 LDLの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、 1 mL PBSバッファーで 3回各ゥエルを洗浄し、 0. 1% SDSによる細胞溶解を行った。溶解後に一定量の溶解 液を回収し、 96ゥエルのブラックプレート（NUNC社製）に分注し、 Dilを指標に取り込 まれた酸化 LDLの測定を行った。蛍光測定機器は、 Molecular Devices社の「SPECT RA MAX GEMINI EM」を用いており、励起波長 540nm、検出波長 585nm、遮断波 長 570nmで行った。
[0076] 図 4、 5はぞれぞれ、実施例 6で行った、 bLOX_l、 hLOX-1を発現した CHO細胞の 酸化 LDLの取り込み量の結果を示している。 bLOX-l、 hLOX-1共に活性が認められ たのは、数種あるが、特にフエオフオルバイド aは、 hLOX-1におレ、て、抗 hLOX抗体 より強い取り込み阻害を示した。
なお、図には示していないが、実施例 5で行ったミトコンドリア活性を指標とした細胞 毒性試験より、この抑制効果は細胞毒性によるものでは無いことも明らかである。同 様にェチルフエオフオルバイド&、へマトポルフィリン及びゥロポルフィリン IIIも有効な 阻害活性が示される濃度では細胞毒性が見られなかった。
[0077] (実施例 7)
実施例 1、 2と同様の化合物についてアフリカミドリザルの腎臓由来（COS-1)細胞（ ヒューマンサイエンス研究資源バンク）、 bLOX発現 CHO細胞、 hLOX発現 CHO細胞 、 SR- ΑΠ発現 CHO細胞、正常大動脈内皮細胞（BAEC、 Cell Applications Inc.社製） の各細胞に対する、 DiI_OxLDLの取り込み、クラスリン小胞輸送の特異的マーカーと しての Alexa 568をコンジュゲートしたトランスフェリン（励起波長 548nm、検出波長 605 nm、モレキュラープローブ社）の取り込み、力べオラ経路の輸送マーカーとしての Ale xa 488をコンジュゲートした CTB (cholera toxin subunit B、励起波長 480nm、検出波 長 530nm、モレキュラープローブ社）の取り込みを各阻害剤について実施例 6と同様 に検証した。なお、ナイスタチン (ヮコ一社製）は力べオラ輸送の特異的阻害剤として 使用した。
[0078] 図 6は、実施例 7の方法により得られた各マーカーの取り込み量の結果を示す。 CO S-1細胞での取り込みの結果より、フエオフオルバイド aは力べオラ輸送経路も顕著に 阻害することから、フエオフオルバイド aは力べオラを経由した細胞内へのリポプロティ ンのエンドサイト一シスによる酸化 LDL取り込み阻害能を有することが確認できる。ま た、 DiI_OxLDLが bL〇X発現 CH〇細胞でナイスタチンにより CTBと同程度阻害される こと力 、 Diト OxLDLの輸送経路はその多くが力べオラ輸送経路に依存しており、 LO X-1アンタゴニスト活性と力べオラ輸送阻害という 2つの阻害活性をフエオフオルバイ ド aは有していることが示唆された。正常大動脈内皮細胞において、フエオフオルバイ ド aは抗 LOX-1抗体以上の阻害活性を有しており、単なるアンタゴニスト作用よりも強 い取り込み抑制能を有することがこの結果からも示唆された。驚くことに、このフヱォ フォルバイド aは LOXによる酸化 LDLの取り込み抑制能のみならず、 SR-Aによる酸化 LDLの取り込み抑制能も有することが明らかとなった。よって、 SR-A及び内皮細胞の 結果と併せて、このフエオフオルバイド aは様々なスカベンジャー受容体に対する変 性 LDL取り込み抑制能を持つことが示唆されたので、さらに変性 LDLを取り込む細胞 である平滑筋細胞についても検証を行った。
なお、ェチルフエオフオルバイド&、へマトポルフィリン及びゥロポルフィリン IIIについ てもフエオフオルバイド aと類似の阻害傾向が見られた。
[0079] (実施例 8)
実施例 1、 2と比較例 6の化合物について、平滑筋細胞に対する酸化 LDL取り込み 抑制能の評価を実施例 6と同様な方法で行った。
[0080] 平滑筋細胞を 1 X 105 cells/mLとなるように調製し、 96ゥエルプレートへのまき込み を行った。 2日間培養後、実施例 6と同様な方法で各阻害剤による処理を行った。阻 害剤の処理後、 PBSによる洗 d浄を 3回行レ、、室温 '喑所で 10%ホルマリン溶液での 固定を 10分間行った。固定処理を行った細胞を超純水で 2回洗浄し、 DAPIによる核 染色を行った。これらの細胞を「IN Cell Analyze (GEヘルスケア バイオサイエンス 株式会社製）により、 DH標識酸化 LDLの平滑筋細胞への取り込みを核数で除した値 を算出した。また、 1ゥヱル当たり 4視野を測定し、 1処理あたり n= 3で測定した。 [0081] 図 7は実施例 8により得られた試験結果を示す。ボルフオビリノ一ゲン（Po卬 hobillino gen)用した。このように、内皮細胞同様に平滑筋細胞においてもフエオフオルバイド a は非常に強い取り込み抑制能を示し、且つ抗 LOX-1抗体以上の抑制効果を示した 。よってこれらの結果からもフエオフオルバイド aは、内皮細胞、マクロファージと同様 に変性 LDLの取り込みを行い動脈硬化症の初期病変と関わりの深い平滑筋細胞に おいても、 LOX-1のアンタゴニスト活性と共に輸送阻害、あるいは他のス力べンジャ 一受容体を介した酸化 LDLの取り込み抑制能を有することにより、多面的な阻害剤 であることが示唆された。
なお、へマトポルフィリン及びゥロポルフィリン IIIにつレ、てもフエオフオルバイド aと類 似の阻害傾向が見られた。
[0082] 上記の動脈硬化抑制剤の食品組成物、医薬組成物中への添加量は、前記組成物 100gあたり lOOmg以下が好ましぐ具体的には有効濃度等を考えた上、 5〜： !Omg で添加することにより、安全性と有効性が両立できる。例えば、食品組成物、医薬組 成物の配合例としては、以下のものが挙げられる。
[0083] (実施例 9)
キャンディへの配合例
砂糖 64g、水飴 35gを 150°Cで加熱溶解し、 120°Cに冷却後、クェン酸 lg、動脈硬 化抑制剤 5〜： !Omgを添加、攪拌後、均一としたものを成型し、冷却してキャンディを 得た。
[0084] (実施例 10)
グミへの配合例
砂糖 45g、水飴 50gを 110°Cで加熱溶解し、別途膨潤溶解させたゼラチン 8gを添 加し、さらにクェン酸 2g、動脈硬化抑制剤 5〜： !Omgを添加混合し、型に流し込み、 一昼夜静置後、型からはずして、グミを得た。
[0085] (実施例 11)
錠剤への配合例
デキストリン 20g、乳糖 10g、パラチノース 15g、バレイショデンプン 40g、ステアリン 酸マグネシウム 5g、動脈硬化抑制剤 5〜： !Omgを均一に混合し、得られた組成物を 流動法で造粒してから乾燥し、さらに打錠機にて打錠して錠剤を得た。
[0086] (実施例 12)
カプセル剤への配合例
スクワレン 20g、リノレン酸トリグリセリド 20g、小麦胚芽油 10g、精製イワシ油 20g、ト コフエノール 0. 2gを混合攪拌し、均一な組成物とした。この組成物に脱脂大豆粉末 39.8gと動脈硬化抑制剤 5〜： !Omgを加えてニーダ一により十分に混練した。得られ た混練物をカプセル充填機によりカプセル化してカプセル剤を得た。
産業上の利用可能性
[0087] 本発明の動脈硬化抑制剤は、酸化 LDL受容体である LOX-1への酸化 LDLの結合 を阻害するアンタゴニスト作用、 LOX-1と LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介し た脂質取り込み抑制作用、あるいは力べオラ経由での細胞内へのエンドサイト一シス による酸化 LDL取り込み阻害能に優れ、また、血管内皮細胞等の動脈硬化症に関連 する細胞への酸化 LDLの取り込みが継続的に阻害されることで、結果としてヒトあるい は非ヒト動物における動脈硬化症の発症を抑えたり、また症状を緩和することが期待 できる。
[0088] 本明細書に包含される本発明の多くの利点を上記に述べた力 この開示は、多くの 点で例示に過ぎないことが理解されよう。本発明の範囲を逸脱しなければ、細部にわ たり、特に、部品の形状、大きさ及び配置等の事項について、様々な変更を行うこと が可能である。
本発明の範囲が添付の請求の範囲に述べられている文言により限定されることは 勿論である。

Claims

請求の範囲
式 (1) :
Figure imgf000030_0001
(式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の:!〜 4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; Rから Rはそれ
3 8 ぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の:!〜 2個の炭素原子を有する炭化水 素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様 酸化低密度リポ蛋白質受容体 (LOX-1)アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤 式 (2)
[化 2]
Figure imgf000031_0001
(式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の 1〜4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; R力 Rはそれ
3 8 ぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の 1〜2個の炭素原子を有する炭化水素基若しく は、ホルミノレ基、カルボキシメチル基、カルボキシェチル基からなる群力 選択される )
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を含有する、レクチン様 酸化低密度リポ蛋白質受容体 (LOX-1)アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤
[3] 前記式（1)で表されるポルフィリン系誘導体化合物がフエオフオルバイド a及びェチ ルフエオフオルバイド aである請求項 1記載の動脈硬化抑制剤。
[4] 前記式（2)で表されるポルフィリン系誘導体化合物がへマトポルフィリン及びゥロポ ルフィリン ΠΙである請求項 2記載の動脈硬化抑制剤。
[5] LOX-1以外のスカベンジャー受容体を介した細胞への酸化 LDLの取り込み抑制作 用を有する請求項:!〜 4いずれか記載の動脈硬化抑制剤。
[6] 力べオラを経由した細胞内への酸化 LDLの取り込み抑制作用を有する請求項 1〜 4レ、ずれか記載の動脈硬化抑制剤。
[7] 請求項 1· 〜6いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する食品組成物。
[8] 請求項 1· 〜6いずれか記載の動脈硬化抑制剤を含有する医薬組成物。
[9] 式 (1) :
[化 3]
Figure imgf000032_0001
(式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の 1〜4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; R力 Rはそれ
3 8 ぞれ水素、又は直鎖状の飽和若しくは不飽和の:!〜 2個の炭素原子を有する炭化水 素基若しくは、ホルミル基からなる群から選択される）
あるいは式（2)：
[化 4]
Figure imgf000033_0001
(式中、 R、 Rはそれぞれ水素、又は直鎖状若しくは分鎖状の、飽和若しくは不飽和
1 2
の:!〜 4個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる群から選択され; Rから Rはそれ
3 8 ぞれ直鎖状の飽和若しくは不飽和の 1〜2個の炭素原子を有する炭化水素基若しく は、ホルミノレ基、カルボキシメチル基、カルボキシェチル基からなる群力 選択される )
で表されるポルフィリン系誘導体化合物又はそのエステル類を有効成分として含有し てなる、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体 (LOX-1)アンタゴニスト作用を有す る組成物。
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