FR2628118A1 - Fractions peptidiques issues d'hemolysats de cruor, leur obtention et leurs applications - Google Patents
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Abstract
On décrit une fraction peptidique ayant une teneur en histidine au moins égale à 55 mg/g de m.s., et notamment au moins égale à 60 mg/g de m.s. Sa composition en acides aminés, en g/100 g de m.s. est : Asp : 9-10; Thr : 4,5-5; Ser : 4,5-5,5; Glu : 7,5-8,5; Pro : 3-4; Gly: 4-5; Ala : 8-10; Val : 8-10; Ile : moins de 0,5; Met : 1-2; Leu : 14-15; Tyr : 2,5-3; Phe : 6,5-8,5; Lys : 8-9,5; His : 6-7; Arg : 3,5-5,5; Trp : 1-1,5 Pour l'obtenir, on réalise l'hydrolyse en continu d'un hémolysat du cruor, dans un réacteur enzymatique 1 à ultra-filtration sur membranes minérales 8, l'enzyme travaillant à pH < 4 (pepsine). Le rétentat d'ultrafiltration constitue une fraction héminique à au moins 1 % de fer sur la base des m.s., utile en thérapie, pour les apports en fer. L'ultra-filtrat constitue, notamment après purification, ainsi que ses sous-fractions résultant d'une séparation par filtration sur gel, un complément nutritionnel (pour nourrissons), ou encore un milieu de culture biologique ou cellulaire ou un composant d'un tel milieu.
Description
() RÉPUBLIQUE FRAN AISE N de publication: 2 628 118 (à n'utiliser que
pour les INSTITUT NATIONAL commandes de reproduction)
DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE
(D Ne d'enregistrement national 88 02876 PARIS ( Int Cl4' C 12 P 21/06; A 23 J 1/06, 3/00; C 07 K 15/06;
A 61 K 37/18; C 12 N 5/00.
@ DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1
( Date de dépôt: 7 mars 1988.) Demandeur(s): CENTRE NATIONAL DE LA RE-
CHERCHE SCIENTIFIQUE CNRS et UNIVERSITE DES
Priorité SCIENCES ET TECHNIQUES LILLE I. - FR.
( Inventeur(s): Didier Gérard Daniel Guillochon: Jean Marie Edmond Marcel Piot; Danielle Georgette Yvette
4 Date de la mise à disposition du public de la Leconte; Daniel Thomas.
demande: BOPI " Brevets " n 36 du 8 septembre 1989.
( Références à d'autres documents nationaux appa-
rentés: (n) Titulaire(si:
Mandataire(s) Cabinet Harle et Phelip.
( Fractions peptidiques issues d'hémolysats de cruor, leur obtention et leurs applications.
) On décrit une fraction peptidique ayant une teneur en histidine au moins égale à 55 mg/g de m.s., et notamment au moins égale à 60 mg/g de m. s. Sa composition en acides aminés, en g/100 g de m.s. est: Asp: 9-10: Thr: 4,5-5; 2 Ser: 4,5-5,5; Glu: 7,5-8,5: Pro: 3-4; Gly: 4-5; Ala: 8-10; 3 Val: 8-10: Ile: moins de 0,5: Met: 1-2: Leu: 14-15: Tyr: F I 2,5-3; Phe: 6,5-8,5; Lys: 8-9,5; His: 6-7; Arg: 3,5-5,5: Trp: 8 1-1,5 Pour l'obtenir, on réalise l'hydrolyse en continu d'un ' m hémolysat du cruor, dans un réacteur enzymatique 1 à ultra- F " filtration sur membranes minérales 8, I'enzyme travaillant à F pH < 4 (pepsine). Le rétentat d'ultrafiltration constitue une F F fraction héminique à au moins 1 %/o de fer sur la base des/ ' m.s., utile en thérapie, pour les apports en fer. L'ultra-filtrat
O constitue, notamment après purification, ainsi que ses sous-
- fractions résultant d'une séparation par filtration sur gel, un complément nutritionnel (pour nourrissons), ou encore un milieu o de culture biologique ou cellulaire ou un composant d'un tel milieu. U {O oe i La présente invention porte sur de nouvelles fractions peptidiaues issues de produits de l'hémolyse de la partie du sang qui est obtenue après séparation du plasma, cette partie étant désignée dans ce qui suit par le terme "cruor". Ces fractions peuvent être classées en fractions appauvries en hème ou sensiblement non héminiques (désignées
ci-après simplement par l'expression "fractions peptidi-
ques"), et en fractions peptidiques héminiques, qui présentent toutes les deux de l'intérêt, comme cela sera
-10 décrit ci-après.
La présente invention concerne également un procédé pour l'obtention de ces deux types de fractions, ce procédé mettant en jeu l'hydrolyse en continu du cruor dans un réacteur enzymatique à ultrafiltration, le perméat d'ultrafiltration ou ultrafiltrat <parfois également désigné
dans la suite de la description par le terme "hydrolysat)">),
constituant, tel qu'il est obtenu ou après avoir subi un traitement de purification à des degrés plus ou moins poussés, les fractions peptidiques précitées, et le rétentat d'ultrafiltration constituant les fractions peptidiques héminiques précitées, également après purification éventuelle. La présente invention porte enfin sur les applications de ces deux types de fractions: les fractions peptidiques sont utiles, d'une part, comme complément alimentaire, en alimentation humaine et animale, en médecine humaine, en particulier en nutrition thérapeutique pédiatrique, et en médecine vétérinaire, et, d'autre part, pour la préparation de milieux de culture; quant aux fractions peptidiques héminiques, elles trouvent application chaque fois qu'il convient de réaliser un apport en fer, en
médecine humaine et vétérinaire, par exemple pour -
l'administration à des femmes venant d'accoucher et
présentant, de ce fait, une carence en fer.
Les hydrolysats de protéines sont maintenant largement utilisés en tant qu'aliments de -nutrition pour l'alimentation humaine et animale, et également dans des applications particulières, dans des domaines tels que la nutrition entérale clinique, les milieux de cultures microbiologiques, les milieux de cultures cellulaires, les produits vétérinaires, et l'isolement des peptides à activité biologique. Des recherches sont menées de façon croissante dans le domaine de la thérapie nutritionnelle, o l'on demande des hydrolysats présentant une pureté élevée et une constance de composition. De telles exigences sont également valables pour d'autres applications, par exemple, les milieux de culture. De plus, une connaissance complète des compositions d'hydrolysats permettrait une purification
plus facile des peptides actifs.
Jusqu'à maintenant, la plupart des hydrolysats de protéines étaient obtenus par un traitement enzymatique de sources de protéines, telles que le soja, la caséine, le blé et le poisson. Il est cependant difficile d'obtenir des échantillons purs de ces protéines à partir de leurs matières premières; de plus, la composition de ces dernières peut varier, d'o il résulte que les hydrolysats provenant de ces protéines présentent également des
compositions variables.
Le sang destiné à l'utilisation en alimentation humaine est généralement centrifugé de façon à séparer le plasma <composé de protéines incolores) du cruor, qui est le
résidu cellulaire solide constitué à près de 95% d'hémo-
globine, protéine facile à obtenir à l'état pur et ayant une composition constante d'un lot à l'autre. Alors que le plasma est utilisé notamment dans les industries de salaison et de conserve de viandes, la quasitotalité du cruor est rejetée à titre de déchets, ou très faiblement valorisée, par exemple, traitée pour entrer dans la composition d'engrais, de colles, etc. On a donc cherché à valoriser le cruor, afin d'obtenir des fractions peptidiques pouvant être utilisées dans l'alimentation animale ainsi que dans l'alimentation humaine, par exemple par incorporation dans les urocuits de charcuterie ou dans les potages fabriqués industriellement, ou encore en diététique médicale, par incorporation dans des formulations alimentaires diététiques, notamment pour les nourrissons. On a déjà proposé un procédé discontinu d'obtention de globine décolorée hydrolysée à propriétés fonctionnelles intéressantes (pouvoir d'émulsification; propriétés moussantes), supérieures à celles du caseinate, suivant lequel on réalise une hydrolyse enzymatique du cruor, en cuve agitée, l'enzyme étant l'Alcalase; on inactive l'enzyme par chauffage et à pH acide; on sépare, par centrifugation ou ultrafiltration, la fraction fortement colorée précipitée, d'une fraction liquide moins colorée, que l'on traite ensuite par le charbon actif; on concentre le produit liquide clair obtenu par les techniques classiques d'élimination de l'eau <osmose inverse ou évaporation); puis on le stabilise et on le sèche par atomisation. On a aussi propose, dans la demande de brevet français n 2 561 074, de réaliser une hydrolyse enzymatique d'un hémolysat de cruor. Le procédé est un procédé en discontinu mettant en jeu une enzyme protéolytique digestive, comme la pepsine, après quoi, on centrifuge et on décolore le surnageant par mise en contact avec un agent adsorbant choisi parmi l'alumine, la magnésie et le silicate de magnésium. La fraction peptidique obtenue après lyophilisation du produit ainsi décoloré ne présente plus d'activité enzymatique et a une valeur nutritive
intéressante. Ce procédé n'est cependant pas avantageuse-
ment applicable à l'échelle industrielle.
On a maintenant découvert que l'hydrolyse en
continu d'un hémolysat du cruor, dans un réacteur enzyma-
tique à ultrafiltration sur membranes minérales, pouvait conduire à une fraction peptidique non héminique spécifique de valeur, dans des conditions industriellement satisfaisantes. Il n'était pas évident que la technioue connue d'hydrolyse dans un réacteur enzymatique à ultrafiltration s'applique aux hémolysats du cruor. On pouvait en effet s'attendre à un colmatage des membranes d'ultrafiltrazion par suite d'une accumulation dans le circuit de peptides insolubles riches en hème. Par ailleurs, on obtient, selon l'invention, un perméat d'ultrafiltration nettement moins coloré que l'hydrolysat
enzymatique brut.
Il en résulte qu'à l'étape ultérieure de décoloration, on peut réaliser une économie non négligeable en agent décolorant, quel qu'il soit. Sur le plan industriel, cet avantage s'ajoute à l'intérêt d'une
opération menée en continu.
Par ailleurs, avec le procédé selon l'invention, en agissant sur différents paramètres, en particulier les
paramètres du réacteur enzymatique à ultrafiltration (débit.
pression), on peut obtenir des hydrolysats et, après purification, des fractions peptidiques qui sont mieux adaptes aux besoins et dont on peut contrôler la
reproductibilité et la pureté.
Le perméat d'ultrafiltration a été caractérisé avant et après sa purification, et le perméat purifié a été séparé en sous-fractions qui ont été elles-mêmes caractérisées et qui font également l'objet de la présente invention. Egalement, le rétentat d'ultrafiltration a été caractérisé en ce qui concerne sa teneur en fer, ce qui a permis de mettre en évidence son utilité dans des
applications thérapeutiques nécessitant un apport en fer.
La fraction peptidique de la présente invention, est, d'une manière générale, caractérisée par le fait qu'elle possède une teneur en histidine au moins égale à mg/g de matières sèches, et notamment au moins égale à
60 mg/g de matières sèches.
Cette fraction peut egalement étre caractérisee par sa composition en acides aminés en grammes, Tour 100 g de matieres sches, qui est la suivante: Asp:9 - 10 Thr: 4,5 - 5 Ser: 4,5 - 5,5 Glu: 7,5 - 8,5 Pro: 3 - 4 Gly: 4 - 5 Ala 8 - 10 Val: 8 - 10 Ile: moins de 0,5 Xet: 1 - 2 Leu: 14 15 Tyr: 2,5 - 3 Phe: 6,5 - 8,5 Lys: 8 - 9,5 His: 6 - 7 Arg: 3,5 - 5,5
î Trp:- 1,5.
L'invention porte également sur une fraction peptidique qui peut être caractérisée par le fait que: - 5 & 15% environ des peptides qui la composent ont une masse moléculaire supérieure à environ 6 000 daltons; 45 à 65% environ des peptides qui la composent ont une masse moléculaire comprise entre environ 1 300 et 6 000 daltons; et - 20 à 50% environ des peptides qui la composent ont une
masse moléculaire inférieure à environ 1 300 daltons.
Egalement, l'invention porte sur une fraction peptidique qui peut être caractérisée par le fait qu'en filtration sur gel de dextrane réticulé, elle fournit un chromatogramme comportant sept pics principaux. Les masses ioléculaires des fractions correspondant à ces sept pics sont notamment les suivantes: Pic 1: environ 6 500 daltons Pic 2: environ 4 000 daltons Pic 3 environ 2 600 altons Pic 4: environ 1 300 daltons Pic 4: environ 1650 daltons Pic 6: environ 350 daltons Pic 67: environ 150 daltons
Pic 7 environ 150 da!tons.
La répartition en pourcentage des peptides dans les différents pics est notamment la suivante: Pic 1: environ 10 Pic 2: environ 15 i5 Pic 3: environ 15 Pic 4: environ 20 Pic 5: environ 15 Pic 6: environ 15
Pic ?: environ 3.
Les sept sous-fractions correspondant aux pics majeurs obtenus en séparation par chromatographie de perméation de gel, éventuellement purifiées par HPLC phase inverse, et toutes combinaisons possibles entre ces
fractions font également l'objet de la présente invention.
Leur composition en acides aminés est indiquée ci-après.
Connaissant cette composition, on pourra utiliser ces sous-fractions dans des applications spécifiques, en
fonction de leur richesse en tel ou tel acide aminé.
En particulier, on peut souligner, les fractions ayant une teneur en histidine comprise entre 6 et 15g/100' d'acides aminés, très avantageusement applicables en thérapeutique nutritionnelle chez les nourrissons, l'histidine étant en effet un acide aminé essentiel pour le
nourrisson.
? Quant a la fraction peptiaique nhéminiaue ce l'invention, elle consiste en le rétentat d'ultrafiitration d'un hydrolysat peptidiaue de cruor, la teneur en fer de
ladite fraction étant d'au minimum 1% des matières sèche'..
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation, à partir d'un hémolysat du cruor, de la fraction peptidique telle que définie ci-dessus et/ou de la fraction peptidique hêminique également telle que définie ci-dessus, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'il consiste à: - introduire ledit hémolysat dans une zone de réaction, en vue d'une mise en contact intime avec une enzyme protéolytique travaillant à un pH inférieur a 4; - soutirer en continu le produit de la réaction enzymatique en l'amenant de la zone de réaction dans une zone d'ultrafiltration comportant des membranes minérales d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure leur permettant de retenir ladite enzyme et l'hémoglobine, laissant passer pratiquement seulement les peptides provenant de l'hydrolyse; - soutirer en continu un perméat qui représente la fraction peptidique recherchée -; - recycler, au moins partiellement, le rétentat d'ultrafiltration dans la zone de réaction; et - recueillir le rétentat, en tant que la fraction peptidique héminique recherchée, après purification éventuelle. On utilise notamment un hémolysat de cruor ayant une teneur en hémoglobine comprise entre 1 et 10 % en poids, le cruor ayant été hémolysé en milieu aqueux, à un pH acfde, notamment de 2, puis dilué jusqu'à la teneur en hémoglobine recherchée. En particulier, on choisit, comme enzyme protéolytique, la pepsine et on ajuste le pH dans la zone de réaction à une valeur allant de 1,5 à 2,5, var addition d'un composé à réaction acide. On introduit la pepsine dans la zone de réaction a raison de 40 à 80 unites AN.SON par Éilogrammnne d'hémoglobine (l'unité ANSON étant définie dans "J. GEN. PHYSIOL. 22, 7989-1939"). Par ailleurs, on effectue l'hydrolyse à une température inférieure à la température de dénaturation de l'enzyme utilisée; on choisira notamment une température se situant dans la zone
de 35 à 45'C.
Conformément à une autre caractéristique de l'invention, on met en circulation le milieu se trouvant dans la zone de réaction, alors que le taux d'hydrolyse est
de l'ordre de 10 à 20 %.
On choisit des membranes minérales présentant un seuil de coupure inférieur à 30 000 environ, pouvant être aussi faible que 10 000 environ, et même pouvant présenter une valeur inférieure à 10 000. A titre d'exemple de membranes d'ultrafiltration, on peut mentionner les membranes tubulaires de carbone recouvertes d'oxyde de zirconium, telles que celles mises sur le marché par la Société de Fabrication d'Eléments Catalytiques (SFEC),
France.
Ce procédé se distingue de celui décrit dans la demande de brevet européen n' 0 061 256 qui vise seulement la préparation de peptides héminiques. Ce procédé connu met en jeu une étape de dénaturation à pH 11il de l'hémoglobine, avant de conduire l'hydrolyse enzymatique à un pH se situant entre 9 et 7, l'enzyme employée étant notamment l'Alcalase, la neutrase ou la papaïne, mais en tout cas, jamais la pepsine. Selon l'invention, la pepsine est mise en oeuvre à
son pH optimum de 2 qui est dénaturant pour l'hémoglobine.
Les membranes organiques employés conformément au procédé de la demande européenne n' 0 061 556 ne pourraient être mises
en oeuvre à une telle valeur de pH.
Dans ces conditions, les fractions peptidiques de la présente invention auront donc nécessairement une composition distincte des produits obtenus par ce procédé connu. Le procédé de l'invention permet de préparer en continu des nydrolysats pevtidiques definis (répartition en
masses moléculaires et composition en acices aminés) e-
reproductibles à l'abri des contaminations bactériennes, rendant ainsi les peptides applicables dans des domaines o cette reproductibilité est importante, comme en diététioue
médicale ou dans les milieux de cultures.
L'ultrafiltrat obtenu par le procédé peut être avantageusement décoloré par la mise en contact avec un adsorbant. Comme adsorbant, on utilise notamment la magnésie. On peut également mentionner les autres adsorbants cités dans la demande de brevet français n 2 561 074. Toutefois la magnésie présente les avantages de dénaturer l'enzyme qui aurait pu passer dans le perméat
d'ultrafiltration et de permettre une élution aisée.
Après avoir, le cas échéant, décoloré
l'ultrafiltrat, on peut le dessaler, en utilisant pour cela,.
à titre d'exemple, la technique d'électrodialyse.
Ensuite, on peut concentrer et atomiser 1'ultrafiltrat pour obtenir la fraction peptidique recherchée sous la forme d'une poudre. En particulier, on peut réaliser l'opération de concentration à l'aide d'un
évaporateur à flot tombant.
La présente invention porte également sur la fraction peptidique et la fraction peptidique heminique qui sont obtenues par le procédé tel qu'il vient d'être défini ci-dessus. La présente invention porte enfin sur l'utilisation de la fraction peptidique selon l'invention, purifiée ou non, ainsi que des sous-fractions qui ont été définies ci-dessus, comme aliment ou complément alimentaire, en alimentation humaine et animale, ou comme aliment ou complément nutritionnel, en thérapeutique ou diététique chez l'homme ou l'animal, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique. Cette utilité vient de la teneur élevée en histidine de cette fraction ou de ces sous-fractions, qui est nettement supérieure à celle du lait de femme (en moyenne 26 mg par g de protéine) ou même de la caséine (28 mg par g de protéine). On sait en effet eue ''hiszicdine
est un acide aminé essentiel pour le jeune enfant.
L'invention porte également sur un aliment ou complément nutritionnel contenant une fraction peptidique et/ou au moins l'une des sous-fractions qui ont été définies ci-dessus. L'invention porte également sur l'utilisation de la fraction peptidique et des sous-fractions définies cidessus dans le domaine vétérinaire, pour favoriser
l'appétence des animaux.
Egalement, l'invention porte sur l'utilisation de la fraction peptidique héminique telle qu'elle e été définie ci-dessus, en thérapeutique humaine ou animale, pour
réaliser un apport en fer.
Pour les applications du domaine médical, la fraction peptidique (et les sous-frdctions) et la fraction peptidique héminique de l'invention pourront sans inconvénient être placées sous une forme pharmaceutique appropriée, dans laquelle ces fractions constituent l'ingrédient actif. On peut citer notamment les formes pharmaceutiques convenant pour l'administration orale, entérale, ou par voie injectable. Dans le cas de la fraction peptidique héminique utilisable en thérapie humaine et animale chaque fois qu'il est nécessaire de réaliser un apport en fer, on peut mentionner une forme pharmaceutique
intéressante qui estconstituée par les gélules.
Enfin, la présente invention porte également sur l'utilisation de la fraction peptidique et des sous-fractions telles que définies ci-dessus, comme milieu de culture biologique ou cellulaire ou comme composant de tels milieux. L'invention porte également sur le milieu de culture biologique ou cellulaire constitué par ou renfermant cette fraction peptidique ou au moins l'une des
sous-fractions peptidiques définies ci-dessus.
1.1 On a représenté, sur la Figure 1 du dessin annexe, le réacteur enzymatique à membranes minérales, utiilse pour l'hydrolyse du cruor. Sur ce dessin, (m) désigne un
manomètre, chaque (D), un débitmètre, et (f), un filtre.
Ce réacteur enzymatique comporte une cuve a réaction désignée par le chiffre de référence 1. Cette
cuve 1 est équipée d'un système d'agitation 2.
L'alimentation.continue en hémolysat est effectuée par la canalisation 3, comme indiqué par la flèche F. La pepsine est introduite directement dans la cuve 1. Cette dernière est également équipée d'un appareillage servant à la fois à mesurer et à maintenir le pH dans la cuve de réaction. Le produit d'hydrolyse prélevé dans la cuve de réaction 1 par la canalisation 4 est acheminé par une pompe d'alimentation ou de gavage 5. Au refoulement de la pompe 5, le produit passe dans une canalisation 6 et est amené dans un module d'ultrafiltration 7. Ce module 7 comprend une pompe de circulation 7a et des membranes tubulaires 8 dont les caractéristioues sont indiquées ci-après pour chacun des
deux exemples de mise en oeuvre du procédé.de l'invention.
La circulation du produit d'hydrolyse renfermant l'enzyme est symbolisée par les flèches F et le passage de la fraction peptidique d'ultrafiltrat à travers les
membranes 8, par la flèche F2.
L'ultrafiltrat est récupéré dans une canalisation 9 (comme indiqué par la flèche f). Quant au rétentat du module 7, il est prélevé par la canalisation 10, sur laquelle peut se trouver un échangeur, et il est acheminé par cette canalisation pour être recyclé au moins
partiellement dans la cuve de réaction 1.
On a constaté, selon l'invention, quet grâce à l'utilisation d'un réacteur enzymatique combiné à une ultrafiltration sur membranes minérales, on pouvait non seulement hydrolyser l'hémoglobine en continu, mais aussi optimiser d'une façon étonnament élevée l'étape de décoloration. Ainsi, on divise par un facteur de l'ordre de ouinze la quantité d'adsorbant employé (magnésie par exemple> et par un facteur de l'ordre de douze, le temps de decoloration. Il s'agit là d'un avantage inattendu et
intéressant du procédé de l'invention.
Dans ce qui suit, on a décrit deux exemples illustrant la mise en oeuvre du procédé complet selon la présente invention; le mode opératoire général était le même dans les deux cas, mais les membranes utilisées étaient différentes.
A. HYDROLYSE ENZYMATIQUE CONTINUE
On a obtenu l'hémoglobine en effectuant une hémolyse d'érythrocytes par de l'eau, et on en a déterminé la concentration conformément à la méthode à la
cyanméthémoglobine <Crosby, W.H.; Munn, J.I.; Furth, F.W.
"Standardizing a method for clinical hemoglobinometry. U.S. Armed Forces Med. J. 1954, 5, 693 - 703"))), afin d'obtenir 300 1 d'hémoglobine dénaturée à 5% (p/v), à pH 2. Pour la digestion pepsique, on a chauffé 80 1 d'hémoglobine jusu'àa 40'C dans un réacteur <SETRIC), et on a ajouté 240 Unités ANSON de pepsine porcine (MERCK). L'hydrolyse a duré 8 heures, à un pH de 2, maintenu par.le dispositif pH statique (Electrode INGOLD type 465 dans une sonde de type 764), délivrant de l'acide chlorhydrique 4,2 M. Des échantillons (5 ml) ont été prélevés du milieu d'incubation, et la teneur en azote a été déterminée conformément à la méthode de KJELDHAL <appareil GERHARDT VAPODEST 3). La
teneur en protéines a été exprimée sous forme N x 6,25.
Au bout de 8 heures, le réacteur a été relié aux
membranes d'ultrafiltration. Le dispositif d'ultra-
filtration était équipé de deux modules, en séries, de membranes M4 (Exemple 1) ou M5 <Exemple 2) Carbosep SFEC;, d'une pompe d'alimentation (HILGE type Hygiana 1/.3, type centrifuge: débit 1 m3/h, 5 bars) et d'une pompe de circulation (HILGE type Hygia super II, type centrifuge: d3bit 5 m/h, 1,8 bars. Chaue module prsenti une débit 5 m /h, 1,8 bars). Chaque module présentait une surface de 0,16 m2 et se composait de sept tubries mesurant chacun 1,2 m de longueur, avec un diametre interne de 6 mm et un diamètre externe de 10 mm; les tubes étaient realises en carbone poreux et revêtus par une couche active d'oxyde de zirconium sur leur surface interne. Des membranes présentant des seuils de coupure de respectivement 000 daltons (membranes M5 de l'Exemple 2) et 000 daltons (membrane M4 de l'Exemple 1) ont été utilisées. La résistance physique et chimique des membranes et l'appareillage permettaient une opération dans une plage de températures de 0 - 85'C, dans une plage de pH 1 - 14, et dans une plage de pressions de 0 - 8 bars. Le débit de perméation caractéristique pour l'eau était de 60 1/h/m /bar (pour les membranes M4) et de 45 1/b/m2 /bar (pour les
membranes M5) à 25'C.
L'ultrafiltration a été conduite à 40 C pendant 22 heures. Les pressions de travail ont été ajustées manuellement, afin de maintenir constant le débit de l'ultrafiltrat (30 1/ni /h). La vitesse d'écoulement transversal a été fixée à 4 m/s. Le réacteur était équipé d'un régulateur de niveau. Pendant l'ultrafiltration, le niveau du réacteur a été maintenu constant par l'addition d'hémolysat. Les pressions internes des membranes ont été suivies en fonction du temps, à un débit de perméat de 1/h pour les membranes X4 <Exemple 1) et M5 <Exemple 2); c'est ce qui est représenté sur la Figure 2: Légende de la Figure 2: Effet de la sélectivité des membranes sur les pressions internes des membranes et les volumes de perméat en fonction du temps. Ultrafiltration avec membranes M4 <(o) et membranes >5 <*>) Les pressions internes des membranes passent de 1 bar à 1,4 bar, et de 1,5 bar à 4 bars pour les membranes respectivement M4 et M5
B. DECOLORATION
La decoloration de l'ultrafiltrat a été effectuée dans un réservoir agité en continu, A 20 C, à l'aide de
magnésie: 10 g/l (membranes M5) et 148 g/1 (membranes X4).
Des échantillons <10 ml) ont été prélevés dans le réservoir, afin de déterminer la cinétique de la décoloration en suivant l'absorbance spectrométrique à 400 nm, due à la teneur en hèmes, et à 280 nm, afin d'apprécier le teneur totale en protéines. Chaque échantillon a été centrifugé à 5 000 t.p.m. pendant 10 minutes, afin d'éliminer les
matières non-dissoutes avant la mesure spectrométrique.
Les spectres des ultrafiltrats bruts sont présentés sur la Figure 3, Légende de la Figure 3: Effet de la sélectivité des membranes sur le procédé de décoloration. Spectre de l'ultrafiltrat provenant des membranes X4, dilué 3 fois dans l'eau <), et de l'ultrafiltrat provenant des
membranes XS, non dilué (--->.
Les évolutions en fonction du temps des processus
de décoloration sont résumées sur la Figure 4.
Légende de la Figure 4: Evolution dans le temps de la teneur en hèmes et peptides durant les procédés de
décoloration avec les membranes X4 (,) et M5 (A).
L'absorbance à 400 nm montre que l'ultrafiltrat de M4 est bien plus coloré par les peptides héminiques que l'ultrafiltrat de M5. Par conséquent, l'ultrafiltrat de M4 demande environ 15 fois plus de magnésie et de temps que
0 l'ultrafiltrat de M5, pour l'achèvement de la décoloration.
C. ELECTRODIALYSE
Le dessalage de l'ultrafiltrat décoloré a été effectué par électrodialyse (Aqualizer P20 de SRTI). On a contr6lé l'élimination de sel en suivant la diminution de l'intensité (8 à 0,5 A), sous une tension constante imtosée
(110 V).
]. CONCENTRATION ET ATOMISATION
L'hydrolysat décoloré aessaie a été a'abora concentre a l'aide d'un évaporateur <(FIVES CAIL), Dui.s atomisé (Atomiseur NIRO) La concentration a été effectuée a 78'C, sous 0,5 bar. L'atomisation a été effectuée entre
'C et 100'C.
Les valeurs des rendements des différentes étapes
du procédé sont rapportées dans le Tableau 1.
Tableau 1 Rendements des étapes successives du procédé selon les Exemples1 et 2. Les quantités de protides sont exprimées sous forme N x 6,25 Etapes Exemple 1 Exemple 2
Quantité de Rende- Quantité de Rende-
protides ment protides ment récupérée récupérée (kg) (%) (kg) (%) Hémolyse 11,1 100 11,7 100 Ultrafiltration 8,6 77 8,1 69 Décoloration 4,3 50 7,4 91 Dessalage 3,8 88 5,9 80 Concentration 3,8 88 5,8 98 Atomisation 3,7 97 5,7 98 Rendements totaux 33 49
E. CARACTERISATION DES HYDROLYSATS PEPTIDIQUES
E. 1 Analyse chimique élémentaire Les résultats de l'analyse chimique élémentaire des poudres peptidiques obtenues sont rapportés dans le Tableau 2 ci-après. _bl e6L?2: Analyse élémentaire chimique des roudres oeptidioues. Les Quantités d'éléments sont exprimées en g pour 100 g de poudre.
HYDROLYSAT
Eau et _ __ Eléments Exemple 1 Exemple 2 (membranes M4) (membranes X5) De/") A%)
N 14,55 14,72
H20O 6,56 4,64
Na 0,99 1,19 Kg 0,80 0,98 Ci 0,60 0,68 Ca 6,5 102 6,3 102 P 5 10o3 8 10-3
-3 -2
Fe 3 103 1,1 102
-3 -'3
K 3 10 2,5 103
-4 -4
Cu 6 104 5 10 Pb 1,2 10-5 9 10-6
- ? -6
Cd 9 107 1,8 10 La teneur en azote permet d'évaluer le pourcentage de peptides dans la poudre peptidique comme étant un pourcentage dépassant 90% (N x 6,25). La teneur élevée en magnésium, par comparaison avec celle du cruor, provient de
la magnésie utilisée à l'étape de décoloration.
E.2 Composition en acides aminés Pour l'analyse des acides aminés, les. peptides sont hydrolysés dans HICl 6 À, à 110'C, sous vide, pendant 24 heures, avec une goutte de phénol à 1%, afin d'empncher une dégradation excessive de la tyrosine, et ils sont en fin
de compte analysés à l'aide d'un analyseur d'acides aminés.
BECKMAN 119 CL.
Les compositions en acides amines des hydrolysats préparés avec les membranes M4 et M5 sont énuméré, dans le
Tableau 3.
Ibleau 3: Reproductibilité des compositions en acides aminés des hydrolysats. (Les compositions en acides aminés sont exprimées en g d'acide aminé pour 100 g des acides aminés totaux). AieHydrolysat Acides aminés Exemple 1 Exemple 2
A B C D
Asp 9,4 9,2 9,8 9,1 Thr 4,7 4,6 4,9 4,7 Ser 5,3 4,7 5,1 4,7 Glu 8,3 7,6 8, 3 8,1 Pro 3,? 3,4 3,4 3,4 Gly 4,6 4,2 4,2 4,1 Ala 8,2 8,4 9,5 8,2 Val 8, 1i 8,8 9,? 8,5 Ile 0,3 0,3 0,3 0,2 X[!t 1,3 1,7 1,6 1,7 Leu 14,2 14,0 14, 7 14,5 Tyr 2,8 2,8 2,6 3,0 Phe 7,5 8,0 6,9 8,4 Lys 8,1 9,4 8,0 8,6 His 6, 9 6,8 6,0 6,6 Arg 5,2 5,0 3,8 5,2 Trp 1,4 1,1 1,25 1,0 Acides aminés essentiels 48,4 50,7 49,95 50,6 totaux La quantité d'acides aminés libres dans les
hydrolysats était inférieure à 1%.
18. Pour l'application en thérapie nutritionnelle et, en particulier, pour la nutrition entérale, cette teneur en acides aminés libres est recommandée de façon à é'viter une osmolarité intestinale élevée et pour permettre une plus forte absorption d'acides aminés à partir de peptides.
En vue des applications.nutritionnelles en.
pédiatrie, on peut souligner la teneur élevee en histidine (trois fois plus que dans les hydrolysats de caséine), qui
est un acide aminé essentiel pour les enfants.
Ainsi, pour chaque expérience avec un type de membrane et quel que soit le type de membrane utilisé pendant le procédé, il n'a pas été observé de différences significatives sur les compositions en acides aminés des hydrolysats. On conclut que le procédé permet la préparation d'hydrolysats successifs avec des compositions
en acides aminés qui sont reproductibles.
E.3 Filtration sur Sel Les expériences de filtration sur gel ont éte effectuées sur une colonne de "Sephadex G 25 superfine" <90 x 5 cm), équilibrée par de l'acide chlorhydrique 0,01 M, à pH 2. Un échantillon de chacune des poudres peptidiques (ultrafiltrats purifiés (250 mg)) a été dissous dans 3 ml d'acide chlorhydrique 0,01 M et filtré à travers un filtre
de 0,45 "m (MILLIPORE), avant d'être appliqué à la colonne.
Le débit de la colonne était de 50 ml/h. L'absorbance a été
détectée à 225 nm, à l'aide d'un détecteur LKB 2151.
La technique de filtration sur gel a été réalisée notamment pour apprécier la reproductibilité de la SO répartition de la masse moléculaire dans les hydrolysats peptidiques. Les Figures 5A et 5B représentent les
chromatogrammes correspondants.
Légende des Figures 5A et 5B: Fig 5A Hydrolysats A (....) et B <_ _) avec membranes M4 Fig 5B Hydrolysats C (...> et D (_ _) avec membranes M5
19 2628118
Le chromatogramme ainsi obtenu dans le cas de l'hydrolysat A a été divisé en neuf fractions, suivanz la
Figure 6 du dessin annexe.
Les masses moléculaires de la DluDart des fractions ont pu être estimés comme allant d'environ 6 500 (Fraction 1) à 150 <Fraction 7)..Les fractions 8 et 9 contiennent des petits peptides interagissant avec le gel, étant donné que leur volume d'élution était supérieur au volume total de la colonne. Les quantités de peptides récupérées dans chaque fraction, calculées à partir de leur teneur en acides aminés, et leurs masses moléculaires apparentes obtenues par filtration sur gel, sont présentés
dans le Tableau 4.
Tableau A:
Distribution des masses moléculaires apparentes des peptides séparés par filtration de gel sur Sephadex G 25 et quantités récupérées dans chaque fraction calculées à partir de la teneur en acides aminés Fractions
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Xasse moléculaire moyenne 6500 4000 2600 1300 650 350 150 Interaction en poids avec le gel apparente (daltons) Quantités de peptides 10,55 16,19 15,44 21,09 15,84 15,13 2,35 3,31 0,1 récupérées en % Chaque fraction a été analysée pour sa teneur en acides aminés (Tableau 5) <même mode opératoire que précédemment)
* 2628118
Tab!eau._Dû: Acides aminés totaux dans les fractions éluées de Sephaaex G 25. (Les compositions en acides aminés sont exprimées en g d'acide aminé pour 100 g des acides aminés totaux>. Acides Aminés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Asp 16,68 9,98 13,03 8,73 6,88 6,51 3,73 1,18 7,48 Thr 3,31 0,93 3,12 3,87 8, 62 5,6 1,45 9,08 4,43 Ser 5,03 5,7 6,8 4,07 2,76 6,28 7,08 1,39 4,63 Glu 2,88 6,? 3,41 8,7 6,46 12,86 13,54 11,29 7,79 Pro 2,87 1,08 6,88 2,84 5, 03 1,09 0,78 8,95 4,1 Gly 5,39 9,63 1,88 5,1 2,1 4,12 3 0,88 18,49 Ala 6, 97 17,29 9,43 7,2 6,98 6,65 4,78 0,88 4,15 Val 8,81 12,03 9,1 10,9 10,6 4, 37 2,28 16,35 9,02 let 4,6 0,75 0,37 0,74 1,72 2,76 1,96 0,6 1,13 Ile 0, 57 0,43 0,49 0,56 0,42 0,6 0,98 0,76 2,9 Leu 9,98 7,94 13,38 20,01 14,6 18,43 10,93 2,8 8,13 Tyr 0,7 0,37 0,84 0,69 5,89 7,02 7,4 15,59 7,71 Phe 5,54 0,92 6,05 5,87 10,17 6,18 35,54 15,53 8,49 His 8,2 9,8 14,26 6,02 7, 62 0,95 0,89 1,1 3,12 Lys 17,5 15,76 6,56 11,45 5,88.6,32 0,73 0,53 3,37 Arg 0,97 0,69 4,4 3,25 4,27 10,26 4,93 13,09 5,06 Acides aminés essentiels 51,01 39,13 39,91 54,09 57,9 51,28 61,27 61,24 45,18 totaux La composition fluctue largement d'une fraction à l'autre. En ce qui concerne les acides aminés essentiels totaux, elle est très proche de (Fractions 1, 4, 6) et même supérieure (Fractions 5, 7,8) à la protéine de l'oeuf (Protéine de réference F.A.O. 51,3 g d'acides aminés essentiels pour 100 g d'acides aminés totaux) et ce, malgré le manque d'isoleucine. Les Fractions 2 et 3 montrent -une faible teneur en acides aminés essentiels, mais une teneur
21 I2628118
éleievée en histidine, dont on a déjà souligné l'importance.
Les Fractions 7 et 8 sont caractérisées par des teneurs trèsélevées en tyrosine et en phénylalanine. _n tout cas, les Fractions 1 à 5 montrent une teneur importante en histidine. E.4 Chromatographie HPLC phase inverse L'analyse des peptides de l'hydrolysat A et des différentes fractions séparés par filtration sur gel a été effectuée par HPLC phase inverse. Il est apparu que la combinaison chromatographie par perméation de gel - HPLC phase inverse constitue un moyen efficace pour purifier les
fractions selon l'invention.
Toutes les séparations ont été réalisées à l'aide d'un appareil LKB avec deux pompes Modèle 2150. Chaque échantillon a été fractionné sur une colonne, phase inverse, cm x 7,5 mm de diamètre interne, ODS - 120 T C18. La phase mobile <dégazée par l'hélium) se composait de tampon acétate d'ammonium 10 mM (préparé quotidiennement à partir d'acétate d'ammonium analytique et ajusté de façon précise à pH 6,1 par de l'acide acétique, en tant que solvant A, et un tampon acétonitrile - acétate d'ammonium 10 mM à pH 6,1 <50/50>, en tant que solvant B. Le gradient de solvant était de 0 à 100% de B en 80 minutes à un débit de 1,5 ml/mn. Les échantillons ont été dissous dans le tampon A (10 mg/ml) et filtrés à travers des filtres de 0,20 um avant d'être chargés sur la colonne (200 1pl). Les peptides ont été détectés en continu dans
nm à 370 nm avec un détecteur spectral Modèle 2140 LKB.
Le rapport entre l'absorbance à deux différentes longueurs d'onde de 200 nm à 230 nm a été utilisé comme outil pour le contrôle de la pureté de pic. Si le. rapport est constant
sur le temps d'élution du pic, le pic est pur.
22628 1 18
Les chromatogrammes obtenus sont représentés sur
les Figures 7 et 81 à 89.
Légende de la Figure 7: Séparation par HPLP phase inverse de l'hydrolysat peptique total décoloré A. Légende des Figures 8 à 89: Séparation HPLC phase inverse des neuf fractions peptidiques-issues de la colonne
Sephadex G 25.
Pour illustrer l'application des fractions non héminiques selon l'invention-comme ingrédients de milieux de culture, la valeur nutritive, pour trois espèces de Tetrahymena, des fractions peptidiques A à D précitées a été étudiée, à la fois en remplacement du mélange d'acides aminés dans un milieu chimiquement défini et en remplacement
des petones dans un milieu complexe.
Pour la culture de Tetrahymena, on peut utiliser un milieu très simple à base de peptone et l'extrait de levure, dont chaque lot doit être testé pour savoir s'il convient pour favoriser une croissance normale, ou bien on peut utiliser un milieu complètement défini qui est très long à préparer, délicat à stériliser, et les vitesses de croissance obtenues ne sont pas absolument identiques d'un lot de milieu à un autre. Dans beaucoup de cas <par exemple cultures synchrones), la définition complète du milieu n'est pas nécessaire. On a déjà indiqué dans la littérature l'utilisation possible de plusieurs peptones et de quelques autres sources d'azote pour la culture de Tetrahymena. La plupart des hydrolysats protéiques sont des hydrolysats enzymatiques et proviennent de plusieurs sources de protéines, telles que soja, blé, poisson et viande. Comme on l'a déjà indiqué, il est difficile de vurifier toutes ces protéines à partir des matières premières, et, en outre, leur composition peut fluctuer. En conséquence, les hydrolysats provenant de ces sources protéiques sont
pratiquement non reproductibles.
23 2622628 1 18
Ayant déjà mis en évidence, par les étuoes analytiques et chromatographiques décrites ci--dessus, a reproductibilité des fractions peptidiaues selon l'invention, on a alors examiné la valeur nutritive de ces fractions pour trois espèces de Tetrahymena. Dans une première étape, les fractions ont été utilisées dans un milieu défini pour définir les acides aminés qui sont fournis en de trop faibles quantités dans le milieu. Dans une seconde étape, on a utilisé ces fractions pour le remplacement de la peptone couramment utilisée dans un
milieu complexe.
* Le milieu défini a été préparé conformément a "Rasmussen et Modgewed Hansen J. Cell Sci. 1973, 12, 275-286">. Le mélange d'acides aminés a été remplacé par la fraction non héminique de l'invention <A, B, C ou D) qui a été supplémentée, si nécessaire, par des acides aminés à la même concentration finale que -dans le milieu défini standard,
ajouté de façon aseptique à partir de solutions stériles.
Le milieu complexe a été préparé conformément à <"Plesner et al. dans ZEUTHEN E. Synchrony in cell division and growth", Intersci. Publ. New York, 1964, p543-563)". La fraction peptidique de l'invention CA, B, C ou D) a remplacé la Protéose Peptone (Difco) à la même concentration
(0,75 p/v).
Pour les études de croissance, les cellules ont été comptées électroniquement dans des cultures qui ont été inoculées à 300-600 cellules/ml et suivies à partir de 000 cellules/ml jusqu'à la phase stationnaire. En portant le temps de génération en fonction de la densité de cellules dans les cultures, il a été possible de déterminer la population maximale pour laquelle la culture est
facilement en phase exponentielle de croissance.
Ainsi, la Figure 9 montre le temps de génération mesuré dans des culture de Tetrahymena thermophila en
fonction de la densité de population dans la culture.
La culture est en vhase exponentielle de croissance jusqu'à
000 - 200 000 cellules/ml (<in = 12 - 12,2).
Le tableau 6 montre la composition moyenne en acides amines des quatre hydrolysats A à D: La préparation des hydrolysats est reproductible à la fois en ce qui concerne la teneur en acides aminés et la distribution des masses moléculaires des peptides. Ainsi, le produit est valable lorsqu'une standardisation élevée de la-composition
du milieu est nécessaire.
Conformément aux résultats des expériences préliminaires, les concentrations des hydrolysats de l'invention ont été fixées à 0,5 % et à 0,75.% respectivement dans le milieu défini et dans le milieu complexe. La teneur en acides aminés des milieux dans de telles conditions peut être comparée avec celles des milieux standards <Tableau 6>. Dans un milieu défini, la carence en isoleucine est évidente, avec une carence relative en glycine, méthionine et tryptophane. Dans le milieu complexe, il semble n'y avoir qu'une carence en isoleucine et la complémentation possible en cet acide aminé par de
l'extrait de levure n'est pas connue.
Composition en acides aminés (eng d'acide amine/](0 e
-Doudre) des quatre lots A a D (moyenne et écart-tyve), e.
des concentrations en acides aminés (en mg/100 mi de miiieu)
dans les milieux testés durant cette étude.
Fp (g d'acides Xilieu Fp Protéose Fp Acides aminés aminés/100 g défini 0, 5% peptone 0,75 % de poudre) Ala 8,5 0,6 15 40,7 36 61 Arg 5,2 0,67 30 23 28 34,5 Asp 9,38 0,31 20 (Asn) 44,5 46 66,8
Gln - 10 - - -
Glu 8,08 0,33 40 38,4 77 38,4 Gly 4,28 0,22 40 20,4 55 30,7 His 6,58 0,4 20 31,4 9 47,1 Ile 0,275 0,05 20 1,4. 9 2,2 Leu 14,35 0,31 20 50,7 30 76 Lys 8,53 0,64 20 40,5 22 40,5 Xet 1,58 0,2 15 7,5 13,5 11, 2 Phe 7,7 0,64 15 36,7 20 55,0 Pro 3,5 0,2 20 16,5 37 24,8 Ser 5,0 0,3 15 23,6 24 35,4 Thr 4,7 0,1 20 22,5 24 33,8 Trp 1,2 0,2 15 5 5,1 7,5 Tyr 2,8 0,2 - 13,8 24 20 Val 8,8 0,7 20 41,7 12,5 62,5 * Fp = fraction peptidique de l'invention Le Tableau 7 montre les résultats obtenus dans-un milieu standard et dans un milieu défini de fraction peptique, complémenté par de l'isoleucine, et l'effet de l'addition de glycine et de méthionine avec trois
différentes espèces de Tetrahymena.
Temps de génération de trois espèces de Tetrahymena sur des milieux définis & base de fraction peptidiaue, enrichis ou non par des acides aminés (x = moyenne de quatre expériences; e = écart-type) Milieu Fp 0,5% Fp +Ile Fp +Ile Fp +Ile défini +Ile +Gly +Wet +Gly +Met Tetrahymena x 257 225 246 257 274 pyriformis e 54 29 33 29 43 Tetrahymena x 219 251 203 215 209 rostrata e 8 49 9 24 6 Tetrahymena x 181 202 201 202 191 thermophila e 42 22 17 24 15 Fp: Fraction peptidique Tetrabymena pyriformis (souche Zeuthen>: souche originale de l'Institut Carlsberg, Copenhague; ** Tetrabymena rostrata: collection Fauré-Frémiet, souche fournie par G. Fryd-Versavel (Université d'Orsay, France); av Tetrahymena thermophila: souche BIV de, la collection D.L. Nanney, fournie par le Dr C. Sripati (Institut de Biologie de Physico-Chimie, Fondation Rothschild, Paris). L'analyse statistique a montré qu'il n'y a pas.de
* différences significatives entre les cinq milieux utilisés.
0 Au contraire, les temps de génération obtenus entre les trois espèces sont très différents, T. Thermophila est la
souche qui montre la meilleure adaptation en milieu défini.
Pour T. rostrata, la complémentation de milieu à base de fraction peptidique - isoleucine par de la glycine a donné des résultats bien plus reproductibles qu'avec l'isoleucine seule, bien que le temps de génération ne soit pas
27 2628118
significativement raccourci. Pour les deux autres esreces, la dispersion des temps de génération observées dans ies milieux à base de fraction peptidique est plDius faible cue
dans le milieu défini standard. Une expérience complémen-
taire a été réalisée par addition de tryptophane au milieu a
base de fraction peptidique - isoleucine. Un effet signifi-
catif n'a été trouvé que pour Tetrahymena thermophila, pour lequel le temps de génération est diminué de 181 à minutes. Ni la méthionine ni la méthionine-glycine
n'améliorent significativement la quantité des milieux.
Croissance des trois espèces de Tetrahvmena dans des milieux
complexes à base de fraction peptidique.
Les quatre lots A à D ont été testés durant cette étude. On a réalisé une expérience complémentaire par
addition d'isoleucine aux milieux; cette dernière expé-
rience n'a été répétée que deux fois en raison du fait qu'il n'y avait pas de grandes différences, au moins pour deux
espèces. Les résultats sont rapportés aans le Tableau 8.
Tableau 8:
Temps de génération de trois espèces'de Tetrahymena dans des milieux complexes de fraction peptidique sur la base des quatre différents hydrolysats enzymatiques A à D. (Moyenne supérieure: milieu sans Ile (moyenne de quatre expériences); Moyenne inférieure soulignée: milieu avec Ile <moyenne de deux expériences)) Espèce Lot A Lot B Lot C Lot D T. 220 i 16 249 50 250 14 243 i 12 Pyriformis 234 59 26 24 T. 198 i 14 193 12 219 11 210 i 15 rstrata 168180 2 17 1 T. 128 7 131 i 12 134 8 128 8 thermophila 123 124 129_ k
28 2628118
Les résultats montrent que les quatre lots A a D donnent des résultats identiques, à la fois avec ou sans complémentation avec l'isoleucine. Au contraire, ii y a à nouveau une différence significative entre les vitesses de croissance des trois espèces, Tetrahymena thermophila étant celle qui se développe la plus vite. L'analyse de la variance des résultats par espèce a montré que la croissance de Tetrahymena rostrata est significativement stimulée par l'addition d'isoleucine dans le milieu. Ceci signifie que, pour cette espèce, l'acide aminé n'est pas fourni en quantités suffisantes par l'extrait de levure. Pour les deux autres souches utilisées, aucune action significative
de l'acide aminé ne peut être détectée.
Duroe de la croissance exp.=Lntie e t populatioan.
ellulai ma__xi male obtenue dans les __e__tur-.
Dans de nombreuses expériences, des cellules en croissance exponentielle ou des cultures stationnaires sont nécessaires, mais les conditions physiologiques des cellules doivent être bonnes, Ainsi, il est nécessaire de connaître la population maximale pour laquelle les cultures sont en phase exponentielle et la population maximale atteinte à la
phase stationnaire.
Population maximale atteinte durant la phase exponentielle de croissance et densité finale de cellules, obtenue dans des cultures de trois espoèces de Tetrahymena dans différents milieux. Temps de Densité de cellules Densité de cellules Souches et milieux génération à la fin de la à la phase (minutes) croissance stationnaire exDonentielle (/ml) (/ml) T. thermophila milieu défini 181 250 000 350 000 Fp + lie 202 250 000 660 000 Fp + Ile + Trp 130 250 000 800 000 Complexe Fp milieu 128 200 000 540 000 T. rostrata milieu défini 219 d'abord 300 000 non déterminé Fp + Ile + Lys 203 160 000 800 000 Complexe Fp milieu 198 100 000 980 000 T. pyriformis milieu défini 257 d'abord 160 000 700 000 Fp + Ile 225 120 000 600 000 Complexe Fp milieu 220 80 000 660 000 Fp: fraction peptidique Pour T. thermophila, la phase exponentielle est identique au milieu défini standard et dans les milieux a base de fraction peptidique, bien que la population finale soit inférieure dans le milieu standard. L'addition de tryptophane diminue le temps de production et augmente le rendement final de la culture. Pour les deux autres espèces, aucune différence significative ne peut être notée en ce qui concerne les milieux définis. Dans le milieu complexe, la population maximale atteinte durant la croissance exponentielle est toujours inférieure à celle dans les milieux définis, mais ce résultat est observé aussi avec des peptones communes et ne peut être correlé de façon
spécifique à l'utilisation de la fraction peptidiue.
spécifique à l'utilisation de la fraction peptidique.
2628118
Les résultats obtenus montrent clairement que les fractions peptidiaues A à D selon l'invention representent une source d'azote appropriée pour la culture de Tetrahynena, à la fois dans des milieux définis et dans des milieux complexes. Dans le premier cas, l'addition d'isoleucine est nécessaire et suffisante pour permettre une croissance satisfaisante des cultures, bien qu'une addition complémentaire de glycine soit utile pour T. rostrata, et de tryptophane pour T. thermophila. Dans des milieux complexes, l'addition d'isoleucine n'est pas utile pour la culture de T. thermophlla et T. pyrifirmis, probablement parce que l'extrait de levure fournit de l'isoleucine suffisamment pour favoriser la croissance de ces deux espèces. Le milieu défini est plus facile à préparer avec les fractions de l'invention et'son coût est diminué de cino fois. Pour le milieu complexe, la préparation et le coût sont analogues au milieu standard, mais les fractions de l'invention représentent une source plus stable et définie d'acides aminés cue les peptones courantes et ne peuvent
qu'être recommandées pour la fabrication de ces milieux.
Cette étude, effectuée sur Tetrahymena, à titre d'exemple, confirme la reproductibilité des fractions peptidiques selon l'invention, et leur intérêt dans l'utilisation, de manière générale, comme milieux de culture
de cellules.
-31
Claims (19)
1 - Fraction peptidique, caractérisee par le fait qu'elle possède une teneur en histidine au moins égalie a mg/g de matières sèches, et notamment au moins égale a 60 mg/g de matières sèches. 2 - Fraction peptidique selon la revendication 1, caractérisée par la composition suivante en acides aminés en grammes, pour 100 g de matières sèches: Asp 9 - 10 Thr: 4,5 - 5 Ser: 4,5 - 5,5 Glu: 7,5 - 8,5 Pro: 3 - 4 Gly: 4 - 5 Ala: 8 - 10 Val: 8 - 10 Ile: moins de 0,5 Met: 1 - 2 Leu: 14 - 15 Tyr: 2, 5 - 3 Phe: 6,5 - 8,5 Lys: 8 - 9,5 His: 6 - 7 Arg: 3,5 - 5,5
Trp: 1 - 1,5.
3 - Fraction peptidique, caractérisée par le fait que: - 5 à 15% environ des peptides qui la composent ont une s0 masse moléculaire supérieure à environ 6 000 daltons; - 45 à 65% environ des peptides qui la composent ont une masse moléculaire comprise entre environ 1 300 et 6 000 daltons; et - 20 à 50% environ des peptides qui la composent ont une
masse moléculaire inférieure à environ 1 300 daltons.
4 - Fraction peptidique, caractérisée par le fait qu'en filtration sur gel de dextrane réticulé,-elle fournit
un chromatogramme comportant sept pics principaux.
- Fraction selon la revendication 4, caractérisée par le fait que les masses moléculaires des fractions correspondant à ces sept pics sont les suivantes: Pic 1: environ 6 500 daltons Pic 2: environ 4 000 daltons Pic 3: environ 2 600 daltons Pic 4: environ 1 300 daltons Pic 5: environ 650 daltons Pic 6: environ 350 daltons
Pic 7: environ 150 daltons.
6 - Fraction peptidique selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la répartition en pourcentage des peptides dans les différents pics est la suivante: Pic 1: environ 10 Pic 2: environ 15 Pic 3: environ 15 Pic 4: environ 20 Pic 5: environ 15 Pic 6: environ 15
Pic 7: environ 3.
7 - Chacune des sept sous-fractions correspondant aux pics majeurs obtenus en séparation par chromatographie de perméation de gel, éventuellement purifiées par HPLC phase inverse, de la fraction telle que définie à l'une des
revendications 4 à 6, et toutes les différentes combinaisons
possibles d'au moins deux de ces fractions.
8 - Sous-fractions- selon la revendication 7, ayant une teneur en histidine comprise entre 6 et 15 g / 100 g
d'acides aminés.
9 - Fraction peptidique héminique, caractérisée
par le fait qu'elle consiste en le rêtentat d'ultra-
filtration d'un hydrolysat peptidique de cruor, la teneur en fer de ladite fraction étant d'au minimum 1% des matières sèches. - Procédé de préparation, à partir d'un hémolysat du cruor, de la fraction peptidique telle que
aéfinie à l'une des revendications- 1 à 6, et/ou de la
fraction peptidique héminique telle que définie & la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il.consiste à: - introduire ledit hémolysat dans une zone de réaction (1), en vue d'une mise en contact intime avec une enzyme protéolytique travaillant à un pH inférieur à 4; - soutirer en continu le produit de la réaction enzymatique en l'amenant de la zone de réaction (1) dans une zone d'ultrafiltration (7) comportant des membranes minérales d'ultrafiltration (8) ayant un seuil de coupure leur permettant de retenir ladite enzyme et l'hémoglobine, laissant passer pratiquement seulement les peptides provenant de l'hydrolyse; - soutirer en continu un perméat qui représente la fraction peptidique recherchée; - recycler, au moins partiellement, le rétentat d'ultrafiltration dans la zone de réaction <1); et - recueillir le rétentat, en tant que la fraction peptidique héminique recherchée, après purification éventuelle. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'on utilise un hémolysat de cruor ayant une teneur en hémoglobine comprise entre 1 et 10 % en poids, le cruor ayant été hémolysé en milieu aqueux, à un pH acide, notamment de 2, puis dilué jusqu'à la teneur en
hémoglobine recherchée.
12 - Procédé selon l'une des revendications 10 et
11, caractérisé par le fait qu'on choisit la pepsine, comme enzyme protéolytique, et qu'on aJuste le pH dans la zone de réaction (1) à une valeur allant de 1,5 à 2,5, par addition d'un composé à réaction acide. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'on introduit la pepsine dans la zone de réaction (1), à raison de.40 à 80 unités ANSON par
kilogramme d'hémoglobine.
14 - Procédé selon l'une des revendications 10 à
13, caractérisé par le fait qu'on effectue l'hydrolyse à une
température de l'ordre de 35-45'C.
- Procédé selon l'une des revendications 10 à
14, caractérisé par le fait qu'on met en circulation le milieu se trouvant dans la zone de réaction (1>, alors que
le taux d'hydrolyse est de l'ordre de 10 à 20 %.
16 - Procédé selon l'une des revendications 10 à
, caractérisé par le fait qu'on choisit des membranes minérales présentant un seuil de coupure inférieur à 30 000
environ.
17 - Procédé selon l'une des revendications 10 à
16, caractériséepar le fait qu'on utilise, comme membranes d'ultrafiltration, des membranes tubulaires de carbone
recouvertes d'oxyde de zirconium.
18 - Procédé selon l'une des revendications 10 à
17, caractérisé par le fait qu'on décolore l'ultrafiltrat
obtenu par mise en contact avec un adsorbant.
19 - Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme adsorbant, la
magnésie.
- Procédé selon l'une des revendications 10 à
19, caractérisé par le fait qu'on dessale l'ultrafiltrat.
21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait qu'on effectue le dessalage par
électrodialyse.
2628 1t 22 - Procéde selon l'une des reverdicat;r, a 21. caracterisé par le fait qu'après décoloration et dessalage éventuels. on concentre et on atomise l'ultrafiltrat pour obtenir la fraction peptidique recherchée sous la forme d'une poudre. 23 - Procédé selon la revendication 22, caractérisé par le fait qu'on concentre & l'aide d'un
évaporateur à flot tombant.
24 - Fraction peptidique et fraction peptidique héminique obtenues par le procédé tel que défini à l'une des
revendications 10 à 23.
- Utilisation de la fraction peptidique telle
que définie à l'une des revendications 1 à 6 et 24, et des
sous-fractions telles que définies à l'une des revendica-
tions 7 et 8, comme aliment ou complément alimentaire, en alimentation humaine et animale, ou comme aliment ou complément nutritionnel, en thérapeutique ou diététique chez l'homme ou l'animal, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique. 26 - Aliment ou complément nutritionnel, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique, contenant une fraction peptidique telle que définie à l'une des
revendications 1 à 6 et 24, et/ou au moins l'une des
sous-fractions telles que définies à l'une des
revendications 7 et 8.
27 - Utilisation de la fraction peptidique, telle
que définie à l'une des revendications 1 à 6 et 24, et des
sous-fractions telles que définies à l'une des revendica-
tions 7 et 8, dans le domaine vétérinaire, pour favoriser
l'appétence des animaux.
28 - Composition pharmaceutique destinée à réaliser un apport en fer en thérapeutique humaine ou animale, caractérisée par le fait qu'elle renferme, comme ingrédien actif, une fraction peptidique héminique telle que
définie à la revendication 9 ou à la revendication 24.
2628118'
29 - Formes pharmaceutiques, convenant notamment pour l'administration orale, entérale, ou par voie injectable, renfermant, à titre d'ingrédient actif au moins
l'une des fractions telles que définies aux revendications 1
à 6, 9 et 24, et/ou au moins l'une des sous-fractions telles
que définies aux revendications 7 et 8.
- Utilisation de la fraction peptidique telle
que définie à l'une des revendications 1 à 6 et 24 et des
sous-fractions telles que définies à l'une des revendica-
tions 7 et 8, comme milieu de culture biologique ou
cellulaire ou comme composant de tels milieux.
31 - Xilieu de culture biologique ou cellulaire constitué par ou renfermant la fraction peptidique telle que
définie à l'une des revendications 1 à 6 et 24, et/ou au
moins l'une des sous-fractions telles que définies à l'une
des revendications 7 et 8.
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cceS I I Cu OaC -9'0 (In Cr __L CD Fig 83 0,4 Fraction 3 E o t Temps (minutes) 0,7 --- o I 60 '-t Temps (minutes) Fig 84 1,5 Fraction 4 E C _ u c w 0,75 <J,N I l
80
Temps (minutes)r Temps ( minutes) Fig 85 0,8 Fraction 5 E o !" o= C c=, r'- O%j Co(
0 40 80
Temps (minutes) Fig 86 1,5 Fraction 6 E c o 1Y o 0,75- - u
0 30 60
Temps (minutes) Fig 87 Fraction 7 E o lu 1<C
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Temps (minutes) Fig 88 0,8 Fraction 8 E Co o Ot,4 ul
0 40.
Temps (minutes) ce Fig 89 0o8 Fraction 9 E cri o oo o,4- 0O 17/17 Fig 9 Temps de génération (minutes) 450 *e * m e . De le 0 e* * e - *À 0 0 e* ee..000 * In(n) 9tI! 213 9 10 il 12 13
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| FR2628118B1 (fr) | 1990-09-21 |
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