WO2017187109A1 - Hydrolysat de proteines de luzerne, son procede d'obtention et son utilisation - Google Patents

Hydrolysat de proteines de luzerne, son procede d'obtention et son utilisation Download PDF

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WO2017187109A1
WO2017187109A1 PCT/FR2017/051033 FR2017051033W WO2017187109A1 WO 2017187109 A1 WO2017187109 A1 WO 2017187109A1 FR 2017051033 W FR2017051033 W FR 2017051033W WO 2017187109 A1 WO2017187109 A1 WO 2017187109A1
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hydrolyzate
enzyme
alfalfa
proteins
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PCT/FR2017/051033
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Brice WISNIEWSKI
Sandrine Lourette
Julie ANTHONI
Alix ROUSSEAUX
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Luzerne Recherche Et Developpement (Sas)
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Definitions

  • the present invention relates to a protein hydrolyzate of alfalfa, a process for its preparation and the use of the hydrolyzate as a food ingredient, as a cosmetic ingredient and as an agro-material.
  • Protein along with carbohydrates and lipids, is one of three major families of macronutrients. There are a very large number of different amino acids but only twenty are used by the vertebrate organism for the production of proteins (so-called proteogenic amino acids). Of these 20 amino acids, 12 can be made by the human body and the remaining 8 are said to be essential because the body is unable to synthesize them. These amino acids must therefore be provided by the diet.
  • the amino acid composition of proteins is taken into account to evaluate the protein quality of our diet.
  • the quality of dietary protein sources is almost exclusively defined by their ability to meet the protein and essential amino acid requirements.
  • Animal proteins the majority of which are used in the diet of industrialized countries, come mainly from milk, eggs, fish and meat.
  • Vegetable proteins are therefore one of the alternative sources of animal protein in the human diet.
  • sources of plant-based protein are mainly soy, cereals and legumes.
  • alfalfa proteins [Medigaco sativa] which are composed of all the acids essential amines (tryptophan, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine, leucine and isoleucine).
  • Alfalfa proteins are particularly interesting because they have a balanced aminogram composed of all the essential amino acids, in addition their nutritional properties are equivalent to or even superior to those of other conventional agricultural proteins of vegetable origin (wheat gluten, soy protein) or animal like fish protein for example.
  • the patent application FR 2 876 389 describes hydrolysates of proteins obtained by enzymatic hydrolysis of soluble proteins of alfalfa green juice (so-called white proteins, in particular RubisCO). This method, and the hydrolyzate obtained, are also described in Schaud D'Amse et al (Enzyme end mlcroblal technoiogy 34 (2004), 380-391).
  • the process described in these documents involves the following steps: alfalfa green juice is alkalinized to separate insoluble green proteins from soluble white proteins. These white proteins are then precipitated at acid pH (4-6), separated by urtrafiltration and purified by diafiltration on mineral membranes. The protein cream obtained following these steps is then subjected to enzymatic hydrolysis and the permeate is decolourised and desalinated.
  • a first objective of the present invention is an alfalfa protein hydrorysate comprising all the proteogenic amino acids.
  • a second objective of the present invention is a process for preparing an alfalfa protein hydrolyzate comprising a step of direct hydrolysis of alfalfa green juice.
  • a third object of the present invention is a process for preparing an alfalfa protein hydrolyzate comprising a step of hydrolyzing an alfalfa coagulum comprising alfalfa green juice proteins.
  • a fourth objective of the present invention is a process for preparing an alfalfa protein hydrolyzate comprising all the proteogenic amino acids.
  • a fifth objective of the present invention is the use of an alfalfa protein hydrolyzate for the preparation of food, cosmetic and agromaterial compositions.
  • the concept of protein nitrogen content refers to the determination of the total nitrogen content, according to the Kjeldhal method, subtracted from the mineral nitrogen material, the whole being multiplied by a factor of 6.25.
  • the percentage of dry matter is defined relative to the total mass (or raw material) of the green juice of alfalfa, coagulum or hydrolyzate as the case, unless otherwise indicated.
  • the expression "molecules of molecular weight less than XX Da" denotes the amino acids and / or peptides and / or proteins, depending on the value of the molecular mass.
  • a first object of the present invention is a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids.
  • alfalfa protein hydrolyzate means a mixture of proteins, oligopeptides and peptides and free amino acids obtained by reducing the molecular weight of the proteins contained in the green juice of the plant. alfalfa.
  • alfalfa green juice is the liquid fraction obtained by pressing alfalfa, advantageously alfalfa that has not reached the flowering stage.
  • Alfalfa is advantageously mown from March to December, preferably from April to May.
  • alfalfa may belong to a variety selected from Aliso, Artemls, Asmera, Felicia, Everest, Neptune, Exquisite, Galaxy, Alexis, Prunelle, Salsa, Alicia, Arpeggio, Alpha, Andela, Concerto, Timpani, Redemption, Verdor and Barmed.
  • water-soluble means that at least 95%, advantageously at least 99%, preferably at least 99.9%, of the powder is soluble at a concentration of 25 g. hydrolyzate per 100 g of water at 20 B C water (pH - 7).
  • solubility of the powder is measured by the method described in Appendix A of COSEX STAN 295R-2009: 1 g of sample is placed in a centrifuge tube of determined mass. 15 mL of water is added and the sample dissolved. The solution is centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm and the supernatant is removed. Centrifugation is repeated twice. The tube is dried at 105 ° C until a constant mass is obtained. The results are reported as a percentage of water-insoluble solid according to the following equation:
  • Water-insoluble solid residue (%) (W1-W0) / S x 100, where W1 is the mass of the tube and residue after centrifugation, W0 is the mass of the centrifuge tube and S is the mass of the sample. The percentage of dissolved powder corresponds to 100 - solid residue insoluble in water.
  • the term "coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins” means the solid fraction obtained by precipitation of the proteins contained in the green juice by alkalinization of the green juice at a pH greater than 7, in particular of 7 to 8, preferably 7.3 to 7.5 and steam injection at a temperature above 80 ° C, especially at a temperature of about 85 ° C.
  • Coagulum within the meaning of the present invention, is therefore a mixture of white proteins and alfalfa green proteins, unlike patent application FR 2 876 389, in which the hydrolysis is carried out on alfalfa white proteins. , contained in the filtrate obtained after a step of alkalization and steam injection.
  • the amino acids contained in the alfalfa hydrolyzate according to the present invention are those constituting the human proteins (so-called proteogens).
  • the 8 essential amino acids are valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan, methionine, threonine and lysine.
  • the 12 non-essential amino acids are cysteine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, histidine, lysine, methionine, proline, arginine, serine, valine and tyrosine. They all come from alfalfa and are present in the hydrolyzate in free form or as constituents of peptides and proteins soluble in water.
  • the hydrolysates according to the present invention are weakly pigmented.
  • the term "weakly pigmented” means that the hydrolyzate in powder form is whitish or very slightly tinted.
  • the low pigmented hydrolysates according to the present invention advantageously comprise less than 1000 ppm, advantageously less than 250 ppm, preferably less than 180 ppm, of pigments such as xanthophylls, especially lutein, neoxanthine and vioaxanthine relative to the total mass of the solids content of the hydrolyzate.
  • the hydrolysates according to the present invention preferably contain carotenoids ( ⁇ -carotene) at a content of less than 220 ppm and xanthophylls, in particular lutein, neoxanthin and vioaxanthine at a total content of less than 180 ppm of xanthophylls of the extract. dry hydrolyzate.
  • carotenoids ⁇ -carotene
  • the hydrolysates according to the present invention also contain from 20 to 950 ppm of chlorophyll of the total dry matter, of which 20 to 800 ppm of chlorophyll A and 20 to 800 ppm of chlorophyll B.
  • the pigment content is determined according to the following method: For chlorophylls: [Extract Pe grams of sample with an 80% acetone solution, read the absorbances at 645 and 663 nm on a spectrometer and then calculate the chlorophyll A, B and total concentrations from the following equations:
  • A663 Absorbance at 663 nm
  • A645 Absorbance at 645 nm
  • V Volume is 0.100 L
  • Pe Test sample of the sample in g.
  • xanthophylls lutein, violaxanthin and neoxanthrin
  • carotenoids B-carotene: extract xg of sample with a mixture of petroleum ether-acetone 7/3, mix the mixture with ultraturax, saponify (with methanolic potassium hydroxide ) the mixture to degrade the chlorophylls and concentrate the pigment extract. Resume the sample in 10 mL of ethanol and separate the pigmenta by HPLC.
  • the alfalfa protein hydrolyzate according to the present invention may be in the form of a solution in water or in the solid form, in particular a powder.
  • the protein hydrolyzate is in the form of an aqueous solution, for example a syrup.
  • the aqueous solution contains from 1 to 79%, especially from 1 to 60%, in particular about 50% of dry matter relative to the total mass of the solution.
  • said hydrolyzate in the form of an aqueous solution is obtained at the end of the hydrolysis step of the process described below, before the drying step.
  • Such a syrup may also be obtained by dissolving hydrolyzate in solid form, especially a powder in water.
  • the present invention also relates in a particular embodiment a hydrolyzate of alfalfa protein in liquid form, especially in the form of a siro p in aqueous solution.
  • Said hydrolyzate in liquid form may in particular be a syrup characterized by a dry matter content ranging from 56 to 65% and in particular 56.98 and 64.31% of the total mass of the syrup, in which the proportion of minerals varies. from 3 to 27% of minerals, especially 4 and 21% of the dry matter and a protein nitrogen content ranging from 13 to 90%, especially 21 to 85% of the dry extract.
  • the syrup can be characterized by its viscosity.
  • the viscosity of a syrup at 63% solids content is 100 to 500 cP at 500 s -1 and 20 ° C.
  • the viscosity at 55 ° C. of a syrup with a solids content of 63% is 30 to 200 cP at 500 s -1.
  • the viscosity is measured according to the following method: in a beaker, prepares about 10 g of an aqueous solution of protein at 63% (w / w) of dry matter. The viscosity is then measured on an AR 1000 viscometer with a plane cone.
  • the protein hydrolyzate is in the solid form.
  • Said solid comprises from 50 to 100% of dry matter, in particular from 90 to 99% of dry matter, in particular about 95% of dry matter.
  • Said solid is in particular a powder or granules.
  • the powder is composed of granules having a diameter ranging from 5 to 500 microns, in particular from 7 to 330 micrometers.
  • the median diameter of the granules constituting the powder is in particular from 30 to 75 ⁇ .
  • the particle size of the powder is determined by laser granulometry with a Coulter, Fraunhofer optical model, LS30 apparatus, dry, without vibration mode and over a period of 30sec. The results can be read directly on the device.
  • the nitrogenous protein content is at least 20%, especially at least 40% of the total dry matter.
  • the nitrogenous protein content varies from 13 to 90%, especially from 21 to 85% of the total dry matter.
  • protein nitrogenous material means all the proteins, including amino acids, polypeptides and proteins.
  • the percentage of protein nitrogenous matter can be determined according to the Kjeldhal method, by mineralization of the proteins with surfuric acid (H 2 SO 4 ) concentrated according to the following methodology:
  • the present invention also relates to an alfalfa protein hydrolyzate in which the proteinaceous nitrogen material comprises:
  • the proteinaceous nitrogenous material comprises: 35 to 75%, in particular approximately 46% of molecules with a molecular weight of less than 300 Da,
  • the peptic profile is defined according to the internal method of the InVrvo Lab laboratory by HPLC with UV detection and according to a distribution by molar mass range, unless otherwise indicated.
  • the present invention also relates to a hydrolyzate of alfalfa proteins in which the nitrogenous material Protein includes:
  • the said alfalfa protein hydrolyzate comprises the amino acids in the following proportions of the proteinaceous nitrogen material: an alanine content of between 5.9% and 6.6%,
  • a cystine content of between 0.9% and 1.1% is provided.
  • the said alfalfa protein hydrolyzate comprises the 20 amino acids in the following proportions, by mass of the total mass of proteinaceous nitrogenous material:
  • valine content 2.9% to 9.3%, especially 4.7% to 7.5%
  • tryptophan content of from 0.8% to 2.7%, especially from 1.2% to 2.1%
  • hydrolysates obtained on alfalfa green jux according to the present invention are characterized by the molecular profile of the proteinaceous nitrogenous material resulting from the enzymatic hydrolysis.
  • the peptic profile is defined according to the internal method of the InVivo Lab laboratory by HPLC with UV detection and according to a distribution by molar mass range, unless otherwise indicated.
  • the present invention also relates to a green alfalfa protein hydrolyzate in which the proteinaceous nitrogen material comprises:
  • the hydrolysates according to the present invention From 26 to 88%, in particular from 42 to 70% of molecules of molecular weight between 1000 and 5000 Da, of from 1 to 10%, in particular from 2 to 8% of molecules of molecular weight between 5000 and 10,000 Da, the hydrolysates according to the present invention, at least 55%, in particular at least 70% of molecules with a molecular weight of less than 300 Da, are included in the protein nitrogenous material. In the hydrolysates according to the present invention, at least 65%, advantageously at least 85% of molecules of molecular weight less than 1000 Da are included in the protein nitrogenous material.
  • hydrolysates according to the present invention at least 75%, advantageously at least 90% of molecules with a molecular weight of less than 10,000 Da are included in the protein nitrogenous material.
  • the hydrolysates according to the present invention at least 95% of molecules with a molecular weight of less than 10,000 Da are included in the protein nitrogenous material. According to a particular embodiment, at least 95% of molecules with a molecular weight of less than 10,000 Da and at least 55%, in particular at least 70% of molecules with a molecular weight of less than 300 Da, are included in the protein nitrogenous material.
  • the content of salts (or ashes) is from 1 to 25% of the total dry matter.
  • the cations constituting these salts there are, for example, Na + . NH 4 + , K + , Ca 2+ and Mg 2+ and among the anions constituting these salts CI-, NO 3 -, SO 4 2- and ⁇ 4 2- .
  • hydrolysates of the present invention contain high amounts of potassium, calcium, and magnesium and make them a natural source of these minerals.
  • the hydrolysates according to the present invention also have a soluble sodium content.
  • the low sodium content makes it a particularly recommended ingredient in low sodium diets.
  • the National Health and Nutrition Program (PNNS) recommends a daily salt intake (sodium chloride) of 8g for adult men and 6.5g for women and children.
  • the World Health Organization for its part, has set a target of a maximum of 5 g of salt.
  • the use of the hydrolyzate of the invention makes it possible to provide a salty taste in the food where it is used without noticeably being a source of sodium because the salty note comes mainly from the potassium present in the subject of the invention.
  • the present invention therefore also relates to hydrolysates as defined above, in which the sodium content is less than 5000 mg kg, in particular less than 2500 mg kg and preferably from 440 mg to 2200 mg / kg relative to the raw material.
  • the present invention therefore also relates to hydrolysates as defined above, in which the potassium content is from 20,000 mg / kg to 70,000 mg / kg, in particular from 22,000 mg / kg to 60,000 mg / kg relative to the raw material, the calcium content is from 10 000 mg / kg to 50 000 mg / kg, in particular from 13 000 mg / kg to 40 000 mg / kg and the magnesium content is from 2000 mg / kg to 5000 mg / kg, in particular from 3,300 mg / kg to 3,600 mg / kg relative to the raw material
  • the invention relates to a hydrolyzate as defined above in which the potassium content is from 0 mg / kg to 87,000 mg / kg, in particular from 8,800 mg / kg to 70,000 mg. kg / kg relative to the raw material, the calcium content is 6 000 mg / kg to 50000 mg / kg, especially 9 600 mg / kg to 40000 mg / kg and the magnesium content is 0 mg / kg 5400 mg / kg, especially 800 mg / kg to 4 300 mg / kg relative to the raw material.
  • the hydrolysates according to the present invention also contain iron, in particular in a proportion of 10 to 100 mg / kg, in particular 47 to 68 mg / kg.
  • the hydrolysates according to the present invention also contain other components such as water-soluble plant fibers and lipids.
  • saponins are also examples, which contain saponins, isoflavones, in particular from 0.001% to 0.015%, in particular from 0.0102% to 0.0105% (as a percentage by weight relative to the gross mass of the hydrolyzate), phytates, in particular in a proportion of from 0 to 0.2%, in particular from 0.001% to 0.14% and L-canavanines, in particular from 0 to 5 mg / kg, in particular less than 5 mg / kg.
  • isoflavones in particular from 0.001% to 0.015%, in particular from 0.0102% to 0.0105% (as a percentage by weight relative to the gross mass of the hydrolyzate)
  • phytates in particular in a proportion of from 0 to 0.2%, in particular from 0.001% to 0.14%
  • L-canavanines in particular from 0 to 5 mg / kg, in particular less than 5 mg / kg.
  • the nitrogenous protein content is 25 to 50%, especially 40 to 50%, preferably 45 to 50% of the total dry matter.
  • the hydrolyzate is advantageously obtained by enzymatic hydrolysis of the green juice without the step of isolating the proteins prior to the step hydrolysis.
  • the content of salts (or ashes) in the hydrolyzate is 10 to 20%, especially about 15%.
  • said alfalfa protein hydrolyzate based on green juice comprises the 20 amino acids in the following proportions, by mass of the total mass of proteinaceous nitrogenous material:
  • a content of hlstidine from 0.8% to 3.0%, especially from 1.2% to 2.4%
  • Threonine content from 1.9% to 6.9%, especially from 3.1% to 5.6%
  • the present invention also relates, in a first particular embodiment, to a water solids alfalfa protein hydrolyzate in solid form, comprising:
  • proteinous nitrogenous material relative to the total dry matter, comprising at least 95% of molecules with a molecular weight of less than 10,000 Da and at least 55%, especially at least 70% of molecules with a molecular weight of less than 300 da,
  • hydrolyzate being advantageously obtained by enzymatic hydrolysis of the green juice, without prior protein isolation step.
  • the subject of the present invention is a process for preparing an alfalfa hydrolyzate in which 20 essential and non-essential amino acids are present, in particular a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate in which 20 amino acids, essential and non-essential, are present with the characteristics described above.
  • the present invention relates in particular to a process for the preparation of an alfalfa protein hydrolyzate comprising an enzymatic hydrolysis step, carried out directly on the alfalfa green juice obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins, in particular to obtain a protein hydrolyzate in liquid form.
  • the alfalfa is milled in hammer mills or in attritor mills, preferably at room temperature.
  • the milled alfalfa is then advantageously pressed in an oil press press, preferably without temperature control.
  • the juice of pressing constitutes the green juice.
  • the expression "implementation directly on green alfalfa juice” means that green alfalfa juice undergoes no treatment before the hydrolysis step.
  • the proportion of dry matter it contains is that of the juice obtained after pressing alfalfa.
  • the proportion of dry matter typically varies from 8 to 15%, and is especially about 10%.
  • the raw material of the hydrolysis step (a) is a green alfalfa juice, it advantageously comprises from 4 to 19%, especially 7 to 15%, of dry matter, said dry matter being constituted, by mass relative to the total mass of the dry matter, from:
  • the enzymatic hydrolysis step may be carried out with any enzyme capable of cutting the peptidine bonds of the proteins contained in the green juice of alfalfa, in particular a protease or a mixture of proteases.
  • protease refers to any exogenous enzyme capable of hydrolyzing said raw material. Proteases can be of fungal, animal or bacterial origin.
  • protease can be commercial enzymes such as DuPont® Protex 6L, DuPont® Protex 20L, DuPont® Protex 7L, DuPont® Protex 51 FP, or Dyadic's Conc ®.
  • the protease may be an endoprotease or an exoprotease or a mixture of an endoprotease and an exoprotease.
  • the inventors of the present invention have demonstrated that endoproteases are more effective at hydrolyzing alfalfa green juice proteins than exoproteases.
  • the enzyme is therefore an endoprotease.
  • the hydrolyzate is intended for human and / or animal nutrition, the enzyme must be a food grade protease, accepted by health authorities such as the French Food Safety Agency (AFSSA).
  • AFSSA French Food Safety Agency
  • Food Grade proteases meeting these criteria are in particular Protex 6L (Bacillus licheniformis endopeptidase,) marketed by Genencor, Protex 20L (Bacillus licheniformis endopeptidase), marketed by Genencor or AP Conc (Bacillus licheniformis endopeptidase), marketed by Dyadic.
  • Protex 6L Bacillus licheniformis endopeptidase
  • Protex 20L Bacillus licheniformis endopeptidase
  • AP Conc Bacillus licheniformis endopeptidase
  • the invention thus relates, in an advantageous embodiment, to a process for the preparation of an alfalfa hydrorysate as defined above, soluble in water, comprising an enzymatic hydrolysis step, advantageously with an endoprotease chosen in particular among the endopeptidases of Bacillus licheniformis on alfalfa green juice
  • the enzyme used in the hydrolysis step must also advantageously meet a certain number of criteria.
  • the enzyme must have a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of protein material nitrogen content in relation to the total dry mass of the hydrolyzate in a time sufficiently short to avoid fermentation of the green juice and bacterial contamination.
  • the enzyme must therefore advantageously make it possible to obtain a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 12 hours, in particular at most 8 hours. especially at most 6 hours, preferably about 5 hours.
  • a hydrolyzate according to the present invention will have a degree of hydrolysis (DH) ranging from 14 to 58%, preferably 25 to 58%.
  • DH degree of hydrolysis
  • DH degree of hydrolysis
  • B Base consumption (in mL)
  • Nb normality of the base
  • htot total number of peptide bonds of the protein substrate (meqv / g protein)
  • Mp mass of protein (N x Kjeidahl factor) (g).
  • This proteolytic activity allows the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in a sufficiently short time to avoid the fermentation of the green juice and a Bacterial contamination should advantageously be obtained at a temperature below the coagulation temperature of the proteins contained in the green alfalfa juice.
  • the enzyme must therefore have a proteolytic activity at a temperature below 80 ° C, especially below 60 ° C, preferably at a temperature of about 55 ° C.
  • the enzyme must also have a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate as defined above comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in question. a sufficiently short time to avoid the fermentation of the green juice and a bacterial contamination at a pH below the coagulation pH of the proteins contained in the green juice of alfalfa.
  • the enzyme therefore also sleeps have a proteolytic activity at a pH below 9.5, especially at a pH below 9, preferably at a pH of about 8.
  • the enzyme is therefore an endoprotease that makes it possible to obtain a hydrolyzate as defined above comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass.
  • the hydrolyzate in at most 8 hours, in particular at most 6 hours, preferably 5 hours, at a pH of less than 9, in particular of approximately 8 and at a temperature below 60 ° C., in particular of approximately 55 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis step is carried out with as little enzyme as possible compared to the dry matter contained in the green juice.
  • the concentration of proteases depends on the protein concentration of the raw material.
  • the enzyme concentration is advantageously from 0.01 to 10%, advantageously from 0.03 to 1.75% relative to the mass of the raw material.
  • the proportion of enzyme corresponds to the mass of enzyme relative to the mass of green juice. When the proportion is 0.25%, this means that 2.5 g of enzyme are used per 1 kg of green juice.
  • the proportion of enzyme is 0.25% for green juice.
  • a proportion of 0.25% corresponds to 2.5 g of enzyme per 1 kg of green juice.
  • the proportion of enzyme required may also be defined in terms of enzyme activity (DU / 100 g).
  • the enzyme concentration is advantageously from 120000 to 840000 DU per 100g of substrate) relative to the weight of the raw material.
  • the proportion of enzyme is 0.25% for the green juice (fate about 100,000 DU per 100g of juice
  • the DU activity is that given by the supplier of said enzyme. It is based on the ability of a protease to cleave p-nitroanilides from a synthetic substrate. The result is an increase in absorbance at 405nm. This increase in absorbance is directly related to the protoase activity, by means of a standard curve established with a standard. If 1mL of a 2% enzyme solution gives an extinction difference of 0.400 under the conditions of the assay (substrate: casein, pH 8.5, 40 ° C), the enzymatic preparation has an activity of 1000 DU. Preferably, the protein / enzyme ratio is about 10/1.
  • ratios above are expressed in mass.
  • a ratio of 10/1 corresponds to 10 g of protein per 1 g of enzyme.
  • the enzymatic hydrolysis step is advantageously carried out at a constant pH, advantageously from 7 to 10, in particular from 7.5 to 8.5, by addition of a base during the hydrolysis reaction.
  • the base may be in particular a hydroxide, for example calcium, potassium or sodium or ammonia.
  • the base is ammonia.
  • ammonia reduces the amount of salts in the final product because it is removed during the purification step.
  • the inventors of the present invention have also demonstrated that ammonia leads to an improved kinetics of hydrolysis compared with that observed with sodium hydroxide, all the other reaction conditions being identical.
  • the enzymatic hydrolysis step is followed by a step of inactivation of the enzyme.
  • This step may in particular be carried out by heat treatment of the reaction medium at a temperature and for a period allowing the denaturation of the enzyme.
  • said inactivation step is carried out at a temperature of at least 85 ° C., in particular of approximately 90 ° C.
  • the duration of this heat treatment varies depending on the amount and nature of the enzyme. Typically it is 5 to 30 minutes, especially about 10 minutes.
  • the hydrolysis medium is subjected to solid / liquid separation in order to separate the soluble hydrolysed proteins from the insoluble proteins.
  • hydrolysis medium means the suspension obtained at the end of the hydrolysis reaction containing the dry matter initially present in the green juice and the enzyme, denatured or not.
  • the inventors have indeed demonstrated that the centrifugation of the hydrolysis medium led to the formation of a pellet containing the pigments and the insoluble materials in water.
  • the soluble proteins contained in the supernatant can therefore be isolated in a simple and economical manner to give a hydro-salate in liquid form which can be concentrated, for example in the form of a syrup, or dried to yield a hydrolyzate in solid form.
  • pellet is therefore understood to mean the insoluble matter isolated at the end of the solid / liquid separation step and therefore containing the material that is not soluble in water.
  • hydrolyzate in liquid form means the supernatant obtained at the end of the solid / liquid separation step.
  • This solid / liquid separation step can be implemented according to conventional methods for the skilled person.
  • the hydrolyzate in liquid form can advantageously be separated from the solids by dynamic separation, in particular by centrifugation and / or decantation.
  • a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids can thus be obtained by simple solid / liquid separation, such as the decantation of the hydrolysis reaction, in particular by centrifugation, without steps involving complex treatments such as ion exchange column chromatography or uKrafiltration.
  • the hydrolyzate in liquid form may undergo a concentration step in order to increase the amount of dry matter in said hydrolyzate in liquid form.
  • the hydrolyzate in liquid form can be used as it is or dried. Drying may be lyophilization or drying of the solution, optionally concentrated by atomization. When the drying is carried out by spraying, an additional filtration step may be implemented in order to eliminate any particles that may clog the nozzles of the atomization tower.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a hydrolyzate in liquid form, a hydrolyzate in concentrated liquid form or a hydrolyzate in solid form, in particular in pulverulent form, from alfalfa green juice.
  • the present invention relates to a process (I) for preparing a liquid alfalfa protein hydrolyzate such as a syrup, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of alfalfa green juice for obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins and the enzyme, b) inactivating the enzyme, especially at a temperature of at least 85 ° C, preferably 90 ° C, to obtain a hydrolysis medium in which the enzyme is deactivated,
  • the present invention relates to a process (II) for preparing a hydrolyzate of alfalfa proteins in solid form, in particular in pulverulent form as defined above, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis alfalfa green juice to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins and the enzyme, b) inactivation of the enzyme, especially at a temperature of at least 85 ° C, preferably 90 ° C, for to obtain a hydrolysis medium in which the enzyme is deactivated,
  • the present invention also relates to a process (Ib) for preparing a protein hydrolyzate of alfalfa in the form of a liquid such as a syrup, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of alfalfa green juice to obtain a medium hydrolysis solution containing soluble alfalfa proteins and the enzyme; b) inactivation of the enzyme, especially at a temperature of at least 85 ° C, preferably 90 ° C, to obtain a hydrolysis medium in which enzyme is disabled,
  • the present invention also relates to a process (lib) for preparing a hydrolyzate of alfalfa proteins in solid form, in particular in pulverulent form, as defined above, comprising the steps of: a) ertzymatic hydrolysis of alfalfa juice to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins and the enzyme,
  • the present invention relates to a process as defined above for the preparation of an alfalfa hydrolyzate in liquid form such as a syrup, comprising the steps of: a) hydrothermal ertzymatic at a constant pH of green alfalfa jux to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins, the enzyme having a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 6 hours, preferably about 5 hours, at a temperature below 60 ° C, preferably at a temperature of about 55 ° C, at a pH below 9, of preferably at a pH of about 8 ", the enzyme being advantageously an endoprotease, the ratio (protein mass contained in the green juice) / enzyme being from 5/1 to 151, in particular of about 10/1, the pH being kept constant by the addition of a base, preferably ammonia,
  • the present invention relates to a process as defined above for the preparation of an alfalfa hydrolyzate in solid form, in particular in pulverulent form, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis at a constant pH green alfalfa juice to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins, the enzyme having a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% nitrogenous protein material by relative to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 6 hours, preferably about 5 hours, at a temperature below 60 ° C, preferably at a temperature of about 55 ° C, at a pH below 9, preferably at a pH of about, the enzyme being advantageously an endoprotease, the ratio (protein mass contained in the green juice) / enzyme being from 5/1 to 15/1, in particular from 10/1, the pH being kept constant by adding a base, preferably ammonia,
  • a third subject of the present invention relates to a protein hydrolyzate obtainable by one of the processes described above.
  • a fourth object of the present invention is the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above.
  • a fifth object of the present invention relates to the use of an alfalfa protein hydrolyzate obtainable by one of the methods described above.
  • the present invention relates to the use of a water soluble alfalfa protein hydrolyzate, comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a protein hydrolyzate obtainable by one of the methods described above, in a food composition.
  • the food composition can be for human or animal use.
  • the present invention therefore relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a hydrolyzate of proteins that can be obtained by one of the methods described above in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins intended for human consumption.
  • the hydrolyzate according to the present invention can in particular be used in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins in products such as cereal bars, food supplements intended for sportsmen, pastries, sweets, milk desserts, in particular supplements in cameo products or substitutes for proteins of animal origin, for example in meat substitutes.
  • the present invention therefore relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a hydrolyzate susceptfcle protein to be obtained by one of the methods described above in substitution or in addition to animal and / or plant proteins for animal feed.
  • hydrolytes according to the present invention can in particular be used in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins in products intended for pet food, livestock feed or aquaculture, especially in substitution or in addition to animal and vegetable proteins.
  • the hydrolysates according to the present invention are characterized by a very high foaming power and emulsifying power.
  • the emulsifying power of the hydrolysates according to the present invention especially at pH 4, varies from 50 to 75%, especially from 65 to 75%, and is about 70%.
  • the foaming power of the hydrolysates according to the present invention varies from 20 to 300. Some hydrolysates have a foaming power of the order of 2 ° and a stability of the emulsion of nearly 80%. Said hydrolysates can therefore be used for the preparation of food emulsions.
  • the present invention also relates to the use of a hydrolyzate of solubie solubie proteins in water, comprising the 20 proteogonous, essential and non-essential amino acids as described above or a protein hydrolyzate likely to be present. obtained by one of the processes described above, as agromaterials, for example vegetable glues or as a binder substituting toxic resins.
  • the present invention also relates to the use of a water solubility alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a protein hydrolyzate obtainable by one of the processes described above, as an ingredient in cosmetic compositions.
  • the hydrolysates according to the present invention can be used as a source of mineral salts in tablets for food use, or in as an ingredient in food products used in low sodium diets.
  • hydrolysates according to the present invention can also be, because of their salty note, used as flavor enhancers.
  • the present invention therefore also relates to the use of a hydrolyzate according to the present invention, in particular cf a hydrolyzate in which the potassium content is from 5,500 mg / kg to 87,000 mg / kg, in particular from 8,800 mg to 69,000 mg / kg. 600 mg / kg relative to the raw material, the calcium content is 6,000 mg / kg to 50,000 mg / kg, especially 9,600 mg / kg to 40,000 mg / kg and the magnesium content is 495 mg / kg to 5400 mg / kg, especially 792 mg / kg to 4320 mg / kg relative to the raw material as flavor enhancer, particularly as a salt substitute (NaCl), preferably in food products for low sodium diets.
  • the peptic profile is defined according to the internal method of the InVivo Lab laboratory by HPLC with UV detection and according to a distribution by molar mass range, unless otherwise indicated.
  • the nitrogenous protein content is 55 to 80%, especially 65 to 80%, in particular 75 to 80%.
  • the hydrolyzate is advantageously obtained from a coagulum of green juice proteins.
  • the content of salts (or ashes) in the hydrolyzate is from 1 to 10%, especially about 6%.
  • the hydrolysates obtained on alfalfa coagulum according to the present invention are characterized by the molecular profile of the proteinaceous nitrogenous material at the end of the enzymatic hydrolysis.
  • the present invention also relates to a coagulum-based alfalfa protein hydrolyzate in which the proteinaceous nitrogen material comprises:
  • said coagulum-based alfalfa protein hydrolyzate comprises the 20 amino acids in the following proportions of the proteinaceous nitrogenous material: an alanine content of 2.8% to 8.9%, in particular 4.5%. % to 7.2% a cystine content of 0.2% to 0.7%, especially 0.3% to 0.6% an aspartic acid content of 4.0% to 13.8%, especially 6.4% to 11.0%
  • the protein hydrolyzate is in the solid form.
  • Said solid comprises from 50 to 100% of dry matter, in particular from 90 to 99% of dry matter, in particular about 95% of dry matter.
  • Said solid is in particular a powder or granules.
  • the powder is composed of granules having a diameter ranging from 5 to 700 ⁇ , in particular from 200 to 500 ⁇ m. The median diameter of the granules constituting the powder is in particular 200 to 500 ⁇ m.
  • the particle size of the powder is determined by laser granulometry on a Coulter, Fraunhofer optical model device, LS30, dry, without vibration mode and over a period of 30sec. The results can be read directly on the device.
  • the proportions of the mineral salts and oligosaccharides of the hydrolysates according to the present invention with is given in the following table (relative to the gross mass of the hydrolyzate).
  • the hydrolysates of the present invention contain high amounts of potassium, calcium, and magnesium and make them a natural source of these minerals. Even more unexpectedly, the hydrolysates according to the present invention also have a low sodium content. The low sodium content makes it a particularly recommended ingredient in low sodium diets.
  • the National Health and Nutrition Program (PNNS) recommends a daily salt intake (sodium chloride) of 8g for adult men and 6.5g for women and children.
  • the World Health Organization for its part, has set a target of a maximum of 5 g of salt.
  • the use of the hydrolyzate of the invention makes it possible to provide a salty taste in foods where it is used without noticeably being a source of sodium because the salty note comes mainly from the potassium present in the subject of the invention.
  • the present invention also relates, in a second particular embodiment, to a hydrolyzate of water-soluble alfalfa proteins in solid form, comprising:
  • hydrolyzate being advantageously obtained by enzymatic hydrolysis of a coagulum of green juice proteins.
  • the subject of the present invention is a process for preparing an alfalfa hydrolyzate in which 20 essential and non-essential amino acids are present, in particular a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate in which 20 amino acids, essential and non-essential, are present with the characteristics described above.
  • the present invention relates in particular to a process for the preparation of an alfalfa protein hydrolyzate comprising an enzymatic hydrolysis step, carried out on a coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins, in particular to obtain a protein hydrolyzate in liquid form.
  • the alfalfa is milled in hammer mills or in attritor mills, preferably at room temperature.
  • the milled alfalfa is then advantageously pressed in an oil press press, preferably without temperature control.
  • the juice of pressing constitutes the green juice.
  • the term "coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins” the solid fraction obtained by precipitation of the proteins contained in the green juice by aicallnisatlon Green Juice at a pH greater than 7, including 7 to 8, preferably 7.3 to 7.5 and steam injection at a temperature above 80 ° C, especially at a temperature of about 85 ° C.
  • Coagulum within the meaning of the present invention, is therefore a mixture of white proteins and alfalfa green proteins, unlike the patent application FR 2 876 389, in which the hydrolysis is carried out on alfalfa white proteins. contained in the filtrate obtained after a step of alkalinlsation and steam injection.
  • the coagulum should be suspended in water prior to the hydrolysis step and brought to a pH suitable for the hydrolysis reaction.
  • the proportion of coagulum in the water is advantageously 10 to 20%, in particular about 15%.
  • the proportion of dry matter is less than 10%, a significant amount of water must be removed during the purification steps of the hydrolyzate thus entailing higher costs.
  • the proportion of dry matter is greater than 20%, the viscosity is too high, pH regulation is very difficult and hydrolysis is less effective under equivalent conditions.
  • the coagulum contains a lower proportion of salts (or ash), it is advantageous to use it for the preparation of hydrolysates containing a lower proportion of salts (or ashes), especially less than 10% of the dry matter of the hydrolyzate. .
  • the raw material of the hydrolysis step (a) is a coagulum obtained by precipitation of the proteins contained in the green juice of alfalfa, it advantageously comprises, before being suspended in water, 23 to 7 ⁇ %, in particular 37 to 64%, of dry matter, said dry matter consisting, by weight relative to the total mass of the dry matter, of:
  • Said coagulum obtained by precipitation of the proteins contained in the alfalfa juice is therefore resuspended in water, advantageously at a dry matter content of 10 to 20%, especially about 15%, before the step of hydrolysis.
  • the enzymatic hydrolysis step may be carried out with any enzyme capable of cleaving the peptide bonds of the proteins contained in the alfalfa green juice or the coagulum, in particular a protease or a mixture of proteases.
  • protease refers to any exogenous enzyme capable of hydrolyzing said raw material. Proteases can be of fungal, animal or bacterial origin.
  • protease can be commercial enzymes such as Protex 6L from DuPont®, Protex 20L from DuPont®, Protex 7L from DuPont®, Protex 51 FP from DuPont®, or AP Conc from home Dyadic®.
  • the protease may be an endoprotease or an exoprotease or a mixture of an endoprotease and an exoprotease.
  • the inventors of the present invention have demonstrated that endoproteases are more effective for hydrolysis of coagulum proteins than exoproteases.
  • the enzyme is therefore an endoprotease.
  • the enzyme When the hydrolyzate is intended for human and / or animal nutrition, the enzyme must be a food grade protease, accepted by health authorities such as the French Food Safety Agency (AFSSA).
  • AFSSA French Food Safety Agency
  • Food Grade proteases meeting these criteria are in particular Protex 6L (Bacillus licheniformis endopeptidase,) marketed by Genencor, Protex 20L (BacilIus licheniformis endopeptidase), marketed by Genencor or AP Conc (Bacillus licheniformis endopeptidase), marketed by Dyadic.
  • Protex 6L Bacillus licheniformis endopeptidase
  • Protex 20L Bacillus licheniformis endopeptidase
  • AP Conc Bacillus licheniformis endopeptidase
  • the invention therefore relates, in an advantageous embodiment, to a process for the preparation of an alfalfa hydrolyzate as defined above, soluble in water, comprising an enzymatic hydrolysis step, advantageously with an endoprotease chosen in particular among endopeptidases of Bacillus licheniformis on a coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins.
  • the enzyme used in the hydrolysis step must also advantageously meet a certain number of criteria.
  • the enzyme must have a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in a short enough time to avoid fermentation. coagulum and bacterial contamination.
  • the enzyme must therefore advantageously make it possible to obtain a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 12 hours, in particular at most 8 hours. especially at most 6 hours, preferably about 5 hours.
  • a hydrolyzate according to the present invention will have a degree of hydrolysis (DH) ranging from 10 to 58%, preferably from 14 to 58%.
  • DH degree of hydrolysis
  • the degree of hydrolysis (DH) is defined (in%) as the number of hydrolyzed peptic bonds (h) on the total peptic binding number (htot).
  • the relationship between DH and basic consumption is given by following equation (Adler-Nissen, 1982, 1 ⁇ 87):
  • B Basic consumption (in ml Nb: normality of the base (N) a: average degree of dissociation of the ⁇ -amino groups Word: total number of peptide bonds of the protein substrate (meqv / g protein) Mp: mass of protein (N x Kjeldahl factor) (g).
  • This proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 30% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in a short enough time to prevent fermentation of the coagulum and contamination bacterial should advantageously be obtained at a temperature below the coagulation temperature of the proteins contained in the coagulum.
  • the enzyme must therefore have a proteolytic activity at a temperature below 80 ° C, especially below 60 ° C, preferably at a temperature of about 55 ° C.
  • the enzyme must also have a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate as defined above comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in a sufficiently short time to prevent fermentation of the coagulum and bacterial contamination at a pH below the coagulation pH of the proteins contained in the coagulum
  • the enzyme must also have a proteolytic activity at a pH below 9.5 , especially at a pH below 9, preferably at a pH of about 8.5.
  • the enzyme is therefore an endoprotease that makes it possible to obtain a hydrolyzate as defined above comprising at least 20%, advantageously at least 30% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass.
  • the hydrolyzate in at most 8 hours, especially at most 6 hours, preferably 5 hours, at a pH below ⁇ , in particular about 8.5 and at a temperature below 60 ° C, in particular about 55 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis step is carried out with as little enzyme as possible compared to the dry matter contained in the coagulum.
  • the concentration of proteases depends on the protein concentration of the raw material.
  • the enzyme concentration is advantageously from 0.01 to 10%, advantageously from 0.03 to 1.75% relative to the mass of the raw material.
  • the proportion of enzyme corresponds to the mass of enzyme relative to the mass of coagulum. When the proportion is 0.25%, which means that 2.5 g of enzyme per 1 kg of green juice or coagulum is used.
  • the proportion of enzyme is 0.42% for the coagulum.
  • the proportion of enzyme required may also be defined in terms of enzyme activity (DU / 100 g).
  • the enzyme concentration is advantageously from 120000 to 840 000 DU per 100 g of substrate) relative to the weight of the raw material.
  • the proportion of enzyme is 0.42% for the coagulum is about 185000 DU per 100g of diluted coagulum).
  • the DU activity is that given by the supplier of said enzyme. It is based on the ability of a protease to store p-nitroanilides from a synthetic substrate. The result is an increase in absorbance at 405nm. This crabsorbance increase is directly related to the protease activity, through a standard curve established with a standard. If 1mL of a 2% enzyme solution gives an extinction difference of 0.400 under the conditions of the assay (substrate: casein, pH 8.5, 40 ° C), the enzymatic preparation has an activity of 1000 DU.
  • the protein / enzyme ratio varies from 5/1 to 130/1, especially from 10/1 to 100/1, in particular from 20/1 to 60/1.
  • the protein / enzyme ratio is about 60/1.
  • the ratios above are expressed in mass.
  • a ratio of 60/1 corresponds to 60 g of protein per 1 g of enzyme.
  • the enzymatic hydrolysis step is advantageously carried out at a constant pH, advantageously from 7 to 10, in particular from 7.5 to 8.5, by addition of a base during the hydrolysis reaction.
  • the base may be in particular a hydroxide, for example calcium, potassium or sodium or ammonia.
  • the base is ammonia.
  • the use of ammonia reduces the amount of salts in the final product because it is removed from the purification stage. Surprisingly, the inventors of the present invention have also demonstrated that the ammonia led to an improved hydrolysis kinetics compared with that observed with sodium hydroxide, all the other reaction conditions being identical.
  • the enzymatic hydrolysis step is followed by a step of inactivating the enzyme. This step may in particular be carried out by heat treatment of the reaction medium at a temperature and for a period allowing the denaturation of the enzyme.
  • said inactivation step is carried out at a temperature of at least 85 ° C., in particular of approximately 90 ° C.
  • the duration of this heat treatment varies depending on the amount and nature of the enzyme. Typically it is 5 to 30 minutes, especially about 10 minutes.
  • hydrolysis medium means the suspension obtained at the end of the hydrolysis reaction containing the dry matter initially present in the coagulum and the enzyme, denatured or not.
  • the inventors have indeed demonstrated that the centrifugation of the hydrolysis medium led to the formation of a pellet containing the pigments and the insoluble materials in water.
  • the soluble proteins contained in the supernatant can thus be isolated in a simple and economical manner to give a hydrolyzate in liquid form which can be concentrated, for example in the form of a syrup, or dried to yield a hydrolyzate in solid form.
  • pellet is therefore understood to mean the insoluble matter isolated at the end of the solid / liquid separation step and therefore containing the material that is not soluble in water.
  • hydrolyzate in liquid form means the supernatant obtained at the end of the solid / liquid separation step.
  • This solid / liquid separation step can be implemented according to conventional methods for the skilled person.
  • the hydrolyzate in liquid form can advantageously be separated from the solids by dynamic separation, in particular by centrifugation and / or decantation.
  • a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids can thus be obtained by simple solid / liquid separation, such as the decantation of the hydrolysis reaction, in particular by centrifugation, without steps involving complex treatments such as ion exchange column chromatography or ultrafiltration.
  • the hydrolyzate in liquid form may undergo a concentration step in order to increase the amount of dry matter in said hydrolyzate in liquid form.
  • the hydrolyzate in liquid form can be used as it is or dried. The drying can be lyophilization or drying of the solution, possibly concentrated by atomization.When the drying is carried out by atomization, an additional filtration step can be carried out. in order to eliminate any particles likely to clog the nozzles of the atomization tower.
  • the present invention also relates to a process for preparing a hydrolyzate in liquid form, a hydrolyzate in concentrated liquid form or a hydrolyzate in solid form, in particular in pulverulent form, from a coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice protein.
  • the present invention relates to a process (I) for preparing a liquid alfalfa protein hydrolyzate such as a syrup, comprising the steps of: e) enzymatic hydrolysis of the coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice protein to obtain a hydrolysis medium containing solubte alfalfa protein and enzyme,
  • the present invention relates to a process (II) for preparing a hydrolyzate of alfalfa proteins in solid form, in particular in pulverulent form as defined above, comprising the steps of: f) enzymatic hydrolysis coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins and the enzyme,
  • the present invention also relates to a process (1a) for preparing a hydrolyzate of alfalfa protein in the form of a liquid such as a syrup, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of a coagulum obtained by precipitation of proteins alfalfa green juice, in particular of composition as defined above, to obtain a hydrolysis medium containing alfalfa proteins soluWes and the enzyme,
  • the present invention also relates to a process (Ma) for preparing a hydrolyzate of alfalfa proteins in solid form, in particular in pulverulent form, as defined above, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of a coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins and the enzyme,
  • the process defined above also comprises the steps for preparing said coagulum of: a) pressing alfalfa, to obtain green alfalfa juice and alfalfa cake,
  • the present invention relates to a process as defined above for the preparation of a liquid alfalfa hydrolyzate such as a syrup, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of a coagulum obtained by precipitation of the proteins contained in alfalfa juice, in suspension in water, advantageously at a dry matter content of 10 to 20%, in particular of approximately 15%, to obtain a hydrolysis medium containing proteins soluble alfalfa, the enzyme having a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protoic material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 6 hours, preferably at least 5 hours, at a temperature below 60 ° C., preferably at a temperature of about 55 ° C., at a constant pH, in particular less than 9, preferably at a pH of about 8.5, the enzyme being advantageously an endoprotease, the ratio (protic material contained in green juice) / enzyme
  • the present invention relates to a process as defined above for the preparation of an alfalfa hydrolyzate in solid form, especially in pulverulent form, comprising the steps of: a) enzymatic hydrolysis of a coagulum obtained by precipitation of the proteins contained in the alfalfa green juice, in suspension in water, advantageously at a solids content of 10 to 20%, in particular of approximately 15%, to obtain a hydrolysis medium containing soluble alfalfa proteins, the enzyme having a proteolytic activity allowing the formation of a hydrolyzate comprising at least 20%, advantageously at least 40% of nitrogenous protein material relative to the total dry mass of the hydrolyzate in at most 6 hours , preferably about 5 hours, at a temperature below 60 ° C, preferably at a temperature of about 55 ° C, at a constant pH, especially less than 9, of reference to a pH of about 8.5, the enzyme being advantageously an endoprotease, the ratio (nitrogenous material contained in the green juice
  • a third subject of the present invention relates to a protein hydrolyzate obtainable by one of the processes described above.
  • a fourth object of the present invention is the use of a hydrolyeat of water-soluble alfalfa protein comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above.
  • a fifth object of the present invention relates to the use of an alfalfa protein hydrolyeat obtainable by one of the methods described above.
  • the present invention relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyeat comprising 20 amino acids, essential and non-essential as described above or a protein hydrolyeat obtainable by one of the methods described above, in a food composition.
  • the food composition can be for human or animal use.
  • the present invention therefore relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a hydrolyzate of proteins that can be obtained by one of the methods described above in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins intended for human consumption.
  • the hydrolysates according to the present invention can in particular be used in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins in products such as cereal bars, food supplements intended for sportsmen, pastries, sweets, milk desserts, in particular supplements in meat products or substitutes for proteins of animal origin, for example in meat substitutes.
  • the present invention therefore relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a hydrolyzate of proteins that can be obtained by one of the methods described above in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins intended for animal feed.
  • hydrolysates according to the present invention can in particular be used in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins in products intended for pet food, livestock feed or aquaculture, especially in substitution or in addition to animal and / or vegetable proteins.
  • the hydrolysates according to the present invention are characterized by a very high foaming power and emulsifying power.
  • the emulsifying power of the hydrolysates according to the present invention especially at pH 4, varies from 50 to 75%, especially from 65 to 75%, and is about 70%.
  • the foaming power of the hydrolysates according to the present invention varies from 20 to 300. Some hydrolysates have a foaming power of the order of 290 and a stability of the emulsion of nearly 80%. LesdKs hydrolysates can therefore be used for the preparation of food emulsions.
  • the present invention also relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate, comprising the 20 essential and non-essential proteogenic amino acids as described above or a protein hydrolyzate which may be obtained by one of the processes described above, as agromaterials, for example vegetable glues or as a binder substituting toxic resins.
  • the present invention also relates to the use of a water-soluble alfalfa protein hydrolyzate comprising 20 essential and non-essential amino acids as described above or a protein hydrolyzate obtainable by the method. one of the methods described above, as an ingredient in cosmetic compositions.
  • the hydrolysates according to the present invention can be used as a source of mineral salts in tablets for food use, or in as an ingredient in food products used in low sodium diets.
  • hydrolysates according to the present invention can also be, because of their salty note, used as flavor enhancers.
  • the present invention therefore also relates to the use of a hydrolyzate according to the present invention, especially a hydrolyzate in which the potassium content is from 5,500 mg / kg to 87,000 mg / kg, in particular from 8,800 mg / kg. at 69,600 mg / kg relative to the raw material, the calcium content is 6,000 mg / kg to 50,000 mg / kg, especially 9,600 mg / kg to 40,000 mg / kg and the magnesium content is from 495 mg / kg to 5400 mg / kg, especially from 792 mg / kg to 4320 mg / kg relative to the raw material as a flavor enhancer, in particular as a salt substitute (NaCl), preferably in food products for diets low sodium.
  • a hydrolyzate according to the present invention especially a hydrolyzate in which the potassium content is from 5,500 mg / kg to 87,000 mg / kg, in particular from 8,800 mg / kg. at 69,600 mg / kg relative to the raw material, the calcium content is 6,000 mg /
  • Figure 7 shows production yields from alfalfa green juice or coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins.
  • Figura 8 represents the composition of dry matter, ash (or salts) and protein of a hydrolyzate prepared from the green juice of alfalfa or coagulum obtained by precipitation of alfalfa green juice proteins.
  • Figure 9 shows the mass distribution of the Dalton size of amino acids, proteins and peptides in different hydrolysates made in the laboratory according to the present invention and according to the analytical method ARD.
  • Figure 9a shows the mass distribution of the Dalton size of amino acids, proteins and peptides in different hydrolysates carried out in the pilot stage according to the present invention and according to the In Vivo Lab analytical method.
  • FIG. 10 shows the aminogram of a peptide powder according to the present invention in comparison with the semi-skimmed milk and alfalfa protein concentrate marketed under the name Luzixine® (CPL).
  • FIG. 11 represents the proportion of insoluble matter of a solubilization test of 25% alfalfa green juice (JV) protein, an alfalfa green juice protein hydrolyzate (JV powder) or a hydrolyzate of a coagulum (coagulum powder).
  • the raw material may be alfalfa green juice or alfalfa coagulum (Table 1).
  • Green juice has a dry matter content between 8 and 13%, a protein concentration between 28 and 35% of the dry matter, a mineral content between 15 and 19% of the dry matter, a concentration of total chlorophylls between 6000 and 11000ppm dry matter, a concentration of carotenoids (B-carotene) between 200 and 500 ppm of the dry matter and a concentration of xanthophylls (lutein, neoxanthine and violaxanthin) between 600 and 1200ppm of the dry matter.
  • B-carotene carotenoids
  • xanthophylls lutein, neoxanthine and violaxanthin
  • Centrifugal decantation allows the removal of some of the water and minerals contained in the green juice.
  • the coagulum thus obtained is thus enriched in proteins.
  • the coagulum thus has a greater dry matter content than green juice between 46 and 53%, a protein content between 35 and 56% of the dry matter and a mineral content between 9 and 19% of the dry matter.
  • the coagulum is rich in chlorophyll, xanthophyll and carotenoids.
  • Example 1 Selection of the enzyme The tests made it possible to identify three particularly effective enzymes for carrying out the enzymatic hydrolysis reaction of the green juice and the coagulum. These are Protex 6L, Protex 20L and Protease AP conc.
  • the degree of hydrolysis is less than 5%. Given the amount of NaOH necessary to reach such a pH, the hydrolyzate obtained contains a very large proportion of salts.
  • a pH of 8 is therefore preferable to minimize the amount of salts in the protein hydrolyzate.
  • the degree of hydrolysis varies between 18% and 28% depending on the dose of enzyme used.
  • the substrate enzyme ratio of 1/10 gives the best hydrolysis (28%).
  • a loss of 3 points of degree of hydrolysis is observed with the enzyme dose just below 1/15.
  • the lowest dose of 1/90 results in a loss of 10 DH points.
  • the enzyme / substrate ratio for the hydrolysis of the green juice is therefore preferably 1/10.
  • a series of tests was also performed to determine the optimal enzyme dose for coagulum hydrolysis. The pH was set at 8, the temperature at 55 ° C and the coagulum was redissolved to 10% DM Five doses (enzyme substrate mass ratio) were tested.
  • Example S Treatment of the hydrolysis reaction Following the hydrolysis, the product obtained is a mixture of insoluble proteins, soluble peptides, pigments (chlorophylls and xanthophylls) and salts.
  • a green pellet is formed.
  • the whole of the green juice or hydrolysed coagulum was therefore centrifuged for 15 min at 4080G and at 4 ° C.
  • the analysis of this pellet shows that it contains proteins and pigments.
  • the product can then be processed to be easily transportable at a lower cost, maintainable and formable (Incorporate in food preparations for example).
  • Incorporate in food preparations for example.
  • the powder form (provided that it is soluble) is appreciated in agro- food because it allows easy incorporation into all products. Taking into account all these constraints, the two unit operations to be added to the process are the evaporation concentration and the atomization.
  • the physico-chemical composition of the peptide powders of green juice and coagulum was also determined.
  • the compositions are given in Table 4bls.
  • the proportions of the components of interest (proteins and minerals) in the hydrolysates are given in Figure 8.
  • Peptides less than 100 Da represent 70% of the peptides of the four batches of powders tested.
  • the other peptide size representing 20% of the peptides, have a size between 1000 and 500 Da.
  • Few peptides have a size greater than 5000 Da, representing 5% of the peptides having a thallium between 5000 and 60000 Da.
  • Protein hydrolysates thus contain a large part of easily assimilable peptides and are therefore perfectly adapted to human and animal nutrition.
  • the aminogram of the powders was also determined in order to confirm the presence of all the proteogenic amino acids and their proportions in the hydrolyzate.
  • the alfalfa protein hydrolysates according to the present invention do contain the eight essential amino acids, but also the twenty proteogenic amino acids.
  • the acid hydrolysis destroys tryptophan and converts the amide functions of glutamine and asparagine into amide to give glutamate and aspartate.
  • the peptide profile (according to the analytical method ARD): entra i and 10% of molecular weight molecules between 10,000 and 5000 Da between 40 and 60% of molecules of molecular weight between 5000 and 1000 Da
  • the nitrogen protein content ((Nt - Nammo) x 6.25) is between 10 and 15% of the dry extract
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 1 ppm and 20ppm of the dry extract
  • the xanthophyll content (lutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1ppm and 100ppm of the dry extract
  • the chosen method is COSEX STAN 295 -2009 (Appendix A).
  • the method described in Appendix A of the Korean Food Standards Law enhances the "official method AOAC 950.66".
  • solubility of the powders was tested once they were dissolved in osmosis water at a mass concentration ranging from 1% up to 25%. This concentration of 25% was chosen because it mimics the maximum protein concentrations found in food products.
  • the solution is centrifuged at 4000G 5min.
  • Example 7.2 Examples of Protein Hydrolyzates Obtained from Alfalfa Juice: Method for Determining Emulsifying Potency Materials:
  • Protocol In a pill box, about 10 g of an aqueous protein solution at 1% are prepared and the exact volume A is noted.
  • This solution is stirred magnetically and the pH adjusted to the chosen value with 0.1 N HCl or NaOH solution and then left stirring slowly for 1 h. the pH is readjusted to the chosen value if necessary.
  • 700mL of a 1% protein solution are prepared with osmosis water.
  • a test tube and the protein solution are heated to 25 ° C. and 50 ml of the solution are poured into the test tube.
  • the bulb is adjusted to the mark with the solution then 500mL are poured into the ampoule.
  • the 500 ml of solution are poured into the test tube in 3 minutes.
  • the height of the foam is measured for 20 minutes at regular intervals (0-1-2-3-5- 10-15 and 20 min).
  • the foaming capacity corresponds to the height of the foam at T0 and the stability is determined by the equation (foam height at T20) - (foam height at T0) x100.
  • the green alfalfa juice is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 55 ° C and the pH is adjusted to 8 with ammonia.
  • the protease is added at 0.3% by weight.
  • the hydrolysis is carried out at a constant pH close to 8, at a constant temperature of 55 ° C. and for a duration of 5 hours.
  • the juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles.
  • the hydrolyzate is concentrated under vacuum and then spray-dried.
  • the chemical analysis of the hydrolyzate obtained is as follows:
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 1 ppm and 10 ppm of the dry extract
  • the xanthophyll content (lutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1 ppm and 46ppm of the dry extract
  • solubility soluble at pH between 2 and 11
  • the green alfalfa juice is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 25 ° C and the pH is adjusted to 8 with ammonia.
  • the protease is added at 0.3% by weight.
  • the hydrolysis is carried out at a constant pH close to 8, at a constant temperature of 25 ° C. and for a period of 5 hours.
  • the juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles.
  • the hydrolyzate is concentrated under vacuum and then spray-dried.
  • the chemical analysis of the hydrolyzate obtained is as follows:
  • the peptide profile (according to the analytical method ARD): between 1 and 3% of molecular weight molecules between 10,000 and 5000 Da
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 1 ppm and 10 ppm of the dry extract
  • the xanthophyll content (lutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1 ppm and 48 ppm of the dry extract
  • Solubility solubility at pH between 2 and 11
  • foaming property foaming capacity of 290 and stability of 79%
  • the green alfalfa juice is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 55 ° C and the pH is adjusted to 8 with ammonia.
  • the protease is added at 0.3% by weight.
  • the hydrolysis is carried out at a constant pH close to ⁇ , at a constant temperature of 55 ° C. and for a duration of 1 hour. After 1 h, the hydrolysis is stopped by heating at 90 ° C for a period of 10 minutes. The juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles. The hydrolyzate is concentrated under vacuum and then dried by spraying.
  • the xanthophyll content (lutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1 ppm and 46ppm of the dry extract
  • solubility soluble at pH between 2 and 11
  • the green alfalfa juice is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 55 ° C and the pH is adjusted to 6 with ammonia.
  • the protease is added at 0.3% by weight.
  • the hydrolysis is conducted at a constant pH close to 6, at a constant temperature of 55 ° C. and for a period of 5 hours. After 5h, the hydrolysis is stopped by heating at 90 ° C for a period of 10 minutes.
  • the juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles.
  • the hydrolyzate is concentrated under vacuum and then spray-dried.
  • the chemical analysis of the hydrolyzate obtained is as follows:
  • the peptide profile (according to the analytical method ARD): between 1 and 3% of molecular weight molecules between 10,000 and 5000 Da
  • the nitrogen protein content (Nt ⁇ Nammo) x 6.25) is between 27% and 47% of the dry extract
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 1 ppm and 10 ppm of the dry extract
  • the xanthophyll content (lutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1 ppm and 46ppm of the dry extract
  • solubility soluble at pH between 2 and 11
  • Example 7.2.5 The green alfalfa juice is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 55 ° C and the pH is adjusted to 8 with ammonia. The protease is added at 0.3% by weight. The hydrolysis is carried out at a constant pH close to 8, at a constant temperature of 55 ° C. and for a duration of 5 hours.
  • the juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles.
  • hydrolyzate is concentrated under vacuum and then dried by lyophilization.
  • chemical analysis of the hydrolyzate obtained is as follows:
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 1 ppm and 10 ppm of the dry extract
  • the xanthophyll content (iutein, neoxanthine and violaxanthin) is between 1ppm and 46ppm of the dry extract
  • solubility soluble at pH between 2 and 11
  • Example 9 Coagulum Green alfalfa juice, pH between 5.8 and 6.2 is neutralized or slightly alkalized by adding a solution of potash up to pH 7.0-8.0.
  • This juice is mounted at a temperature of 85 e C, in less than 5 minutes by direct steam injection lyre type, with a minimum contact time of 20s.
  • a precipitate forms, precipitated named coagulum.
  • the protein coagulum produced is separated from the mother liquor (or serum) by centrifugal decantation at a rate of 30 to 55 t / h.
  • the coagulum diluted to 15% DM in water, is placed in a hydrolysis tank equipped with a stirring system, the temperature is raised to 55 ° C. and the pH is adjusted to 8.5 with water. 'ammonia.
  • the protease is added at a rate of 0.42% by weight.
  • the hydrolysis is carried out at a constant pH close to 8.5, at a constant temperature of 55 ° C. and for a period of 5 hours.
  • the hydrolysis is stopped by heating at 90 ° C for a period of 10 minutes.
  • the juice is then centrifuged in a centrifugal decanter to remove solid particles.
  • the carotenoid content ( ⁇ -carotene) is between 11ppm and 211ppm of the dry extract
  • a content of aspartic acid in particular from 4% to 13.9% on proteins
  • a content of glutamic acid in particular from 5.5% to 17.3% on proteins
  • a histidine content in particular from 1.0% to 3.2% on proteins
  • a threonine content especially from 2.2% to 7.2% on proteins
  • valine content in particular of 2.9% to 9.3% on proteins
  • tyrosine content in particular of 2.0% to 6.4% on proteins.
  • solubility soluble at pH between 5 and 8
  • foaming property foaming capacity between 20 and 40
  • the hydrolyzate powder is diluted in water of 1: 3 proportions (hydrolyeat / water, mass / mass) at 20 ° C. This mixture is left to mature for 1 to 24 hours at room temperature. This dilution is then placed on the smooth phase to be glued with a sheet of 190 gram vinyl paper on a surface of 10 cm 2 (previously drawn on the sheet with a width of 2 cm and a length of 5 cm) using a spatula. Another sheet of vinyl paper is placed above it. These two sheets thus glued are dried in a Memmert oven at 45 ° C. for a period of time ranging from 1 to 24 hours, and the sheets thus glued are then attached to a board.
  • weights are introduced into the basket until peeling off the leaf glued by the alfalfa, the basket is then weighed, the weight thus determined is related to the amount of alfalfa introduced and compared with other samples worked under similar conditions.
  • the hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, is diluted in osmosis water at proportions 1/3 (hydrolyzate / water, mass mass) at 20 ° C. This mixture is left to mature for 1 to 24 hours. ambient temperature.
  • the glue thus obtained demonstrates a bonding force of 0.088 kg / cm 2 per 1 g of dry product (as against 0.380 kg / cm 2 per 1 g of dry UHU type glue product, 0.072 kg cm 2 per 1 g of dry product of type glue based on gelatinized starch and 0.130 kg / cm 2 for 1 g of gelatinized flour dry glue).
  • Example 8.2 Vegetable glue formulated with baking soda
  • the hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, is diluted in 1/3 osmosis water (hydrolyzate / water, mass / mass) at room temperature (20 ° C.). To this mixture is added 6 to 7% of bicarbonate of concern (powder). This mixture is left to mature for 1 hour to 24 hours at room temperature.
  • the glue thus obtained demonstrates a binding force of 0.097 kg cm 2 per 1 g of dry product.
  • the hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6 is diluted in osmosed water in the proportions 1/3 (hydrolyzate / water w / w) at room temperature (20 e C). To this mixture is added 6 to 7% urea (powder). This mixture is left to mature for 1 hour to 24 hours at room temperature.
  • the glue thus obtained demonstrates a bonding strength of 0.105 kg / cm 2 for 1 g of dry product.
  • Example 8.4 Use as a tensor:
  • the hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, is diluted in osmosis water at proportions of between 1 and 10% (hydrolyzate / water, mass mass) at ambient temperature (20 ° C.).
  • This mixture is poured into a pastry mold previously buttered and floured.
  • the mold is then placed in the oven, previously preheated to Thermostat 6 (180 ° C), for 45 minutes at 180 ° C.
  • Example 8.6 Preparation of a marshmallow 25 g of wheat-based glucose syrup and 250 g of white sugar beet sugar are placed in a saucepan and are cooked up to 130 ° C. Once this temperature is reached, the juice obtained is incorporated into 75g of chicken egg white. Everything is mixed with the beater (phillips type HR 1459/00). A bet 4 layers of gelatin food of porcine origin are covered with cold water for 10 minutes then the leaves are dewatered by hand and added to 10 drops of strawberry syrup. This mixture is incorporated in the preceding mixture 1 teaspoon of hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, is added to this latter mixture. The mixture is mixed until complete homogenization, with a beater (phillips type HR 1459/00).
  • Example 8.8 preparation of a cereal protein bar 2 chicken eggs, 2 teaspoons of sunflower oil (Lesieur type), 4 tablespoons of liquid honey (all flowers type), 250g of muesli ( crispy fruit type), 2 teaspoons cocoa pure chocolate powder and 4 teaspoons hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, are mixed until homogenization.
  • the mixture is deposited on a plate, in order to obtain a uniform and compact layer of 2 cm.
  • the plate is baked 15min at thermostat 6.
  • Example 8.9 preparation of a dessert cream 30 g of cornstarch, 30 g of brown sugar and 50 ml of semi-skimmed cow's milk at 4 ° C. are mixed until homogenisation and whipped 100 g of pastry chocolate cut into small pieces are incorporated in the previous preparation and the whole is heated to melt the chocolate, after adding 4 g of hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, the mixture is mixed until thickened. ° C.
  • Example 8.10 Preparation of a yoghurt with 1L of whole cow's milk, 1 unsweetened natural Danone type yoghurt, 2 teaspoons of Vahiné type liquid coffee flavor, 4 tablespoons of sugar crystallized white beet are mixed until homogenization to 2 teaspoons of hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6. The whole is placed in ramekins placed in a yogurt maker for 12 hours of type (Her type u) at 30 ° C.
  • Example 8.11 preparation of ketchup 131g of yellow onions, 7g of clove of garlic are peeled, the whole is added to 1123g of ripe red tomatoes and the whole is cut roughly. The whole is placed 30 minutes in a saucepan under high heat, while stirring regularly to prevent the mixture from catching. The cooked mixture is passed to the vegetable mill to obtain a grout. 7CI of colored alcohol vinegar, 1 clove and a pinch of cayenne pepper are mixed with this coulis before being cooked for 45 minutes in a saucepan, or until half of the volume is reduced, in order to get a syrupy consistency. The whole is mixed in order to obtain a homogeneous mixture.
  • Example 8 preparation of a mayonnaise 21.5g of chicken egg yolk and 9.2g of "fine and strong" djjon mustard are mixed before progressive incorporation of sunflower oil in order to raise the mayonnaise. To 50 g of this mixture, 1 g of hydrolyzate powder, obtained as described in Example 6, are mixed. Everything is reserved at 4 ° C before tasting.

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Abstract

La présente invention concerne un hydrolysat de protéines de luzerne, un procédé pour sa préparation et l'utilisation de l'hydrolysat comme ingrédient alimentaire, comme ingrédient cosmétique et comme agro-matériau.

Description

HYDROLYSAT DE PROTEINES DE LUZERNE, SON PROCEDE DOBTENTION ET SON UTILISATION
La présente invention concerne un hydrolysat de protéines de luzerne, un procédé pour sa préparation et l'utiieation de l'hydrolysat comme ingrédient alimentaire, comme Ingrédient cosmétique et comme agro-matériau.
Les protéines sont, avec les glucides et les lipides, l'une des trois grandes familles de macronutriments. Il existe un très grand nombre d'acides aminés différents mais seulement vingt sont utilisés par l'organisme des vertébrée pour la fabrication des protéines (acides aminés dits c protéogènes »). Parmi ces 20 acides aminés, 12 peuvent être fabriqués par le corps humain et les 8 autres sont dits essentiels car l'organisme est incapable de les synthétiser. Ces acides aminés doivent par conséquent être apportés par l'alimentation.
La composition en acides aminés des protéines est prise en compte pour évaluer la qualité protéique de notre alimentation. La qualité des sources alimentaires de protéines est presque exclusivement définie par leurs capacités à couvrir les besoins en protéines et en acides aminés essentiels.
Les protéines animales, majoritaires dans l'alimentation des pays industrialisés, proviennent notamment du lait, de l'œuf, des poissons et de la viande. Les ressources disponibles pour produire ces protéines animales, qu'il s'agisse de viande, de produits laitiers ou de poisson, ne sont pas Infinies.
Actuellement, de l'ordre de 70% des protéines végétales produites sont utilisées pour produire des protéines animales avec un rendement moyen particulièrement médiocre, puisqu'il faut entre 4 kg et 15 kg de protéines végétales pour produire 1kg de protéines animales suivant le type d'animal considéré.
Les protéines végétales représentent donc une des sources alternatives aux protéines animales dans l'alimentation humaine. A l'heure actuelle, les sources de protéines d'origine végétales sont essentiellement le soja, les céréales et les légumineuses.
Une diversification et un enrichissement de l'offre actuelle en protéines végétales, monopolisée principalement par le soja, s'avère donc essentiels.
Si les protéines végétales ont la réputation d'être "Incomplètes" car déficientes en l'un ou l'autre des acides aminés essentiels, ce n'est pas le cas des protéines de luzerne [Medigaco sativa) qui sont composées de tous les acides aminés essentiels (tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine et isoleucine). Les protéines de luzerne sont particulièrement intéressantes car elles présentent un aminogramme équilibré composé de tous les acides aminés essentiels, de plus leurs propriétés nutritionnellee sont équivalentes voire supérieures à celles des autres protéines agricoles conventionnelles d'origine végétales (gluten de blé, protéines de soja) ou animales comme les protéines de poisson par exemple.
La demande internationale WO 02/058482 décrit un extrait protéique non hydrolysé obtenu par précipitation des protéines insolubles du jus vert de luzerne. L'extrait protéique décrit dans cette demande, commercialisé sous le nom Luzixine®, se présente sous forme d'une semoule grossière de faible solubilité dans l'eau.
La demande de brevet FR 2 876 389 décrit des hydrolysats de protéines obtenus par hydrolyse enzymatique des protéines solubles du jus vert de luzerne (dites protéines blanches, notamment le RubisCO). Ce procédé, et l'hydrolysat obtenu sont également décrits dans Prévôt D'AMse et al (Enzyme end mlcroblal technoiogy 34 (2004), 380-391). Le procédé décrit dans ces documents Implique les étapes suivantes : le jus vert de luzerne est alcalinisé pour séparer les protéines vertes insolubles des protéines blanches solubles. Ces protéines blanches sont ensuite précipitées à pH acide (4-6), séparées par urtrafiltration et purifiées par diaflltration sur des membranes minérales. La crème protéique obtenue suite à ces étapes est ensuite soumise à une hydrolyse enzymatique et le perméat est décoloré et désalinisé.
Le procédé décrit dans ce document présente cependant l'inconvénient de nécessiter plusieurs étapes préalables à l'étape d'hydrolyse enzymatique pour isoler les protéines blanches du jus vert. En outre, l'hydrolysat de luzerne obtenu par ce procédé a une solubilité dans l'eau très réduite, ce qui limite son utilisation, en particulier dans l'industrie alimentaire.
II existe donc un besoin pour un hydrorysat de luzerne dans lequel tous les acides aminés essentiels sont présents et pour un procédé simplifié par rapport à celui connu de l'art antérieur.
La présente invention vient combler ce besoin. Un premier objectif de la présente invention est un hydrorysat de protéines de luzerne comprenant l'ensemble des acides aminés protéogènes. Un deuxième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse directe du jus vert de luzerne.
Un troisième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse d'un coagulum de luzerne comprenant des protéines du jus vert de luzerne.
Un quatrième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant l'ensemble des acides aminés protéogènes. Un cinquième objectif de la présente invention est l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne pour la préparation de compositions alimentaires, cosmétiques et d'agromatériaux.
Dans la suite de la description et les revendications, tous les pourcentages sont des pourcentages massiques, sauf indication contraire. Dans la suite de la description et les revendications, le pourcentage d'acides aminés et/ou de peptides et/ou de protéines est défini par rapport à la masse totale de la matière azotée, désigné par NT *6,25, selon la méthode de dosage par Kjeldhal, sauf indication contraire.
Dans la suite de la description, la notion de teneur en matière azotée protéique fait référence au dosage de la matière azotée totale, selon la méthode Kjeldhal, soustrait de la matière azotée minérale, le tout étant multiplié par le facteur 6,25.
Dans la suite de la description et les revendications, le pourcentage de matière sèche est défini par rapport à la masse totale (ou matière brute) du jus vert de luzerne, du coagulum ou de Phydrolysat selon le cas, sauf indication contraire. Dans la suite de la description et les revendications, l'expression « molécules de poids moléculaire inférieure à XX Da » désigne les acides aminés et/ou peptides et/ou protéines, selon la valeur de la masse moléculaire.
Dans la suite de la description et sauf indication contraire, le profil peptique est défini selon la méthode interne ARD par HPLC (colonne Shodex Protein KW-8025) avec détection UV 260 nm et selon une distribution par gamme de masses molaires définie selon le kit de calibration SIGMA 6500-66000 : réf MW-GF-70 kit.. Un premier objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines de luzerne eoluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés essentiels et non essentiels.
Au sens de la présente invention, on entend par « hydrolysat de protéines de luzerne » un mélange de protéines, d'oligopeptides et de peptides et d'acides aminés libres obtenu par la réduction de la masse moléculaire des protéines contenues dans le jus vert de luzerne.
Le jus vert de luzerne est, au sens de la présente invention, la fraction liquide obtenue par pressage de la luzerne, avantageusement de la luzerne n'ayant pas atteint le stade de floraison. La luzerne est avantageusement fauchée de mars à décembre, de préférence d'avril à mai. De manière non limitative, la luzerne peut appartenir à une variété choisie parmi Aliso, Artemls, Asmera, Félicia, Everest, Neptune, Exquise, Galaxie, Alexis, Prunelle, Salsa, Alicia, Arpège, Alpha, Andela, Concerto, Timbale, Rachat, Verdor et Barmed. Au sens de la présente invention, on entend par « soluble dans l'eau » le fait qu'au moine 95 %, avantageusement au moins 99, de préférence au moins 99,9 % de la poudre est soluble à une concentration de 25 g d'hydrolysat pour 100 g d'eau à 20BC dans l'eau (pH - 7). Dans la présente invention, la solubilité de la poudre est mesurée par la méthode décrite en annexe A de la norme COSEX STAN 295R-2009 : 1 g d'échantillon est placé dans un tube à centrifugation de masse déterminée. 15 mL d'eau sont ajoutés et l'échantillon dissous. La solution est centrifugée pendant 15 minutes à 3000 tours par minutes et le surnageant est éliminé. La centrifugation est répétée deux fois. Le tube est séché à 105°C jusqu'à obtenir une masse constante. Les résultats sont reportés en pourcentage de solide insoluble dans l'eau selon l'équation suivante :
Résidu solide insoluble dans l'eau (%) = (W1 - W0)/ S x 100, où W1 est la masse du tube et du résidu après centrifugation, W0 est la masse du tube à centrifugation et S est la masse de l'échantillon. Le pourcentage de poudre dissoute correspond à 100 - résidu solide insoluble dans l'eau.
Au sens de la présente Invention, on entend par « coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne » la fraction solide obtenue par précipitation des protéines contenues dans le Jus vert par alcalinisation du jus vert à un pH supérieur à 7, notamment de 7 à 8, de préférence de 7,3 à 7,5 et injection de vapeur â une température supérieure à 80°C , notamment à une température d'environ 85°C . Le coagulum, au sens de la présente invention, est donc un mélange de protéines blanches et de protéines vertes de luzerne, contrairement à la demande de brevet FR 2 876 389, dans lequel l'hydrolyse est mise en œuvre sur les protéines blanches de luzerne, contenues dans le filtrat obtenu consécutivement à une étape cfalcalinisation et d'injection de vapeur. La présente invention concerne en particulier des hydrolysats tels que définie ci-dessus, caractérisés en ce qu'au moins 95 %, notamment au moins ΘΘ %, de préférence 99,9 % de l'hydrolysat est soluble dans l'eau à une concentration de 25 g d'hydrolysat pour 100 g d'eau à 20"C (à pH = 7).
Les acides aminés contenus dans l'hydrolysat de luzerne selon la présente invention sont ceux constituant les protéines humaines (dits protéogénes). Les 8 acides aminés protéogénes essentiels sont la valine, la leucme, l'isoleucine, la phénylalanlne, le tryptophane, la méthionine, la thréonine et la lysine. Les 12 acides aminés non-essentiels sont la cystéine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, la lysine, la méthionine, la proline, l'arginine, la sérine, la valine et la tyrosine. Ils proviennent tous de la luzerne et sont présents dans l'hydrolysat sous forme libre ou en tant que constituants de peptides et de protéines solubles dans l'eau.
Outre leur solubilité dans l'eau, les hydrolysats selon la présente Invention sont faiblement pigmentes.
Au sens de la présente invention, on entend par " faiblement pigmenté » le fait que l'hydrolysat sous forme de poudre est blanchâtre ou très légèrement teinté. Les hydrolysats faiblement pigmentés selon la présente invention comprennent avantageusement moins de 1000 ppm, avantageusement moins de 250 ppm, de préférence moins de 180 ppm, de pigments tels que les xanthophylles, notamment la lutéine, la néoxanthine et la vioiaxanthine par rapport à la masse totale de l'extrait sec de l'hydrolysat.
Les hydrolysats selon la présente invention contiennent de préférence des caroténoïdes (β-carotène) à une teneur inférieure à 220 ppm et des xanthophylles, notamment la lutéine, la néoxanthine et la vioiaxanthine à une teneur totale inférieure à 180 ppm de xanthophylles de l'extrait sec de l'hydrolysat.
Les hydrolysats selon la présente Invention contiennent également de 20 à 950 ppm de chlorophylle de la matière sèche totale, dont 20 à 800 ppm de chlorophylle A et 20 à 800 ppm de chlorophylle B. Dans la présente invention, la teneur en pigments est déterminée selon la méthode suivante : Pour les chlorophylles : [Extraire Pe grammes d'échantillon par une solution d'acétone à 80%, lire les absorbances à 645 et 663 nm sur spectrométre puis calculer les concentrations en chlorophylles A, B et totales à partir des équations suivantes :
- Chlorophylles Totales (en mg/Kg) = 8,02*A663+20,21*A645)*(v7Pe)*1000 - Chlorophylles A (en mg/Kg)= (12,7*663-2,6* 645) *(V Pe)*1000
- Chlorophylles B (en mg/Kg)= (22.9*A645-4,68*A663) *(v7Pe)*1000
Avec A663 : Absorbance à 663 nm ; A645 : Absorbance à 645 nm ; V : Volume soit 0,100 L ; Pe : Prise d'essai de l'échantillon en g.
Pour les xanthophylles (lutéine, violaxanthine et neoxanthrine) et caroténoTdes (B- carotène) : extraire x g d'échantillon par un mélange éther de pétrole- acétone 7/3, mixer le mélange à l'ultraturax, saponifier (par de la potasse méthanolique) le mélange afin de dégrader les chlorophylles et concentrer l'extrait de pigmente. Reprendre l'échantillon dans 10mL d'éthanol et séparer les pigmenta par HPLC.
L'hydrolysat de protéines de luzerne selon la présente Invention peut être sous la forme d'une solution dans l'eau ou sous la forme solide, notamment d'une poudre.
Dans un mode de réalisation, l'hydro lysat de protéines est sous la forme d'une solution aqueuse, par exemple un sirop. Dans ce mode de réalisation, la solution aqueuse contient de 1 à 79 %, notamment de 1 à 60 %, en particulier environ 50 % de matière sèche par rapport à la masse totale de la solution. Avantageusement, ledit hydrolysat sous forme de solution aqueuse est obtenu à l'issue de l'étape d'hydrolyse du procédé décrit ci-après, avant l'étape de séchage. Un tel sirop peut également être obtenu par dissolution de rhydrolysat sous forme solide, notamment d'une poudre dans l'eau.
La présente invention concerne également dans un mode de réalisation particulier un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide, notamment sous la forme d'un siro p en solution aqueuse. Ledit hydrolysat sous forme liquide peut en particulier être un sirop caractérisé par un taux de matière sèche variant de 56 à 65 % et en particulier de 56,98 et 64,31% de la masse totale du sirop, dans lequel la proportion de minéraux varie de 3 à 27 % de minéraux, notamment de 4et 21 % de la matière sèche et par une teneur en matière azotée protéique variant de 13 à 90 %, notamment de 21 à 85 % de l'extrait sec. Le sirop peut être caractérisé par sa viscosité. Avantageusement, la viscosité d'un sirop à 63 % de matière sèche est de 100 à 500 cP à 500 s-1 et 20 °C. La viscosité à 55°C d'un sirop à 63 % de matière sèche est de 30 à 200 cP à 500 s-1 Dans la présente invention, la viscosité est mesurée selon la méthode suivante : dans un bêcher, on prépare environ 10 g d'une solution aqueuse de protéines à 63% (p/p) de matière sèche. La viscosité est ensuite mesurée sur un viscosimètre AR 1000 avec un cône plan.
Dans un mode de réalisation, l'hydrolysat de protéines est sous la forme solide. Ledit solide comprend de 50 à 100 % de matière sèche, notamment de 90 à 99 % de matière sèche, en particulier environ 95 % de matière sèche. Ledit solide est notamment une poudre ou des granules. Typiquement, la poudre est composée de granules ayant un diamètre variant de 5 à 500 μm, notamment de 7 à 330 μηη.
Le diamètre médian des granules constituant la poudre est en particulier de 30 à 75 μπι. dans la présente invention, la granulométrie de la poudre est déterminée par granulométrie laser eur un appareil de type Coulter, Model optique Fraunhofer, LS30, par voie sèche, sans mode de vibration et sur une durée de 30sec. Les résultats peuvent être lus directement sur l'appareil.
Dans les hydrolysats selon la présente invention, la teneur en matière azotée protéique est d'au moins 20 %, notamment d'au moins 40 % de la matière sèche totale. Avantageusement, la teneur en matière azotée protéique varie de 13 à 90 %, notamment de 21 à 85 % de la matière sèche totale.
Au sens de la présente invention, on entend par « matière azotée protéique » l'ensemble des protides, incluant les acides aminés, polypeptides et protéines. Le pourcentage de matière azotée protéfque peut être déterminé selon la méthode de Kjeldhal, par minéralisation des protides avec de l'acide surfurique (H2SO4) concentré selon la méthodologie suivante :
Détermination de la matière azotée totale : minérallser x grammes d'échantillon durant 2h à 400°C et distiller sur appareil Kjeldahl (Vapodest Gerhardt).
Détermination de l'azote ammoniacal : Distiller x g d'échantillon sur appareil Kjeldahl (Vapodest Gerhardt). Matière azotée protéique : Analyser l'échantillon en azote totale et azote ammoniacal puis calculer la concentration en protéines totales par la formule suivante : (azote totale- azote ammoniacal) x 6,25 et calculer la concentration en protéines insolubles par la formule suivante : protéines totales - protéines solubles. La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne dans lequel la matière azotée protéique comprend :
• 14 à 73 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• 7 à 22 %. de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da, • 8 à 17 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1 000 Da,
• 11 à 59 % de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 5000 Da,
• 1 à 11 % de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da.
Dans un mode de réalisation particulier, la matière azotée protéique comprend : · 35 à 75 %, notamment environ 46 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• 5 à 10 %, notamment environ 9 % de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• 7 à 15 %, notamment environ 12 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1 000 Da,
• 8 à 35 %, notamment envion 28 % de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 5000 Da, 1 à 5 %, notamment environ 5 % de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10 000 Da.Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVrvo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire- La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne dans lequel la matière azotée protéique comprend :
• de 7 à 48%, notamment de 11 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 3 à 46%, notamment de 5 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 7 à 28%, notamment de 11 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
· de 9 à 88%, notamment de 15 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 0,9 à 10%, notamment de 1 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, notamment pour le jus vert : · de 7 à 23%, notamment de 11 à 18% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 3 à 11%, notamment de 5 à 9% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da, • de 7 à 25%, notamment de 11 à 20% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
• de 26 à 88%, notamment de 42 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
· de 1 à 10%, notamment de 2 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, notamment pour le coagulum:
• de 14 à 48%, notamment de 22 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
· de 14 à 46%, notamment de 23 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 8 à 28%, notamment de 13 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
• de 9 à 33%, notamment de 15 à 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 0,9 à 4%, notamment de 1 à 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,
De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne comprend les 20 acidee aminés dans les proportions suivantes de la matière azotée protéique : · une teneur en alanine comprise entre 5,9% et 6,6%,
• une teneur en cystine comprise entre 0,9% et 1 ,1%,
• une teneur en acide aspartique comprise entre 12,0% et 13,9%,
• une teneur en acide glutamique comprise entre 10,4% et 11 ,8%,
• une teneur en phénylalanine comprise entre 4,5% et 5,2%,
• une teneur en glycine comprise entre 4,5% et 5,1%,
• une teneur en htetidine comprise entre 1,9% et 2,2%,
• une teneur en isoleucine comprise entre 4,1% et 4,6%,
• une teneur en lysine comprise entre 5,8% et 6,6%,
• une teneur en leuclne comprise entre 6,7% et 7,3%,
• une teneur en méthionine comprise entre 1 ,5% et 1,7%,
• une teneur en proline comprise entre 4,9% et 5,4%,
• une teneur en arginine comprise entre 4,9% et 5,5%,
• une teneur en sérine comprise entre 4,1% et 4,8%,
• une teneur en thréonine comprise entre 4,6% et 5,3%, • une teneur en valine comprise entre 5,3% et 5,9%,
• une teneur en tryptophane comprise entre 1 ,6% et 1,9%,
• une teneur en t rosine comprise entre 3,6% et 4.1 %.
De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes, en masse de la masse totale de matière azotée protéique :
• une teneur en alanina de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%
• une teneur en cystlne de 0,2% à 1 ,4%, notamment de 0,3% à 1 , 1 %
• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 21 ,3%, notamment de 6,4% à 17,0%
• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 17,3%, notamment de 7,3% à 13,8%
• une teneur en phénylalanine de 1 ,9% à 8,2%, notamment de 3,1% à 6,5%
• une teneur en glycine de 2,0% à 7,7%, notamment de 3,3% à 6,2%
· une teneur en histidine de 0,8% à 3,2%, notamment de 1 ,2% à 2,6%
• une teneur en isoleucine comprise de 1,9% à 7,5%, notamment de 3,0% à 6,0%
• une teneur en lysine de 2,2% à 9,2%, notamment de 3,5% à 7,4%
• une teneur en leucine de 3,0% à 12,5%, notamment de 4,9% à 10,0% · une teneur en môthlonine de 0,6% à 2,9%, notamment de 0,9% à 2,3%
• une teneur en praline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%
• une teneur en arginine de 1 ,2% à 9,0%, notamment de 1 ,9% à 7,2%
• une teneur en serine de 1 ,7% à 6,6%, notamment de 2,8% à 5,2%
• une teneur en thréonine de 1 ,9% à 7,2%, notamment de 3, 1 % à 5,7% · une teneur en valine de 2,4% à 9,3%, notamment de 3,9% à 7,5%
• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 ,1 % à 2,2%
• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 6,4%, notamment de 1 ,9% à 5, 1 %
notamment :pour le jus vert
• une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%
• une teneur en cystine de 0,3% à 1 ,4%, notamment de 0,5% à 1 , 1 %
• une teneur en acide aspartique de 5,6% à 21,3%, notamment de 8,9% à 17,0% • une teneur en acide glutamique de 4,6% à 16,5%, notamment de 7,3% à 13,2%
• une teneur en phénylalanine de 1,9% à 7,1%, notamment de 3,1% à 5,7%
• une teneur en glycine de 2,0% à 7,2%, notamment de 3,3% à 5,8%
• une teneur en histidine de 0,8% à 3,0%, notamment de 1 ,2% à 2,4%
• une teneur en isoleucine de 1,9% à 6,6%, notamment de 3,0% à 5,2%
• une teneur en lysine de 2,2% à 8,8%, notamment de 3,5% à 7,0%
• une teneur en leucine de 3,0% à 11 ,6%, notamment de 4,9% à 9,2%
• une teneur en méthionine de 0,6% à 2,3%, notamment de 0,9% à 1 ,9%
• une teneur en proline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%
• une teneur en arginine de 1 ,2% à 7,4%, notamment de 1 ,9% à 5,9%
• une teneur en serine de 1 ,8% à 6,6%, notamment de 2,9% à 5,2%
• une teneur en thréonine de 1 ,9% à 6,9%, notamment de 3,1 % à 5,6%
• une teneur en valine de 2,4% à 8,2%, notamment de 3.9% à 6,6%
• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 , 1 % à 2,2%
• une teneur en tyrostne de 1 ,2% à 5,6%, notamment de 1 ,9% à 4,5% notamment pour le coagulum:
• une teneur en alanine de 2,8% à 8,9%, notamment de 4,5% à 7,2%
• une teneur en cystine de 0,2% à 0,7%, notamment de 0,3% à 0,6 %
• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 13,8%, notamment de 6,4% à 11,0%
• une teneur en acide glutamique de 5,5% à 17,3%, notamment de 8,9% à 13,8%
• une teneur en phenylalanine de 2,5% à 8,2%, notamment de 4,1% à 6,5%
• une teneur en glycine de 2,5% à 7,7%, notamment de 3,9% à 6,2%
• une teneur en histidine de 1 ,0% à 3,2%, notamment de 1 ,5% à 2,6%
• une teneur en isoleucine de 2,3% à 7,5%, notamment de 3,6% à 6,0%
• une teneur en lysine de 2,8% à 9,2%, notamment de 4,6% à 7,4%
• une teneur en leucine de 4,0% à 12,5%, notamment de 6,4% à 10,0%
• une teneur en méthionine de 0,9% à 2,9%, notamment de 1 ,5% à 2,3%
• une teneur en praline de 2,4% à 7,9%, notamment de 3,9% à 6,3%
• une teneur en arginine de 2,7% à 9,0%, notamment de 4,4% à 7,2%
• une teneur en serine de 1 ,7% à 5,8%, notamment de 2,8% à 4,6%
• une teneur en thréonine de 2,2% à 7,2%, notamment de 3,4% à 5,7%
• une teneur en valine de 2,9% à 9,3%, notamment de 4,7% à 7,5% • une teneur en tryptophane de 0,8% à 2,7%, notamment de 1 ,2% à 2, 1 %
• une teneur en tyrosine de 2,0% à 6,4%, notamment de 3,2% à 5, 1 %
Les hydrolysats obtenus sur j us vert de luzerne selon la présente invention sont caractérisés par le profil moléculaire de la matière azotée protéique à l'Issue de l'hydrolyse enzymatique.
Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVivo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire..
La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne à base de jus vert dans lequel la matière azotée protéique comprend :
• de 7 à 23%, notamment de 11 à 18% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
· de 3 à 11%, notamment de 5 à 9% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 7 à 25%, notamment de 11 à 20% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
• de 26 à 88%, notamment de 42 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da, de 1 à 10%, notamment de 2 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 65 %, avantageusement au moins 85 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 1 000 Da sont comprises dans la matière azotée protéique.
Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 75 %, avantageusement au moins 90 % de molécules de poids moléculaire Inférieur à 10000 Da sont compris dans la matière azotée protéique.
De manière avantageuse, dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Selon un mode de réalisation particulier, au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Dans les hydrolysats selon la présente Invention, la teneur en sels (ou cendres) est de 1 à 25 % de la matière sèche totale. Parmi les cations constituant ces sels, on trouve par exemple Na+. NH4 +, K+, Ca2+ et Mg2+ et parmi les anions constituant ces sels CI-, NO3-, SO4 2- et ΡΟ4 2- .
Les proportions en sels minéraux et oligoéléments des hydrolysats selon la présente invention est donnée dans le tableau suivant (par rapport à la masse brute de l'hydrolysat).
Figure imgf000015_0001
De manière inattendue, les hydrolysats selon la présente invention contiennent des quantités élevées de potassium, de calcium, et de magnésium et en fait une source naturelle de ces minéraux.
De manière encore plus inattendue, les hydrolysats selon la présente invention ont également une teneur en sodium fable. La faible teneur en sodium en fait un ingrédient particulièrement recommandé dans le cadre des régimes pauvres en sodium. Le programme national nutrition santé (PNNS) recommande un apport journalier en sel (chlorure de sodium) de 8g chez l'homme adulte et 6,5 g pour la femme et les enfants. L'Organisation Mondiale de la Santé a pour sa part, mis comme objectif un maximum de 5 g de sel. L'utilisation de l'hydrolysat de l'invention permet d'apporter un goût salé dans les aliments où il est utilisé sans notablement être une source de sodium car la note salée provient principalement du potassium présent dans l'objet de l'invention.
La présente invention concerne donc également des hydrolysats tels que définis ci- dessus, dans lesquels la teneur en sodium est inférieure à 5000 mg kg, notamment inférieure à 2500 mg kg et de préférence de 440 mg kg à 2200 mg/kg par rapport à la matière brute.
La présente invention concerne donc également des hydrolysats tels que définis ci- dessus, dans lesquels la teneur en potassium est de 20 000 mg/kg à 70 000 mg/kg, notamment de 22 000 mg/kg à 60000 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 10 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 13 000 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 2 000 mg/kg à 5 000 mg/kg, notamment de 3 300 mg/kg à 3 600 mg/kg par rapport à la matière brute
.Selon un mode de réalisation avantageux, I' invention concerne un hydrolysat tel que défini ci-dessus dans lequel la teneur en potassium est de 0 mg/kg â 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg/kg à 70 000 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 0 mg/kg â 5400 mg/kg, notamment de 800 mg/kg à 4 300 mg/kg par rapport à la matière brute.
Les hydrolysats selon la présente invention contiennent également du fer, notamment en proportion de 10 à 100 mg / kg, en particulier de 47 à 68 mg/kg.
Les hydrolysats selon la présente invention contiennent également d'autres composants tels que des fibres végétales solubles dans l'eau et des lipides.
Ils contiennent ainsi des sapon!nes, des isoflavones, notamment de 0,001% à 0,015%, en particulier de 0,0102% à 0,0105% (en pourcentage massique par rapport à la masse brute de l'hydrolysat), des phytates, notamment en proportion de 0 à 0,2 %, en particulier de 0,001% à 0,14 % et des L-canavanines, notamment de 0 à 5 mg / kg, en particulier Inférieure à 5 mg / kg.
Dans un mode de réalisation, la teneur en matière azotée protéique est de 25 à 50 %, notamment de 40 à 50 %, de préférence de 45 à 50 % de la matière sèche totale. Dans ce mode de réalisation, l'hydrolysat est avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique du jus vert sans étape d'isolement des protéines préalable à l'étape d'hydrolyse. La teneur en sels (ou cendres) dans l'hydrolysat est de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %.
De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne à base de jus vert comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes, en masse de la masse totale de matière azotée protéique :
• une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%
• une teneur en cysttne de 0,3% à 1 ,4%, notamment de 0,5% à 1 , 1 %
• une teneur en acide aspartique de 5,6% à 21,3%, notamment de 8,9% à 17,0%
• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 16,5%, notamment de 7,3% à 13,2%
• une teneur en phénylalanine de 1 ,9% à 7, 1 %, notamment de 3, 1 % à 5,7%
• une teneur en glycine de 2,0% à 7,2%, notamment de 3,3% à 5,8%
• une teneur en hlstidlne de 0,8% à 3,0%, notamment de 1,2% à 2,4%
• une teneur en isoleucine de 1 ,9% à 6,6%, notamment de 3,0% à 5,2%
• une teneur en lysine de 2,2% à 8,8%, notamment de 3,5% à 7,0%
• une teneur en leucine de 3,0% à 11 ,6%, notamment de 4,9% à 9,2%
• une teneur en méthionine de 0,6% à 2,3%, notamment de 0,9% à 1 ,9%
• une teneur en proline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%
• une teneur en arginine de 1 ,2% à 7,4%, notamment de 1 ,9% à 5,9%
• une teneur en sérine de 1 ,8% à 6,6%, notamment de 2,9% à 5,2%
• une teneur en thréonine de 1,9% à 6,9%, notamment de 3,1% à 5,6%
• une teneur en valine de 2,4% à 8,2%, notamment de 3,9% à 6,6%
• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 , 1 % à 2,2%
• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 5,6%, notamment de 1 ,9% à 4,5%
La présente invention concerne également, dans un premier mode de réalisation particulier, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau sous forme solide, comprenant :
• 20 acides aminés, essentiels et non essentiels,
• 90 à 99 % de matière sèche,
• 45 à 50 % de matière azotée protéique par rapport à la matière sèche totale, comprenant au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• 10 à 20 %, notamment environ 15 % de la matière sèche totale de sels, ledit hydrolysat étant avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique du j us vert, sans étape d'isolement préalable des protéines.
La présente invention a pour deuxième objet un procédé de préparation d'un hydroiysat de luzerne dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents, notamment un hydroiysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau dans lequel 20 acides aminée, essentiels et non-essentiels, sont présents présentant les caractéristiques décrites ci-dessus.
La présente invention concerne en particulier un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, mise en œuvre directement sur le jus vert de luzerne obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment pour obtenir un hydrolysat de protéines sous forme liquide.
Avant le pressage, la luzerne est broyée dans des broyeurs à marteau ou dans des broyeurs à attrftion, de préférence à température ambiante. La luzerne broyée est ensuite avantageusement pressée dans une presse à vis de type presse à oléagineux, de préférence sans contrôle de la température. Le jus de pressage constitue le jus vert.
Au sens de la présente invention, on entend par « mise en œuvre directement sur le Jus vert de luzerne » le fait que le jus vert de luzerne ne subit aucun traitement avant l'étape d'hydrolyse. Le jus vert de luzerne n'ayant subi aucun traitement, la proportion de matière sèche qu'il renferme est celle du jus obtenu suite au pressage de la luzerne. La proportion de matière sèche varie typiquement de 8 à 15 %, et est notamment d'environ 10 %.
Lorsque la matière première de l'étape d'hydrolyse (a) est un jus vert de luzerne, celui-ci comprend avantageusement de 4 à 19 %, notamment 7 à 15 %, de matière sèche, ladite matière sèche étant constituée, en masse par rapport à la masse totale de la matière sèche, de :
■ 30 à 45 %, notamment 35 à 40 %, de protéines
• 10 à 20 %, notamment 13 à 17 % de cendres,
• 5000 à 10000 ppm, notamment 6 000 à 8 000 ppm, de Chlorophylle A
· 6 000 à 12000 ppm, notamment 19 000 à 10000 ppm, de chlorophylle B,
• 50 à 200 ppm, notamment 100 à 150 ppm de néoxanthine,
• 100 à 300 ppm, notamment 200 à 300 ppm de violaxanthine,
• 500 à 1 000 ppm, notamment de 600 à 900 ppm, de lutélne, et • 300 à 600 ppm, notamment 400 à 500 ppm, de bêta carotène.
L'étape d' hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre avec toute enzyme capable de couper les liaisons peptldiques des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, notamment une protéase ou un mélange de protéases. Le terme c protéase » désigne toute enzyme exogène capable d'hydrolyser ladite matière première. Les protéases peuvent être d'origine fongique, animale ou bactérienne.
Ces enzymes peuvent être des enzymes commerciales tel es que la Protex 6L de chez DuPont®, la Protex 20L de chez DuPont®, la Protex 7L de chez DuPont®, la Protex 51 FP de chez DuPont®, ou encore ΑΡ Conc de chez Dyadic®. La protéase peut être une endoprotéase ou une exoprotéase ou un mélange d'une endoprotéase et d'une exoprotéase.
Les Inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que les endoprotéases étaient plus efficaces pour l'hydrolyse des protéines contenues dans le jus vert de luzerne que les exoprotéases. Avantageusement, l'enzyme est donc une endoprotéase. Lorsque l'hydrolysat est destiné à l'alimentation humaine et/ou animale, l'enzyme doit être une protéase dite Food Grade, acceptées par les autorités sanitaires telles que l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA).
Les protéases dites Food Grade répondant à ces critères sont notamment la Protex 6L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor, la Protex 20L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Dyadic. De préférence, il s'agit de rendopeptidase de Bacillus licheniformis Protex 20L commercialisée par Genencor.
L'invention concerne donc, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé de préparation d'un hydrorysat de luzerne tel que défini ci-dessus, soluble dans l'eau, comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, avantageusement avec une endoprotéase notamment choisie parmi les endopeptidases de Bacillus licheniformis sur le jus vert de luzerne
L'enzyme utilisée dans l'étape d'hydrolyse doit également avantageusement répondre à un certain nombre de critères.
L'enzyme doit posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne. L'enzyme doit donc avantageusement permettre l'obtention d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 12 heures, notamment au plus 8h, en particulier d'au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures.
Typiquement, un hydrolysat selon la présente invention aura un degré d'hydrolyse (DH) variant de 14 à 58% préférentiellement de 25 à 58%.
Dans la présente demande et les figures, le degré d'hydrolyse (DH) est défini (en %) comme le nombre de liaisons peptiques hydrolysées (h) sur le nombre de liaison peptiques totales (htot). La relation entre le DH et la consommation de base est donnée par l'équation suivante (Adler-Nfssen, 1982, 1987) :
Figure imgf000020_0001
où B : Consommation de base (en mL) Nb : normalité de la base (N) a : degré de dissociation moyen des groupements α-aminés htot : nombre total de liaisons peptidiques du substrat protéique (méqv/g protéine) Mp : masse de protéine (N x facteur de Kjeidahl) (g).
Cette activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne doit avantageusement être obtenue à une température inférieure à la température de coagulation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne. Avantageusement, l'enzyme doit donc avoir une activité protéolytique à une température inférieure à 80 °C, notamment inférieure à 60°C, de préférence à une température d'environ 55°C.
L'enzyme doit en outre posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne à un pH inférieur au pH de coagulation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne. Avantageusement, l'enzyme dort donc également avoir une activité protéolytique à un pH inférieur à 9,5, notamment à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'enzyme est donc une endoprotéase permettant l'obtention d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 8h, notamment au plus 6 heures, de préférence 5 heures, à un pH inférieur à 9, notamment d'environ 8 et à une température inférieure à 60°C , notamment d'environ 55°C .
Une enzyme permettant la mise en œuvre du procédé dans ces conditions présente notamment des avantages économiques notables. Le pH du jus vert de luzerne étant proche de 5,5, une quantité réduite de base est ajoutée au jus vert de luzerne ou au coagulum pour la mise en œuvre de la réaction. La température de mise en œuvre de cette étape d'hydrolyse étant relativement peu élevée et le temps nécessaire pour obtenir un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat étant relativement court, le procédé est donc moins énergivore.
L'étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une quantité aussi faible que possible d'enzyme par rapport à la matière sèche contenue dans le jus vert. La concentration en protéases dépend de la concentration en protéines de la matière première. La concentration en enzymes est avantageusement de 0,01 à 10 %, avantageusement de 0,03 à 1,75% par rapport à la masse de la matière première. La proportion d'enzyme correspond à la masse d'enzyme par rapport à la masse de jus vert. Lorsque la proportion est de 0,25 %, cela signifie donc que l'on emploie 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert.
Préférentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,25% pour le jus vert. Une proportion de 0,25 % correspond à 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert.
La proportion d'enzyme nécessaire peut également être définie en termes d'activité enzymatique (DU / 100 g). Dans ce cas, la concentration en enzymes est avantageusement de 120000 à 840000 DU pour 100g de substrat) par rapport au poids de la matière première. Préférentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,25% pour ie jus vert (sort environ 100000 DU pour 100g de jus
Dans la présente invention, l'activité en DU est celle donnée par le fournisseur de ladite enzyme. Elle est basée sur l'habilité d'une protéase à cliver les p-nitroanilldes provenant d'un substrat synthétique. Le résultat est une augmentation de l'absorbance à 405nm. Cette augmentation d'absorbance est directement reliée à l'activité protôasique, par le biais d'une courbe étalon établie avec un standard. Si 1mL d'une solution enzymatique à 2% donne une différence d'extinction de 0,400 dans les conditions de l'essai (substrat : caséine, pH 8,5 ; 40°C), la préparation enzymatique a une activité de 1000 DU. De manière préférée, le ratio protéines / enzyme est d'environ 10/1.
Les ratios ci-dessus sont exprimés en masse. Un ratio de 10/1 correspond donc à 10 g de protéines pour 1 g d'enzyme.
L'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement mise en œuvre à pH constant, avantageusement de 7 à 10, notamment de 7,5 à 8,5, par addition d'une base au cours de la réaction d'hydrolyse. La base peut être notamment un hydroxyde, par exemple de calcium, de potassium ou de sodium ou l'ammoniaque. Avantageusement, la base est l'ammoniaque.
L'utilisation de l'ammoniaque permet de réduire la quantité de sels dans le produit final car celui-ci est éliminé lors de l'étape de purification. De manière surprenante, les Inventeurs de la présente invention ont également mis en évidence que l'ammoniaque conduisait à une cinétique d'hydrolyse améliorée par rapport à celle observée avec la soude, toutes les autres conditions réactlonnelles étant identiques.
L'étape d'hydrolyse enzymatique est suivie d'une étape d'inactivation de l'enzyme. Cette étape peut notamment être mise en œuvre par traitement thermique du milieu réactionnel à une température et pendant une durée permettant la dénaturation de l'enzyme. Avantageusement, ladite étape d'inactivation est mise en œuvre à une température d'au moins 85°C , notamment d'environ 90°C . La durée de ce traitement thermique varie en fonction de la quantité et de la nature de l'enzyme. Typiquement el e est de 5 à 30 minutes, en particulier d'environ 10 minutes. Après l'inactivation de l'enzyme, le milieu d'hydrolyse est soumis à une séparation solide / liquide afin de séparer les protéines hydrolysées solubles des protéines insolubles.
Dans la présente Invention, on entend par « milieu d'hydrolyse » la suspension obtenue à l'issue de la réaction d'hydrolyse contenant la matière sèche initialement présente dans le Jus vert et l'enzyme, dénaturée ou non. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence que la centrifugation du milieu d'hydrolyse conduisait à la formation d'un culot contenant les pigments et les matières insolubles dans l'eau. Les protéines solubles contenues dans le surnageant peuvent donc être isolées de manière simple et économique pour donner un hydroiysat sous forme liquide qui peut être concentré, par exemple sous forme d'un sirop, ou séché pour conduire à un hydrolysat sous forme solide.
Au sens de la présente invention, on entend donc par « culot » la matière non soluble isolée à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide et contenant donc la matière non soluble dans l'eau.
Au sens de la présente invention, on entend par < hydrolysat sous forme liquide » le surnageant obtenu à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide.
Cette étape de séparation solide / liquide peut être mise en œuvre selon des méthodes classiques pour l'Homme du Métier. L'hydrolysat sous forme liquide peut, de manière avantageuse, être séparé des solides par séparation dynamique, en particulier par centrifugation et/ou décantation.
De manière très inattendue, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels peut donc être obtenu par simple séparation solide / liquide, telle que la décantation de la réaction d'hydrolyse, notamment par centrifugation, sans étapes impliquant des traitements complexes telles que la chromatographie sur colonne échangeuse d'ions ou l'uKrafiltration. L'hydrolysat sous forme liquide peut subir une étape de concentration afin d'augmenter la quantité de matière sèche dans ledit hydrolysat sous forme liquide.
L' hydrolysat sous forme liquide peut être utilisé tel quel ou bien être séché. Le séchage peut être une lyophilisation ou un séchage de la solution, éventuellement concentrée par atomlsatlon. Lorsque le séchage est réalisé par atomisation, une étape de filtration supplémentaire peut être mise en œuvre afin d'éliminer les éventuelles particules susceptibles de boucher les buses de la tour d'atomisation.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un hydrolysat sous forme liquide, d'un hydrolysat sous forme liquide concentré ou d'un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, à partir du jus vert de luzerne.
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (I) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment â une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (II) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente tel que défini cl-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,
e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide.
La présente invention concerne également un procédé (Ib) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme d'un liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
La présente invention concerne également un procédé (lib) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse ertzymatique du jus de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,
b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C. pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,
e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente.
Dans un troisième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse ertzymatique à pH constant du j us vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8„ l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (masse protéique contenue dans le jus vert) / enzyme étant de de 5/1 à 151 , notamment d'environ 10/1 , le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque, b) inactivatlon de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C, pendant au moins 10 minutes,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique à pH constant du j us vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environs, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (masse protéique contenue dans le jus vert) / enzyme étant de 5/1 à 15/1 , notamment d'environ 10/1, le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque,
b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pendant au moins 10 minutes,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,
e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente. Un troisième objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.
Un quatrième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus.
Un cinquième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.
La présente invention concerne en particulier l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, dans une composition alimentaire.
La composition alimentaire peut être à usage humain ou animal.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation humaine.
Les hydrolysate selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits tels que des barres de céréales, des compléments alimentaires destinés aux sportifs, des pâtisseries, des sucreries, des desserts lactés, en compléments dans des produits camées ou en substituts aux protéines d'origine animales, par exemple dans des substituts de viandes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptfcle d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de PaHmentation animale.
Les hydrolyeats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits destinés au pet food, à l'alimentation du bétail ou à l'aquaculture, notamment en substitution ou en complément de protéines animales et ou végétales.
Les hydrolysats selon la présente invention sont caractérisés par un pouvoir moussant et un pouvoir émulsrfiant très élevés. Le pouvoir émuleifiant des hydrolysats selon la présente invention, notamment à pH4, varie de 50 à 75 %, notamment de 65 à 75 %, et est d'environ 70 %. Le pouvoir moussant des hydrolysats selon la présente invention varie de 20 à 300. Certains hydrolysats ont un pouvoir moussant de l'ordre de 2Θ0 et une stabilité de l'émulsion de près de 80 %. Lesdits hydrolysats peuvent donc être employés pour la préparation d'émulsions alimentaires. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne solubie dans l'eau, comprenant les 20 acides aminés protéogônes, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'agromatériaux, par exemple des colles végétales ou en tant que liant en substitution de résines toxiques. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne solubie dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'ingrédient dans les compositions cosmétiques.
Grâce à leur faible teneur en sodium et leur teneur élevée en sels minéraux tels que le calcium, le magnésium et le potassium, les hydrolysats selon la présente invention peuvent être utilisés en tant que source de sels minéraux dans des comprimés à usage alimentaire, ou en tant qu'ingrédient dans les produits alimentaires utilisés dans les régimes alimentaires pauvres en sodium.
Les hydrolysats selon la présente invention peuvent également être, en raison de leur note salée, utilisés en tant qu'exhausteurs de goût.
La présente invention concerne donc également l'utiïsation d'un hydrolysat selon la présente invention, notamment cf un hydrolysat dans lequel la teneur en potassium est de 5 500 mg/kg à 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg kg à 69 600 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 495 mg/kg à 5 400 mg/kg, notamment de 792 mg/kg à 4320 mg/kg par rapport à la matière brute en tant qu'exhausteur de goût, en particulier en tant que substitut au sel (NaCI), de préférence dans des produits alimentaires destinés à des régimes hyposodés. Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVivo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire..
Dans un autre mode de réalisation, la teneur en matière azotée protéique est de 55 à 80 %, notamment de 65 à 80 %, en particulier de 75 â 80 %. Dans ce mode de réalisation, l'hydrolysat est avantageusement obtenu à partir d'un coagulum dee protéines du Jus vert La teneur en sels (ou cendres) dans l'hydrolysat est de 1 â 10 %, notamment d'environ 6 %.
Les hydrolysats obtenus sur coagulum de luzerne selon la présente invention sont caractérisés par le profil moléculaire de la matière azotée protéique à l'issue de l'hydrolyse enzymatique. La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne à base de coagulum dans lequel la matière azotée protéique comprend :
• de 14 à 48%, notamment de 22 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 14 à 46%, notamment de 23 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 8 à 28%, notamment de 13 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
· de 9 à 33%, notamment de 15 à 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 0,9 à 4%, notamment de 1 à 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,
• De manière avantageuse, ledit hydrolysat de protéines de luzerne à base de coagulum comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes de la matière azotée protéique : une teneur en alanine de 2,8% à 8,9%, notamment de 4,5% à 7,2% une teneur en cystine de 0,2% à 0,7%, notamment de 0,3% à 0,6 % une teneur en acide aspartique de 4,0% à 13,8%, notamment de 6,4% â 11,0%
une teneur en acide glutamique de 5,5% à 17,3%, notamment de 8,9% à 13,8% • une teneur en phénylalanine de 2,5% à 8,2%, notamment de 4,1% à 6,5%
• une teneur en glycine de 2,5% à 7,7%. notamment de 3,9% à 6,2%
• une teneur en histlcflne de 1,0% à 3,2%, notamment de 1 ,5% à 2,6%
• une teneur en isoleucine de 2,3% à 7,5%, notamment de 3,6% à 6,0% · une teneur en lysine de 2,8% à 9,2%, notamment de 4,6% à 7,4%
• une teneur en leucine de 4,0% à 12,5%, notamment de 6,4% à 10,0%
• une teneur en méthionine de 0,9% à 2,9%, notamment de 1 ,5% à 2,3%
• une teneur en proline de 2,4% à 7,9%, notamment de 3,9% à 6,3%
• une teneur en arginine de 2,7% à 9,0%, notamment de 4,4% à 7,2%
· une teneur en serine de 1 ,7% à 5,8%, notamment de 2,8% à 4,6%
• une teneur en thréonine de 2,2% à 7,2%, notamment de 3,4% à 5,7%
• une teneur en valine de 2,9% à 9,3%, notamment de 4,7% à 7,5%
• une teneur en tryptophane de 0,8% à 2,7%, notamment de 1,2% à 2,1%
• une teneur en tyrosine de 2,0% à 6,4%, notamment de 3,2% à 5, 1 %, Dans un mode de réalisation, l'hydrolysat de protéines est sous la forme solide. Ledit solide comprend de 50 à 100 % de matière sèche, notamment de 90 à 99 % de matière sèche, en particulier environ 95 % de matière sèche. Ledit solide est notamment une poudre ou des granules. Typiquement, la poudre est composée de granules ayant un diamètre variant de 5 à 700 μιτι, notamment de 200 à 500 μm. Le diamètre médian des granules constituant la poudre est en particulier de 200 à 500 um. dans la présente invention, la granulométrie de la poudre est déterminée par granulométrie laser sur un appareil de type Coulter, Model optique Fraunhofer, LS30, par voie sèche, sans mode de vibration et sur une durée de 30sec. Les résultats peuvent être lus directement sur l'appareil. Les proportions en sels minéraux et ollgoèléments des hydrolysats selon la présente invention avec est donnée dans le tableau suivant (par rapport à la masse brute de l'hydrolysat).
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De manière inattendue, les hydrolysats selon la présente invention contiennent des quantités élevées de potassium, de calcium, et de magnésium et en fait une source naturelle de ces minéraux. De manière encore plus inattendue, les hydrolysats selon la présente invention ont également une teneur en sodium faible. La faible teneur en sodium en fait un ingrédient particulièrement recommandé dans le cadre des régimes pauvres en sodium. Le programme national nutrition santé (PNNS) recommande un apport journalier en sel (chlorure de sodium) de 8g chez l'homme adulte et 6,5 g pour la femme et les enfants. L'Organisation Mondiale de la Santé a pour sa part, mis comme objectif un maximum de 5 g de sel. L'utilisation de l'hydrolysat de l'invention permet d'apporter un goût salé dans les aliments où il est utilisé sans notablement être une source de sodium car la note salée provient principalement du potassium présent dans l'objet de l'invention.
La présente invention concerne également dans un deuxième mode de réalisation particulier, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau sous forme solide, comprenant :
• 20 acides aminés, essentiels et non essentiels,
• 90 à 99 % de matière sèche, • 32 à 90 % de matière azotée protéique par rapport à la matière sèche, comprenant au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 7 %, de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• 1 à 10 %, notamment environ 6 % de la matière sèche totale de sels. l'hydrolysat étant avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique d'un coagulum des protéines du jus vert.
La présente invention a pour deuxième objet un procédé de préparation d'un hydrolysat de luzerne dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents, notamment un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents présentant les caractéristiques décrites ci-dessus.
La présente invention concerne en particulier un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, mise en œuvre sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment pour obtenir un hydrolysat de protéines sous forme liquide.
Avant le pressage, la luzerne est broyée dans des broyeurs à marteau ou dans des broyeurs à attrition, de préférence à température ambiante. La luzerne broyée est ensuite avantageusement pressée dans une presse à vis de type presse à oléagineux, de préférence sans contrôle de la température. Le jus de pressage constitue le jus vert. Au sens de la présente invention, on entend par « coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne * la fraction solide obtenue par précipitation des protéines contenues dans le jus vert par aicallnisatlon du Jus vert à un pH supérieur à 7, notamment de 7 à 8, de préférence de 7,3 à 7,5 et injection de vapeur à une température supérieure à 80°C , notamment à une température d'environ 85°C . Le coagulum, au sens de la présente invention, est donc un mélange de protéines blanches et de protéines vertes de luzerne, contrairement à la demande de brevet FR 2 876 389, dans lequel l'hydrolyse est mise en œuvre sur les protéines blanches de luzerne, contenues dans le filtrat obtenu consécutivement à une étape d'alcalinlsation et d'injection de vapeur.
Le coagulum doit être suspendu dans l'eau avant l'étape d'hydrolyse et amené à un pH approprié pour la réaction d'hydrolyse. La proportion de coagulum dans l'eau est avantageusement de 10 à 20 %, en particulier d'environ 15 %. Lorsque la proportion de matière sèche est inférieure à 10 %, une quantité d'eau importante doit être éliminée lors des étapes de purification de l'hydrolysat entraînant ainsi des coûts plus Importants. Lorsque la proportion de matière sèche est supérieure à 20 %, la viscosité est trop élevée, la régulation du pH est très difficile et l'hydrolyse est moins efficace à conditions équivalentes.
Le coagulum contenant une proportion moindre de sels (ou cendres}, il est avantageux de l'utiliser pour la préparation d'hydrolysats contenant une proportion moindre de sels (ou cendres), notamment inférieure à 10 % de la matière sèche de l'hydrolysat.
Lorsque la matière première de l'étape d'hydrolyse (a) est un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, celui-ci comprend avantageusement, avant d'être suspendu dans de l'eau, 23 à 7Θ %, notamment 37 à 64 %, de matière sèche, ladite matière sèche étant constitué, en masse par rapport à la masse totale de la matière sèche, de :
• 17 à 84 %, notamment 28 à 67 %, de protéines
• 4 à 28%, notamment 7 à 23 % de cendres,
• 3 100 à 22500 ppm, notamment 5080 à 18 000 ppm, de Chlorophyl e A
• 1 900 à 8 200 ppm, notamment 3 000 à 7000 ppm, de chlorophylle B,
« 0 à 1500 ppm, notamment 50 à 400 ppm de néoxanthine,
• 0 à 1 500 ppm, notamment 50 à 400 ppm de violaxanthlne,
« 100 à 7 000 ppm, notamment de 500 à 1 000 ppm, de lutéine, et
• 100 à 4 000 ppm, notamment 500 à 1 500 ppm, de béta carotène.
Ledit coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus de luzerne est donc remis en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, avant l'étape d'hydrolyse.
L'étape d'hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre avec toute enzyme capable de couper les liaisons peptidiques des protéines contenues dans le jus vert de luzerne ou le coagulum, notamment une protéase ou un mélange de protéases. Le terme c protéase » désigne toute enzyme exogène capable d'hydrolyser ladite matière première. Les protéases peuvent être d'origine fongique, animale ou bactérienne.
Ces enzymes peuvent être des enzymes commerciales telles que la Protex 6L de chez DuPont®, la Protex 20L de chez DuPont®, la Protex 7L de chez DuPont®, la Protex 51 FP de chez DuPont®, ou encore l'AP Conc de chez Dyadic®. La protéase peut être une endoprotéase ou une exoprotéase ou un mélange d'une endoprotéase et d'une exoprotéase. Les Inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que les endoprotéases étaient plus efficaces pour l'hydrolyse des protéines contenues dans le coagulum que les exoprotéases. Avantageusement, l'enzyme est donc une endoprotéase.
Lorsque l'hydrolysat est destiné à l'alimentation humaine et/ou animale, l'enzyme doit être une protéase dite Food Grade, acceptées par les autorités sanitaires telles que l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA).
Les protéases dites Food Grade répondant à ces critères sont notamment la Protex 6L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor, la Protex 20L (endopeptidase de BacilIus licheniformis,) commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Dyadic. De préférence, il s'agit de l'endopeptidase de Bacillus licheniformis Protex 20L commercialisée par Genencor.
L'invention concerne donc, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé de préparation d'un hydrolysat de luzerne tel que défini ci-dessus, soluble dans l'eau, comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, avantageusement avec une endoprotéase notamment choisie parmi les endopeptidases de Bacillus licheniformis sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne.
L'enzyme utilisée dans l'étape d'hydrolyse doit également avantageusement répondre à un certain nombre de critères. L'enzyme doit posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne. L'enzyme doit donc avantageusement permettre l'obtention d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 12 heures, notamment au plus 8h, en particulier d'au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures.
Typiquement, un hydrolysat selon la présente invention aura un degré d'hydrolyse (DH) variant de 10 à 58% préférentiellement de 14 à 58%. Dans la présente demande et les figures, le degré d'hydrolyse (DH) est défini (en %) comme le nombre de liaisons peptiques hydrolysées (h) sur le nombre de liaison peptiques totales (htot). La relation entre le DH et la consommation de base est donnée par réquation suivante (Adler-Nissen, 1982, 1Θ87) :
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où B : Consommation de base (en ml Nb : normalité de la base (N) a : degré de dissociation moyen des groupements α-aminés Mot : nombre total de liaisons peptidiques du substrat protéique (méqv/g protéine) Mp : masse de protéine (N x facteur de Kjeldahl) (g).
Cette activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 30 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne doit avantageusement être obtenue à une température inférieure à la température de coagulation des protéines contenues dans le coagulum. Avantageusement l'enzyme doit donc avoir une activité protéolytique à une température inférieure à 80°C , notamment inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C.
L'enzyme doit en outre posséder une activité protéolytique permettant (a formation d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne à un pH inférieur au pH de coagulation des protéines contenues dans le coagulum. Avantageusement, l'enzyme doit donc également avoir une activité protéolytique à un pH inférieur à 9,5, notamment à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8.5.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'enzyme est donc une endoprotéase permettant l'obtention d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 30 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 8h, notamment au plus 6 heures, de préférence 5 heures, à un pH inférieur à Θ, notamment d'environ 8.5 et à une température inférieure à 60°C , notamment d'environ 55°C.
L'étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une quantité aussi fable que possible d'enzyme par rapport à la matière sèche contenue le coagulum. La concentration en protéases dépend de la concentration en protéines de la matière première. La concentration en enzymes est avantageusement de 0,01 à 10 %, avantageusement de 0,03 à 1,75% par rapport à la masse de la matière première. La proportion d'enzyme correspond à la masse d'enzyme par rapport à la masse de coagulum. Lorsque la proportion est de 0,25 %, cela signifie donc que l'on emploie 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert ou de coagulum.
Préfêrentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,42% pour le coagulum.
La proportion d'enzyme nécessaire peut également être définie en termes d'activité enzymatique (DU / 100 g). Dans ce cas, la concentration en enzymes est avantageusement de 120000 à 840 000 DU pour 100g de substrat) par rapport au poids de la matière première.
Préfêrentiellement, la proportion d'enzyme est 0,42% pour le coagulum soit environ 185000 DU pour 100g de coagulum dilué). Dans la présente invention, l'activité en DU est celle donnée par le fournisseur de ladite enzyme. Elle est basée sur l'habilité d'une protéase à civer les p-nitroanllldes provenant d'un substrat synthétique. Le résultat est une augmentation de l'absorbance à 405nm. Cette augmentation crabsorbance est directement reliée à l'activité protéaslque, par le biais d'une courbe étalon établie avec un standard. Si 1mL d'une solution enzymatique à 2% donne une différence d'extinction de 0,400 dans les conditions de l'essai (substrat : caséine, pH 8,5 ; 40°C), la préparation enzymatique a une activité de 1000 DU.
Lorsque le coagulum est le substrat, le ratio protéines / enzyme varie de 5/1 à 130/1, notamment de 10/1 à 100/1, en particulier de 20/1 à 60/1.
De manière préférée, le ratio protéines / enzyme est d'environ 60/1. Les ratios ci-dessus sont exprimés en masse. Un ratio de 60/1 correspond donc à 60 g de protéines pour 1 g d'enzyme.
L'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement mise en œuvre à pH constant, avantageusement de 7 à 10, notamment de 7,5 à 8,5, par addition d'une base au cours de la réaction d'hydrolyse. La base peut être notamment un hydroxyde, par exemple de calcium, de potassium ou de sodium ou l'ammoniaque. Avantageusement, la base est l'ammoniaque.
L'utilisation de l'ammoniaque permet de réduire la quantité de sels dans le produit final car celui-ci est éliminé Ions de l'étape de purification. De manière surprenante, les Inventeurs de la présente invention ont également mis en évidence que l'ammoniaque conduisait à une cinétique d'hydro lyse améliorée par rapport à celle observée avec la soude, toutes les autres conditions réactionnelles étant identiques. L'étape cf hydrolyse enzymatique est suivie d'une étape dlnactivation de l'enzyme. Cette étape peut notamment être mise en œuvre par traitement thermique du milieu réactionnel à une température et pendant une durée permettant la dénaturation de l'enzyme. Avantageusement, ladite étape d'inactivation est mise en œuvre à une température d'au moins 85°C , notamment d'environ 90°C . La durée de ce traitement thermique varie en fonction de la quantité et de la nature de l'enzyme. Typiquement elle est de 5 à 30 minutes, en particulier d'environ 10 minutes.
Après l'inactivation de l'enzyme, le milieu d'hydrolyse est soumis à une séparation solide / liquide afin de séparer les protéines hydrolysées solubles des protéines insolubles. Dans la présente invention, on entend par « milieu d'hydrolyse » la suspension obtenue à l'issue de la réaction d'hydrolyse contenant la matière sèche initialement présente dans le coagulum et l'enzyme, dénaturée ou non.
Les Inventeurs ont en effet mie en évidence que la centrifugation du milieu d'hydrolyse conduisait à la formation d'un culot contenant les pigments et les matières Insolubles dans l'eau. Les protéines solubles contenues dans le surnageant peuvent donc être isolées de manière simple et économique pour donner un hydrolysat sous forme liquide qui peut être concentré, par exemple sous forme d'un sirop, ou séché pour conduire à un hydrolysat sous forme solide.
Au sens de la présente invention, on entend donc par « culot » la matière non soluble isolée à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide et contenant donc la matière non soluble dans l'eau.
Au sens de la présente invention, on entend par « hydrolysat sous forme liquide > le surnageant obtenu à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide.
Cette étape de séparation solide / liquide peut être mise en œuvre selon des méthodes classiques pour l'Homme du Métier. L'hydrolysat sous forme liquide peut, de manière avantageuse, être séparé des solides par séparation dynamique, en particulier par centrifugation et/ou décantation.
De manière très inattendue, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels peut donc être obtenu par simple séparation solide / liquide, telle que la décantation de la réaction d'hydrolyse, notamment par centrifugation, sans étapes impliquant des traitements complexes telles que la chromatographie sur colonne echangeuse d'ions ou l'ultrafiltration. L'hydrolysat sous forme liquide peut subir une étape de concentration afin d'augmenter la quantité de matière sèche dans ledit hydrolysat sous forme liquide. L" hydrolysat sous forme liquide peut être utilisé tel quel ou bien être séché. Le séchage peut être une lyophilisation ou un séchage de la solution, éventuellement concentrée par atomisation. Lorsque le séchage est réalisé par atomisation, une étape de filtration supplémentaire peut être mise en œuvre afin d'éliminer les éventuelles particules susceptibles de boucher les buses de la tour d'atomisation.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un hydrolysat sous forme liquide, d'un hydrolysat sous forme liquide concentré ou d'un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, à partir d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (I) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : e) hydrolyse enzymatique du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubte s et l'enzyme,
f) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
g) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
h) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop. Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (II) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : f) hydrolyse enzymatique du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,
g) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
h) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
i) éventuellement concentration de l'hydrolysat pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,
j} séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide.
La présente Invention concerne également un procédé (la) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme d'un liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment de composition tel que défini ci-dessus, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne soluWes et l'enzyme,
b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
La présente invention concerne également un procédé (Ma) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,
b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C, de préférence 90 *C, pour obtenir un miDeu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot, d) éventuellement concentration de Γ hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,
e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente.
Lorsque l'étape d'hydrolyse est mise en œuvre sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, le procédé défni ci-dessus comprend en outre les étapes permettant de préparer ledit coagulum de : a) pressage de la luzerne, pour obtenir un jus vert de luzerne et un tourteau de luzerne,
b) alcalinisation du jus vert de luzerne et injection de vapeur pour coaguler les protéines contenues dans fe jus de luzerne,
c) décantation des protéines coagulées pour obtenir le coagulum,
d) éventuellement séchage du coagulum pour obtenir un coagulum riche en matière sèche,
e) mise en suspension du coagulum, éventuellement séché pour obtenir un coagulum en suspension dans l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %.
Dans un premier mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus de luzerne, en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolyttque permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protôique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60 °C, de préférence à une température d'environ 55°C , à un pH constant, notamment Inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8,5, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (matière protélque contenue dans le Jus vert) / enzyme étant de 20/1 à 60/1 , de préférence d'environ 60/1 , le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pendant au moins 10 minutes,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrtfugatton, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55°C , à un pH constant, notamment inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8,5, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (matière azotée contenue dans le jus vert) / enzyme étant de 20/1 à 60/1, de préférence d'environ 60/1 , le pH étant maintenu constant par rajout d'une base, de préférence l'ammoniaque,
b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C , de préférence 90°C , pendant au moins 10 minutes,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré,
e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente. Un troisième objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.
Un quatrième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus.
Un cinquième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.
La présente invention concerne en particulier l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolyeat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, dans une composition alimentaire.
La composition alimentaire peut être à usage humain ou animal.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation humaine.
Les hydrolysats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits tels que des barres de céréales, des compléments alimentaires destinés aux sportifs, des pâtisseries, des sucreries, des desserts lactés, en compléments dans des produits carnées ou en substituts aux protéines d'origine animales, par exemple dans des substituts de viandes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation animale.
Les hydrolysats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits destinés au pet food, à l'alimentation du bétail ou à l'aquaculture, notamment en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales.
Les hydrolysats selon la présente invention sont caractérisés par un pouvoir moussant et un pouvoir émulslflant très élevés. Le pouvoir émulsifiant des hydrolysats selon la présente Invention, notamment à pH4, varie de 50 à 75 %, notamment de 65 à 75 %, et est d'environ 70 %. Le pouvoir moussant des hydrolysats selon la présente invention varie de 20 à 300. Certains hydrolysats ont un pouvoir moussant de l'ordre de 290 et une stabilité de l'émulsion de près de 80 %. LesdKs hydrolysats peuvent donc être employés pour la préparation d'émulsions alimentaires. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant les 20 acides aminés protéogènes, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'agromatériaux, par exemple des colles végétales ou en tant que liant en substitution de résines toxiques. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans Peau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'ingrédient dans les compositions cosmétiques.
Grâce à leur faible teneur en sodium et leur teneur élevée en sels minéraux tels que le calcium, le magnésium et le potassium, les hydrolysats selon la présente invention peuvent être utilisés en tant que source de sels minéraux dans des comprimés à usage alimentaire, ou en tant qu'ingrédient dans les produits alimentaires utilisés dans les régimes alimentaires pauvres en sodium.
Les hydrolysats selon la présente invention peuvent également être, en raison de leur note salée, utilisés en tant qu'exhausteurs de goût.
La présente invention concerne donc également l'utilisation d'un hydrolysat selon la présente invention, notamment d'un hydrolysat dans lequel la teneur en potassium est de 5 500 mg/kg à 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg/kg à 69 600 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 495 mg/kg à 5400 mg/kg, notamment de 792 mg/kg à 4320 mg/kg par rapport à la matière brute en tant qu'exhausteur de goût, en particulier en tant que substitut au sel (NaCI), de préférence dans des produits alimentaires destinés à des régimes hyposodés. La Figura 1 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec les protéases dites Food Grade Protex 6L commercialisée par Genencor, Protex 20L commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus llcheniformis) commercialisée par Dyadic à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 8 maintenu par addition de soude en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes.
La Figura 2 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec les protéases dites Food Grade Protex 6L commercialisée par Genencor, Protex 20L commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis) commercial sée par Dyadic à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 9,5 maintenu par addition de soude en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes.
La Figura 3 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de la soude ou de l'ammoniaque.
La Figure 4 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec la protéase Protex 20L commerciai sée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.
La Figura 5 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le coagulum suspendu dans l'eau à 10 % de matière sèche avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.
La Figure 6 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur ie coagulum suspendu dans l'eau à différents taux de matière sèche avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.
La Figure 7 représente les rendements de production à partir du jus vert de luzerne ou du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne. La Figura 8 représente la composition en matière sèche, en cendres (ou sels) et en protéines d'un hydrolysat préparé à partir du jus vert de luzerne ou du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne.
La Figure 9 représente la répartition massique de la taille en Dalton des acides aminés, protéines et peptides dans différents hydrolysats réalisés au laboratoire selon la présente invention et suivant la méthode analytique ARD.
La Figure 9 bis représente la répartition massique de la taille en Dalton des acides aminés, protéines et peptides dans différents hydrolysats réalisé au stade pilote selon la présente invention et suivant la méthode analytique In Vivo Lab.
La Figure 10 représente l'aminogramme d'une poudre de peptides selon la présente invention en comparaison avec le lait demi-écrémé et le concentré de protéines de luzerne commercialisé sous la dénomination Luzixine® (CPL). La Figure 11 représente la proportion de matière insoluble d'un essai de solubilisation de 25 % de protéines de jus vert de luzerne (JV), d'un hydrolysat de protéines de jus vert de luzerne (poudre JV) ou d'un hydrolysat d'un coagulum (poudre coagulum).
Exemples : Matière première Issue de la luzerne
La matière première peut-être le jus vert de luzerne ou le coagulum de luzerne (tableau 1).
Le jus vert présente une matière sèche entre 8 et 13%, une concentration en protéines entre 28 et 35% de la matière sèche, une teneur en minéraux entre 15 et 19% de la matière sèche, une concentration en chlorophylles totales entre 6000 et 11000ppm de la matière sèche, une concentration en carotônoides (B-carotène) entre 200 et 500ppm de la matière eèche et une concentration en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) entre 600 et 1200ppm de la matière sèche.
La décantation centrifuge permet l'élimination d'une partie de l'eau et des minéraux contenue dans le jus vert. Le coagulum ainsi obtenu se trouve ainsi enrichi en protéines. Le coagulum présente donc une matière sèche plus importante que le jus vert entre 46 et 53%, une teneur en protéines entre 35 et 56% de la matière sèche et une teneur en minéraux entre 9 et 19% de la matière sèche. De même que le jus vert le coagulum est riche en pigments de type chlorophylles, xanthophylles et caroténoTdes.
Figure imgf000047_0001
Exemple 1 : Choix de l'enzyme Les essais ont permis d'identifier trois enzymes particulièrement efficaces pour effectuer la réaction d'hydrolyse enzymatlque du jus vert et du coagulum. Il s'agit de la Protex 6L, de la Protex 20L et de la protéase AP conc.
L'hydrolyse enzymatique a été étudiée avec ces trois enzymes à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10 à 55 °C et à des pH de 8 et 9,5. Les résultats sont présentés dans les Figures 1 et 2.
A pH = 9,5, qui correspond au pH optimal de fonctionnement de l'enzyme, le degré d'hydrolyse dépasse les 30 %.
A pH = 8, le degré d'hydrolyse est inférieur de plus de 5 %. Compte tenu de la quantité de NaOH nécessai re pour atteindre un tel pH, l'hydrolysat obtenu contient une proportion de sels très importante.
Un pH de 8 est donc préférable pour minimiser la quantité de sels dans l'hydrolysat de protéines.
Exemple 2 : Choix de la base L'hydrolyse enzymatique a été évaluée avec deux basée différentes, la soude et l'ammoniaque, à la température de 65°C , pH = 8 et avec un ratio matière protéique / enzyme de 1/10.
Les résultats sont présentés dans la Figure 3. L'ammoniaque, dont l'utilisation avait initialement été envisagée pour réduire la quantité de sels dans l'hydrolysat s'avère la base de choix pour réaliser la réaction d'hydrolyse enzymatique. L'ammoniaque permet en effet d'améliorer le rendement de l'hydrolyse de plus de 5 % à pH = 8, qui n'est pas le pH optimum de fonctionnement de l'enzyme.
Exemple 3 : Choix du ratio matière protéique / enzyme pour le Jus vert et le coagulum
Une série d'essais a été effectuée pour déterminer la dose optimale d'enzyme pour l'hydrolyse des protéines du jus vert. Le pH a été fixé à 8 et la température à 55°C. Six doses (rapport massique enzyme substrat protéique) ont été testées.
Les résultats sont présentés dans la Figure 4. Le degré d'hydrolyse varie entre 18% et 28% en fonction de la dose d'enzyme utilisée. Le rapport enzyme substrat de 1/10 permet d'obtenir la meilleure hydrolyse (28%). Une perte de 3 points de degré d'hydrolyse est observée avec la dose d'enzymes juste inférieure de 1/15. La dose la plus faible de 1/90 entraine une perte de 10 points de DH. Le rapport enzyme/substrat pour l'hydrolyse du jus vert est donc de préférence de 1/10. Une série d'essais a été également été effectuée pour déterminer la dose optimale d'enzyme pour l'hydrolyse du coagulum. Le pH a été fixé à 8, la température à 55"C et le coagulum a été remis en solution à 10%MS. Cinq doses (rapport massique enzyme substrat) ont été testées.
Les résultats sont présentés en figure 5. Une dose entre 1/20 et 1/60 permet d'obtenir un degré d'hydrolyse de 23%. Une dose plus faible entre 1/130 et 1/250 permet l'hydrolyse de 17% des protéines du coagulum de luzerne. La dose optimale d'enzyme est donc un rapport enzyme/substrat de 1/60.
Cette dose inférieure à celle nécessaire pour l'hydrolyse du jus vert s'explique certainement par la présence moindre d'impuretés dans le coagulum, impuretés pouvant être à l'origine d'une inhibition de l'enzyme. Exemple 4 : Choix du taux de matière sèche dans le coagulum
Afin d'étudier la concentration en substrat, quatre concentrations en matière sèche ont été testées. L'ensemble des hydrolyses a été effectué à pH = 8, 55 °C et avec un rapport massique enzyme/substrat protéique de 1/25 (excès d'enzymes). Les résultats sont présentés dans la Figure 6.
La viscosité du coagulum à 25% MS est trop importante, la régulation du pH est très difficile. Cette concentration pourrait ne pas être traitée industriellement car les transferts de chaleur et de matière (alcali) ne seraient pas gérables.
Les meilleurs résultats d'hydrolyse sont obtenus avec un coagulum à 15%MS, dans ces conditions te degré d'hydrolyse est de 29%. A 20%MS, le degré d'hydrolyse diminue de 6 points (cf figure 13). La concentration en matière sèche optimale du coagulum pour son hydrolyse est de 15%MS.
Exemple S : Traitement de la réaction d'hydrolyse Suite à l'hydrolyse, le produit obtenu est un mélange de protéines non solubles, de peptidee solubles, de pigments (chlorophylles et xanthophylles) et de sels. Par simple décantation du produit d'hydrolyse, un culot de couleur verte se forme.
L'ensemble du jus vert ou du coagulum hydrolysé a donc été centrifugé pendant 15 min à 4080G et à 4°C. L'analyse de ce culot montre qu'il contient des protéines et des pigments.
Figure imgf000050_0001
La technique la plus simple et la moins coûteuse permettant de séparer les peptides solublee des protéines restées insolubles et des pigments est donc la centrifugation. Exemple 6 : Séchage de l'hydrolyeat
Après l'étape de séparation, le produit peut ensuite subir des opérations pour être facilement transportable à moindre coût, conservable et formulable (Incorporable dans des préparations alimentaires par exemple). Pour l'aspect conservation et transport à moindre coût, il faut réduire l'humidité du produit donc le concentrer. Pour l'aspect formulation, la forme poudre (à condition qu'elle soit soluble) est appréciée en agro- alimentaire car elle permet une incorporation facile dans la totalité des produits. En tenant compte de l'ensemble de ces contraintes, les deux opérations unitaires à ajouter au procédé sont la concentration par évaporation et l'atomisation.
Les rendements des procédés à partir du jus vert ou du coagulum sont présentée dans le tableau 3 et dans la Figure 7.
Figure imgf000051_0001
En termes de rendement, il est préférable de mettre en œuvre le procédé à partir du jus vert de luzerne.
La composition physico-chimique des poudres de peptides du jus vert et de coagulum a également été déterminée. Les compositions sont données dans le tableau 4bls. Les proportions des composants d'intérêt (protéines et minéraux) dans les hydrolysats sont données dans la Figure 8.
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
m Le profil peptidique dee poudres a également été étudié par SDS Page. Les profils peptidiques (suivant la méthode analytique ARD), des productions laboratoire, sont identiques pour trois des lots testés. Seul un lot de coagulum (production 2) a un profil légèrement différent, explicable par une étape d'hydrolyse incomplète. Les résultats sont présentés sur la Figure 9.
Les peptldes de taille inférieure à 100 Da représentent 70% des peptides des quatre lots de poudres testés. L'autre taille de peptides représentant 20% des peptides, ont une taille entre 1000 et 500 Da. Peu de peptides ont une taille supérieure à 5000 Da, représentant 5% des peptides ayant une talle entre 5000 et 60000 Da. Les hydrolysats de protéines contiennent donc une grande partie de peptides facilement assimilables et sont donc parfaitement adaptés à l'alimentation humaine et animale.
Le profil peptidique (suivant la méthode analytique INZO), des productions pilote, a également été déterminé. Les résultats sont présentés en Figure 9bls.
L'aminogramme des poudres a également été déterminé afin de confirmer la présence de l'ensemble des acides aminés protéogènes et leurs proportions dans l'hydroiysat.
Les résultats sont présentés dans la Figure 10.
Les hydrolysats de protéines de luzerne selon la présente invention contiennent bien les huit acides aminés essentiels, mais aussi les vingt acides aminés protéogènes.
(Exemple comparatif : Hydrolyse acide chimique du coagulum de luzerne Dans un pot shott de 250 ml, 10g de coagulum sont ajoutés à 90g d'eau osmosée ét ajusté à pH à 5 avec de l'acide sulfurique 1 N. Le pot fermé est placé dans un baln-marie à sec 2h à 70°C. Le pot est ensuite refroidi à température ambiante et centrifugé dans une centrifugeuse de type RC12BP+ (thermoscientJfic) à 4000G pendant 5 min. 2 phases sont obtenues, le culot (la phase inférieure) et la phase liquide (phase supérieure). La phase liquide (surnageant) est récupérée et analysée.
L'hydrolyse acide détruit le tryptophane et transforme en acide les fonctions amides de ia glutamine et de l'asparagine pour donner du glutamate et de l'aspartate.
L'analyse chimique du surnageant obtenu est le suivant :
• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): - entra i et 10% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000 Da - entre 40et 60% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000 Da
- entre 40 et 60% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500 Da
- entre 10 et 21% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300 Da
- entre 4 et 30% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da. · la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 10 et 15% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 40 et 50% sur l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 100ppm et 500ppm de l'extrait sec
• la teneur en caroténoîdes (β-carotône) est comprise entre 1 ppm et 20ppm de l'extrait sec · la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 100ppm de l'extrait sec
L'hydrolyse chimique en milieu acide conduit à un produit dans lequel la matière sèche azotée représente une proportion moindre. En outre, on observe une forte hausse des cendres. Exemple 7.1 : Etude de la solubilité des poudres
La méthode choisie est la norme COSEX STAN 295 -2009 (Appendice A). La méthode décrite à l'Appendice A dans la Loi sur les nonnes alimentaires en vigueur en Corée améliore la « méthode officielle AOAC 950.66 ».
La solubilité des poudres a été testée une fois celles-ci remise en solution dans de l'eau osmosée à une concentration massique allant de 1 % jusqu'à 25%. Cette concentration de 25% a été choisie car elle mime les concentrations en protéines maximales retrouves dans les produits alimentaires.
La solubilité de ces poudres a été comparée à celle du jus vert atomisé et remis en solution dans de l'eau (alimentaire) également à une concentration massique de 25%. Ces poudres sont remises en solution entre 1 et 25% massique dans de l'eau osmosée.
La solution est centrifugée à 4000G 5min.
Des pesées et analyses de matière sèche, d'azote total et d'azote ammoniacal sont réalisées sur la solution et le surnageant. Le calcul du pourcentage de solubilité des protéines est le suivant : quantité (azote total - azote ammoniacal) dans le surnageant / quantité (azote total - azote ammoniacal) dans la solution * 100.
Lee résultats sont présentés dans la Figure 11. Le pourcentage d'insoluble, dans du jus vert de luzerne atomisé en solution dans de l'eau à 25%, est de 30%. Suite au procédé d'hydrolyse, ce pourcentage est nul. L'hydrolyse permet donc d'obtenir des protéines de luzerne solubles.
[Exemple 7.2 : Exemples d'hydrolysats de protéines obtenus du Jus de luzerne : Méthode de détermination du pouvoir émulsiflant Matériels :
• Homogénéiseur Polytron PT 3100
• Béchers ou pilullers
• (Balance de précision
• Agitateurs magnétiques
· Centrifugeuse â 530G Tubes à centrifuger
• pH mètre
• HCI ou NaOH 0,1N
• Huile de tournesol.
Protocole : Dans un pilulier, environ 10 g d'une solution aqueuse de protéines à 1% sont préparés et le volume exact A est noté.
Cette solution est mise sous agitation magnétique et le pH ajusté à la valeur choisie avec une solution HCI ou NaOH 0,1N puis laissée sous agitation lente pendant 1h. le pH est réajusté à la valeur choisie si nécessaire. Le môme volume A d'huile de tournesol est ajouté, en tenant compte de sa densité (108,4mL d'huile = 95,3g) et l'émulsion est formée dans le Polytron pendant 1min â la vitesse maximum (24000tr/min).
L'émulsion est versée dans un tube à centrifuger qui est centrifugé à 530G pendant 5min. Les volumes respectifs d'huile, d'émulsion et d'eau sont notés. Le résultat est exprimé en pourcentage de chaque phase par rapport au volume total. Il s'agit donc d'une comparaison du pouvoir émulsifiant de différentes solutions pro télques à 1%. Méthode de détermination du pouvoir moussant Matériels : · Eprouvette thermostatée de 10OOmL
• Régulateur de température
• Eprouvette de 100mL
• Eprouvette de 500mL
• Ampoule à décanter avec trait de jauge de 1000mL
· Support
• Chronomètre.
Protocole :
700mL d'une solution à 1% de protéines sont préparés avec de l'eau osmosée. Une éprouvette et la solution de protéines sont chauffées à 25°C puis 50mL de la solution sont versés dans l'éprouvette. L'ampoule est ajustée au trait de jauge avec la solution puis 500mL sont versés dans l'ampoule. Les 500 mL de solution sont mis à couler dans l'éprouvette en 3min.
La hauteur de ia mousse est mesurée pendant 20 minutes à intervalles réguliers (0-1-2-3-5- 10-15 et 20 min). La capacité moussante correspond à la hauteur de la mousse à T0 et la stabilité est déterminée par l'équation (hauteur de mousse à T20)-(hauteur de mousse à T0) x100.
(Exemple 7.2.1.
Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque. La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.
Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90"C pendant une durée de 10 minutes.
Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :
• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD) :
- entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
- entre 15 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
- entre 10 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
- entre 7 et 11 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da
- entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire Inférieur à 300Da
• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec
• ta teneur en caroténoïdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :
• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,
• propriété moussante : capacité moussante de 20
• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.
Exemple 7.2.2.
Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 25°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque.
La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 25°C et pendant une durée de 5h.
Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.
Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :
• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
o entre 13 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
o entre 9 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da
o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire Inférieur à 300Da
• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec
• la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 48ppm de l'extrait sec
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :
• solubilité : solubie au pH compris entre 2 et 11 ,
• propriété moussante : capacité moussante de 290 et stabilité de 79%
• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.
Exemple 7.2.3.
Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque.
La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de Θ, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 1h. Après 1h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes. Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisatlon.
L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :
• le profil peptkJique (suivant la méthode analytique ARD) : o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
o entre 11 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
o entre 8 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da
o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da
• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec
• la teneur en caroténoTdes (B-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :
• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,
• propriété moussante : capacité moussante de 20
• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.
[Exemple 7.2.4.
Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55"C et le pH est ajusté à 6 avec de l'ammoniaque.
La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 6, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h. Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.
Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.
L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :
• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
o entre 10 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
o entre 8 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da
o entre 48 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da
• la teneur en matière azotée protéique ((Nt ~ Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de rextrait sec
• la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :
• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,
• propriété moussante : capacité moussante de 150
• propriété émulsrfiante : phase émulsion de 68%.
Exemple 7.2,5. Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque. La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.
Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.
Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.
L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par lyophilisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :
• le profil peptJdique (suivant la méthode analytique ARD) : o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
o entre 15 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
o entre 10 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da
o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da.
• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec
• la teneur en caroténoïdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (iutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 46ppm de l'extrait sec
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :
• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,
• propriété moussante : capacité moussante de 20
• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.
Exemple 9 : coagulum Le jus vert de luzerne, de pH compris entre 5,8 et 6,2 est neutralisé ou légèrement alcalinisé par ajout d'une solution de potasse jusqu'à pH 7,0-8,0.
Ce jus est monté à une température de 85eC, en moins de 5 minutes, par une Injection de vapeur directe type lyre, avec un temps de contact minimum de 20s. Un précipité se forme, précipité nommé coagulum.
Le coagulum protéique produit est séparé des eaux mères (ou sérum) par décantation centrifuge à un débit de 30 à 55t/h.
Le coagulum, dilué à 15%MS dans l'eau, est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8,5 avec de l'ammoniaque.
La protéase est ajoutée à raison de 0,42% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8,5, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.
Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes. Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.
La phase liquide est ensuite retraitée sur centrifugeuse autodebourbeuee. L'hydrolysat est concentre sous vide puis séché par atomisation, L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant : · le profil peptidique (suivant la méthode analytique INZO) :
- entre 1 et 4% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da
- entre 9et 32% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da
- entre 8 et 28% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da
- entre 14 et 46% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300 Da - entre 14 et 48% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da.
• la teneur en matière azotée protêique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 32% et 95% de l'extrait sec
• la teneur en minéraux est comprise entre 3% et 9% de l'extrait sec
• la teneur en chlorophylles est comprise entre 60ppm et 940ppm de l'extrait sec
· la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 11ppm et 211ppm de l'extrait sec
• la teneur en xanthophylles (lutéine, nôoxanthtne et violaxanthine) est comprise entre 20ppm et 225ppm de l'extrait sec
- l'amlnogramme :une teneur en alanine notamment de 2,8% à 8,9% sur protéines - une teneur en cystine notamment de 0,2% à 0,7% sur protéines
- une teneur en acide aspartique notamment de 4% à 13,9% sur protéines - une teneur en acide glutamique notamment de 5,5% à 17,3% sur protéines
- une teneur en phênylalanine notamment de 2,6% à 8,2% sur protéines
- une teneur en glycine notamment de 2,5% à 7,7% sur protéines
- une teneur en histidine notamment de 1 ,0% à 3,2% sur protéines
- une teneur en isoleucine notamment de 42,3% à 7,5% sur protéines
- une teneur en lysine notamment de 2,8% à 9,2% sur protéines
- une teneur en leucine notamment de 4% à 12,5% sur protéines
- une teneur en méthionine notamment de 0,9% à 2,9% sur protéines
- une teneur en proline notamment de 2,4% à 7,9% sur protéines
- une teneur en arginine notamment de 2,7% à 9,0% sur protéines
- une teneur en sérine notamment de 1 ,7% à 5,8% sur protéines
- une teneur en thréonlne notamment de 2,2% à 7,2% sur protéines
- une teneur en valine notamment de 2,9% à 9,3% sur protéines
- une teneur en tryptophane notamment de 0,8% à 2,7% sur protéines
- une teneur en tyrosine notamment de 2,0% à 6,4% sur protéines.
L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydroiysat est la suivante :
• solubilité : soluble au pH compris entre 5 et 8,
• propriété moussante : capacité moussante comprise entre 20 et 40
• propriété émulstfiante : pas de propriété
Exemple 8 : utilisation des hydrolysats selon la présente Invention :
La méthode utilisée pour la mesure de la force de collage aux exemples 8.1, 8.2 et 8.3 est la suivante :
La poudre d'hydrolysat est diluée dans de l'eau osntosée aux proportions 1/3 (hydrolyeat /eau, masse/masse) à 20°C, ce mélange est laissé maturé de 1h à 24h à température ambiante. Cette dilution est ensuite disposée sur la phase lisse à encoller d'une feuille de papier vinyl de 190 grammes sur une surface de 10 cm2 (préalablement dessinée sur la feuille d'une largeur de 2 cm et d'une longueur de 5 cm) à l'aide d'une spatule. Une autre feuflle de papier vinyl est disposée au-dessus de celle-ci. Ces deux feuilles ainsi collées sont mises à sécher dans une étuve de type Memmert à 45"C pendant une durée aHant de 1h à 24h. Les feuilles ainsi collées sont ensuite accrochées à une planche. Un dispositif (panier) permettant d'introduire des poids est ainsi attaché à la feulle de papier vinyl. Des poids sont Introduits dans le panier jusqu'à arrachement par pelage de la feuille collée par la luzerne. Le panier est ensuite pesé. Le poids ainsi déterminé est rapporté à la quantité de luzerne introduite et comparé avec d'autres échantillons travaillés dans des conditions similaires.
Exemple 8.1 : Colle végétale (non formulée)
La poudre d'hydrolysat, obtenue tele que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse masse) à 20°C, ce mélange est laissé maturé de 1h à 24h à température ambiante. La colle ainsi obtenue démontre une force de collage de 0,088 kg/cm2 pour 1g de produit sec (contre 0,380 kg/cm2 pour 1g de produit sec de colle en tube type UHU; 0,072 kg cm2 pour 1g de produit sec de type colle à base d'amidon gélatinisée et 0,130 kg/cm2 pour 1g de produit sec de colle à base de farine gélatinisée). Exemple 8.2 : Colle végétale formulée avec du bicarbonate de soude
La poudre cPhydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse/masse) à température ambiante (20°C). A ce mélange est ajouté 6 à 7 % de bicarbonate de soucie (poudre). Ce mélange est laissé maturé de 1 h à 24h à température ambiante. La colle ainsi obtenue démontre une force de colage de 0,097 kg cm2 pour 1g de produit sec.
(Exemple 8.3 : Colle végétale avec formulation urée
La poudre d'hydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse/masse) à température ambiante (20eC). A ce mélange est ajouté 6 à 7 % d'urée (poudre). Ce mélange est laissé maturé de 1 h à 24h à température ambiante.
La colle ainsi obtenue démontre une force de collage de 0.105 kg/cm2 pour 1g de produit sec.
Exemple 8.4 : Utilisation en tant que tenseur :
La poudre d'hydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions comprises entre 1 et 10% (hydrolysat /eau, masse masse) à température ambiante (20°C).
Des brins de laine sont trempés dans ces solutions pendant 15 minutes à température ambiante. Les brins sont ensuite déposés et séchés à température ambiante sur une potence (24h minimum). Une longueur de fil est mesurée à tO (avant trempage) et à t final (après trempage et séchage), les résultats sont donnés en pourcentage d'étirement du fil :
Figure imgf000065_0001
Exemple 8.5 : Préparation d'un gâteau au chocolat
Dans une casserole, 200g de chocolat Type pâtissier dessert et 100g de beurre coupé en morceaux (de type doux 60% M. G.) sont fondus à feu très doux. Dans un saladier, 100g de sucre blanc (type sucre de betterave en poudre), 3 œufs de poule, et 50g de farine de blé sont mélangés jusqu'à homogénéisation totale. Le mélange chocolat/beurre est ajouté au mélange précédent et mélangé jusqu'à homogénéisation totale. A ce mélange sont ajoutés, 9g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, et 6g de levure chimique (de type poudre à lever de tête). L'ensemble est mélangé jusqu'à homogénéisation totale.
Ce mélange est versé dans un moule pâtissier préalablement beurré et fariné. Le moule est alors placé au four, préalablement préchauffé à Thermostat 6 (180°C), pendant 45minutes à 180°C.
Exemple 8.6 : Préparation d'une guimauve 25g de sirop de glucose base blé et 250g de sucre cristallisé blanc de betterave sont placés dans une casserole et sont cuits jusqu'à 130°C, une fois cette température atteinte, le jus obtenu est incorporé à 75g de blanc d'œufs de poule. Le tout est mélangé au batteur ménagé (type phillips HR 1459/00). A pari 4 feui les de gélatine alimentaire d'origine porcine sont recouvertes d'eau froide pendant 10minutes puis les feuilles sont essorées à la main et ajoutées à 10 gouttes de sirop de fraise. Ce mélange est incorporé au mélange précédent 1 cuillère à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, est ajoutée à ce dernier mélange. L'ensemble est mélangé jusqu'à homogénéisation totale, avec un batteur ménagé (type phillips HR 1459/00).
Le tout est mis dans un moule, préalablement recouvert d'un mélange d'amidon de pommes de terre en poudre et de sucre glace (1 cuillère d'amidon et 4 cuillères de sucre glace). Le tout est laissé 3h à 20°C puis 1 nuit à 4°C. Exemple 8.7 : préparation d'une soupe
Quatre pommes de terre rouges de montagne de type chair ferme de variété Rosabelle, 4 carottes, ½ aubergines, 1 oignon jaune, 150 g de tomate sont nettoyés, pelés et découpés en dés. L'ensemble est placé dans une casserole avec un peu d'huile et fait revenir pendant 15minutes, puis 1 ,5L d'eau minérale et un cube de légumes (type bouquet garni). Le tout est chauffé durant 1 h à feu doux avant d'être mixé mixeur de type moulinex DD1001 41 turbomix plus, une pincée de sel (type sel marin) et 37g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont ajoutés à la préparation finale. Exemple 8.8 : préparation d'une barre de céréales protéinée 2 œufs de poule, 2 cuillères à café d'huile de tournesol alimentaire (de type Lesieur), 4 cuillères à soupe de miel liquide (de type toutes fleurs), 250g de muesli (de type croustillant fruits), 2 cuillères à café de chocolat en poudre de type pur cacao et 4 cuillères à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés jusqu'à homogénéisation.
Le mélange est déposé sur une plaque, afin d'obtenir une couche uniforme et compacte de 2 cm. La plaque est mise au four 15min à thermostat 6.
Exemple 8.9 : préparation d'une crème dessert 30g de maïzena, 30g de sucre roux et 50cl de lait demi-écrémé de vache à 4"C sont mélangés jusqu'à homogénéisation et fouettés. 100g de chocolat pâtissier coupés en petits morceaux sont incorporés à la préparation précédente et l'ensemble est chauffé afin de faire fondre le chocolat, après ajout de 4g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, l'ensemble est mélangé jusqu'à épaississement. Le tout est réservé à 4°C. Exemple 8.10 : préparation d'un yaourt au café protélné 1L de lait entier de vache, 1 yaourt nature non sucré de type Danone, 2 cuillères à café d'arôme de café liquide de type Vahiné, 4 cuillères à soupe de sucre cristallisé blanc de betterave sont mélangés jusqu'à homogénéisation à 2 cuillères à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6. L'ensemble est placé dans des ramequins placés dans une yaourtière durant 12h de type (type Heru) à 30°C.
Exemple 8.11 : préparation de ketchup 131g d'oignons jaunes, 7g de gousse d'ail sont épluchés, l'ensemble est ajouté à 1 123g de tomates rouges bien mûres et l'ensemble est coupé grossièrement. L'ensemble est placé 30minutes dans une casserole sous feu vif, tout en remuant régulièrement afin d'éviter que le mélange n'accroche. Le mélange cuit est passé au moulin à légumes afin d'obtenir un coulis. 7CI de vinaigre d'alcool coloré, 1 clou de girofle et une pincée de piment de Cayenne sont mélangés à ce coulis avant d'être cuit 45minutes dans une casserole, ou jusqu'à réduction de la moitié du volume, et ce afin d'obtenir une consistance sirupeuse. L'ensemble est mixé afin d'obtenir un mélange homogène. 60g de cassonade sont mélangés à la préparation avant d'être remis sur le feu durant 15minutes, toujours en remuant régulièrement afin que le mélange n'accroche pas. 3g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés à 179g du mélange précédent L'ensemble est réservé 3-4 jours à 4°C avant consommation. Dans cette recette l'hydrolysat remplace le sel et le poivre. Exemple 8.12 : préparation d'une mayonnaise 21.5g de jaune d'oeuf de poule et 9.2g de moutarde de dljon « fine et forte » sont mélangés avant incorporation progressive d'huile de tournesol afin de faire monter la mayonnaise. A 50g de ce mélange, 1g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés. Le tout est réservé à 4°C avant dégustation.

Claims

REVENDICATIONS 1. Hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels.
2. Hydrolysat selon la revendication 1 , sous forme liquide comprenant avantageusement de 1 à 79 % en masse de matière sèche, notamment de 1 à 60 % de matière sèche, en particulier environ 50 % de matière sèche par rapport à la masse totale de l'hydrolysat ou sous forme solide, en particulier d'une poudre, comprenant avantageusement de 80 à 100 % en masse de matière sèche, notamment de 90 à 99 % de matière sèche, en particulier environ 95 % de matière sèche par rapport à la masse totale de l'hydrolysat.
3. Hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel la teneur en matière azotée protéique est d'au moins 20 %, notamment d'au moins 40 % en masse de la masse de matière sèche.
4. Hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la matière azotée protéique comprend :
• de 7 à 48%, notamment de 11 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 3 à 46%, notamment de 5 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 7 à 28%, notamment de 11 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
• de 9 à 88%, notamment de 15 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 0,9 à 10%, notamment de 1 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, notamment :
• de 7 à 23%, notamment de 11 à 18% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 3 à 11%, notamment de 5 à 9% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 7 à 25%, notamment de 11 à 20% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da, • de 26 à 88%, notamment de 42 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 1 à 10%, notamment de 2 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, ou notamment :
• de 14 à 48%, notamment de 22 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,
• de 14 à 46%, notamment de 23 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,
• de 8 à 28%, notamment de 13 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,
• de 9 à 33%, notamment de 15 à 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,
• de 0,9 à 4%, notamment de 1 à 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,
5. Hydrolysat selon Tune des revendications 1 à 4, comprenant les 20 acides aminés dans les proportions suivantes, en masse de la masse totale de matière azotée protéique :
· une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%
• une teneur en cystine de 0,2% à 1 ,4%, notamment de 0,3% à 1 , 1 %
• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 21 ,3%, notamment de 6,4% à 17,0%
• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 17,3%, notamment de 7,3% à 13,8%
• une teneur en phénylalanine de 1,9% à 8,2%, notamment de 3,1% à 6,5% · une teneur en glycine de 2,0% à 7,7%, notamment de 3,3% à 6,2%
• une teneur en histidine de 0,8% à 3,2%, notamment de 1 ,2% à 2,6%
• une teneur en isoleucirte comprise de 1 ,9% à 7,5%, notamment de 3,0% à 6,0%
• une teneur en lysine de 2,2% à 9,2%, notamment de 3,5% à 7,4%
• une teneur en leucine de 3,0% à 12,5%, notamment de 4,9% à 10,0%
· une teneur en méthlonlne de 0,6% à 2,9%, notamment de 0,9% à 2,3%
• une teneur en prollne de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%
• une teneur en arginine de 1 ,2% à 9,0%, notamment de 1 ,9% à 7,2%
• une teneur en sérine de 1 ,7% à 6,6%, notamment de 2,8% à 5,2%
• une teneur en thréonine de 1 ,9% à 7,2%, notamment de 3,1 % à 5,7% • une teneur en valine de 2,4% à 9,3%, notamment de 3,9% à 7,5%
• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 ,1% à 2,2%
• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 6,4%, notamment de 1 ,9% à 5,1% notamment :
• une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%
• une teneur en cystine de 0,3% à 1 ,4%, notamment de 0.5% à 1 , 1 %
• une teneur en acide aspartique de 5,6% à 21,3%, notamment de 8,9% à 17,0%
• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 16,5%, notamment de 7,3% à 13,2%
• une teneur en phénylalanine de 1 ,9% à 7,1%, notamment de 3,1% à 5,7%
• une teneur en glycine de 2,0% à 7,2%, notamment de 3,3% à 5,8%
• une teneur en histidine de 0,8% à 3,0%, notamment de 1 ,2% à 2,4%
• une teneur en isoleucine de 1 ,9% à 6,6%, notamment de 3,0% à 5,2%
• une teneur en lysine de 2,2% à 8,8%, notamment de 3,5% à 7,0%
• une teneur en leucine de 3,0% à 11 ,6%, notamment de 4,9% à 9,2%
• une teneur en méthionine de 0,6% à 2,3%, notamment de 0,9% à 1 ,9%
• une teneur en proline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%
• une teneur en arginine de 1 ,2% à 7,4%, notamment de 1 ,9% à 5,9%
• une teneur en sértne de 1 ,8% à 6,6%, notamment de 2,9% à 5,2%
• une teneur en threonlne de 1,9% à 6,9%, notamment de 3,1% à 5,6%
• une teneur en valine de 2,4% à 8,2%, notamment de 3,9% à 6,6%
• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 , 1 % à 2,2%
• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 5,6%, notamment de 1 ,9% à 4,5% ou notamment :
• une teneur en alanine de 2,8% à 8,9%, notamment de 4,5% à 7,2%
• une teneur en cystine de 0,2% à 0,7%, notamment de 0,3% à 0,6 %
• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 13,8%, notamment de 6,4% à 11 ,0%
• une teneur en acide glutamique de 5,5% à 17,3%, notamment de 8,9% à 13,8%
• une teneur en phenylalanine de 2,5% à 8,2%, notamment de 4, 1 % à 6,5%
• une teneur en glycine de 2,5% à 7,7%, notamment de 3,9% à 6,2%
• une teneur en histidine de 1 ,0% à 3,2%, notamment de 1 ,5% à 2,6%
• une teneur en isoleucine de 2,3% à 7,5%, notamment de 3,6% à 6,0%
• une teneur en lysine de 2,8% à 9,2%, notamment de 4,6% à 7,4%
• une teneur en leucine de 4,0% à 12,5%, notamment de 6,4% à 10,0% une teneur en méthionine de 0,9% à 2,9%, notamment de 1 ,5% à 2,3% une teneur en praline de 2,4% à 7,9%, notamment de 3,9% à 6,3% une teneur en arglnlne de 2,7% à 9,0%, notamment de 4,4% à 7,2% une teneur en serine de 1 ,7% à 5,8%, notamment de 2,8% à 4,
6% une teneur en thréonine de 2,2% à 7,2%, notamment de 3,4% à 5,7% une teneur en valine de 2,9% à 9,3%, notamment de 4,7% à 7,5% une teneur en tryptophane de 0,8% à 2,7%, notamment de 1 ,2% à 2,1% une teneur en tyrosine de 2,0% à 6,4%, notamment de 3,2% à 5,1%
8. Hydrolysat selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la teneur en potassium est de 0 mg/kg à 87 000 m g/kg, notamment de 8 800 m g/kg à 70 000 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 0 mg/kg à 5 400 mg/kg, notamment de 800 mg/kg à 4300 mg/kg par rapport à la matière brute.
7. Hydrolysat selon la revendication 6, dans lequel la teneur en sodium est inférieure à 5000 mg/kg, notamment inférieure à 2500 mg/kg et de préférence de 440 mg/kg à 2200 mg/kg par rapport à la matière brute.
8. Procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne solubJe dans l'eau comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels, comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, avantageusement avec une endoprotéase notamment choisie parmi les endopeptidases de BacHlus llcheniformis sur le jus vert de luzerne ou sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'enzyme permet l'obtention d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 12 heures, notamment au plus 8h, en particulier d'au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures.
10. Procédé selon Furie des revendications 8 ou 9, dans lequel l'étape d'hydrolyse est mise en œuvre à pH constant, avantageusement de 7 à 10, notamment de 7,5 à 8,5, par addition d'une base telle qu'un hydroxyde ou l'ammoniaque, avantageusement l'ammoniaque.
11. Procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme d'un liquide ou d'un sirop selon l'une des revendications 8 à 10, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un jus vert de luzerne ou d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse constitué d'une fraction solide contenant des protéines insolubilisées et d'une fraction liquide contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C , de préférence 90 °C , pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.
12. Procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente selon l'une des revendications 8 à 11 , comprenant les étapes de :
a) hydrolyse enzymatique d'un jus vert de luzerne ou d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse constitué d'une fraction solide contenant des protéines insolubilisées et d'une fraction liquide contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré,
e) séchage hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide.
13. Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, comprenant les étapes de : hydrolyse enzymatlque à pH constant d'un jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse constitué d'une fraction solide contenant des protéines insolubilisées et d'une fraction liquide contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C, de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (protéine contenue dans le jus vert) / enzyme étant de 5/1 à 15/1, notamment d'environ 10/1, le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque,
inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pendant au moins 10 minutes,
séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge, notamment par décantation, voire par centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré,
séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomieation pour obtenir un hydrolysat sous forme solide.
Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, comprenant les étapes de : hydrolyse enzymatique à pH constant d'un coagulum de luzerne dilué à 15% MS pour obtenir un milieu d'hydrolyse constitué d'une fraction solide contenant des protéines insolubilisées et d'une fraction liquide contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60 °C, de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8,5, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (protéine contenue dans le coagulum) / enzyme étant de 20/1 à 80/1, notamment d'environ 60/1 , le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pendant au moins 10 minutes,
c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,
d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré,
séchage de l'hydrolysat sous forme Bquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation pour obtenir un hydrolysat sous forme solide 15. Utilisation d'un hydrolysat de protéines selon l'une des revendications 1 à 7, dans des compositions alimentaires, notamment en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales ou dans des compositions destinées à l'alimentation animale (pet food, alimentation bétail, aquaculture...), notamment en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales ou en tant qu'exhausteur de goût, notamment pour donner une note salée, dans des produits alimentaires. 16. Utilisation d'un hydrolysat de protéines selon l'une des revendications 1 à 7, pour la préparation d'agromatériaux tels que des col es végétales ou des résines. 17. Utilisation d'un hydrolysat de protéines selon l'une des revendications 1 à 7, en tant qu'ingrédient dans les compositions cosmétiques, telles que des shampooings.
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