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Cette invention se rapporte aux complexes cobalamine- peptide, à leur préparation et à leur extraction.
On sait que la cyanocobalamine et les autres cobalamines dans lesquelles le radical cyano est remplacé par un autre radical comme par exemple l'hydroxocobalamine, ont une valeur thérapeutique considérable dans le traitement de l'anémie pernicieuse., particu- lièrement lorsqu'elles sont administrées au patient par voie paren- térale, et qu'elles sont beaucoup moins actives lorsqu'elles sont prises par voie-orale.
En fonction de cette considération on admet que la présen- ce d'une autre substance, souvent désignée par le terme "facteur intrinsèque" est nécessaire dans les cas d'anémie pernicieuse pour
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permettre l'absorption efficace de ces cobalamines par -roie or@@@ On considère en général, dans la littérature consacrée ce sujet, que ce facteur serait de nature protéinique et présenterait un poids moléculaire élevé, et que pour être efficace, il devrait être capable de se lier à la cobalamine ce qui éviterait ainsi la destruction de cette dernière dans le système digestif et favorise- rait donc son abs@rption dans l'organisme.
Divers essais ont été effectués dans le but d'isoler à partir de sources animales une substance convenable de haut poids moléculaire qui présenterait'une activité de "facteur intrinsèque"; c'est ainsi que par exemple des extraits de muqueuse gastrique de porc ont été utilisés avec de la cyanocobalamine. Le résultat des essais cliniques n'est toutefois pas entièrement satisfaisant.
D'autres traitements de l'anémie pernicieuse par voie orale sont liés à l'usage d'une dose relativement importante d'extraits bruts de foie ou de la cyanocobalamine elle-même. C'est pourquoi le traitement actuellement utilisé est presque exclusivement un trai- tement par injections avec tous les dangers et toutes les difficul- tés que cela peut comporter. De plus, la préparation de solutions injectables'est relativement difficile et coûteuse.
Un des buts de la présente invention est d'apporter un procédé'de préparation de produits améliorés contenant de la co- balamine, qui soient actifs dans le traitement de l'anémie perni- cieuse lorsqu'ils sont administrés par voie orale.
C'est ainsi que la présente invention apporte un procéda de préparation d'un complexe cobalamine-peptide, qui comporte la dégradation d'un produit de fermentation microbienne contenant de la cobalamine jusqu'à ce que ce produit devienne actif par voie orale- dans le traitement de l'anémie pernicieuse.
La dénomination "complexe cobalamine-peptide", telle qu'elle est utilisée ici, désigne une substance contenant un groupe peptide lié à un groupe cobalamine, défini ci-après, ou un mélange de ces substances.
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Il n'est pas nécessaire pour l'usage clinique de la pré- sente invention que le complexe de cette invention soit isolé, bien qu'il soit préférable qu'il en soit ainsi. C'est pourquoi cette in- vention comporte, outre les procédés de préparation de ces complexes les procédés de fabrication de certaines préparations qui en con- tiennent.
Le groupe cobalamine du complexe peut être de la cyano- cobalamine c'est-à-dire de la vitamine B12, ou une cobalamine qui peut être transformée en cyanocobalamine par l'action des ions cyanure, comme par exemple l'hydroxocobalamine, c'est-à.-dire la vitamine B12bou encore une cobalamine qui se distingue des b cobalamines précédentes par les substituants du cycle benzénique de la fraction benzimidazole de la cobalamine, comme par exemple le dérivé de la cobalamine ayant un groupe 5-hydroxybenzimidazole, c'est-à-dire le facteur III, ou encore une cobalamine dans laquelle la partie benzimidazole de la molécule est remplacée par une partie naphtimidazole. La cobalamine doit être non toxique et être active contre l'anémie pernicieuse lorsqu'elle est administrée par voie parentérale.
Pour manifester une activité contre l'anémie pernicieuse, dans un traitement par voie orale, le complexe cobalamine-peptide (ou en général les différents composés dont le complexe est un mélange), doit avoir un poids moléculaire inférieur à 15.000 environ.
Le poids moléculaire peut être déterminé par les techni- ques habituelles, comme par exemple la détermination de la constante de sédimentation dans une ultra-centrifugeuse, la diffusion, la dialyse, à travers des membranes semi-perméables dont la dimension des pores est connue, ou la mesure du rapport du poids de la partie cobalamine au poids de la partie peptide dans le complexe, comme par exemple le procédé qui sera décrit ci-après- Comme le poids moléculaire de la cyanocobalamine elle-même est de 1350, les com- plexes cobalamine-peptide de la présente invention présentent un poids moléculaire généralement supérieur à.
2000 environ, bien que
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des complexes de poids moléculaire moins élevé., comme par @@emple 1500,, peuvent également être efficaces dans le traitement par voie orale de l'anémie pernicieuse. Le domaine de poids moléculaire que l'on choisit de préférence est compris entre 2000 et ll.OOC environ
Les complexes préparés suivant cette invention présentent des poids moléculaires relativement peu élevés, comme le montre l'essai de dialyse décrit ci-dessous.
En dialysant une certaine quantité du complexe obtenu à partir d'une culture de Streptomyces ATCC 11072, décrit dans l'exemple 1, on observe que le produit migre à travers une membrane de "Cellophane" ayant un diamètre moyen des pores de 24 AngstrÖm, qui le sépare de l'eau pure, mais qu'il ne migre pas à travers la même membrane qui le sépare d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium contenant 60 parties en poids de sel pour 100 parties en poids d'eau. La cyanocobalamine elle-même, à approximativement la même concentration, diffuse librement à travers la membrane qui la sépare d'une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de la même con- centration.
Les échantillons de complexes cyanocobalamine-peptide préparés par les procédés décrits dans les exemples de 1 à 5, sont soumis aux essais de détermination des poids de cyanocobalamine et de peptide dans ces complexes. Si l'on admet que le rapport en mole de la cyanocobalamine au peptide est de 1/1 et que le poids molécu- laire de la cyanocobalamine est de 1350, les poids moléculaires des complexes sont .ceux qui sont indiqués dans le tableau qui suit:
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EMI5.1
<tb> N <SEP> du <SEP> Préparé <SEP> comme <SEP> dans <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> Poids
<tb> com- <SEP> l'exemple <SEP> cyanoco- <SEP> peptide <SEP> moléplexe <SEP> balamine <SEP> ;
<SEP> poids/ <SEP> culaire
<tb> HPP <SEP> % <SEP> poids/ <SEP> poids <SEP> calculé
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<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> (Streptomyces
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EMI5.2
ATCC 11072)¯",r," 3¯7 6 .):.5.illL..-
EMI5.3
<tb> 4 <SEP> 3 <SEP> (Propionibacté-
<tb>
<tb>
<tb> rium <SEP> freudenreichii) <SEP> 13,2 <SEP> 86,8 <SEP> 10. <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> 4A <SEP> 3 <SEP> (après <SEP> précipita-
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> à <SEP> l'acétone) <SEP> 15,8 <SEP> 84,2 <SEP> 8.600
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<tb> 5 <SEP> 4 <SEP> (Streptomyces
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<tb> ATCC <SEP> 11072) <SEP> 14,1 <SEP> 85,9 <SEP> 9.
<SEP> 550
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<tb>
<tb> 5A <SEP> 4 <SEP> (après <SEP> précipita-
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> à <SEP> l'acétone) <SEP> 29,3 <SEP> 70,7 <SEP> 4.600
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 5 <SEP> (Propionibacté-
<tb>
<tb>
<tb> rium <SEP> freudenreichii) <SEP> 13,4 <SEP> 67,5 <SEP> 8.100
<tb>
Le comportement à l'hydrolyse acide ou alcaline et le spectre d'absorption dans le visible et l'ultra-violet sont d'autres propriétés caractéristiques des complexes de cette invention. Ces propriétés sont décrites ci-dessous.
Après hydrolyse dans de l'acide chlorhydrique 6N en tube scellé pendant 24 heures du complexe cyanocobalamine-peptide issu d'une culture de Streptomyces ATCC 11072 comme décrit dans l'exemple 1 on obtient un mélange hydrolyse dont l'analyse par chromatographie sur papier, en utilisant comme solvants de développement les systé- mes phénol/ammoniaque et eau/butanol/acide acétique, révèle la pré- sence des acides aminés suivants: acides glutamique et aspartique, glycine, valine, proline, arginine, cystéine, ou cystine, sérine, alanine,leucine, isoleucine, phénylalanine, lysine, hystidine, et thréonine. Après hydrolyse alcaline en présence d'hydroxyde de baryum, on peut mettre en évidence la présence de tryptophane.
On peut mettre en évidence les restés des mêmes acides aminés dans le complexe cobalamine-peptide issu de Propionibactérium freudenreichii comme décrit dans l'exemple 2, par le même procédé.
L'examen des complexes cyanocobalamine-peptide préparés comme décrit dans les exemples 1 à 5 à été complété par une étude spectroscopique en utilisant de la lumière ayant une longueur d'onde
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du domaine du visible ou de l'ultra-violet. Les spectres d'absorp- < tion de quelques uns de ces complexes sont présentés dans les figures 1 à 3 des dessins qui accompagnent cette demande de brevet.
Lorsqu'on fabrique des préparations qui contiennent 'les complexes de la présente invention à partir du bouillon de fermenta tion ou bouillon de culture, il est souhaitable d'incorporer dans le procédé une ou plusieurs opérations de concentration et de purifica tion du produit, et on préfère même isoler le complexe sous forme de corps pur. Si l'on considère l'efficacité clinique du complexe qui se manifeste par le fait qu'une quantité de 10 microgrammes environ de cobalamine constitue une dose convenable, on comprendra que non seulement le produit pur mais encore les compositions qui contiennent le complexe sous une forme modérément concentrée, con- tiendront trop de complexe pour constituer une médication commode pour administration par voie orale.
C'est pourquoi on préfère pré- parer ces complexes par le mélange du complexe pur ou d'un produit purifié concentré contenant ce complexe, avec des diluants liquides ou solides non toxiques. Il est clair que le terme non toxique qualifie une substance non toxique dans les quantités qui seront utilisées dans l'usage clinique.
On a montré que.la mannitol est un diluant solide conve- hable, bien'que d'autres solides non toxiques comme l'amidon, ou le phosphate dibasique de calcium peuvent être utilisés si. on le dési- re- Le complexe peut être mis en solution ou en suspension dans de l'eau ou dans d'autres liquides contenant si on le désire des agents stabilisants comme par exemple des agents tampons.
Lorsque la préparation est sous la forme liquide, il est avantageux d'y incorporer un agent édulcorant ou un agent aromati- sant de manière que son goût soit plus agréable. Les produits con- venablement purifiés peuvent cependant être utilisés sans que de telles additions soient nécessaires, et les préparations solides peuvent se présenter sous la forme de tablettes ou de cachets, ce qui supprime la nécessité d'aromatiser. Dans tous les cas il est -
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possible d'incorporer dans les préparations d'autres substances d' activité thérapeutiques reconnues, pour peu bien entendu qu'elles soient chimiquement compatibles avec les cobalamines et avec les peptides.
Toute substance convenable peut être utilisée pour aroma- tiser, ou, d'une manière générale, pour rendre le goût des prépara- tions plus agréable, puisque celles-c sont essentiellement desti- nées à. un traitement par voie orale. Parmi ces substances on peut citer le sucre ou les autres agents édulcorants et les aromes de fruits.
Les résultats cliniques obtenus par traitement par voie orale au moyen des complexes décrits dans'les exemples 1 à 5 sont représentés graphiquement dans les figures 4 à. 10 des dessins qui accompagnent cette demande de brevet- Ces résultats montrent qu'après une dose initiale de complexe correspondant à environ 100 microgrammes de cyanocobalamine quotidiennement pendant une durée de 7 à. 8 jours, les patients qui souffrent d'anémie pernicieuse sont maintenus en bonne santé sans récumence des symptômes de la maladie, pendant toute la période des essais par une dose quotidienne par voie orale du complexe contenant environ de 10 à 20 microgrammes de cyanocobalamine.
Les résultats cliniques montrent que les complexes coba- lamine-peptide de cette invention sont extrêmement efficaces dans le traitement par voie orale de l'anémie pernicieuse, et ceci particulièrement aux doses qui contiennent la même quantité de cyanocobalamine que celles qui produiraient les mêmes résultats dans un traitement par voie parentérale. On a montré que des doses quo- tidiennes de complexe contenant environ 10 microgrammes de cobalami- ne sont entièrement efficaces dans un traitement permanent d'entre- tien, par voie orale.
Cette découverte est tout-à-fait surprenante puisqu'elle s'oppose à l'opinion prévalente qui affirme que seules les substance- de poids moléculaire élevé comme les vraies protéines, qui sont dond
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non dialysables, peuvent remplir le rôle de facteur intrinsèque".
En plus des résultats cliniques observés par l'adminsi- tration par voie orale des complexes de la présente invention, on a également montré que ces produits activent la maturation des cel- lules mégaloblastiques, c'est-à-dire des cellules rouges non mûres de la moëlle des. os longs des patients souffrant d'anémie pernicieu- se, en normoblastes c'est-à.-dire en cellules entièrement formées et mures, in vitro. La cyanocobalamine pure, cristallisée, exige pour être efficace comme agent de maturation des cellules mégaloblasti- ques de ces sources, l'addition d'un peu de suc gastrique normal.
(Callendrer and Lajtha, Blood (1951) 6, p.1234).
La présente invention comporte des procédés de préparation des complexes décrits ci-dessus et des procédés de fabrication de préparations qui contiennent ces complexes, soit avec, soit sans isolement intermédiaire de ces complexes.
Comme il a été dit plus haut, les complexes cobalamine- peptide sont extraits de cultures en fermentation et ils peuvent tre élaborés par différents microorganismes cultivés dans un milieu convenable* Dans la mesure des connaissances 'actuelles, tous les organismes qui élaborent des cobalamines par fermentation produisent* ces substances sous une forme à partir de laquelle les complexes de la présente invention peuvent être isolés. Différents organismes qui élaborent des cobalamines sont déjà. bien connus. Les organismes connus convenables appartiennent au groupe des Fungi qui se partage en sous-groupes des Myxomycètes, des Schizomycètes et des Eumycètes décrits par exemple dans l'ouvrage "Industrial Mycolog par Smith et Raistrick, London, Arnold & C .
(1946) aux pages 1 à 3.
On a montré que, tout particulièrement, les membres des genres Streptomyces et Propionibactérium (ce dernier est décrit dans l'ouvrage "Manual of Déterminative Bacteriology", par Bergey, 6ème Edition, Waverley Press, Baltimore), fournissent de bons rendements de ces complexes, et que parmi ceux-ci le Streptomyces ATCC 11072, le Streptomyces griseus et le Propionibacterium freudenreichii se
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sont révélés être particulièrement appropriés- Ces organismes sont déjà largement utilisés dans les fermentations industrielles.
Propionibacterium shermanii et P.technicum donnent également des rendements satisfaisants des complexes- Il est possible de s'assu- rer qu'un microorganisme particulier est capable d'élaborer des cobalamines en faisant fermenter un milieu nutritif approprié contenant des sources d'azote, de carbone et de cobalt assimilable comme par exemple du liquide de trempage de mais, du glucose et du chlorure de cobalt, respectivement, et en examinant le produit de fermentation pour voir s'il contient des cobalamines.
Si l'on observe que des cobalamines se sont formées, il convient de déter- miner dans quelle mesure le microorganisme est approprié pour le but de la présente invention en préparant un complexe de cobalamine à partir du produit de fermentation par les méthodes décrites dans la présente invention et en soumettant le complexe ainsi préparé aux essais cliniques suivant la technique usuelle. D'autre'part, le complexe peut être soumis aux essais relatifs aux autres propriétés mentionnées ci-dessus afin de déterminer si le microorganisme est approprié au but qu'on poursuit sans être obligé de procéder aux essais cliniques.
Dans le but de fabriquer ces complexes à relativement grande échelle, on préfère effectuer la fermentation avec des micro- organismes sélectionnés immergés dans un milieu liquide. Dans le cas des organismes aérophiles comme Streptomyces il est nécessaire de prévoir une aération du milieu de fermentation, tandis que lorsqu'on se sert de certaines espèces de Propionibacterium comme par exemple P.freudenreichii, on a montré qu'il est avantageux d'observer des conditions de fermentation anaérobies du milieu nutritif pendant la première période de la fermentation, puis d'admettre ensuite une certaine quantité d'air, ce qui est également avantageux.
Si on le désire, certains précurseurs peuvent être ajoutés ,au milieu de fermentation, de préférence après le développement 4,Une
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certaine quantité de microorganismes, afin de préparer des complexes cobalamine-peptide qui contiennent des cobalamines autres que la cyanocobalamine. On peut ajouter par exemple du 5-hydroxybenzimida- zole afin de produire un complexe contenant la cobalamine corres- pondant, connue également sous le nom de facteur III.
Le procédé de préparation peut comporter des stades liés à la transformation du type de la cobalamine présente: l'hydroxyco- balamine, par exemple, peut être transformée en cyanocobalamine suivant des procédés connus; mais ces stades ne font pas partie de la présente invention et il n'en sera plus fait mention par la sui- te.
On sait que les cobalamines, par exemple la.cyanocobalamin et l'hydroxocobalamine, se présentent largement dans le produit de fermentation sous une forme "liée". Ceci signifie que les cobalami- nes sont liées à des composés de poids moléculaire élevé et de nature protéique, et que sous cette forme la cobalamine n'est pas .disponible pour la plupart des microorganismes, comme par exemple pour le protozoaire Ochromonas malhamensis, dont il est fait un usage fréquent pour le dosage microbiologique des cobalamines- Sous cette forme les cobalamines sont également sans effet contre l'anémie pernicieuse lorsqu'elles sont ingérées par voie orale.
Les différentes étapes du procédé connu d'isolement de la cyanocobalamine à partir des cultures de fermentations entraînent une dégradation du composé cyanocobalamine-protéine, non détermina- ble par voie microbiologique, et dont le groupe cobalamine est qualifié de "lié" en un complexe cyanocobalamine-peptide de poids moléculaire moins élevé, qui est déterminable par voie microbiolo- gique et dont¯le groupe cobalamine est qualifié de "libre" et finalement en cyanocobalamine linon combinée" de poids moléculaire 1350.
En vue d'obtenir les complexes cobalamine-peptide de poids moléculaire désiré pour la présente invention la-dégradation des cÖbalamines "liées" peut être effectuée pas l'action des ions cyanu-
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res des enzymes protéolytiques, des acides ou de la chaleur, par exemple. Le traitement de dégradation peut être effectué à un moment quelconque convenable après la fin de la fermentation, par exemple sur la culture de fermentation ou sur les extraits ou les concentrats qui en dérivent.
On peut concentrer et purifier les cultures de fermentation par les méthodes utilisées pour effectuer la concentration et la purification dans les procédés de fabrication de cyanocobalamine "non combinée" mais il est souhaitable pour obtenir un bon rende- ment du complexe de traiter les cellules ou le mycélium de l'orga- nisme utilisé à une valeur acide du pH, afin de libérer les produits contenant de la cobalamine du contenu cellulaire- On peut par exemple mettre en suspension les cellules ou le mycélium dans le liquide de culture fermenté après avoir ajusté celui-ci à une valeur acide du pH, par exemple dans la gamme de pH de 1 à 3, pen- dant une durée appropriée, puis on filtre et élimine ainsi les cellules ou le mycélium.
D'autre part on peut séparer les cellules ou le mycélium du liquide fermenté par filtration ou par centrifugation et remet- tre en suspension les cellules ou le mycélium dans un liquide de pH favorable jusque à ce que la totalité du produit contenant la coba- lamine soit libérée des cellules, après quoi le produit cellulaire insoluble est filtré et éliminé.
Les cobalamines "liées" et "libres" ainsi obtenues peuvent être purifiées et concentrées par absorption sur une résine échangeu- se d'ions convenable- Elles sont ensuite éluées de la résine, par exemple au moyen d'isopropanol acidifié, et l'éluat peut être encore concentré et purifié par des procédés connus comme par exemple par des extractions répétées à partir d'une solution aqueuse dans une solution phénol/benzène et des réextractions à partir de ce mélange de solvants dans de l'eau, par l'addition de n-butanol ou d'acétate de butyle.
On a observé qu'il était souhaitable de.purifier et de concentrer la solution jusqu'à ce qu'elle contienne une concen-
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tration totale en cyanocobalamines comprise entre 500 et 1500 micro- grammes par millilitre, comme par exemple une solution aqueuse con- tenant environ 1200 microgrammes de cobalamines par millilitre.
Les cobalamines totales peuvent être dosées par dosage microbiologi- que après qu'une partie aliquote de la solution ait été soumise à l'action de la chaleur en solution aqueuse et. en milieu acide jusqu'à ce que toutes la cobalamine "liée" ait été libérée ou par dosage spectrophotométrique, par exemple au moyen de la lumière ayant une longueur d'onde de 550 millimicrons.
La solution ainsi obtenue contient normalement de la cyanocobalamine "liée" et "libre", à moins que la fermentation n'ait été effectuée-en présence d'un précurseur, comme par exemple un benzimidazole, tomme le 5-hydroxybenzimidazole et dans ce cas on obtiendra la cobalamine correspondante (facteur III) sous forme "liée" et "libre", ainsi que de la cyanocobalamine. Dans le but d'augmenter le rendement en cyanocobalamine "libre" la solution peut être soumise à la dégradation partielle nécessaire pour obte- nir un produit de podes moléculaire désiré.
D'autre part il-est également possible d'effectuer l'opé- ration dégradation du produit "lié" sans avoir effectué préalablemert la concentration dn produit ou même lorsque le produit est sous la forme d'une suspension (particulièrement d'une resuspension) de cellules en fermentation, et dans ce cas la solution du complexe ainsi obtenue peut être séparée et conditionnée pour l'usage clini- que sans concentration ou dilution appréciable.
On peut très aisément dégrader les cobalamines "liées" en complexe cobalamine-peptide d'un poids moléculaire désiré en trai- tant les solutions aqueuses concentrées par des ions cyanure, comme par exemple par l'addition d'une solution de cyanure de potassium à 2% poids/volume environ, pendant un temps déterminé, comme par exemple pendant de I à 2 heures à la température de la chambre.
Bien que l'usage d'ions cyanure pour effectuer la dégra- dation partielle de la cobalamine "liée" soit commode, en ce que la dégradation est ainsi, susceptible d'être contrôlée, le procédé
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de cette invention n'est pas uniquement limité'à ce procédé.
D'au- tres procédés peuvent également être utilisés, et par exemple un traitement acide ou un traitement par des enzymes protéolytiques com me la pepsine, la trypsine, la chrymotrypsine ou la papa.ine. La dégradation partielle peut être effectuée si on le désire par un traitement prolongé des cellules ou du mycélium à une valeur acide du pH, décrite plus haut, ce qui libère la cobalamine "liée" du matériel cellulaire et qui suffit à causer la. dégradation d'au moins une partie de la cobalamine "liée" en complexe cobale,mine- peptide de poids moléculaire désiré. Ici également la dégradation nécessaire peut être effectuée en chauffant la cobalamine "liée" de préférence en solution aqueuse.
La dégradation peut être effectuer à. une température convenablement élevée comme par exemple supérieure à 50 C environ et de préférence supérieure à 80 C environ. Il est même possible d'obtenir le degré nécessaire de dégradation d'une partie du produit contenant la cobalamine en laissant la fermenta- tion continuer jusqu'au stade de l'autolyse par les organismes fermentants, mais ce procédé est peu efficace, et d'un contrôle difficile, c'est pourquoi on préfère les autres procédés.
Afin de pouvoir établir à quel moment la dégradation est suffisamment avancée, on effectue des essais de dialyse de temps à autre en utilisant d.es membranes comme la "cellophane" qui possè- dent une dimension des pores appropriée,après élimination de la cobalamine non "liée". par exemple par 'absorption sur charbon ac- tif, comme décrit ci-dessous.
De plus on peut faire des essais avec des microorganismes convenables et observer si leur croissance s'en trouve stimulée.
La solution aqueuse qui contient le complexe de poids moléculaire désiré peut, si on le désire, être encore concentrée ou bien elle peut être traitée à ce stade par un agent précipitant or- ganique ou inorganique ce qui permet d'obtenir le complexe cobala- mine-peptide désiré sous forme solide.
D'autre part cette solution peut être purifiée suivant les
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besoinset utilisée comme' telle ou après concentration ultérieure dans la confection de préparations liquides pour usage clinique.
Dans ce but, la solution est diluée jusqu'à ce que la concentration en cobalamine présente sous forme d'un complexe soit inférieure à 100 microgrammes par millilitre et de préférence jusqu'à ce que la concentration soit inférieure à 10 microgrammes par millilitre.
L'agent précipitant que l'on ajoute à. la solution aqueuse concentrée du complexe cobalamine-peptide peut être l'un ou l'autre des agents convenables dont on fait usage pour relarguer les compo- sés organiques à partir de leurs solutions aqueuses, comme par exemple les sels inorganiques comme les sulfates d'ammonium, de so- dium ou de potassium. L'agent de relarguage est ajouté en quantité telle que l'on obtienne une solution aqueuse dont la concentration en sel de relarguage soit comprise entre celle d'une solution saturée à 25% et celle d'une solution entièrement saturée, et de préférence dans le cas du-sulfate d'ammonium entre celle d'une solution saturée à 50% et celle d'une solution saturée à 70%.
Le complexe peut également être précipité par addition d'agents précipitants organiques comme l'acétone, le propanol ou l'isopropanol.
Si l'on désire obtenir le complexe cobalamine-peptide à l'état pur, les cobalamines "non liées" seront éliminées après l'opération d'isolement de telle manière que ces cobalamines "non liées" formées à partir du complexe au cours des opérations de concentration et d'isolement, ainsi que celles qui se sont formées antérieurement, soient éliminées ensemble en une seule extraction.
Si on le désire les cobalamines "non liées" peuvent toutefois être éliminées avant l'opération d'isolement et le complexe impur sera cependant susceptible de recevoir une application clinique.
On préfère cependant isoler le complexe à l'état pur (ou tout au moins un solide contenant le complexe exempt de cobalamine "non liée) et confectionner à partir de celui-ci les préparations cliniques, de manière à simplifier la standardisation et le dosage des préparations, qui sont rendus plus compliqués par la présence
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de cobalamine "non liée". La présence de quantités importantes de cobalamine "liée" présente les mêmes inconvénients mais on compren- dra'que la méthode de préparation qui a été décrite évite le risque d'une contamination importante par la. cobalamine liée.
Le traitement d'une solution qui contient des cobalamines "non liées" par du charbon actif constitue un procédé approprié pour 1-'élimination de ces substances. La quantité de charbon actif qu'il conviendra d'utiliser est dans une certaine mesure une fonc- tion de la quantité de cobalamines "non liées présente dans la solution mais on a montré que l'addition d'une quantité de charbon actif égale à environ 2% en poids par rapport au volume de la solu- tion convient bien. La cobalamine est adsorbée sur le charbon actif tandis que le complexe reste en solution. Ce traitement élimine également les impuretés colorées et l'aspect du complexe s'en trouve ainsi amélioré.
Après précipitation, le complexe solide peut être encore purifié par exemple par redissolution dans l'eau et lavage de cette solution aqueuse par des solvants organiques comme le butanol et/ou' le benzène suivi d'une élimination des solvants organiques par distillation. Le complexe peut alors être reprécipité et isolé. Ce, opérations peuvent être répétées jusqu'à ce que le complexe de cobalamine solide présente le degré de pureté désiré.
Les exemples qui suivent illustrent les procédés de pré- paration du complexe cobalamine-peptide à partir des cultures de fermentation, suivant cette invention. Dans les exemples, les déno- minations "partie en poids" et "partie en volume" sont liées entre elles comme le sont les grammes par rapport aux millilitres.
EMI15.1
EXI":.".1:PLE l.-
Le bouillon de culture obtenu par la fermentation d'un milieu nutritif contenant de la. farine de soya, du glucose, du phosphate monopotassique et du chlorure de cobalt par un microor- ganisme streptomyces souche ATCC 11072 est acidifié,pendant une heure jusque un pH 2, puis est filtré- Le filtrat est passé sur une résine échangeuse d'ion qui absorbe les cobalamines linon
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liées" consistant en cyanocobalamine avec un peu d'hydroxocobalamine et tout complexe de peptide qui se serait formé. Ces substances absorbées sont dénommées ci-dessous "cobalamines".
Les cobalamines absorbées sont éluées de la résine par de l'alcool isopropylique acide et.l'éluat est neutralisé. Celui-ci est alors concentré par distillation sous pression réduite pour éliminer l'isopropanol et le pH de la solution concentrée obtenue est ajusté à une valeur de 7 à. 7,5. Une solution de cyanure de potassium à 2% p/v est alors ajoutée et le mélange est laissé au repos. Le mélange ainsi obtenue est traité avec un mélange de phé- nol et de benzène (30/70% volume/volume) pour extraire les cobalami' nes. La solution ainsi obtenu de cobalamines dans le mélange phénol/benzène est alors traitée à l'eau et au n-butanol ce qui fait repasser les cobalamines en solution aqueuse.
La'solution aqueuse contient approximativement 1260 microgrammes de oobalamines totales, c'est-à-dire de cobalamines "liées", "non liées" et "libres", (sous forme de complexe avec un peptide), par millimitre.
On ajoute 2,5 parties en poids de sulfate. d'ammonium à 3,2 parties en'-volume des solutions ainsi obtenues et le mélange est laissé au repos. Une couche huileuse et un précipité se séparent et sont décantés et mélangés avec de l'eau. Le mélange, qui forme une émulsion, est alors lavé au benzène pour éliminer des traces de solvants organiques tels que le phénol ou le butanol. L'émulsion lavée est alors traitée au charbon actif pour éliminer certaines impuretés et la cyanocobalamine non liée". Le charbon est alors éliminé par filtration et lavé à l'eau, laquelle est ajoutée au filtrat.
La solution aqueuse purifiée de composé cyanocobalamine- peptide est lavée au n-butanol puis au benzène et le complexe est précipité de la solution aqueuse lavée par addition d'une quantité suffisante de sulfate d'ammonium pour que la concentration en soit de 60 grammes par 100 ml de solution. Le précipité est à nouveau dissous et précipité deux fois de la même manière et le complexe solide cyanocobalamine-peptide finalement obtenu est séché à l'air.
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A l'examen spectroscopique au moyen de lumière d'une longueur d'onde dans le domaine visible et ultra.-violet, on obtient le spectre de la figure 1. A fins de comparaison, la même figure montre également les spectres de cyanocobalamine et d'une solution aqueuse concentrée contenant de la cyanocobalamine principalement sous la forme "liée".
La teneur en cyanocobalamine du complexe est calculée après examen spectrophotométrique au moyen d'un rayon lumineux ayant une longueur d'onde de 550 millimicrons. La teneur en sulfate d'ammonium peut également être estimée et, par différence, on calcule le sold.e de peptide. De cette manière, on constate que le composé contient 5,5% de cyanocobalamine et 37,6% de peptide.
En se basant sur ces chiffres et en admettant que dans le composé, le rapport moléculaire cyanocobalamine/peptide est 1 :1 que le poids molé- culaire de la cyanocobalamine est 1350, on calcule que le poids mo- léculaire du complexe est environ 10.500. Le comportement d'un échantillon du complexe est examiné dans une ultra-centrifugeuse actionnée pendant 320 minutes à 5.98 x 104 tours à la minute et on observe que la constante de sédimentation non corrigée vaut 0,44 x 10-3 unités Svedberg ce qui indique que le poids moléculaire est environ d.u même ordre de grandeur que celui qui est calculé (.par le procédé spectrophotométrique).
EXEMPLE 2 . -
Un bouillon de culture contenant des cellules obtenu par fermentation d'un milieu contenant du liquide de trempage de mais, du glucose et du chlorure de cobalt au moyen d'une souche de Propionibacterium freudenreichii est acidifié au moyen d'acide sulfurique jusqu'à, un pH 2, puis est laissé au repos pendant 6 heure: pour-séparer les cobalamines sous forme de complexe cyanocobalamine- peptide du'produit cellulaire insoluble'-On élimine le produit insoluble par filtration et :le filtrat est traité avec un mélonge phénol/benzène pour extraire le complexe. La solution ainsi obtenue est alors traitée à l'acétate de butyle et à. l'eau et le complexe
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est extrait sous forme de solution aqueuse.
Cette opération est répétée jusqu'à obtention d'une solution aqueuse concentrée conte- nant un total de 620 microgrammes de cyanocobalamine, principale- ment sous forme de complexe de peptide, par millilitre de solu- tion.
Cette solution concentrée est alors traitée.au charbon actif poux éliminer les impuretés et la cyanocobalamine "non liée" elle-même Après élimination du charbon par filtration, le filtrat est extrait au butanol et lavé au toluène pour éliminer le butanol dissous. La solution aqueuse concentrée est distillée sous pression réduite poûr éliminer les traces de toluène, puis retraité au charbon actif qui est ensuite éliminé par filtration.
On ajoute à. 9,4 parties de cette solution aqueuse con- centrée 7, 15 parties de sulfate d'ammonium et le précipité est séparé par filtration. Le précipité est dissous à nouveau dans l'eau et reprécipité deux fois dans des conditions similaires puis finalement séché à l'air.
Une portion du complexe est alors dissoute à nouveau dans l'eau et soumise à une ultra-filtration à travers une membrane Oxoid dont les pores ont une dimension de 5000 à 1000 Angstroms.
'Une certaine quantité d'impureté présentant un poids moléculaire élevé reste dans le filtre.
EXEMPLE 3.-
A une solution aqueuse du complexe préparé suivant la méthode de l'exemple 2 et contenant 500 microgrammes de cyanoco- balamine par millilitre on ajoute du cyanure de potassium pour obtenir une concentration de 2% poids/volume à un pH d'une valeur de 7 à 7,5. Du sulfate d'ammonium est alors ajouté pour obtenir une concentration de 12% poids/volume et le complexe est extrait au butanol normal. On ajoute alors du toluène .et de l'eau et le complexe est re-extrait en solution aqueuse. Celle-ci est traitée avec un mélange de phénol et de toluène jusqu'à ce que tout le complexe soit extrait dans la phase organique. Le complexe est alors concentré par ré-extraction en solution aqueuse par addition
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diacide acétique, de butanol et d'eau.
La solution aqueuse est alors séparée puis concentrée par distillation sous pression ré- duite, éliminant ainsi l'excédent de solvant et le cyanure.
L'analyse du complexe obtenu indique qu'il contient 13,2% de cyanocobalamine et 86,8% de peptide, ce qui donne un poids moléculaire de 10.250 comme indiqué dans le tableau page 5 du présent mémoire.
L'examen chromatographique et électrophorétique du complexe indique que pratiquement toute la. cyanocobalamine se présente sous forme de complexe de peptide. Il présente le spectre d'absorption de la figure 2.
Mélangé avec du mannitol, le complexe s'avère être d'une saveur agréable et très efficace dans le traitement des symptomes d'anémie pernicieuse, comme décrit dans l'exemple 7.
En purifiant une portion du complexe par l'addition de 25 volumes d'acétone à une solution aqueuse du complexe présentant la susdite analyse, une poudre rose précipite et on la laisse sécher à l'air.
Le précipité ainsi obtenu contient 15,8% cyanocobalamine et 84,2% de peptide ce qui donne un poids moléculaire d'environ 8.600 suivant le procédé décrit plus haut.
Le spectre d'absorption de. ce produit est également reproduit à la figure 2.
L'analyse élémentaire donne les résultats suivants: carbone 49,8%; hydrogène 6, 9% azote 12,5%; soufre 0,96%; phosphore 0,62%; cobalt 0,60%.
EXEMPLE 4. -
Une solution aqueuse contenant du complexe cyanocobalami- ne-peptide est préparée au départ d'un bouillon de culture obtenu par fermentation d'un milieu nutritif par un microorganisme streptomyces souche ATCC 11072, par acidification à un pH 2, suivie de purification et de concentration par extraction et ré-extraction
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dans des solvants organiques et dans l'eau et par traitement au charbon actif. A 9,4 parties en volume de cette solution aqueuse on ajoute doucement en agitant 6 parties de sulfate d'ammonium et le précipité qui se sépare est récupéré par filtration. Le précipité est alors redissous dans l'eau et reprécipité par addition de 70 g de sulfate d'ammonium par 100 millilitres de solution.
La purification du complexe est poursuivie par redisso- lution dans l'eau et par traitement de la solution ainsi obtenue avec 2% de cyanure de potassium à un pH 7 pendant une heure, après' quoi le complexe dicyanocobalamine-peptide qui s'est formé est extrait au butanol en présence de 12% de sulfate d'ammonium. Par addition d'eau, et de toluène le complexe dicyano- est alors ré-extrait dans l'eau. La solution aqueuse enrichie de complexe dicyano- est traitée avec un mélange phénol/toluène (30%/70% v/v) pour¯extraire ce complexe qui est alors ré-extrait dans l'eau après acidification à l'acide acétique glacial. La solution aqueuse de complexe cyanocobalamine-peptide ainsi obtenue est distillée sous pression réduite pour éliminer les ions cyanure et les solvants.
L'analyse de la solution ainsi préparée indique que le complexe contient 14,1% de cyanocobalamine et 85,9%' de peptide ce qui donne un poids moléculaire dnviron 9. 550.
Le mélange d'une partie du complexe avec du mannitol s'avère être d'une saveur agréable et être très efficace pour combattre les symptômes de l'anémie pernicieuse, comme décrit dans l'exemple 8.
Le reste du complexe en solution aqueuse est précipité par addition de 25 volumes d'acétone par volume de solution aqueuse.
Apres séchage à l'air la poudre rose précipitée présente l'analyse suivante : cyanocobalamine 29,3%; peptide 70,7% ce qui donne un poids moléculaire de 4.600.
L'analyse élémentaire du produit précipité à l'acétone donne les'résultats suivants : carbone 45,3%; hydrogène 7,1%; azote 12,55%; soufre 1,43%; phosphore 0,33%; cobalt 1,37%. Les spe@tres d'absorption sont représentés à la figure 3.
r'sentés figure
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EXEMPLE 5.-
Un bouillon de culture obtenu de la fermentation d'un milieu nutritif contenant du liquide de trempage de mais, du glucose et du chlorure de cobalt par une souche de Propionibacterium freudenreichii est ajusté àun pH 2 et laisse au repos pendant 6 heures, après quoi il est purifié et concentré par extraction en solution organique, puis par ré-extraction en solution aqueuse, pour obtenir une solution aqueuse de cobalarnines "liées" "libres" et "non liées" .
Le pH de la solution aqueuse est alors ajusta à 1%ne valeur entre 7 et 7,5, on ajoute 2% poids/volume de cyanure de potassium et la solution est laissée au repos pendant trois heures après quoi le complexe cobalamine-peptide est extrait en solution organique et ré-extrait en solution aqueuse. Le pH de celle-ci est alors ajusté à. une valeur de 4,5 et la solution est concentrée pour éliminer ions cyanure et solvants. On limite à 40 gallons le volume de la solution aqueuse enrichie ainsi obtenue, contenant
500 microgrammes de complexe peptide et de cyanocobalamine non combinée par millilitre.
Du sulfate d'ammonium est ajouté avec agitation pour obtenir une concentration de 60 g par 100 millilitres de solution et le précipté qui se forme est laissé au repos pendant 12 heures, après quoi 11 est filtré et séché à l'air. Le précipité pèse 766 g.
L'amalyse montre que 1 produit contient 13,4% de co- balamines. et 67.5% de- peptide,., le s,olde de 19,1%., étant de sulfate d'ammonium, ce qui donne un. poids moléculaire denviron 8.100.
EXEMPLE 6.-
Le complexe cyanocobalamine-peptide préparé suivant la méthode de l'exemple 1 et qui contient environ 13% en poids de cyanocobalamine est-mélange avec du mannitol, à une concentratiom de 0,16% de complexe dans le mélange, et des doses, de cette prépa- ration sont administrées par voie buccale à six patients souffrant d'anémie pernicieuse. Les patients n'ont pas été soumis à d'autres traitements.
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Le nombre normal de globules rouges chez des personnes saines varie' entre 4,5 et 5,0 x 106 par millimètre cube et le taux d'hémoglobine est compris entre 90 et 100.
Cas n 1.
Pendant les huit premiers jours du traitement on adminis, tre à un patient par voie buccale une dose journalière d'une prépa-' ration contenant 780 microgrammes de complexe (contenant 100 micro- grammes de cyanocobalamine), après quoi la dose journalière est réduite de moitié pendant les 14 jours qui suivent. La dose jour- nalière est'alors réduite à une quantité de préparation contenant : 78 microgrammes de complexe (correspondant à 10 microgrammes de cyanocobalamine), pendant le reste du traitement (263 jours). Le patient a été maintenu en bonne santé au moyen de cette dose journalière, et n'a pas présenté de symptôme d'anémie pernicieuse.
Tout au long du traitement on a effectué des numérations de globules rouges sanguins et des estimations du taux d'hémoglobine, .et les valeurs sont renseignées dans la figure 4.
Cas n 2.
Pendant les huit premiers jours du traitement on adminis- tre à un patient une dose journalière d'une préparation contenant 780 micro grammes de complexe, après quoi la dose est réduite à la moitié de cette valeur pendant les 14 jours suivants.
Vu l'âge du patient (72 ans) une quantité de préparation contenant 156 microgrammes de complexe (correspondant à 20 micro- grammes de cyanocobalamine) lui a été administrée journellement pendant les 77 jours suivants, après quoi la dose est réduite de moitié pendant le reste du traitement (155 jours).
Le patient est maintenu en bonne santé et ne présente aucun symptôme d'anémie pernicieuse.
La figure 5 indique les résultats des relevés du nombre de globules' rouges et des estimations du niveau d'hémoglobine effedtués au courant du trai tement.
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Etant donné l'âge du patient, à en juger par les relevés du nombre de globules rouges et les estimations du taux d'hémoglobi- ne, la réaction au traitement est plus lente que dans les autres cas décrits dans le présent mémoire.
Cas n 3.
Un patient prend par voie buccale pendant 8 jours une dose journalière de préparation contenant 780 microgrammes de complexe après quoi la dose journalière est réduite à un cinquième de cette quantité pendant 22 jours, puis pendant les 41 jours sui- vants on réduit cette dernière quantité de moitié. Après cela le traitement est interrompu.
Après 35 jours sans traitement, la santé du patient se détériore, comme le montre une baisse du nombre de globules rouges et du taux d'hémoglobine.
Une dose unique de la préparation contenant 1560 micro- grammes de complexe (correspondant à 200 microgrammes de cyanoco- balamine) est administrée le soixantième jour après l'interruption du traitement et 14 jours plus tard on commence à administrer journellement au patient une dose d'entretien contenant 78 microgram mes de complexe. Le patient est ainsi maintenu en bonne santé et ne présente aucun symptôme d'anémie pernicieuse pendant le reste du traitement (105 jours).
On trouvera à. la figure 6 les relevés du nombre de globu- les rouges et les estimations du niveau d'hémoglobine.
Cas n 4.
Pendant 7 jours on administre à un patient une dose journalière de la préparation contenant 780 microgrammes du complexe, après quoi la dose journalière est réduite à un dixième de cette quantité pendant le reste du traitement (207 jours).
Le patient reste en bonne santé et ne présente aucun symptôme d'anémie pernicieuse.
La figure 7 donne les relevés du nombre de globulesrouges- et des estimations du taux d'hémoglobine.
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Cas
Pendant 8 jours, on administre à un patient par voie buccale une dose journalière contenant 780 microgrammes de complexe, après quoi la dose journalière est réduite de moitié pendant 7 jours puis pendant les cinq jours suivants elle est réduite au cinquième de la dose-initiale* Après cette période, la quantité de préparation administrée, est réduite à. une dose journalière contenant 78 microgra mes de complexe et .ce pendant le reste du traitement (204 jours).
Le patient est maintenu en bonne santé et ne présente aucun symptôme d'anémie pernicieuse. La figure 8 donne les relevés du nombre de globules rouges et les estimations du taux d'hémoglo- bine.
EXEMPLE 7.-
Un patient est traité avec une préparation qui consiste en complexe produit suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 mélangé avec du mannitol dans le proportion d'environ 1 à 600.
Pendant 7 jours le patient prend par voie buccale une dose journa- lière de préparation contenant 760 microgrammes du complexe (cor- respondant à 100 microgrammes de cyanocobalamine), après quoi la dose journalière est réduite de moitié pendant 5 jours. Puis finalement.elle-est réduite à une quantité de préparation contenant 76 microgrammes du complexe et elle est maintenue à ce niveau pendant le reste du traitement (80 jours).
Le patient est maintenu en bonne santé et ne présente aucun symptôme d'anémie pernicieuse.
La figure 9 donne les relevés du nombre de globules rouges et les estimations du taux d'hémoglobine.
EXEMPLE 8.-
Un patient est traité au moyen d'une préparation admi- nistrée par voie buccale et qui consiste en complexe préparé suivant le procédé décrit dans l'exemple 4, mélangé avec du mannitol. Pen- dant 7 jours le patient prend par voie buccale une dose journalière
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de la préparation contenant 710 microgrammes de complexe (corres- pondant à. 100 microgrammes de cyanocobalamine).,après quoi, pendant les 11 jours suivants la dose journalière est réduite à une quan- tité correspondant à. 142 microgrararnes de complexe- Puis finale- ment elle est réduite à 71 microgrammes et ce pendant le reste du traitement (82 jours).
La figure 10 donne les relevés du nombre de globules rouges et les estimations du taux' d'hémoglobine.
La réaction au traitement est similaire à celle décrite dans l'exemple 7.
EXEMPLE 9.-
Une patiente âgée de 52 ans ayant subi pendant 16 mois un traitement au moyen d'une spécialité pour le traitement par voie buccale de l'anémie pernicieuse, a. pendant ce temps réagi favorablement au traitement à. en juger par les relevés des globules rouges et les estimations du niveau d'hémoglobine, et est ainsi maintenue en bonne santé.
A la fin de cette période, en dépit de la continuation du traitement, elle commence à éprouver des difficultés à se tenir debout et marcher, accompagnées d'une torpeur du pied et manque de sensation aux deux chevilles. Les mouvements de réflexe des genoux et des chevilles sont indolents et les réflexes de la plante du pied ne sont pas nettement visibles. La patiente n'est plus capable non plus de déceler la sensation du contact d'ouate sous le pied.
Ces symptômes persistent en dépit du fait que le nombre de globules rouges est satisfaisant, soit 4,3 x 106 globules rouges par millimètre cube et que le taux d'hémoglobine est de 94%, et ils sont diagnostiqués comme résultant d'une,dégénérescence subaiguë de la moëlle épinière, ce qui, comme on le sait, se produit dans une certaine proportion des patients souffrant d'anémie pernicieuse.
Le traitement de la patiente est changé, et on lui admi- nistre par voie buccale une préparation comprenant du complexe
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cyanocobalamine-peptide comme préparé dans l'exemple 1, mélangé avec du mannitol...
Fendant les sept premiers jours, la patiente prend jour- nellement des quantités ,de préparation contenant une quantité de complexe contenant 300 microgrammes de cyanocobalamine. Après cela, la dose journalière est réduite à-une quantité de préparation contenant 200 microgrammes de cyanocobalamine et ce pendant 8 semaines.
Pendant le traitement la marche s'améliore, et les symptômes sensitifs disparaissent, tandis que la teneur du sang en globules rouges et le taux d'hémoglobine restent constants.
EXEMPLE 10.-
On sait que la cyanocobalamine cristalline seule ne peut causer la maturation in vitro des globules rouges mégalo- blastiques (non mûrs) de la moelle des os de patients souffrant. - d'anémie pernicieuse en normoblastes (cellules mûres), voir par exen ple, Callender et Lajtha, Blood (1951) 6 p. 1234.
On a découvert toutefois, que les complexes cyanocoba- lamine-peptide faisant l'objet de la présente invention causent la maturation in vitro de telles cellules.
Des essais sont effectués sur des cultures de cellules prélevées dans la moëlle des os de patients souffrant d'anémie pernicieuse, en suivant le procédé décrit par Callender et Lajtha, "Blood" (1951)6, p. 1234, excepté qu'une, solution de Ringer a été employée au lieu d'une solution de Gey et que 50 unités de pénicilline sont ajoutés pour éviter une infection pendant l'essai.
Dans cet essai on emploie 7,8 microgrammes de complexe cyanocobalamine-peptide préparé suivant la méthode décrite dans l'exemple 1 et contenant 1 microgramme de cyanocobalamine et on obtient les résultats figurant dans le tableau suivant:
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EMI27.1
<tb> Patient <SEP> Numération <SEP> initiale <SEP> Numération <SEP> après <SEP> une <SEP> culture
<tb>
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<tb> n <SEP> des <SEP> cellules <SEP> de <SEP> la <SEP> de <SEP> 18 <SEP> heures <SEP> dans <SEP> du <SEP> sérum, <SEP> en
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<tb> moëlle <SEP> des <SEP> os <SEP> longs <SEP> présence <SEP> de <SEP> complexe <SEP> cyano-
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<tb> cobalamine-peptide.
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Mégalo- <SEP> Normo- <SEP> Mégalo- <SEP> Normo-
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<tb> blastes <SEP> blastes <SEP> blastes <SEP> blastes <SEP> ¯¯¯¯
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<tb> 1 <SEP> 94% <SEP> 6% <SEP> 55% <SEP> 46%
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<tb> 2 <SEP> 90% <SEP> 10% <SEP> 35% <SEP> 55%
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