CH620691A5

CH620691A5 -

Info

Publication number: CH620691A5
Application number: CH629577A
Authority: CH
Inventors: Mirko Beljanski
Original assignee: Mirko Beljanski
Priority date: 1976-06-03
Filing date: 1977-05-23
Publication date: 1980-12-15
Also published as: SE441679B; US4335239A; JPS63119495A; GB1546322A; DK169766B1; JPH027599B2; DK243877A; IE45285B1; CA1093000A; NO771884L; US4190649A; NL7705658A; IE45285L; DE2723451A1; SE7706425L; FR2353293B1; DE2723451C2; NO145540B; FR2353293A1; NO145540C

Description

L'invention a pour objet un procédé amélioré de préparation de ces polyribonucléotides permettant de les obtenir d'une façon plus simple et avec un rendement fortement accru.

Dans le procédé perfectionné selon l'invention, les méthodes de culture des bactéries, d'isolement des acides ribonucléiques ribosomiques (ARN-r) et de leur conservation sont identiques à celles décrites dans la lettre de brevet français 2 292 481.

Le perfectionnement porte sur trois points:

— sur le choix de la souche bactérienne ou autre matière de départ (champignons, levures ou organes d'animaux) ;

— sur l'agent de dégradation utilisé pour scinder des ARN-ren ARN-fragments;

— sur la suppression de la phase de sélection des ARN-fragments sur colonne.

En ce qui concerne le premier point, on utilise de préférence une souche sauvage de E. coli T 3000 (K12) non pathogène et appartenant aux espèces habituellement hôtes de la flore intestinale; chez cette souche, le rapport bases puriques/bases pyrimidiques est inférieur au rapport correspondant de la souche E.

coli M 500 Sho-R et il est voisin de 1,0.

Mais on peut utiliser des ARN-r isolés d'autres souches bactériennes, de champignons, de levures ou d'organes animaux dont le rapport bases puriques/bases pyrimidiques est adéquat.

Les agents de dégradation des ARN-r utilisés selon la présente invention peuvent être, non seulement des ribonucléases, telles que la ribonucléase pancréatique ou une ribonucléase extraite de Neurospora crassa, mais également une base forte (soude ou potasse), de préférence à une concentration finale 0,1 N dans la solution réactionnelle.

Les ARN-fragments obentus de cette façon à partir d'une matière première convenable présentent un rapport global (G+A) /(C+U) entre 1,0 et 2,5 et il n'est pas nécessaire d'opérer un fractionnement sur colonne. L'invention concerne donc un procédé de préparation de polyribonucléotides ou fragments d'acides ribonucléiques, dans lesquels le rapport global des bases puriques (G+A) aux bases pyrimidiques (C+U) est compris entre 1,0 et 2,5, caractérisé en ce qu'on dégrade les acides ribonucléiques ribosomiques extraits d'un micro-orga-nisme, d'une levure, ou d'organes animaux dont le rapport (G+A) / (C+U) est approprié, par une ribonucléase ou par un agent chimique, pour obtenir des chaînes simples comportant 20 à 80 motifs ribonucléotides.

On cite ci-après la préparation de P3 et P4 à partir d'une souche d'E. coli rendue résistante à la showdomycine décrite par M. Beljanski et col. (C.R. Acad. Sci. Paris, Série D, 272, pages 2107—2110) et enregistrée au Centraal Bureau Voor Schimmel-

3

620 691

cultures, sous le no CBS 615-74 et désignée ci-après par E, coli M 500-Sho-R.

Préparation de P3 et P4 à partir de E. coli M 500 - Sho-R.

Les bactéries de cette souche sont cultivées à 37° C en 5

milieu bien aéré, soit sur milieu riche contenant, par litre de milieu:

10 g de Bacto tryptone

5 g d'extrait de levure io

5 g de chlorure de sodium et de la lessive de soude pour amener le pH à 7,3 ;

soit, si l'on veut isoler à la fois les produits Pj et P2 antiviraux et les produits P3 et P4, un milieu synthétique contenant, par litre de milieu: 15

100 ml de phosphate monopotassique à 136 g/1 10 ml de sulfate d'ammonium à 20 %

1 ml de sulfate de fer à 0,05 %

1 ml de sulfate de magnésium à 20 g /100 ml 20

2 ml de vitamine Bj à 0,5 pour 1000 et de la lessive de potasse pour amener le pH à 7,2 ce milieu étant additonné, après avoir été stérilisé, de 4 ou 5 g pour 1000 de glucose stérilisé à part (solution à 20%).

La culture terminée, les cellules bactériennes sont collectées ,5 par centrifugation et peuvent être gardées congelées. Elles sont ensuite homogénéisées à froid dans un tampon A Tris-HCl 2M : 5 ml, KCl 2M : 30 ml; solution à 30 g/100 ml d'acétate de Mg : 10 ml) puis broyées et leur destruction est complétée par sonnication. 3()

Après dilution avec un tampon B (analoque au tampon A mais ne contenant que 0,1 ml d'acétate de Mg et 0,1 ml de mercaptoéthanol), on centrifuge 20 minutes (25 à 30.000 g),

puis on ajoute au surnageant 10 à 20 [ig de désoxyribonucléase par ml. On laisse agir 15 minutes à 30-37° C, puis l'on centri- 35 fuge 20 mintes (25 à 30.000 g). Le surnageant est alors recentrifugé pendant 2 heures à 40.000 tr/mn dans une ultracentrifugeuse afin de recueillir les ribosomes et d'éliminer la totalité der l'ARN 4 S inutile.

Les ribosomes (culot) sont homogénéisés dans un poter en ,i0 présence de tampon B. On ajoute 2-3 gouttes de laurylsulfate à 20% et soumet à une bonne agitation mécanique. L'ARN ribosomique est extrait par la méthode classique au phénol en présence de tampon B. Plusieurs extractions sont nécessaires. Une extraction finale au chloroforme est nécessaire pour bien 45 éliminer phénol et protéines encore présents.

Les phases aqueuses sont réunies et additionnées d'alcool 96° froid contenant un peu de KCl pour favoriser la précipitation des ARN. Une centrifugation 5 minutes à 5.000 g permet de collecter l'ARN qui est ensuite dialysé pendant une nuit 50 contre de l'eau distillée contenant 0,1 M KCl.

Le matin, on continue la dialyse 1 heure contre de l'eau distillée uniquement. On dose l'ARN à 260 nm (U.V.) à l'aide d'un spectrophotomètre.

Le rapport 260/280 permet de contrôler la propreté de la 55 préparation d'ARN. Ce rapport doit être très voisin de 2.

L'ARN est gardé congelé ou en poudre lyophilisée.

Le fractionnement des ARN en polyribonucléotides (ARN-fragments) s'effectue de la façon suivante: 70 mg d'ARN ribosomiques (environ 10 ml) sont mis en présence de 0,2 ml d'une 60 solution de ribonucléase pancréatique cristallisée. (La solution de ribonucléase pancréatique à 5 mg/ml a été portée précédemment à ébullition 10 minutes, puis refroidie).

On laisse incuber l'ARN avec la ribonucléase 30 minutes exactement à 36° C (bain-marie). La dégradation est arrêtée par 65 addition d'un égal volume de chloroforme et agitation vigoureuse quelques minutes. On centrifuge 5 minutes à 5.000 g. La phase aqueuse (phase supérieure) est prélevée et additionnée une seconde fois d'un même volume de chloroforme, agitée et centrifugée. La phase aqueuse est immédiatement déposée sur une colonne de Sephadex G-25 fine équilibrée avec un tampon HzO-Tris HCl 0,1 M, pH 7,4.

Les ARN-fragments sont élués par ce même tampon.

Dans ces conditions, 5 pics détectables par absorption à 260 nm apparaissent régulièrement comme illustrés par la courbe d'élution. Ils sont désignés dans l'ordre d'élution de la colonne, de 1 à 5.

Les ARN-fragments constituant les pics 1 et 2 présentent une activité antivirale.

Les ARN-fragments constituant les pics 3 et 4 présentent toujours une très spectaculaire activité comme «remonte» leucocytes et plaquettes, et constituent les médicaments obtenus selon l'invention.

Les ARN-fragments constituant le pic 5 ne sont pas conservés.

Les fractions constituant chacun des pics sont réunies et lyophilisées. On obtient ainsi les produits Pj, P2, P3, P4 après avoir repris le résidu sec dans le minimum d'eau distillée, traité une fois vigoureusement par un même volume de Chloroform et centrifugé, le surnageant ayant été dialysé 24 heures (conditions axéniques) contre de l'eau distillée stérile et lyophilisé à sec. Les produits P3 et P4 sont des produits selon l'invention, ainsi que leurs mélanges en toutes proportions.

La constitution des ARN-fragments P3 et P4, qui sont formés de chaînes simples comportant de 25 à 50 nucléotides, a été étudiée selon la technique décrite dans la lettre de brevet français no. 2 292 481 de façon à déterminer leurs teneurs en bases puriques et pyrimidiques.

On hydrolyse 150 jxg d'ARN-fragments pendant 1 heure à 100° C (bain-marie bouillant). Après évaporation dans un des-siccateur, le résidu est repris dans 0,02 ml d'eau distillée et chromatographié sur couche mince (cellulose ectéola) selon la technique décrite par G.R. Björk et L. Svensson (1967, Bio-chim. Biophys. acta, 138, pages 430-432). L'hydrolyse libère les bases puriques et les bases pyrimidiques restent sous forme de nucléotides.

Les constituants des ARN-fragments P3 et P4 ont été séparés par Chromatographie en cuve fermée et identifiés selon la technique décrite précédemment pour les ARN-fragments Pt et P2.

L'ARN-fragment P3 est constitué de:

L'ARN-fragment P4 est constitué de:

A : 29,0 G: 41,1

C: 15,2 U : 15,0 A : 25,6 G : 26,3 C : 21,0 U : 27,1

(G+A/C+U=2,3)

(G+A/C+U= 1,06)

ces chiffres étant exprimés en moles pour 100 moles de nucléotides analysés, en utilisant les coefficients d'extension suivants A = 13; G = 12,8 ;C = 11,5 ;U = 10 et correspondant au maximum d'absorption (voir Methods in Enzymology XII. Nucleic Acides, Part A, Ed. Grossman and K. Moldave, Académie Press (1967), page 386).

Les ARN-fragments P3 et P4 ne contiennent pas trace d'ADN. Ceci fut rigoureusement contrôlé par colorimétrie (diphénylamine) et par enzymologie (activité en présence de DN A-polymérase).

On décrit maintenant, dans les exemples 1 à 3 ci-après le procédé de préparation de ARN-fragments selon l'invention, à partir de ARN-r de E. coli T 3000 par diverses ribonucléases et par une base alcaline.

«

620 691

4

Exemple 1

Dégradation des ARN-r de E. coli T3000par la ribonucléase pancréatique A.

Les ARN-r sont obtenus à partir d'une culture de E. coli T 3000 par un procédé identique à celui décrit dans l'exemple 1 pour les ARN-r de E. coli M 500 Sho-R. La dégradation des ARN obtenus est effectuée selon l'invention par une solution de ribonucléase pancréatique (grade A) à 5 mg/ml, précédemment portée à 100° C pendant 10 minutes (bain-marie bouillant) puis rapidement refroidie.

On fait incuber à 36° C un mélange de ARN-r et de ribonucléase de même concentration en ribonucléase que dans l'exemple 1, mais pendant un temps plus court : 20 minutes (au lieu de 30 minutes). [Si l'on utilise un échantillon différent de ribonucléase pancréatique, plus ou moins cristallisée, il faut adapter la concentration en ribonucléase, ou le temps d'incubation].

La réaction est arrêtée par addition d'une solution de phénol contenant 10% d'eau distillée (1 volume de cette solution pour 1 volume réactionnel) et le mélange est vigoureusement agité afin d'éliminer la ribonucléase. Après centrifugation pendant 5 minutes à 10.000 tr/mn, la phase aqueuse (supérieure) est ensuite additionnée d'un même volume de phénol, le mélange agité puis centrifugé. L'opération est recommencée avec du chloroforme (volume à volume). Après séparation des phases et répétition deux ou trois fois de l'opération, la phase aqueuse est dialysée, dans des conditions axéniques pendant 16 heures, contre de l'eau distillée stérile à 4° C.

La quantité de ARN-fragments non dialysables est déterminée par absorption dans l'ultraviolet à 260 nm. Le rendement en ARN-fragments actifs, par rapport à la quantité initiale de ARN ribosomiques, varie de 50 à 60%.

Les ARN-fragments sont conservés après lyophilisation.

L'électrophorèse sur gel d'acrylamide des ARN-fragments révèle la présence d'un seul pic de ARN-fragments de taille inférieure à celle de l'ARN transfert 4 S, ainsi que le montre la figure 1 en annexe, dans laquelle on a porté en ordonnées

Tableau Bases l'absorbance à 260 nm et en abcisses la distance parcourue en 1 heure 30 minutes (méthode décrite par M. Beljanski, P. Bour-garel et Mme M. Beljanski; Ann. Inst. Pasteur 1970,118, p. 253).

5

Exemple 2

Dégradation des ARN-r de E. coli T3000par la ribonucléase Nj.

La ribonucléase Nx provenant de Neurospora crassa et préparée et purifiée selon K. Kasai et col. J. Bio. Chem. 1969, io 66, p. 389, une fois cristallisée, dégrade les chaînes polyribonu-cléotidiques au niveau de la base G et son action ménagée sur les ARN-r permet d'obtenir des ARN-fragments actifs dans la leucopoïèse et dans la formation des plaquettes sanguines. Les conditions suivantes sont utilisées:

100 mg de ARN-r de E. coli T 3000 en solution dans de l'eau distillée sont incubés en présence de 0,73 ml de ribonucléase N! (solution initiale de 100 unités/2 ml). Temps d'incubation : 30 minutes à 36° C. La ribonucléase est immédiatement éliminée par le phénol et le chloroforme comme décrit dans le cas de la ribonucléase A; les fragments sont dialysés contre de l'eau distillée stérile. Le produit obtenu est lyophilisé.

Exemple 3

Dégradation des ARN-r de E. coli T 3000par la soude ou la potasse.

Une solution de 7 à 10 mg de ARN-r/ml est additionnée d'une solution de NaOH ou KOH afin que la concentration finale de ces derniers soit de 0,1N.

L'incubation est effectuée à 36° C pendant 30 minutes. On neutralise immédiatement par un même volume de HCl 0,1N. On dialyse la solution contre de l'eau distillée pendant 16 heures à 4° C. Le produit non dialysable obtenu est lyophilisé. Après hydrolyse des différents ARN-fragments des exemples 2 et 3 on a déterminé le rapport bases puriques/bases pyrimidiques. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous et exprimés en moles pour 100 moles de nucléotides analysés.

20

25

30

55

ARN-fragments ARN-fragments ARN-fragments de l'exemple 1 de l'exemple 2 de l'exemple 3

G 42,0 24,3

A 28,8 26,8

C 15,7 25,0

U 13,5 23,6

Rapport 2,3 1,06

(G+A/(C+U)

Aucune différence significative n'est observable entre les ARN-fragments obtenus par les divers agents de dégradation 50 précités et selon les conditions décrites ci-dessus: leurs tailles sont pratiquement identiques et toujours inférieures à celle de l'ARN 4 S (voir figure 2).

Propriétés pharmacologiques: 55

On a étudié la répartition dans l'organisme de ARN-frag-ments P3 et P4 décrits ci-dessous marqués au 14C, après injection à des souris ou des lapins, par voie intraveineuse.

L'ARN fragment P4 marqué au 14C se loge essentiellement dans la rate, moins dans le foie et se trouve également dans la 60 moelle osseuse. L'ARN-fragment P3 marqué au 14C se loge également et essentiellement dans ces mêmes organes mais à un taux plus faible. En sacrifiant des souris traitées par ces produits, on constate une augmentation du volume et du poids de la rate (représentée dans les figures 3 et 4) uniquement chez les ani- fl5 maux traités par P4. Dans la figure 3, on a porté en ordonnées le poids de la rate (en mg) et dans la figure 4 le poids du foie (en g), en fonction du nombre de jours (en absicisses) écoulés après que l'animal a reçu une dose de 0,3 mg de produit P3 (courbes 3) ou P4 (courbes 4) pour 20 g de poids de la souris par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. Les deux organes ont retrouvé leur poids normal après 5 à 6 semaines et l'on ne retrouve plus la radioactivité qui a subi une élimination naturelle.

L'action dans la genèse des leucocytes et des plaquettes a été étudiée chez les lapins traités par le méthotrexate. Chez les Animaux ayant reçu du méthotrexate (35 mg par voie I.M. par lapin), on observe une baisse de 30% environ des leucocytes, 48 heures après l'administration de l'antimitotique. Sur 3 lapins en expérience, 1 lapin a alors reçu 2 mg par voie sous-cutanée du mélange P3 + P4 (dans le rapport pondéral 1:1 ) ; 1 lapin a reçu la même dose par voie intrapéritonéale, un troisième lapin n'a reçu que le méthotrexate (témoin). Les deux lapins traités par P3 + P4 ont récupéré en 5-7 jours un taux pratiquement normal de leucocytes alors que le lapin témoin ne l'a récupéré qu'après 15 jours environ.

Ces mêmes lapins ont reçu ultérieurement une deuxième

34.0

23.1

21.2 21,7

1,36

5

620 691

dose de méthotrexate (55 mg en I.V. par lapin), jour 0 sur la figure 5.

Deux jours après, 1 lapin a reçu 5 mg de P3 + P4 (rapport pondéral : 1/1,5) par voie I.P., 1 lapin a reçu la même dose par voie S.C. et le troisième lapin (même témoin que dans l'expérience précédente) n'a reçu que le méthotrexate. Les résultats de l'analyse du taux des leucocytes du sang prélevé tous les deux jours, et ceci pendant 20 jours, sont illustrés par la figure 5.

Sur la figure 5, où est porté en ordonnées le taux de leucocytes en fonction du nombre de jours (en abscisses) écoulés après l'injection de méthotrexate, on voit que l'action du méthotrexate se traduit chez les trois lapins par une baisse très importante du taux des leucocytes (témoins : courbe 1) mais moins importante chez les deux lapins préalablement traités par P3 + P4 par voie sous-cutanée (courbe 2) ou par voie intrapéritonéale, que chez le lapin témoin.

Chez le lapin ayant reçu pour la deuxième fois P3 + P4 par voie I.V. (courbe 3), le taux des leucocytes devient normal en 48 heures, augmente pendant 24 ou 48 heures avant de se stabiliser rapidement. Chez le lapin ayant reçu P3 +P4 par voie sous-cutanée, la courbe 2 représentant l'augmentation du taux des leucocytes atteint son maximum vers le sixième jour et se stabilise par la suite (figure 5). Par contre chez le lapin témoin (non traité par P3 + P4), le taux des leucocytes se maintient à un niveau bas et l'animal n'arrive pas à récupérer un taux normal pendant le temps d'observation.

Le taux de globules rouges chez les lapins ainsi traités ne varie pas.

Les études pharmacologiques effectuées avec les ARN-fragments obtenus avec divers agents de dégradation, selon les exemples 2 à 4, ont montré qu'il n'existe aucune différence significative, quant à l'activité dans la leucopoïèse et dans la formation des plaquettes, entre les produits P3 et P4 de l'exemple 1 administrés seuls, ou en mélange en proportions quelconques, et chacun des produits des exemples 2 à 4.

Une seule dose de chacun des produits des exemples 2 à 4 (2 à 5 mg) administrée par voie intraveineuse à des lapins fortement et constamment immunodéprimés (taux de leucocytes abaissé de 60 à 70%) permet de rétablir un taux normal de leucocytes en 24-48 heures. Le nombre de plaquettes peut être augmenteé par ces ARN-fragments de 50 à 100% par rapport au nombre de plaquettes des animaux témoins. La figure 6 illustre les résultats obtenus pendant la durée d'une expérience (20 à 30 jours) et périodiquement par les ARN-fragments obtenus selon l'un ou l'autre des exemples 1 à 4.

Sur la figure 6, on a porté en abscisses le nombre de jours de l'expérience pendant lesquels les lapins ont reçu 65 mg d'En-doxan par jour. Au temps indiqué par la flèche A, les lapins recevaient 2 mg de ARN-fragments par voie intraveineuse. L'une des courbes de la figure 6 a été obtenue en portant en ordonnées le nombre de leucocytes et l'autre courbe en portant en ordonnées le nombre de plaquettes.

Toutes les voies peuvent être utilisées pour l'injection des ARN-fragments actifs; intramusculaire (I.M.), intraveineuse

(I.V.), sous-cutanée (S.C.), intradermique (I.D.) et per os. Le temps de «réponse» varie avec la voie choisie et est fonction de la dose de produit. Chez les lapins non traités par l'endoxan, dont la formule sanguine est normale, l'administration de ARN-5 fragments par voie I.V. ne modifie pas le taux de globules blanc. Si la dose de produit est forte, on constate une augmentation, mais, en 24 heures, le taux de globules blancs redevient normal.

L'action de divers agents chimiques et physiques (Endoxan, Methotrexate, Thiotépa, rayons), et même une déficience géné-io tique entraînant une baisse leucopoïétique ou une baisse des plaquettes, peut, de ce point de vue, être contrebalancée par celle des divers ARN-fragments précités. L'action sur la genèse des plaquettes est moins rapide que celle sur les globules blancs, mais permet une remontée progressive importante. Des essais 15 cliniques ont confirmé ces résultats.

La prolongation de la chimiothérapie nécessite un renouvellement d'administration des ARN-fragments, sans entraîner d'épuisement du phénomène.

20 Toxicologie:

Les produits P3 et P4 décrits ci-dessus et ceux des exemples 1 à 3, dissous dans de l'eau physiologique stérile, ont été administrés à des souris et à des lapins par voies intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée et par voie orale. Des 25 doses de 1 à 5 mg en une seule injection chez la souris et de 4 à 25 mg chez le lapin, ces injections étant répétées plusieurs jours et jusqu'à 15 jours de suite, n'ont permis de déceler aucun effet toxique des produits.

Des doses nettement plus élevées, administrées par voie 30 orale, n'ont pas révélé non plus d'effet toxique.

Des études tératologiques ont montré que l'injection des produits selon l'invention à des souris femelles en gestation n'a aucun effet néfaste ni pour la première génération, ni pour les générations suivantes.

35 Les produits selon l'invention présentent donc une parfaite innocuité pour l'animal.

Application thérapeutique:

Des essais cliniques ont montrés que les produits obtenus 40 selon l'invention peuvent être administrés chez l'homme, chaque fois qu'il existe une leucopénie ou une déficience en plaquettes, pour ramener à la normale le taux des leucocytes et des plaquettes, sans modifier le reste de la formule sanguine. Il se produit un rééquilibrage entre les divers types de globules 45 blancs.

Les produits étant solubles dans l'eau peuvent être administrés par toute voie parentérale sous forme de solutions physiologiques, ou par voie orale sous toutes les formes galéniques classiques (solutions buvables, comprimés, gélules, etc.). La so dose à administrer peut varier de 10 à 20 mg selon la nature de la maladie à traiter, et les compositions pharmaceutiques selon l'invention contiennent, comme produit actif, l'un au moins des produits selon l'invention, à la dose unitaire de 2 à 100 mg, associé à un véhicule pharmaceutique approprié.

4 feuilles dessins

Claims

620 691 2 REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de polyribonucléotides ou fragments d'acides ribonucléiques, dans lesquels le rapport global des bases puriques (G+A) aux bases pyrimidiques (C+U) est compris entre 1,0 et 2,5, caractérisé en ce qu'on dégrade les ? acides ribonucléiques ribosomiques extraits d'un micor-orga-nisme, d'une levure, ou d'organes animaux dont le rapport

(G+A) / (C+U) est approprié, par une ribonucléase ou par un agent chimique, pour obtenir des chaînes simples comportant 20 à 80 motifs ribonucléotides. io

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme microorganisme, Escherichia coli T 3000.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dégradation des acides ribonucléiques est effectuée par incubation de ceux-ci avec une ribonucléase pancréatique ou une 15 ribonucléase extraite de Neurospora crassa pendant 20 à 30 minutes à 36° C, arrêt de la réaction par addition de phénol puis de chloroforme, en séparant chaque fois la phase aqueuse que l'on dialyse finalement contre de l'eau distillée et en recueillant la fraction non dialysable que l'on lyophilise. 20

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dégradation des acides ribonucléiques est effectuée par une base alcaline.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la dégradation des acides ribonucléiques est effectuée par action 25 de la soude ou de la potasse de concentration molaire finale 0,1

N, pendant 30 minutes à 36° C, ensuite par neutralisation par un même volume d'acide chlorhydrique 0,1 N, puis dialyse de la solution obtenue contre de l'eau distillée pendant 16 heures environ, et lyophilisation de la fraction non dialysable. 30

35

On a décrit récemment(lettre de brevet français no.

2 292 481, et C.R. Acad. Sci. Paris, Série D, T.280 (20 janvier 1975) pages 363—366) un procédé de préparation de polyribonucléotides, appelés aussi «ARN-fragments» (i.e. fragments d'acides ribonucléiques, par action de ribonucléases qui laissent intactes les séquences G—A, en particulier de la ribonu- 40 cléase pancréatique, sur des acides ribonucléiques ribosomiques, riches en nucléotides G et A, extraits de bactéries ou de cellules d'organes animaux. Les polyribonucléotides ainsi obtenus sont formés de chaînes simples comportant environ 20 à 80 motifs ribonucléotides e dans lesquelles les bases puriques sont 45 en excès par rapport aux bases pyrimidiques, et les motifs séquentiels G-A prédominent.

Les polyribonucléotides ont ensuite été sélectionnés en diverses fractions, par passage sur une colonne remplie d'un tamis moléculaire commercialisé sous la dénomination «Sepha- 50 dex G 25 fine» en tampon tris M/100, pH 7,4, et élution avec le même tampon. Les fractions ainsi séparées ont été dénommées selon l'ordre d'élution Pj, P2, P3, P4, P5 et correspondent aux pics de la courbe représentée dans la figure 1 dans laquelle les volumes d'éluat sont portés en ordonnées et l'absorbance mesu- 55 rée à 260 m|i est portée en abscisses.

Les différentes familles de polyribonucléotides ainsi obtenues ont été analysées spectrophotométriquement et leurs teneurs en bases puriques : guanine (G) et adénine (A), et pyrimidiques : cytosine (C) et uracile (U) furent déterminées; 60 elles se distinguent entre elles par la taille et le rapport des bases, les produits Pj et P2 étant les plus riches en bases puriques G et A.

On a déjà rapporté que les produits dénommés P! et P2, obtenus à partir d'ARN ribosomique d'Escherichia coli M 500, 65 présentent une activité antivirale, en particulier vis-à-vis du virus du fibrome de Shope, du virus de la vaccine et du virus de l'herpès.

On a maintenant trouvé que les produits les moins riches en bases puriques G et A et plus précisément les produits dont le rapport global des bases puriques aux bases pyrimidiques [(G+A)] / (C+U)] est compris entre 1,0 et 2,5, présentent une activité intéressante dans la genèse des leucocytes et des plaquettes sanguines, et sont utiles comme médicaments destinés à activer la leucopoïèse et la formation de plaquettes quand une déficience se manifeste.

En particulier, les produits désignés P3 et P4 et obtenus à partir d'ARN ribosomique d'Escherichia coli M 500 Sho-R par action de 1 a ribonucléase pancréatique, présentent tous les deux un rapport (G+A) / (C+ U) compris entre 1,0 et 2,5 et par conséquent constituent des médicaments utiles comme «remonte» leucocytes et plaquettes.

Les médicaments mentionnés peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la lettre de brevet français no. 2 292 481 à partir de différentes sources (levures, bactéries, organes animaux) en sélectionnant notamment à partir d'E-coli M 500 Sho-R, par passage sur tamis moléculaire, les fractions ou ARN-fragments dont le rapport (G+A) / (C+U) est compris entre 1,0 et 2,5.