DK169766B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af polyribonucleotider, der er virksomme ved dannelsen af leucocyter og blodplader - Google Patents

Description

DK 169766 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af polyribonucleotider, der er virksomme ved dannelsen af leucocyter og blodplader.

I fransk patentansøgning nr. 74/38.768 og i C.R.

5 Acad. Sci. Paris, serie D, T.280 (20. januar 1975), side 363-366, er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af polyribonucleotider, også kaldet "RNA-fragmenter", ved indvirkning af ribonucleaser, der lader rækkefølgen G-A intakt, især af pancreasribonuclease, på ribosomale ribonucleinsyrer, 10 der er rige på nucleotiderne G og A, og som er ekstraheret fra bakterier eller celler af animalske organer. De ved denne fremgangsmåde fremstillede polyribonucleotider består af enkelte kæder med ca. 20-80 ribonucleotidgrupper, og hvor purinbaserne er i overskud i forhold til pyrimidin-15 baserne, og grupperækkefølgen G-A er i overvægt.

Polyribonucleotiderne fraskilles ved denne fremgangsmåde selektivt i forskellige fraktioner ved passage i en kolonne fyldt med en molekylær sigte, der forhandles under navnet "Sephadex G 25 fine”® i tredobbelt puffer M/100, pH 20 7,4 og eluering med samme puffer. De således fraskilte frak tioner kaldes efter elueringsrækkefølgen P1, P2, P3, P4, P5 og svarer til spidserne på kurven, der er gengivet i fig.

1, hvor eluatmængderne er anført på abscissen og den målte absorption ved 260 nm er anført på ordinataksen.

25 De således fremstillede polyribonucleotider analyseres spektrophotometrisk, og deres indhold af purinbaser: guanin (G) og adenin (A) samt pyrimidinerne: cytosin (C) og uracil (U) bestemmes; de er indbyrdes forskellige med hensyn til basernes omfang og forhold, idet produkterne P^· og P2 er 30 mest rige på purinbaserne G og A.

Det er kendt, at produkterne kaldet P1 og P2, hvis G+A/C+U-forhold er hhv. 9,0 og 4,8, og som fås af ribosomalt RNA af Escherichia coli M 500 Sho-R, har antiviral virkning, især overfor virus fra Shope’s fibrom, over for virus af 35 vaccine og herpesvirus.

Det har nu vist sig, at de produkter, der ikke er så DK 169766 B1 2 rige på purinbaserne G og A, mere nøjagtigt de produkter, hvis totale forhold mellem purinbaser og pyrimidinbaser [(G+A)/(C+U) ] ligger mellem 1,0 og 2,3, har en interessant virkning ved dannelsen af leucocyter og blodplader og er 5 værdifulde som medikamenter, der skal aktivere leucopoiesis og dannelsen af blodplader, når et underskud er til stede.

Især har produkterne P3 og P4 fremstillet ud fra ribosomalt RNA af Escherichia coli M 500 Sho-R ved indvirkning af pancreasribonuclease begge udvist et forhold (G+A)/-10 (C+U) mellem 1,0 og 2,5 og udgør følgelig medikamenter,der er nyttige til atter at hæve antallet af leucocyter og blodplader.

Produkterne P3 og P4 kan fremstilles som beskrevet i fransk patentansøgning nr. 74/38.768 ud fra forskellige 15 kilder (gær, bakterier, dyreorganer), fortrinsvis ud fra E. coli M 500 Sho-R, ved passage gennem en molekylesigte, idet de fraktioner eller RNA-fragmenter vælges, hvor forholdet (G+A)/C+U) ligger mellem 1,0 og 2,5.

Det er imidlertid opfindelsens formål at angive en 20 fremgangsmåde til fremstilling af disse polyribonucleotider, der er enklere at gennemføre og gør det muligt at opnå et forøget udbytte.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af polyribonucleotider eller RNA-fragmenter, hvori 25 det samlede forhold af purinbaser (G+A) til pyrimidinbaser (C+U) ligger mellem 1,0 og 2,5, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, man nedbryder ribosomale ribonucleinsyrer, som er ekstraheret fra Escherichia coli T 3000, ved hjælp af en ribonuclease eller en alkalisk base til opnåelse af 30 enkle kæder med 20-80 ribonucleotidgrupper i en vandig fase, hvorefter man uden at foretage en fraktionering af de opnåede RNA-fragmenter, fraskiller den vandige fase, som dialyseres mod destilleret vand, og den ikke-dialyserbare fraktion opsamles og lyophiliseres.

35 Dyrkningsmetoderne for bakterien, isoleringen af ribosomale ribonucleinsyrer (RNA-r) og deres opbevaring DK 169766 B1 3 identiske med dem, der er beskrevet i fransk patentansøgning nr. 74/38.768.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen adskiller sig fra den kendte fremgangsmåde ved, at fraktioneringen af de op-5 nåede RNA-fragmenter udelades.

Som udgangsmateriale, anvendes ligesom i fransk patentansøgning nr. 74/38768 ribosomalt RNA ekstraheret fra E. coli T 3000 (også betegnet E. coli K 12) hørende til de arter, der sædvanligvis findes i tarmfloraen; hos denne 10 stamme er forholdet mellem purinbaser og pyrimidinbaser lavere end det tilsvarende forhold hos stammen E. coli M 500 Sho-R (hvor forholdet er ca. 2,0) og ligger i nærheden af 1,0.

De midler, der anvendes til nedbrydning af RNA-r 15 ifølge den foreliggende opfindelse kan være ikke blot ribonu-cleaser såsom pancreasribonuclease eller en ribonucleaseek-strakt af Neurospora crassa, men ligeledes en stærk base (natriumhydroxid eller kaliumhydroxid), fortrinsvis med en slutkoncentration på 0,1N i reaktionsopløsningen.

20 RNA-fragmenterne, der er fremstillet ved fremgangs måden ifølge opfindelsen, har et samlet forhold (G+A)/C+U) mellem 1,0 og 2,5, og det er ikke nødvendigt at foretage en fraktionering i kolonne.

Nedenfor er anført et eksempel på fremstilling ifølge 25 kendt teknik af P3 og P4 ud fra en E. coli-stamme, der er gjort resistent over for showdomycin, der er beskrevet af M. Beljanski m.fl. i C.R. Acad. Sci. Paris, serie D, 272, side 2107-2110, og registreret i Centraal Bureau Voor Schim-melcultures under nr. CBS 615-74 og herefter kaldt E. coli 30 M 500 - Sho-R.

DK 169766 B1 4

Eksempel 1 (sammenligning)

Fremstilling af P3 og P4 af E. coli M 500 - Sho-R

Bakterierne af denne stamme dyrkes ved 37°C i et 5 godt ventileret miljø, i et syntetisk medium indeholdende pr. liter medium 100 ml kaliummonophosphat på 136 g/1 10 ml 20% ammoniumsulfat 1 ml 0,05% ferrosulfat 10 1 ml magnesiumsulfat på 20 g/100 ml 2 ml vitamin på 0,05% og natriumhydroxid for at holde pH på 7,2, idet der til dette medium efter at det er blevet steriliseret sættes 0,4-0,5% steriliseret glycose for sig (opløsning 20%).

15 Når dyrkningen er afsluttet, opsamles bakteriecelleme ved centrifugering og kan opbevares nedfrosset. Derefter homogeniseres de koldt i en puffer A (5 ml 2 molær tris-HC1, 30 ml 2 molær KC1, 10 ml opløsning af 30 g/100 ml Mg-acetat), formales, og nedbrydningen afsluttes med ultralyd.

20 Efter fortynding med en puffer B (svarende til puffer A, men kun indeholdende 0,1 ml Mg-acetat og 0,1 ml mercap-toethanol), centrifugeres der i 20 minutter (25-30.000 G), derefter sættes der til det ovenpå svømmende lag 10-20 jug desoxyribonuclease pr. ml. Der omrøres i 15 minutter ved 25 30-37“C, hvorefter der centrifugeres i 20 minutter 25-30.000 G) . Det ovenpå svømmende lag centrifugeres igen i 2 timer ved 40.000 o/m i en ultracentrifuge, hvorefter ribosomeme opsamles og alt RNA 4 S, der ikke skal anvendes, kasseres.

Ribosomerne (bundfald) homogeniseres i en beholder i 30 nærværelse af puffer B. Der tilsættes 2-3 dråber 20% lauryl-sulfat, og der omrøres kraftigt. Det ribosomale RNA ekstra-heres på kendt måde med phenol i nærværelse af puffer B. Adskillige ekstraheringer er nødvendige. En afsluttende ekstrahering i chloroform er nødvendigt for helt at eliminere 35 phenol og de endnu tilstedeværende proteiner.

De vandige faser samles og tilsættes 96% alkohol, der indeholder en smule KCl for at understøtte udfældningen DK 169766 B1 5 af RNA. Efter en centrifugering i 5 minutter ved 5000 G kan der opsamles RNA, som derefter dialyseres natten over med destilleret vand indeholdende 0,1 molær KC1.

Om morgenen fortsættes dialysen en time i destilleret 5 vand alene. RNA bestemmes ved 260 nm (UV) ved hjælp af et spektrophotometer.

Forholdet 260/280 tillader en kontrol af RNA-præpara-tets egnethed. Dette forhold skal ligge meget nær 2.

RNA opbevares nedfrosset eller som lyophiliseret 10 pulver.

Fraktioneringen af RNA i polyribonucleotider (RNA-fragmenter) sker på følgende måde: 70 mg ribosomalt RNA (ca. 10 ml) bringes i berøring med 0,2 ml af en opløsning af krystalliseret pancreasribonuclease. (Opløsningen af 15 pancreasribonuclease på 5 mg/ml har i forvejen været bragt til kogepunktet i 10 minutter og derefter afkølet).

RNA inkuberes med ribonucleasen i nøjagtig 30 minutter ved 36®C i vandbad. Nedbrydningen bringes til ophør ved tilsætning af en tilsvarende mængde chloroform og kraftig 20 omrøring i nogle minutter. Der centrifugeres i 5 minutter ved 5000 G. Den vandige fase (den øverste fase) fjernes og tilsættes endnu en gang en tilsvarende mængde chloroform, omrøres og centrifugeres. Den vandige fase anbringes straks i en "Sephadex G-25 fine"-kolonne og reguleres med en puffer 25 H20- 0,1 molær tris-HCl til pH 7,4.

RNA-fragmenteme elueres med samme puffer.

Under disse betingelser fremkommer der 5 synlige absorptionsspidser ved 260 nm regelmæssigt som vist på elue-ringskurven. De er betegnet 1-5 efter kolonnens eluerings-30 rækkefølge.

RNA-fragmenterne, der udgør spidserne 1 og 2, har antiviral aktivitet.

RNA-fragmenterne, der udgør spidserne 3 og 4, udviser til stadighed en meget iøjnefaldende aktivitet ved gendan-35 nelse af leucocyter og blodplader.

RNA-fragmenterne, der udgår spids 5, opbevares ikke.

DK 169766 B1 6

Fraktionerne, der udgør hver af spidserne, forenes og lyophiliseres. Herved fås produkterne P1, P2, P3 og P4, efter man har taget den tørre remanens op i en lille smule destilleret vand, behandlet den kraftigt en gang med samme 5 mængde chloroform og centrifugeret, idet det oversvømmende lag dialyseres i 24 timer (axeniske betingelser) i sterilt destilleret vand og lyophiliseres tør. Produkterne P3 og P4 svarer til RNA-fragmenterne fremstillet ifølge opfindelsen.

RNA-fragmenterne P3 og P4,s struktur, der dannes af 10 enkelte kæder med 25-50 nucleotider, er blevet undersøgt ved den i fransk patentansøgning nr. 74/38.768 beskrevne teknik for at bestemme deres indhold af purin- og pyrimidinbaser.

150 /ig RNA-fragmenter hydrolyseres i en time ved 100°C (kogende vandbad). Efter inddampning i en ekscikator 15 tages remanensen op i 0,02 ml destilleret vand og tyndtlags-chromatograferes (ecteola-cellulose) ved den af G.R. Bjork og L. Svensson i Biochim. Biophys. acta, 138, side 430-432, 1967, beskrevne teknik. Hydrolysen frigør purinbaserne, og pyrimidinbaserne forbliver i form af nucleotider.

20 Bestanddelene i RNA-fragmenterne P3 og P4 adskilles ved chromatografi i lukket beholder og identificeres ved den ovenfor for RNA-fragmenterne P1 og P2 beskrevne teknik.

RNA-fragmenterne P3 består af: A: 29,0 25 G: 41,1 C: 15,2 (G+A/C+U = 2,3) U: 15,0 RNA-fragmenterne P4 består af: A: 25,6 C: 26,3 30 C: 21,0 (G+A/C+U = 1,06) U: 27,1 idet disse tal er angivet i mol pr. 100 mol analyserede nucleotider, idet følgende ekstinktionskoefficienter er 35 benyttet: A = 13, G = 12,8, C = 11,5, U = 10 og svarende til maksimumsabsorption (jfr. Methods in Enzymology XIX, DK 169766 B1 7

Nucleic Acides, Part A, Ed. Grossman og K. Mol. dave, Academic Press (1967), side 386).

RNA-fragmenterne P3 og P4 indeholder ingen spor af DNA. Dette blev nøje undersøgt ved colorimetri (diphenylamin) 5 og ved enzymologi (aktivitet i nærværelse af DNA-polymerase).

I eksemplerne 2-4 nedenfor beskrives nu fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af RNA-fragmenter ud fra RNA-r af E. coli T 3000 ved hjælp af forskellige ribonucleaser og en alkalisk base.

10

Eksempel 2

Nedbrydning af RNA-r af E. coli T 3000 ved hiælp af pancreas-ribonuclease.

RNA-r opnås af en kultur af E. coli T 3000 ved den 15 fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 for RNA-r af E. coli M 500 Sho-R. Nedbrydningen af det fremstillede RNA sker ifølge opfindelsen med en opløsning af pancreasribonu-clease med en styrke på 5 mg/ml, hvilken opløsning i forvejen har været opvarmet til 100°C i 10 minutter (kogende vandbad) 20 og derefter hurtigt afkølet.

Man inkuberer en blanding af RNA-r og ribonuclease med samme ribonucleasekoncentration som i eksempel l ved 36°C, men i kortere tid: 20 minutter (i stedet for 30 minut ter) . Hvis der anvendes en anden slags pancreasribonuclease, 25 mere eller mindre krystalliseret, er det nødvendigt at tilpasse ribonucleasekoncentrationen eller inkuberingstiden.

Reaktionen afbrydes ved tilsætning af en phenolopløs-ning indeholdende 10% destilleret vand (1 volumendel af denne opløsning til 1 volumendel reaktionsblanding), og 30 blandingen omrøres kraftigt for at fjerne ribonucleasen. Efter centrifugering i 5 minutter ved 10.000 o/m sættes der til den vandige fase (den øverste) samme volumen phenol, hvorefter blandingen omrøres og derefter centrifugeres. Operationen gentages med chloroform (volumen til volumen).

35 Efter adskillelse af faserne og gentagelse 2 eller 3 gange af operationen, dialyseres den vandige fase under axene DK 169766 B1 8 betingelser i 16 timer i sterilt destilleret vand ved 4°C.

Mængden af RNA-fragmenter, der ikke kan dialyseres, bestemmes ved ultraviolet absorption ved 260 nm. Udbyttet af aktive RNA-fragmenter i forhold til begyndelsesmængden 5 af ribosomalt RNA varierer mellem 50 og 60%.

RNA-fragmenterne opbevares efter lyophilisering. Elektrophorese på acrylamidgel af RNA-fragmenterne viser tilstedeværelse af en enkelt spids for RNA-fragmenterne af mindre størrelse end for RNA 4S, således som det er vist 10 i fig. 2, på hvilken der på ordinataksen er angivet absorptionen ved 260 nm og på abscissen den på 1 time og 30 minutter gennemløbne distance (metoden beskrevet af M. Beljanski, P. Bourgarel og Mme M. Beljanski i Ann. Inst. Pasteur 1970, 118, side 253).

15

Eksempel 3

Nedbrydning af RNA-r af E. coli T 3000 med ribonuclease

Ribonuclease N^, der stammer fra Neurospora crassa 20 og er fremstillet og renset som beskrevet af K. Kasai m.fl. i J. Bio. Chem. 1969, 66, side 389, krystalliseret en gang, nedbryder de polyribonucleotide kæder i samme udstrækning som basen G, og dets virkning på RNA-r giver RNA-fragmenter, der er aktive i leucopoiesen og ved dannelsen af blodplader.

25 Der anvendes følgende betingelser: 100 mg RNA-r af E. coli T 3000 opløst i destilleret vand inkuberes i nærværelse af 0,73 ml ribonuclease N^_ (begyndelsesopløsning 1000 enheder/2 ml). Inkuberingstid: 30 minutter ved 36°C. Ribonucleasen fjernes straks med phenol 30 og chloroform som beskrevet i eksempel 2? fragmenterne dialyseres i sterilt destilleret vand. Det fremstillede produkt lyophiliseres.

Eksempel 4 35 Nedbrydning af RNA-r af E. coli T 3000 med natriumhydroxid el. kaliumhydroxid

Til en opløsning af 7-10 mg RNA-r/ml sættes en opløs- DK 169766 B1 9 ning af NaOH eller KOH, således at koncentrationen af de sidstnævnte er 0, IN.

Inkuberingen sker ved 36°C i 30 minutter. Der neutraliseres straks med samme volumen 0,1N HC1. Opløsningen dia-5 lyseres i destilleret vand i 16 timer ved 4°C. Det fremstillede materiale, der ikke kan dialyseres, lyophiliseres. Efter hydrolyse af de forskellige RNA-fragmenter fra eksemplerne 2, 3 og 4 bestemmes forholdet mellem purinbase og pyrimidinbase. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 10 og er angivet i mol pr. 100 mol analyseret nucleotid.

Tabel 15 RNA-fragmen- RNA-fragmen- RNA-fragmen ter iflg. ter iflg. ter iflg.

Baser Eks. 2 Eks. 3 Eks. 4 G 42,0 24,3 34,0 20 A 28,8 26,8 23,1 C 15,7 25,0 21,2 U 13,5 23,6 21,7

Forh. (G+A)/(C+U) 2,3 1,06 1,36 25

Der kan ikke iagttages nogen afgørende forskel mellem RNA-fragmenterne fremstillet med de ovennævnte forskellige nedbrydningsmidler og under de ovenfor beskrevne betingelser; fragmentstørrelserne er praktisk taget identiske og altid 30 mindre end for RNA 4 S (se fig. 2) .

Farmakologiske egenskaber

Man har undersøgt optagelsen i organismen af RNA-fragmenterne P3 og P4 fra eksempel 1 mærket med C14 efter 35 injektion i mus eller kaniner ad intravenøs vej.

RNA-fragmentet P4 mærket med C14 findes hovedsagelig i milten, mindre i leveren, men ligeledes i knoglemarven.

RNA-fragmentet P3 mærket med C14 findes ligeledes og hovedsagelig i de samme organer, men i mindre grad. Ved aflivning DK 169766 B1 10 af de mus, der var behandlet med disse produkter, konstateres en forøgelse af miltens størrelse og vægt (gengivet i fig.

3), men kun hos dyr behandlet med P4. I fig. 3 er på ordinataksen angivet milten vægt i mg og i fig. 4 leverens vægt 5 i gram bestemt i forhold til antallet af dage (på abscissen), der er forløbet efter at dyret har modtaget en dosis på 0,3 mg af produktet P3 (kurverne 3) eller P4 (kurverne 4) pr.

20 g af musens vægt givet intravenøst eller intraperitonealt.

De to organer har genvundet deres normale vægt efter 5-6 10 uger, og man finder ikke mere radioaktivitet, hvilket skyldes en naturlig eliminering.

Virkningen ved dannelsen af leucocyter og blodplader er blevet undersøgt hos kaniner behandlet med methotrexat.

Hos dyr, der har fået methotrexat (35 mg intramuskulært på 15 kaniner), iagttages en nedgang på ca. 30% i leucocyter 48 timer efter indgivelse af antimitotikaet. Af tre forsøgskaniner fik første kanin 2 mg subkutant af en blanding P3 + P4 ( i vægt forholdet 1:1), anden kanin fik samme dosis intraperitonealt og tredie kanin fik kun methotrexat (kontrol).

20 De to kaniner, der blev behandlet med P3 + P4, genvinder i løbet af 5-7 dage et praktisk taget normalt antal leucocyter, medens kontrolkaninen først har genvundet det efter ca. 15 dage.

De samme kaniner får yderligere endnu en dosis metho-25 trexat (55 mg intravenøst pr. kanin) på dag 0 i fig. 5.

To dage efter får første kanin 5 mg P3 + P4 (vægtforhold 1:1,5) intraperitonealt, anden kanin får samme dosis subcutant og tredie kanin, samme kontroldyr som i det foregående forsøg, får kun methotrexat. Analyseresultaterne af 30 leucocyttallene i blodet taget hver anden dag i 20 dage er vist i fig. 5.

I fig. 5, hvor der på ordinataksen er anført leucocyt-tallet som en funktion af antallet af dage (på abscissen) forløbet efter injektion med methotrexat, ses, at methotrex-35 ats virkning hos de tre kaniner resulterer i en meget udtalt nedgang i leucocyttallet (kontrol: kurve 1), men mindre ______ . . .....______________ DK 169766 Bl 11 udtalt hos de to kaniner, der i forvejen er behandlet med P3 + P4 subcutant (kurve 2) eller intraperitonealt (kurve 3), end hos kontrolkaninen.

Hos den kanin, der for anden gang har fået P3 + P4 5 intraperitonealt (kurve 3), bliver leucocyttallet normalt i løbet af 7-9 dage, stiger over det normale i ca. 2 dage og falder derefter mod det normale. For den kanin, der har fået P3 + P4 subcutant, når kurven 2, der repræsenterer forøgelsen af leucocyttallet, sit maksimum hen mod den 14.

10 dag og falder derefter mod det normale. Derimod-holder leucocyttallet hos kontrolkaninen (kurve 1), der ikke er behandlet med P3 + P4, sig på et lavt niveau, og dyret når ikke at genvinde et normalt tal i løbet af observationstiden.

Antallet af røde blodlegemer hos de således behandlede 15 kaniner varierer ikke.

De farmakologiske undersøgelser, der er foretaget med RNA-fragmenter fremstillet med forskellige nedbrydningsmidler ifølge eksempel 2-4, viser, at der ikke forekommer nogen forskel af betydning med hensyn til virkningen ved 20 leucopoiesen og i dannelsen af blodplader mellem produkterne P3 og P4 i eksempel 1 indgivet hver for sig eller blandet i et hvilket som helst forhold eller hvert af produkterne i eksempel 2-4.

En enkelt dosis af hvert af produkterne i eksempel 25 2-4 (2 mg) indgivet intravenøst til stærkt og konstant immu- nosupprimerede kaniner (leucocyttallene formindsket med 60-70%) tillader retablering af et normalt leucocyttal i løbet af 24-48 timer. Antallet af blodplader kan være forhøjet med RNA-fragmenterne med 50-100% i forhold til antallet 30 af blodplader hos kontroldyr.

Fig. 6 viser de opnåede resultater i løbet af et forsøg (20-30 dage) med kaniner der til stadighed behandles med "Endoxan"® (65 mg/dag) og periodisk med RNA-fragmenterne fremstillet ifølge et af eksemplerne 1-4.

35 I fig. 6 er der på abeissen afsat antallet af de forsøgsdage, hvor kaninerne får 65 mg "Endoxan" om dagen.

DK 169766 B1 12 På det tidspunkt, der er angivet med pilen A, får kaninerne 2 mg RNA-fragmenter intravenøst. En af kurverne i fig. 6 er fremkommet ved på ordinataksen at angive antallet af leuco-cyter og den anden kurve ved på ordinataksen at angive antal-5 let af blodplader.

Alle indgivelsesveje kan benyttes ved administration af aktive RNA-fragmenter: intramuskulaert (I.M.), intravenøst (I.V.), subcutant (S.C.), intradermalt (I.D.) og oralt. Reaktionstiden varierer med den valgte indgivelsesvej og er 10 en funktion af dosis. Hos de kaniner, der ikke-er behandlet med "Endoxan", og hvis blodsammensætning er normal, ændrer indgivet af RNA-fragmenter intravenøst ikke antallet af hvide blodlegemer. Hvis dosis af produktet er stor, konstateres en forøgelse, men i løbet af 24 timer bliver antallet 15 af hvide blodlegemer igen normalt.

Virkningen af forskellige kemiske og fysiske midler ("Endoxan", "Methotrexat", "Thiotépa", stråler) og selv en medfødt mangel, der medfører en leucopoietisk reduktion eller en reduktion af blodplader, kan ud fra dette synspunkt 20 afbalanceres ved hjælp af virkningen af de ovennævnte forskellige RNA-fragmenter. Virkningen på dannelsen af blodplader er mindre hurtig end på de hvide blodlegemer, men tillader en betydelig progressiv genvinding.

En forlængelse af chemoterapien nødvendiggør en gen-25 tagelse af indgivelsen af RNA-fragmenter uden at medføre en udmattelse af genstanden for behandlingen.

Toksicitet

Produkterne P3 og P4 i eksempel 1 og produkterne fra 30 eksempel 2-4 indgives, efter at være blevet opløst i fysiologisk sterilt vand, til mus og kaniner intravenøst, intra-peritonealt, intramuskulært, subcutant og oralt. Doser på 1-5 mg i en enkelt injektion til mus og på 4-25 mg til kaniner, hvilke injektioner gentages i flere dage og indtil 15 35 dage i træk, viser ingen toksisk virkning af produkterne.

Udpræget forhøjede doser indgivet oralt viser ingen DK 169766 B1 13 toksisk virkning.

Teratologiske undersøgelser viser, at injektion af produkterne fremstillet ifølge opfindelsen på hunmus under drægtighedsperioden ikke har nogen skadelig virkning hverken 5 på første generation eller de følgende generationer.

Produkterne fremstillet ifølge opfindelsen er således fuldstændig uskadelige for dyr.

Terapeutisk anvendelse 10 Kliniske forsøg viser, at produkterne- fremstillet ifølge opfindelsen kan indgives til mennesker, når der foreligger leucopeni eller mangel på blodplader, for at bringe leucocyttal og antallet af blodplader op på det normale uden at ændre den øvrige sammensætning af blodet. Der skabes 15 en fornyet ligevægt mellem de forskellige hvide blodlegemer.

Produkterne fremstillet ifølge opfindelsen, der er opløselige i vand, kan indgives parenteralt i form af fysiologiske opløsning, eller oralt i alle klassiske galeniske former (opløsninger, i drikkelig form, tabletter, kapsler 20 etc.). Dosis kan variere fra 10 til 20 mg alt efter naturen af den sygdom, der skal behandles, og farmaceutiske præparater indeholder som aktivt stof i det mindste et af produkterne fremstillet ifølge opfindelsen i enhedsdoser på 2-100 mg kombineret med et passende farmaceutisk bærestof.

25

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af polyribonucleo-tider eller RNA-fragmenter, hvori det samlede forhold af purinbaser (G+A) til pyrimidinbaser (C+U) ligger mellem 1,0 5 og 2,5, kendetegnet ved, at man nedbryder riboso-male ribonucleinsyrer, som er ekstraheret fra Escherichia coli T 3000, ved hjælp af en ribonuclease eller en alkalisk base til opnåelse af enkle kæder med 20-80 ribonucleotidgrup-per i en vandig fase, hvorefter man uden at foretage en frak-10 tionering af de opnåede RNA-fragmenter, fraskiller den vandige fase, som dialyseres mod destilleret vand, og den ikke-dialyserbare fraktion opsamles og lyophiliseres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nedbrydningen af ribonucleinsyreme sker ved 15 indvirkning af en pancreasribonuclease.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at nedbrydningen af ribonucleinsyreme sker ved indvirkning af et ribonucleaseekstrakt af Neurospora crassa.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kra-20 vene 1-3, kendetegnet ved, at man efter inkube- ringen af blandingen af ribosomale ribonucleinsyrer og ribo-nucleasen i 20-30 minutter ved 36eC, afbryder reaktionen ved tilsætning af phenol og derefter af chloroform, idet den vandig fase hver gang fraskilles.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at nedbrydningen af ribonucleinsyreme sker ved indvirkning af natriumhydroxid eller kaliumhydroxid.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man lader natriumhydroxid eller kaliumhydroxid 30 i en endelig molær koncentration på 0,1N virke i 30 minutter ved 36°C, hvorefter der straks neutraliseres med samme volumen 0,IN saltsyre, og at den fremkomne opløsning dialyseres i destilleret vand i ca. 16 timer.